CN101061137A - 用于纯化人生长激素的新方法 - Google Patents

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CN101061137A CNA2004800435652A CN200480043565A CN101061137A CN 101061137 A CN101061137 A CN 101061137A CN A2004800435652 A CNA2004800435652 A CN A2004800435652A CN 200480043565 A CN200480043565 A CN 200480043565A CN 101061137 A CN101061137 A CN 101061137A
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Abstract

本发明涉及使用疏水作用层析用于纯化通过DNA重组技术获得的人生长激素的商业方法，使用苯基柱，用含水缓冲液和有机溶剂的混和物作为洗脱剂，将由于在人生长激素的巨大分子上存在的剪铡位置所产生的作为杂质存在的人生长激素的已剪铡的分子与靶人生长激素分子有效地分离，随后脱盐，冷冻干燥，并且本发明还涉及其中人生长激素的已剪铡的分子的洗脱在靶人生长激素的洗脱之前的方法，以达到纯度＞99.5％的hGH。

Description

用于纯化人生长激素的新方法
技术领域
本发明涉及通过使用疏水作用层析以商业规模纯化人生长激素(hGH)的方法，其有效地分离在通过DNA重组技术的生长激素生产过程中形成的已剪铡的(clipped)激素部分。
背景技术
人生长激素(hGH)是垂体来源的蛋白，其具有多种重要生物功能，包括蛋白合成、细胞增殖和新陈代谢。hGH是约22kDa的191个氨基酸残基的多肽。已将重组人生长激素(hGH)作为细胞内和分泌蛋白在大肠杆菌中表达。已将一系列层析和/或非层析方法用于获得纯蛋白。已报道在人生长激素中在140-150氨基酸残基之间的区域对多种蛋白酶敏感。这导致蛋白的蛋白水解裂解(proteolytically cleaved)形式，其物理性质不同于完整分子的物理性质。hGH的这种变型可在纯化过程中生成，且其除去在治疗级生长激素蛋白生产中引起主要挑战。为了实现hGH用于治疗目的的应用，必须除去已剪铡的分子。
现有技术描述在许多方面不同于本发明的技术，例如处理参数、所用设备、分离靶部分的优先次序、使用相的数量、使用的溶剂、分离杂质的类型。几个现有技术的文献公开更适用于作为分析技术而不是工业分离方法的技术。
US 4332717公开疏水作用层析用于纯化人生长激素的应用。该专利提纯由人垂体腺提取的hGH而与重组hGH或其纯化无关。所以，在此方法中生成的杂质不同于在重组激素中存在的杂质。除了使用不同的介质和不同的柱以外，该方法使用不同的压力条件、不同的温度条件和不同的结合和洗脱缓冲液。洗脱梯度也不同。它还描述蓝色琼脂糖(blue sepharose)或琼脂糖在分离中的应用而没有教导用于洗脱的有机和水溶液的混和物的用途，其是本发明的本质特征之一。
以下参考文献涉及通过重组DNA技术获得的生长激素的纯化。在文献中，已知数篇专利如US4861868，其描述用于生产重组猪生长激素的方法；US4705848，US4694073，US4731440，US5064943，US4975529，US5023323，US5109117和US6410694涉及增溶和变性(naturation)方法作为重要特征，但这些在本发明的范围之外。
美国专利6022858涉及hGH的制剂，其中该hGH用Zn和任选地用赖氨酸或钙离子预处理，此后向其中加入苄醇且将pH调至2-9。
美国专利5734024教导用于测定重组hGH的生物活性的方法并且对于分析目的是良好的。
美国专利5182369教导在pH低于6.5下操作且两步沉淀是必要特征的方法。然而，使用酸性pH的处理条件可能导致蛋白的聚集或酸水解并且是不利的。
美国专利6451347描述了用于hGH的纯化方法，其中进行与金属离子例如Zn离子的配位，其不是本发明的特征。该专利描述由hGH降解生成的变体而不是剪铡部分。
美国专利6451987强调用于纯化包括hGH的肽的阳离子交换方法的应用，但没有提及该已剪铡的激素部分与完整hGH分子分离。
美国专利6437101教导使用了不用离液剂的含水两相萃取的技术。该方法繁琐，由此不易于实施。
在文献中通过专利号引用的专利被解释为已被作为参考包括由此涉及所述专利的文本。
即使现在此类纯化过程中的实际问题还是分离从巨大靶分子中产生的已剪铡的分子。由于分子内存在的某些其他链段这些剪铡部分保持束缚在一起。
有关用于分离hGH变体，包括已剪铡的变体的疏水作用层析的应用的非专利现有技术文献包括下列三个已发表的文件。
Pavlu和Gellerfors，Bioseparation(1993)，3：257-265公开了重组人生长激素Genotropin的疏水作用层析。
Gellerfors等人，Acta Pediatr Scand(Suppl)(1990)，370：93-100教导通过高效液体层析技术的分离和鉴定生长激素变体的方法。
Wu等人，J.Chromatogr.(1990)，500：595-606公开了高效疏水作用层析在鉴定DNA来源的人生长激素的特征中的应用。
