CN1046935A - 羧基酯酶的稳定化 - Google Patents

Abstract

羧基酯酶可因几种化合物如甲氧基甲基萘乙酯或二氯苯氧基苯氧基丙酸的作用而失活。通过置换或修饰羧基酯酶的某些碱性残基，可使该酶在应用中表现出改善了的稳定性。从而该酶有可能以工业规模，甚至在高底物浓度下完成立体特异性水解反应。

Description

本发明涉及羧基酯酶的稳定化。

美国专利4，886，750号公开了酯酶在立体选择性水解α-芳基丙酸酯中的使用。该文献中，该酶的特征在于负责水解（S）-甲氧基甲基萘乙酸酯。相应的酯酶基因是由枯草芽孢杆菌（Bacillus        subtilis）Thai1-8菌株（CBS        679.85）中得到的。已将编码负责立体选择性转化（R，S）-甲氧基甲基萘乙酸酯之酶的基因克隆到大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中。发现在几株枯草芽孢杆菌（a.O.CBS        673.86）中导入多个基因拷贝可改善酯酶活性。因而该微生物和由之得到的酶在水解S-甲氧基甲基萘乙酸酯的方法中的适用性也得到了改善。

在所说的美国专利中，只能使用低底物浓度〔甲氧基甲基萘乙酸（naproxen）或羟基甲基甲丙基苯乙酸（ibuprofen）〕。与之相反，为了获得更大的经济效益，商业应用上要求有高产物浓度。但在进行高底物浓度试验时，发现在这样高底物浓度的工业生产条件下，会使酶发生不可逆的失活。例如，当加入30g/升甲氧基甲基萘乙酸酯时（pH＝9，T＝40℃，吐温80（TM）基质），由枯草芽孢杆菌ThaiⅠ-8得到的羧基酯酶在1小时内几乎完全失活。即该酯酶在pH＝9和T＝40℃（有或没有吐温80（TM））的条件下，只稳定几个小时。在立体选择性水解（R，S）-甲氧基甲基萘乙酸酯期间，酶被水解过程中形成的甲氧基甲基萘乙酸灭活。因此不能获得高产率的甲氧基甲基萘乙酸。

该羧基酯酶可用于其他几个立体选择性酯酶水解反应中。但发现当以商业上有利的初始酯浓度进行反应时，这些反应的产物（酸）常常使酶失活。

欧洲专利申请0299559号中述及，可使用羧基酯酶立体特异性水解二氯苯氧基苯氧基丙酸酯（diclofop        esters），产生相应的对映体纯（S）-酸。在商业上有利的转化条件下，所形成的二氯苯氧基苯氧基丙酸会使酶失活。

其他可导致酶失活的化合物有2-萘氧基乙酸、羟基甲基甲丙基苯乙酸（ibuprofen）、2-萘酚和苯酚。

据文献所述，因为这些酶对热的稳定性差，所以会逐渐失去活性。在升高的温度下，该酶分子可发生伸展。特别是热处理可使氢键断裂（如参见R.D.Schmid，Advances        in        Biochemical        Engineering        12，Ghose，Fiechler        &        Blakebrough（Eds），Springer，Berlin（1979）PP.41-115）。但通过对酶的固定化或交联，可使其热伸展程度减少。例如，与戊二醛交联可改善木瓜蛋白酶（Royer        et        al，FEMS        Lett.80（1977）1）和枯草杆菌肽酶（Boudrant        et        al，Biotechnol.Bioeng.18（1976）1719）的热稳定性。

有关热稳定化的机理目前尚不清楚。E.T.Reese和M.Manders（Biotechnol.Bioeng.22（2）1980，PP.326-336）的实验表明，交联（戊二醛处理）并不能提高纤维素酶的热稳定性和活性。N.W.Ugarova（Biokhimiya42（7），1977，PP.1212-1220）也得到相似的结果，作者述及，用戊二醛修饰过氧化物酶，使其热稳定性降低2.5倍。