在所有这些参考文献中公开的技术在流动相B中使用了表面活性剂Brij(聚氧乙烯23十二烷基醚)并且在主峰后出现与对应于剪铡分子的峰。这些文章公开伴随0.075％Brij使用在流动相A中为0.5％和在流动相B中为5％的乙腈百分比。使用Brij 35以使产物的回收率从70％提高至99％。Brij 35，作为一种洗涤剂帮助降低蛋白与基质之间的相互作用，由此提高回收率。有趣地，靶分子的峰位于变体峰之前。这些文章本质上描述HPLC技术且更适于用于分析目的而不是工业生产目的。这些方法的主要缺点在于洗涤剂如Brij的使用不利于工业规模，因为将其从含蛋白的溶液中除去可能很困难。
本发明以很高的比例使用有机溶剂并排除使用Brij。此外应注意对应于变体的峰位于靶分子峰之前。
现有技术提及在每3.3ml柱体积约50-150μg半纯化蛋白的分析水平荷载下剪铡和完整分子之间的拆分。在本发明中拆分是在每ml柱体积1mg半纯化蛋白荷载下实现的。
现有技术的局限性是使用非离子表面活性剂，Brij 35以在分析水平下提高处理回收率。非离子表面活性的存在在制备水平上可能是不希望的，因为难以除去保持与蛋白分子结合的表面活性剂。本发明所述的方法通过在洗脱剂中使用较高量的可以很容易地通过切向流过滤或凝胶过滤层析除去的有机溶剂，避免需要使用表面活性剂用于提高方法的回收率。
发明内容
发明目的
本发明的主要目的是描述用于人生长激素的纯化的方法，其可以有效地将已剪铡的分子与靶分子分离。
本发明的另一目的是提供用于人生长激素的纯化方法，其首先有效地除去已剪铡的分子，从而更好地控制靶分子的生产。
本发明的又一目的是描述用于人生长激素的纯化方法，其可以用于多种目的，例如用于hGH的分析方法、hGH的分离以及hGH的工业纯化。
本发明的再一目的在于提供在8.0-9.0的pH范围内能有效进行纯化的方法。
本发明的再一目的在于开发不使用任何洗涤剂或表面活性剂的用于人生长激素的纯化的方法。
发明概要
本发明涉及使用疏水作用层析纯化通过重组技术获得的hGH的新方法。本发明进一步涉及使用聚合疏水性珠作为固体载体和含水缓冲液和有机溶剂的混和物作为洗脱剂以将靶hGH分子与作为杂质存在的已剪铡的激素部分分离，并且最后通过凝胶过滤脱盐并冷冻干燥以得到纯化的hGH。
本发明的特征将从下面发明概念的描述和优选实施方案的描述变得更清楚。
附图说明
下表描述有关各图的用于半纯化的hGH的层析分离条件。
 图# 层析  缓冲液A 缓冲液B 样品详述
 1 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/50％乙腈 样品：1.0mg检测：280nm
 2 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/40％乙腈 样品体积：1.0ml检测：280nm
 3 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/30％乙腈 样品体积：1.0ml检测：280nm
 4 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH8.0 20mM磷酸钠，pH8.0/50％乙腈 样品：1mg检测：280nm
 5 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH7.0 20mM磷酸钠，pH7.0/50％乙腈 样品：1.0mg检测：280nm
 6 柱：Resource PHE(1.0 ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH6.0 20mM磷酸钠，pH6.0/50％乙腈 样品：1.0mg检测：280nm
 7 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/50％甲醇 样品：1.0mg检测：280nm
 8 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/40％甲醇 样品：1.0mg检测：280nm
 9 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/30％甲醇 样品：1.0mg检测：280nm
 10 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH8.0 20mM磷酸钠，pH8.0/50％甲醇 样品：1mg检测：280nm
 11 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH7.0 20mM磷酸钠，pH7.0/50％甲醇 样品：1mg检测：280nm
 12 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH6.0 20mM磷酸钠，pH6.0/50％甲醇 样品：1mg检测：280nm
 13 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/50％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 14 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/40％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 15 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/30％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 16 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH8.0 20mM磷酸钠，pH8.0/50％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 17 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH7.0 20mM磷酸钠，pH7.0/50％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 18 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH6.0 20mM磷酸钠，pH6.0/50％异丙醇 样品：1mg的离子交换纯化的样品检测：280nm