现有技术只提出用很特异的方法解决特定的问题（固定化和交联技术），而没有提到普遍适用的方法。另外，已注意到在正常反应条件下（至多45℃）羧基酯酶并不能被热失活，但在这些反应条件下只能被某些化合物失活。现有技术对这类失活作用无能为力。

如果知道哪个氨基酸残基可引起蛋白质失活，则可考虑另一种化学修饰方法。如Ausubel等人（Current        Protocols        in        Molecular        Biology，John        Wiley        &        Son        Inc，1987，New        York）所述，在这种情况下，可通过定点诱变用一个氨基酸残基代替另一个氨基酸残基。在该方法中，可用丝氨酸残基取代蛋氨酸残基，以改善嗜碱杆菌（B.alcalophilus）丝氨酸蛋白酶的抗氧化能力（欧洲专利申请0328229号）。

已知的稳定化技术并不能应用于羧基酯酶，因为此时失活是由相应化合物引起的，即对其失活作用的性质与其他酶不同。

本发明涉及修饰的羧基酯酶，在某些化合物如甲氧基甲基萘乙酸的存在下，其稳定性得以提高，并可用于这些化合物的立体特异性水解作用。因此，本发明提供了一种立体特异性地水解旋光活性底物的方法，该方法包括在羧基酯酶的存在下水解底物，所说的酯酶与野生型酶相比，于40℃下与15mg/ml（S）-甲氧基甲基萘乙酸接触1.5小时时，表现有提高的稳定性。可通过取代或修饰野生型羧基酯酶的至少一个碱性氨基酸残基而得到该修饰的羧基酯酶。

图1显示得自枯草芽孢杆菌Thai        Ⅰ-8（CBS679.85）之羧基酯酶基因的编码区的核苷酸顺序;

图2显示野生型羧基酯酶和几种突变羧基酯酶的活性;

-·-野生型羧基酯酶

-+-Lys        34        Glu突变型

-＊-Lys        81        Glu突变型

-X-Lys        217        Glu突变型

图3显示甲醛处理对羧基酯酶活性的影响;

-·-甲醛处理后

-+-甲醛和甲氧基甲基萘乙酸处理后

图4显示使用羧基酯酶和修饰的羧基酯酶转化甲氧基甲基萘乙酸的结果。

-·-未修饰的酶

-+-戊二酸酐修饰的

-＊-琥珀酸酐修饰的

-□-乙二醛修饰的

-×-戊二醛修饰的

-◇-甲醛修饰的

图5显示分别用羧基酯酶和修饰的羧基酯酶转化（R，S）-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯的结果。

本申请说明书中使用的术语“羧基酯酶”是指可得自芽孢杆菌菌株并能够立体特异性地水解（S）-甲氧基甲基萘乙酸的酯酶。

羧基酯酶在高至45℃的温度下是稳定的。在甲氧基甲基萘乙酸等化合物存在下，该酶将很快被失活。于40℃存在15mg/ml（S）-甲氧基甲基萘乙酸时，酶活性在1.5小时内大部分丧失。酶活性的丧失伴有酶分子的聚集。已发现这种失活或去稳定化作用并不是由于热失活，而是与甲氧基甲基萘乙酸等化合物对酶的化学作用有关。本发明是基于羧基酯酶中带正电荷的氨基酸残基参予去稳定化作用这一发现而完成的。可能是甲氧基甲基萘乙酸与酶表面上的游离氨基反应，从而使得甲氧基甲基萘乙酸的疏水部分干扰酶的折迭。如在甲氧基甲基萘乙酸存在下，增加了酶对蛋白水解作用的敏感性，便会出现这种伸展现象。经取代（蛋白质工程）或化学修饰这些碱性残基后，即可除去或转换这些氨基酸的正电荷。这样就能阻止甲氧基甲基萘乙酸与酶的结合。就这一点来说，可知只有小的和亲水性不大的化学基团能用于修饰这种酶。例如，苯甲醛对酶的稳定性就没有积极作用。另外，将带正电荷的残基改变成带正电荷但对化学修饰不大敏感的其他残基，如将赖氨酸换成精氨酸（如参见R.D.Schmid，Advances        in        Biochemical        Engineering        12，Ghose，Fiechler        &        Blakebrough（Eds），Springer，Berlin（1979），41-115）可能会提高酶的稳定性。

因此，本发明还提供了一种经过修饰的羧基酯酶，该酶是用至少含有一个能与羧基酯酶中带正电荷碱性氨基酸残基反应之基团的化合物处理野生型羧基酯酶而产生的。使用该酶可提高产物浓度和产率。用于处理羧基酯酶的化合物包括醛（一醛或二醛）如甲醛、戊二醛或乙二醛，酐如戊二酸酐或琥珀酸酐等。

加到含野生型羧基酯酶中之反应混合物中的化合物（稳定剂）的浓度一般占反应混合物的0.05-10%（V/V），优选比例为0.1-5%（V/V）。酶稳定化处理期间pH至少为7，优选pH范围为7-10。

在加入醛或酐类化合物后，基本上所有的羧基酯酶均得到稳定化。使用甲醛、单醛或酐能使酶得到稳定化这一事实表明，酶是受到了甲醛或酐的化学修饰而不是发生了分子内交联。

根据本发明的另一个方面，其提供了一种新酶，具体地说是经过修饰的羧基酯酶，它是通过表达编码所说酶的基因而得到的，它至少有一个碱性氨基酸残基不同于相应的野生型酶，并且在应用时显示出改善了的特性，已令人惊异地发现，某些赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基参予了羧基酯酶的失活。

因此，本发明提供了一种稳定化的或经过修饰的酶，特别是稳定化或修饰了的羧基酯酶，该酶是经取代相应野生型酶中的至少一个碱性氨基酸，并表达该突变型基因而产生的或借助某些化合物的作用修饰其碱性氨基酸。

在确定羧基酯酶的DNA顺序后（见实施例1），使用定点诱变技术（Ausubel        et        al.，1987，Current        Protocols        in        Molecular        Biology，John        Wiley        &        Son        Inc.，New        york）使该酯酶基因发生突变而取代其中的赖氨酸、精氨酸和组氨酸残基。以这种方法，即可用例如中性（不带电荷的）或带负电荷的氨基酸残基（如谷氨酰胺、丝氨酸或谷氨酸）取代带正电荷的碱性赖氨酸和/或精氨酸残基。也可用这种方法，由其他残基取代参予羧基酯酶去稳定化的其他残基（如组氨酸）。

经修饰的酶在工业应用如水解甲氧基甲基萘乙酸酯的生产工艺中表现有改善的功能特性。本文中所说的改善的功能特性是指因改善了稳定性，特别是相对于野生型酶来说，改善了对某些化合物的稳定性而得到高的转化性能。

“羧基酯酶”是指可得自芽孢杆菌属菌株的、能够立体特异性水解S-甲氧基甲基萘乙酸酯的酯酶。其较好是与可得自枯草芽孢杆菌菌株的酯酶基本相同或完全相同的酶，且最好是与可得自枯草芽孢杆菌Thai        I-8菌株（CBS679.85）的酯酶基本相同或完全相同的酶。与可得自枯草芽孢杆菌Thai        I-8菌株的酯酶基本相同的酶是指编码酯酶的DNA顺序（核苷酸顺序）至少与编码得自枯草芽孢杆菌Thai        I-8菌株之酯酶的DNA顺序有70%同源性。