 19 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/25％乙腈/25％甲醇 样品：1mg检测：280nm
 20 柱：Resource苯基(1.0ml)Amersham  20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM磷酸钠，pH9.0/25％乙腈/25％异丙醇 样品：1mg检测：280nm
 21 柱：Resource苯基(1.0  20mM磷酸钠/0.4M 20mM磷酸钠， 样品：1mg
ml)Amersham K2HPO4，pH9.0 pH9.0/25％异丙醇/25％甲醇 检测：280nm
 22 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham 20mM磷酸钠，pH8.0/0.4MK2HPO4 20mM磷酸钠，pH8.0/50％乙腈 样品：GH，IEX级分，样品体积：1.0ml，检测：280nm
 23 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham 20mM Tris/0.4MK2HPO4，pH9.0 20mM Tris，pH.0/50％乙腈 样品：1.0mg检测：280nm
 24 柱：Sephacryl S-200HR(Amersham)100ml床体积 9mM磷酸钠，pH8.0 检测：280nm
 25 柱：Resource PHE(1.0ml)Amersham 20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH8.0 20M Na-P，pH8.0 样品：1mg，检测：280nm
 26 柱：苯基琼脂糖FF(1.0ml)，Amersham 20mM磷酸钠/0.4MK2HPO4，pH8.0 20M Na-P/50％乙腈，pH8.0 样品：1mg，检测：280nm
 27 柱；Source 15Q，Amersham 10mM NH4Cl/10mM Tris，pH8.0/3％EtOH 20mM NH4Cl，pH8.0/7.5％EtOH/500mM NaCl 样品：Cu-IDA纯化的具有已剪铡的分子的hGH检测：280nm级分：1ml所用体系：FPLC在1ml/min流速下分析：10μl的各个级分在SDS-PAGE凝胶上分析，随后通过银染色
 28 柱：Superdex 75HR10/30，Amersham 20mM Tris，pH8.0/5％甘油/150mM NaCl 样品：具有已剪铡的分子的hGH-在6M脲中变性且用50mM DTT在RT下还原2小时检测：280nm级分：1ml所用体系：FPLC在0.5ml/min流速下分析：10μl的各级分在SDS-PAGE凝胶上分析，随后通过银染色
 29 柱：苯基琼脂糖FF(high sub)/丁基琼脂糖FF/苯基琼脂糖HP/辛基琼脂糖FF的HiTrap1ml柱 20mM磷酸钠，pH7.0/0.5m(NH4)2SO4 20mM磷酸钠，pH7.0 样品：具有已剪铡的分子的hGH检测：280nm级分：1ml所用体系：AKTAExplorer在1ml/min流速下
具体实施方式
根据所述的目的，本发明公开用于hGH的纯化的技术。含有重组人生长激素(hGH)基因的大肠杆菌细胞在标准条件下于1L摇瓶内生长。诱导8-10小时后，通过在4-8℃下离心15分钟收获细胞。倾去上清液且将细胞沉淀悬浮在含有20-50mM Tris，pH7.0-9.0和100-500mM NaCl的裂解缓冲液中。使用超声30分钟破碎细胞。通过将样品保持在冰上将破碎期间的温度维持在4-8℃。
将该粗溶菌产物通过在4℃下在16,000rpm下离心澄清。离心后弃去沉淀，并向澄清上清液加入咪唑以达到终浓度为20-40mM。将其加载在充填有NiSO4的螯合型琼脂糖珠的10ml柱上。该柱在5-20ml/min的流速下用含有20-50mM TrispH7.0-9.0，100-500mM NaCl，20-40mM咪唑的缓冲液平衡。用该平衡缓冲液洗涤除去未结合的物质并且当在280nm下的吸光度降低至基线后，用含有20-50mM Tris pH7.0-9.0，100-500mMNaCl，200-500mM咪唑的洗脱缓冲液进行结合蛋白的洗脱。测定洗脱中的蛋白浓度，使达到5-10mg/ml的浓度并且保持在4-10℃下进行酶消化。消化进行15-24小时并通过加入pH7-9.0的2M K2HPO4溶液终止，以得到0.2-0.4M的终浓度。将消化样品加载到苯基琼脂糖FF柱(柱体积＝15ml)上，该柱用含有20-50mMTris，0.2-0.4M K2HPO4，pH7.0-9.0的缓冲液以5-10ml/分钟的流速平衡-结合的蛋白用水洗脱并收集峰级分。将其加载在Q琼脂糖FF柱(柱体积＝10ml)上，该柱用20-50mM Tris pH7.0-9.0平衡。用15-30个柱体积线性梯度的含有0.5-2M NaCl的0％A-30％(v/v)的缓冲液“A”进行洗脱。收集含有人生长激素的在280nm下的主峰并且加入2M K2HPO4的溶液以达到0.2-0.6M的终浓度。