可借用下列分析不同因素对杂合体稳定性之影响时所得到的方程式来确定我们的实验中涉及的同源性：

Tm＝81+16.6（log        10        Ci）+0.4（%G+C）-600/n-1.5（%误配）（见Ausubel等人主编的Current        Protocols        in        molecular        biology        1987-1988）

n＝最短探针链的长度

Ci＝离子强度（M）

G+C＝碱基组合

Tm＝杂交温度

假定探针长度为300碱基，我们能够确定一个300碱基或更长片段内至少显示有67%同源性的同源基因。在确定同源性百分率时，我们假定芽孢杆菌的GC含量为50%（Normore，1973，in        Laskin        and        Lechevalier（ed.），Handbook        of        Microbiology        Vol.Ⅱ，CRC        Press，Inc.Boca        Raton，Fla，）。

这就是说，本发明包括了与枯草芽孢杆菌Thai        I-8羧基酯酶至少有70%同源性的修饰的羧基酯酶。

本说明书中所列出的所有出版物和专利申请均定为本文的参考文献。

虽然为清楚说明起见，已借助举例描述和实施例详细说明了本发明的技术特征，但在不背离本发明的精神和待批权利要求之范围的前提下，本领域内普通技术人员显然可对本发明作某些改动和改进。

下列实施例旨在进一步阐述本发明。

实施例1

枯草芽孢杆菌I-85/P        NAPT-7（CBS        673.86）羧基酯酶之氨基酸顺序的测定

按下述方法测定美国专利4，886，750中所述的来源于枯草芽孢杆菌I-85/P        NAPT-7（CBS        673.86）之羧基酯酶的氨基酸顺序。用Sanger等人（Proc.Natl.Acad.Sci.USA        75（1977），5463）所述的二脱氧链终止法测定PNAPT-7之2.2HindⅢ-HindⅢ插入段的核苷酸顺序。在该顺序只能检测到一个能编码30KD蛋白质的大的开放读码区。可由该开放读码的核苷酸顺序推断出该羧基酯酶的氨基酸顺序。图1显示了该羧基酯酶的DNA编码顺序和相应的氨基酸顺序。表示氨基酸的一字母代码为：

A＝丙氨酸        L＝亮氨酸

R＝精氨酸        K＝赖氨酸

N＝天冬酰胺        M＝蛋氨酸

D＝天冬氨酸        F＝苯丙氨酸

C＝半胱氨酸        P＝脯氨酸

Q＝谷氨酰胺        S＝丝氨酸

E＝谷氨酸        T＝苏氨酸

G＝甘氨酸        W＝色氨酸

H＝组氨酸        Y＝酪氨酸

I＝异亮氨酸        V＝缬氨酸

实施例2

羧基酯酶中赖氨酸残基的突变

将编码枯草芽孢杆菌Thai        I-8（CBS        679.85）中羧基酯酶的DNA片段（来源pNAPT-2的2.0Kb        BclⅠ-Hind        Ⅲ片段，参见欧洲专利申请EP-A        233656）克隆到载体pTZ18R中。按照生产商（Pharmacia）推荐的方法制备单股DNA。按已知方法（Ausubel        et        al，上述文章）对该单股DNA进行寡核苷酸定点诱变。进行11次不同的诱变反应，从而用谷氨酰胺残基取代羧基酯酶的11个赖氨酸残基（见图1）。此外还进行第12次反应，以使11个编码不同之赖氨酸→谷氨酰胺突变的不同寡核苷酸的混合物包括在该诱变程序。按照EP-A        233656中所述的方法在大肠杆菌DHI（ATCC33849）中生产由反应1-11得到的突变酯酶（所不同的是用载体pTZ18R代替pUN121）并在（S）-甲氧基甲基萘乙酸的存在下试验其稳定性（详见实施例3）。将得自反应12的突变酶的混合物分配于微量滴定板中，并使用基于β-萘酚和固兰的比色法测定突变酯酶的残留活性，以检验其在甲氧基甲基萘乙酸存在下的稳定性。用自动移液器筛选20.000个候选突变酶。选择由12次不同的诱变反应得到的更为稳定的突变酶，并用以进一步的定性分析。

实施例3

突变羧基酯酶的稳定性

按下述方法试验实施例2中构建的突变羧基酯酶的稳定性：将9ml含0.10g（S）-甲氧基甲基萘乙酸的溶液于40℃保温15分钟，然后加入1ml含24单位羧基酯酶的溶液。终混合物的组成为10g/L甲氧基甲基萘乙酸、1mM        MOPS、20mM甘氨酸、2.4单位/ml羧基酯酶、pH8.75。加入酶溶液并混合之后，立即取出第1份50μl样品（0分钟样品）。然后于保温的0、15、30、45、60、90、120、180和240分钟各取50μl样品，并立即用含0.2%BSA的100mM        MOPS缓冲液（pH8.75）稀释至5ml。按下文“分析方法”部分所述检测这些样品中的羧基酯酶活性。

结果得到几种在甲氧基甲基萘乙酸存在下提高了稳定性的突变型酶，如其中赖氨酸34，赖氨酸81或赖氨酸217被谷氨酰胺取代的突变酶。

如所预料的，大多数构建的突变型酶均表现降低了稳定性或活性。但研究发现，对11个可能的赖氨酸于三个位置中的每一个上进行突变均可提高酶的稳定性，同时又可保留酶活性，此表明进行这种定点诱变是可行的。此外，在该实施例中只进行了以谷氨酰胺取代的突变。用其他残基取代赖氨酸也能产生好的甚至更好的效果。在这方面，基于下述原因，用精氨酸取代赖氨酸将会更为有利：

1精氨酸具有同赖氨酸一样的正电荷;

2.精氨酸ε-氨基比赖氨酸的氨基对烷基或羧基引起之修饰作用的敏感性小。

经结合使用可行的诱变方法已构建了更好的突变型酶。表1中显示了三个赖氨酸→谷氨酰胺突变型及野生型酶的失活作用动态变化情况，各数据是在按上述方法逐渐增加酶与10g/L甲氧基甲基萘乙酸的保温时间后，检测酶活性而得出的。

表1

时间（分钟）        野生型        剩余活性（%）

Lys34Glu        Lys81Glu        Lys217Glu

0        100        100        100        100

15        79        93        67        87

30        56        81        63        71

45        43        81        54        60

60        34        75        49        53

90        24        68        42        38

120        14        61        25        26

180        6        49        13        15

240        4        38        8        8

这些结果也示于图2中。

分析方法

在0.3mg/ml（S）-甲氧基甲基萘乙酸甲酯、2%Tween        80（TM）、1mg/ml        BSA（牛血清白蛋白）存在下，于25℃在0.1M        MOPS（3-〔N-吗啉代〕丙磺酸）（pH7.5）中检测羧基酯酶。所用的HPLC系统是用乙腈：0.03M磷酸盐（34∶66）（pH3.2），以1.5ml/分钟流速洗脱的反相柱（Novapak CN Radial Pak Cartridge，Waters）。发现甲酯的滞留时间为6.9分钟，甲氧基甲基萘乙酸的滞留时间为4.6分钟。1个单位定义为在下文限定的条件下，每分钟水解1×10^-6M（S）-甲氧基甲基萘乙酸甲酯所需要的酶量。

实施例4

枯草芽孢杆菌1-85/pNAPT-7和地衣芽孢杆菌T9的羧基酯酶制剂

按欧洲专利申请EP-A-233656中所述培养枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86），并按其实施例14中所述方法分离酶。冻干超滤浓缩物。干燥材料的活性约为2400单位/克。

在另一实验中，按EP-A-253455中所述方法将pNAPT-7转化到地衣芽孢杆菌T9中。该菌株为蛋白酶阴性、α-淀粉酶阴性和孢子形成阴性菌株，故有利于发酵和回收羧基酯酶。按上述相似方法得到酶并证明其具有相似的活性。可按实施例3所述分析方法测定活性。