将此样品在不同pH、平衡缓冲液和洗脱剂条件下利用疏水作用层析进行分析。
按照本发明，提供通过使用疏水作用层析技术从hGH分子的已剪铡的部分提纯人生长激素的方法，该方法包括步骤：
a.将样品加载到存在高无机盐浓度的柱上，
b.用含水缓冲液平衡加载有样品的柱，
c.用线性梯度的含水缓冲液和有机溶剂的混合物洗脱步骤(b)的已平衡的柱，
d.收集并合并对应于hGH峰的洗脱级分，浓缩合并的级分，
e.通过在周pH6.0-9.0的磷酸氢二钠溶液平衡的Sephacryl S-200凝胶上过滤，脱盐并冷冻干燥步骤(d)的经浓缩级分，
f.得到已纯化的人生长激素。
该方法使用半纯化人生长激素作为用于纯化的样品。
所用的柱是疏水性树脂，该疏水性树脂是交连的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物树脂，具有选自由醚、异丙基、丁基、辛基和苯基组成的组中的已连接的疏水性配体。
疏水性配体优选苯基。
无机盐选自由硫酸铵，磷酸氢二钠，磷酸氢二钾或氯化钠组成的组中，优选磷酸氢二钠且最优选磷酸氢二钾。
所用无机盐浓度范围为0.2-0.6M，更优选0.3-0.4M。
用于平衡该柱的缓冲液是磷酸氢二钠和磷酸氢二钾水溶液的混和物。平衡缓冲液的pH范围是在6.0-9.0之间，优选范围为8.0-9.0。
用于洗脱蛋白的缓冲液是磷酸氢二钠或tris缓冲液和有机溶剂的混和物。
洗脱缓冲液的pH范围优选在8.0-9.0之间。
用于洗脱蛋白的有机溶剂选自由C1至C4醇，乙腈和其混和物组成的组中。
洗脱混和物中的有机溶剂范围在40-70％v/v之间，更优选40％-50％v/v。
用于层析分离的温度范围优选为20-30℃，更优选22-24℃。
将从上述疏水作用层析步骤洗脱出的生长激素峰浓缩并且进一步在Sephacryl S-200凝胶过滤柱上脱盐，该柱用pH7.0-9.0的2-10mM磷酸氢二钠平衡。收集脱盐的级分且冷冻干燥以获得纯的hGH。
已知0.5-5％乙腈无法将已剪铡的部分与重组hGH分离。(Gellerfors P等人，Acta Pediatr Scand(Suppl)(1990)370，93-100，Separation and identification of growth hormonevariants by high performance liquid chromatographytechniques。在本发明中，发现使用范围为50％±10％的乙腈首先有效分离不需要的剪铡分子，并且随后可以有效分离出纯度为＞99.5％的靶分子。pH在分离效率中起重要作用。当进行试验时，发现当pH为酸性时没有有效分离，而当pH升至高于中性时分离变得越来越有效。还发现8-9的pH范围得到最优纯化且由此得到理想品质的产物(图1，图2)。进行系列试验后可以得出pH在使用Resource苯基层析在实现已剪铡和完整hGH分子之间的拆分中确实起重要作用的结论。分离在pH8-9下最有效。降低pH至低于8.0时会极大地削弱拆分(图3)，以至在pH6.0下两种分子作为一个单峰洗脱下来。在所有层析中，位于左侧的峰对应于已剪铡的hGH而位于右侧的峰是完整hGH。
申请人尝试了多种其他技术已尝试来将已剪铡的分子与完整hGH分离，如下所述：
1.用聚合物和琼脂糖珠两者进行离子交换-使用含水缓冲液以及含水-有机溶剂和洗涤剂的混和物
2.使用不同疏水性的琼脂糖珠进行疏水作用层析
3.使用天然以及诱导变性条件的凝胶过滤层析
用于纯化的条件和结果特征详情的简单说明如下。
试验详述
离子交换层析：尝试使用Source 15Q珠的离子交换层析用氯化钠梯度洗脱使完整的分子与已剪铡的hGH分子分离。(图27)
观察：在上述层析过程中在通过SDS-PAGE凝胶分析的任意级分均没有观察到已剪铡的分子与完整hGH分离。
凝胶过滤层析-
柱：Superdex 75HR 10/30，Amersham
缓冲液：20mM Tris，pH8.0/5％甘油/150mM NaCl
样品：具有剪铡分子的hGH-在6M脲中变性且用50mM DTT在RT下还原2小时
检测：280nm
级分：1ml
所用体系：FPLC在0.5ml/min流速下
分析：10ul的各个级分在SDS-PAGE凝胶上分析，随后银染色(图28)
观察：在上述层析过程中在通过SDS-PAGE凝胶分析的任意级分中均没有观察到已剪铡的分子与完整hGH分离。
在琼脂糖珠上的疏水作用层析-(图29)
柱：苯基琼脂糖FF(high sub)/丁基琼脂糖FF/苯基琼脂糖HP/辛基琼脂糖FF的HiTrap 1ml柱
缓冲液A：20mM磷酸钠，pH7.0/0.5m(NH4)2SO4
缓冲液B：20mM磷酸钠，pH7.0
样品：具有剪铡分子的hGH
检测：280nm
级分：1ml
所用体系：AKTA Explorer在1ml/分钟流速下
观察：在上述层析过程中没有观察到已剪铡的分子与完整hGH分离。
下列实施例说明本发明但不构成对本发明范围的限定。本发明描述了其具体实施方案并且对于本领域技术人员来说某些改进和等同方案是显而易见的，它们包括在本发明的范围内。
实施例
实施例1