实施例5

用甲醛修饰羧基酯酶

制备羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86）），其中含有40mg/ml冻干酶、250mM        MOPS（3-〔N-吗啉代〕丙磺酸）（pH7.5）和渐增浓度的甲醛（0.01-10%）。修饰剂的浓度为其在反应混合物中的体积百分比。将溶液于20℃下放置1小时。然后取部分样品直接测定酶活性，部分样品在45℃下与15mg/ml（S）-甲氧基甲基萘乙酸保温1.5小时，然后测定酶活性。结果如表2中所示。

剩余活性是指相对于没作化学处理者，在作某些化学处理后仍保留的活性。按照实施例3所述的分析方法测定酶活性。

表2

甲醛处理并与甲氧基

甲醛（%）        甲醛处理后的剩余        甲基萘乙酸保温后的

活性（%）        剩余活性（%）

0        100        2

0.01        105        7

0.025        99        7

0.05        100        8

0.1        95        20

0.25        93        45

0.5        87        60

1.0        64        61

2.5        47        45

5.0        36        41

10.0        11        16

结果也在图3中示出。这一结果显示未处理的酶在与甲氧基甲基萘乙酸于40℃保温1.5小时后完全失活。甲醛处理的酯酶则只有部分失活。但用1%或更高浓度甲醛处理的经修饰的酶，在与甲氧基甲基萘乙酸（15mg/ml）于40℃保温1.5小时后仍是完全稳定的。

实施例6

用甲醛修饰羧基酯酶

将含有10mg/ml冻干酶、250mM        MOPS（pH7.5）和2%甲醛的羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86））于20℃搅拌1小时。样品对100mM        MOPS（pH7.5）透析。按实施例3中所述的分析方法测定酯酶活性;剩余活性为60%。

实施例7

用戊二醛修饰羧基酯酶

将含有10mg/ml冻干酶、250mM        MOPS（pH7.5）和2%戊二醛的羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86））溶液于20℃下搅拌1小时。样品对100mM        MOPS（pH7.5）透析。按实施例3中所述分析方法测定酯酶活性;剩余活性为68%。

实施例8

用乙二醛修饰羧基酯酶

将含有20mg/ml冰干酶、250mM碳酸盐（pH9.2）和0.8%乙二醛的羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86））溶液于20℃下搅拌1小时。样品对250mM碳酸盐（pH9.2）透析。按实施例3中所述分析方法测定酯酶活性;剩余活性为45%。

实施例9

用琥珀酸酐修饰羧基酯酶

将含有10mg/ml冻干酶、0.5MMOPS（pH8.0）和0.3%琥珀酸酐的羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86））溶液于20℃搅拌1小时。按实施例3中所述的分析方法测定酯酶活性。剩余活性为62%。

实施例10

用戊二酸酐修饰羧基酯酶

将含有10mg/ml冻干酶、0.5MMOPS（pH8.0）和0.3%戊二酸酐的羧基酯酶（来源于枯草芽孢杆菌Ⅰ-85/pNAPT-7（CBS        673.86））溶液于20℃下搅拌1小时。按实施例3中所述分析方法测定酯酶活性。剩余活性为72%。

实施例11

用修饰羧基酯酶转化（R，S）-甲氧基甲基萘乙酸甲酯

将300mg（R，S）-甲氧基甲基萘乙酸甲酯加到10ml        2%TWeen        80（TM）中。将pH调到9.0。然后加入5.5单位实施例6-10中制得的经修饰的酶。滴加2.5M氢氧化銨以使pH保持在9.0。于40℃进行反应。定时用HPLC法监测转化程度，同时用未修饰的酶进行转化以作为对照。结果如图4所示，从中可以看出用修饰的酶要比用未处理的酶能达到更高的转化率。

实施例12

用戊二醛修饰的羧基酯酶转化（R，S）-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯

将750mg（R，S）-二氯苯氧基苯氧基丙酸乙酯加到25ml1%Tween        80（TM）中。将pH调至9.0，然后加入10单位修饰的酶。该修饰的酶是按实施例7所述制得的，不同的是其中只加入0.15%戊二醛。滴加0.1M        NaOH以维持pH＝9。反应温度为20℃。定时用HPLC法监测转化程度。将用未修饰酶进行的转化作为对照。结果如图5所示，从中可以看出用经过修饰的酶可比用未处理的酶达到更高的转化率。

Claims (20)

1、修饰的羧基酯酶，它与野生型羧基酯酶相比，在应用条件下可表现出改善的特性。

2、修饰的羧基酯酶，它与野生型羧基酯酶相比，当与15mg/ml（S）-甲氧基甲基萘乙酸于40℃下接触1.5小时时，表现有较高的稳定性。

3、根据权利要求1或2的修饰的羧基酯酶，其中所说的野生型羧基酯酶是由至少与图1所示DNA有70%同源性的DNA编码的，或其中所说的野生型羧基酯酶至少与枯草芽孢杆菌ThaiⅠ-8羧基酯酶有70%同源性，且其中所说的经修饰的羧基酯酶不同于所说的野生型酯酶，在于在所说的野生型羧基酯酶中至少存在一个修饰酶中没有的碱基氨基酸残基。

4、根据权利要求1-3中任一项的经修饰的羧基酯酶，其中所说的碱性氨基酸残基经用至少包含一个醛或酐基团的化合物处理野生型羧基酯酶而被改变。

5、根据权利要求4的经修饰的羧基酯酶，其中所说的化合物是醛或酐，最好是选自一组包括甲醛、戊二醛、乙二醛、戊二酸酐和琥珀酸酐的醛或酐。

6、根据权利要求1-3中任一项的经修饰的羧基酯酶，其中所说的碱性氨基酸残基被另一个氨基酸残基取代。

7、根据权利要求3或6的经修饰的羧基酯酶，其中所说的碱性氨基酸残基是赖氨酸、精氨酸或组氨酸残基。

8、根据权利要求7的经修饰的羧基酯酶，其中所说的碱性氨基酸残基是Lys        34、Lys81或Lys217。

9、根据权利要求6-8中任一项的经修饰的羧基酯酶，其中所说的碱性氨基酸残基被谷氨酰胺或精氨酸取代。

10、根据权利要求1-9中任一项的经修饰的羧基酯酶，其中所说的野生型羧基酯酶完全相同或基本上相同于可得自枯草芽孢杆菌菌株，最好是枯草芽孢杆菌ThaiⅠ-8（CBS        679.85）菌株的羧基酯酶。

11、一种稳定野生型羧基酯酶的方法，该方法包括修饰或取代野生型羧基酯酶的至少一个碱性氨基酸残基。

12、一种稳定野生型羧基酯酶的方法，该方法包括用能够中和碱性氨基酸残基的试剂处理所说的野生型酯酶。

13、根据权利要求12的方法，其中所说的试剂是醛或酐。

14、根据权利要求13的方法，其中所说的醛选自于甲醛、戊二醛和乙二醛。

15、根据权利要求13的方法，其中所说的酐是戊二酸酐或琥珀酸酐。

16、根据权利要求11-15中任一项的方法制备的修饰的羧基酯酶。

17、修饰野生型羧基酯酶以生产修饰的羧基酯酶的方法，该方法包括

修饰编码所说野生型酯酶的基因，用另一氨基酸残基的密码子取代至少一个碱性氨基酸残基的密码子，以得到修饰的基因;并且

表达所得到的修饰的基因，以产生所说的修饰的羧基酯酶。

18、按权利要求17的方法制备的经修饰的羧基酯酶。

19、进行羧基酯酶的立体特异性水解的方法，该方法包括使所说的酯与进行所说的立体特异性水解有效量的权利要求1-10，16或18中任一项的修饰的羧基酯酶接触。

20、根据权利要求19的方法，其中（R，S）-2-取代的丙酸酯，最好是甲氧基甲基萘乙酸（naproxen）、羟基甲基甲丙基苯乙酸（ibuprofen）或二氯苯氧基苯氧基丙酸（diclofop）酯被立体特异性地水解，主要产生相应的对映体（S）-酸。

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