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图1)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度：＞99.5％，收率：85％)
实施例2
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/40％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图2)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度：＞99.5％，收率：85％)
实施例3
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/30％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子未从完整分子拆分(图3)。
实施例4
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH8.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH8.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图4)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度：＞99.5％，收率：85％)
实施例5
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH7.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH7.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析(图5)。(纯度：＞80％，收率：35％)
实施例6
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH6.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH6.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子未从完整分子拆分(图6)。
实施例7
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/50％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图7)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度：＞99.5％，收率：85％)
实施例8
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/40％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图8)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度：＞99.5％，收率：85％)
实施例9
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/30％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子未从完整分子拆分(图9)。(纯度：＞95％，收率：45％)
实施例10
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH8.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH8.0/50％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图10)。得到高纯形式的人生长激素。(纯度＞98％；收率80％)
实施例11
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH7.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH7.0/50％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图11)。(没有获得纯度)
实施例12
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH6.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH6.0/50％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图12)。(没有获得纯度)
实施例13
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/50％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图13)。得到高纯形式的人生长激素(纯度＞99％；收率85％)。
实施例14
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/40％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图14)。得到高纯形式的人生长激素(纯度＞98％；收率80％)。
实施例15
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/30％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图15)(纯度＞95％；收率60％)。
实施例16
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH8.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH8.0/50％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图16)(没有获得纯度)。
实施例17
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH7.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH7.0/50％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图17)(没有获得纯度)。
实施例18
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH6.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH6.0/50％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图18)(没有获得纯度)。
实施例19
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/25％乙腈/25％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图19)。得到高纯形式的人生长激素(纯度＞99％；收率80％)。
实施例20
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/25％乙腈/25％异丙醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图20)。得到高纯形式的人生长激素(纯度＞99％；收率85％)。
实施例21
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/25％异丙醇/25％甲醇洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图21)。得到高纯形式的人生长激素(纯度＞99％；收率85％)。
实施例22
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到Resource苯基柱(从Amersham Biosciences获得)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH9.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并按照Laemlli的方法通过SDS-PAGE分析。该凝胶在25mA下运行45分钟且此后银染色观察蛋白带(图22)。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱且从凝胶图上看到拆分。
实施例23
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Tris/0.4M K2HPO4，pH9.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Tris，pH9.0/50％乙腈洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析。该剪铡的hGH分子在完整GH分子之前洗脱(图23)。得到高纯形式的人生长激素(纯度：＞99.5％，收率：85％)。
实施例24
将ResourcePHE经纯化的蛋白级分加载在100ml床体积的Sephacryl S-200HR柱上，该柱用9mM磷酸氢二钠缓冲液，pH8.0平衡。该柱用相同的缓冲液在0.4ml/min下洗脱。收集在280nm下检测到的蛋白峰并冷冻干燥。得到纯的hGH(＞99.5％)，其收率＞95％(图24)。
实施例25
向hGH的离子交换纯化级分中加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml Resource苯基柱(30×6.4mm)上，该柱用20mM Na2HPO4/0.4M K2HPO4，pH8.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4，pH8.0洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析(图25)。没有获得剪铡分子和完整hGH分子拆分。
实施例26
向hGH的离子交换纯化级分中，加入K2HPO4至终浓度为0.4M。将其注射到1ml苯基琼脂糖FF柱上，该柱用20mMNa2HPO4/0.4M K2HPO4，pH8.0平衡。结合的蛋白用20ml线性梯度的20mM Na2HPO4/50％乙腈，pH8.0洗脱。收集1ml的级分并通过SDS-PAGE分析(图26)。没有获得剪铡分子和完整hGH分子拆分。
 权利要求书
(按照条约第19条的修改)
1.一种通过使用疏水作用层析技术从hGH分子的已剪铡的部分纯化人生长激素的方法，所述方法包括步骤：
a.加载样品到存在具有浓度范围0.2-0.5M的无机盐的柱上，
b.用具有pH范围6.0-9.0的含水缓冲液平衡步骤(a)的已加载有样品的柱，
c.用线性梯度的范围40-70％v/v的含水缓冲液和有机溶剂洗脱步骤(b)的已平衡的柱，
d.收集和合并对应于hGH峰的洗脱级分，浓缩合并的级分，
e.通过在用pH范围在6.0-9.0之间的磷酸氢二钠溶液平衡的Sephacryl S-200凝胶上过滤，脱盐并冷冻干燥步骤(d)的已浓缩的级分，和
f.获得已纯化的人生长激素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的样品为半纯化的人生长激素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的柱是疏水性树脂，该疏水性树脂含有具有已连接的选自由醚、异丙基、丁基、辛基和苯基组成的组中的疏水性配体的交联的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物树脂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该疏水性配体优选苯基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的该无机盐选自由硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或氯化钠组成的组中，优选磷酸氢二钠，且最优选磷酸氢二钾。
6.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中用于平衡该柱的含水缓冲液是磷酸氢二钠和磷酸氢二钾水溶液的混和物。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中该含水缓冲液是磷酸氢二钠或Tris缓冲液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中使用的该有机溶剂选自由C1至C4的醇，乙腈和/或其混和物组成的组中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中该线性梯度范围优选40-50％。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中该含水缓冲液和该有机溶剂的pH范围优选6.0-9.0。
11.根据权利要求1所述的方法，其中用于层析分离的温度范围优选20-30℃，更优选22-24℃。

Claims (14)

1.一种通过使用疏水作用层析技术从hGH分子的已剪铡的部分纯化人生长激素的方法，所述方法包括步骤：
a.加载样品到存在高浓度的无机盐的柱上，
b.用含水缓冲液平衡步骤(a)的已加载有样品的柱，
c.用线性梯度的含水缓冲液和有机溶剂混合物洗脱步骤(b)的已平衡的柱，
d.收集和合并对应于hGH峰的洗脱级分，浓缩合并的级分，
e.通过在用pH范围在6.0-9.0之间的磷酸氢二钠溶液平衡的Sephacryl S-200凝胶上过滤，脱盐并冷冻干燥步骤(d)的已浓缩的级分，和
f.获得已纯化的人生长激素。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的样品为半纯化的人生长激素。
3.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的柱是疏水性树脂，该疏水性树脂含有具有已连接的选自由醚、异丙基、丁基、辛基和苯基组成的组中的疏水性配体的交联的聚苯乙烯二乙烯基苯聚合物树脂。
4.根据权利要求3所述的方法，其中该疏水性配体优选苯基。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(a)中使用的该无机盐选自由硫酸铵、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾或氯化钠组成的组中，优选磷酸氢二钠，且最优选磷酸氢二钾。
6.根据权利要求1所述的方法，其中使用的盐浓度范围为0.2-0.6M，优选0.3-0.4M。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(b)中用于平衡该柱的该缓冲液是磷酸氢二钠和磷酸氢二钾水溶液的混和物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中该平衡缓冲液的pH范围在6.0-9.0之间。
9.根据权利要求8所述的方法，其中优选的pH范围在8.0-9.0之间。
10.根据权利要求1所述的方法，其中在步骤(c)中使用的用于洗脱蛋白的缓冲液是磷酸氢二钠或Tris缓冲液和有机溶剂的混合物。
11.根据权利要求10所述的方法，其中洗脱缓冲液的pH范围优选在8.0-9.0之间。
12.根据权利要求10所述的方法，其中使用的该有机溶剂选自由C1至C4的醇，乙腈和/或其混和物组成的组中。
13.根据权利要求10所述的方法，其中使用的该有机溶剂在40和70％v/v之间，优选40至50％v/v。
14.根据权利要求1所述的方法，其中用于层析分离的温度范围优选20-30℃，更优选22-24℃。
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