JPH03505678A - カルボキシルエステラーゼの安定化 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 カルボキシルエステラーゼの安定化 及王立！ 本発明はカルボキシルエステラーゼの安定化に関する。

！五反延皿迷文猷 米国特許第４８８６７５０は２−了り−ルプロピオン酸エステルの立体選択的加 水分解におけるエステラーゼの使用を開示する。

この文献において、（Ｓ）−ナプロキセン（ｎａｐｒｏｘｅｎ）エステルの加水 分解に関与する該酵素が性格づけられている。対応するエステラーゼ遺伝子がバ チルス・ズブチリス・タイ　（Ｔｈａｉ）　　１−８株（ＣＢＳ　６７９．８５ ）から得られた。（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステルの立体選択的変換に関与す る酵素をコード化する遺伝子はＥ、コリ及びバチルス・ズブチリスにクローン化 された。いくつかのバチルス・ズブチリス〔例えば（ａ、ｏ、）ＣＢＳ６７３． ８６）に多重遺伝子コピーを導入することによってエステラーゼ活性が改善され ることが見い出された。従って咳微生物及びそれから導かれる酵素のＳ−ナプロ キセンエステルの加水分解プロセスへの使用の適合性も改善された。

該米国特許では低い基質濃度（ナプロキセンまたはイブプロフェン）のみが用い られている。対照的に工業的応用にあたっては経済的に魅力ある成果を得るため 高い生産物濃度が必要とされる。

しかしながら、高基を濃度（工業的条件）でのテスト中に酵素の不可逆的活性化 が見い出された０例えば、バチルス・タイＩ−８から得られたカルボキシルエス テラーゼはナプロキセンエステル３０　ｇ／ｌを加えた場合、１時間以内で殆ど 完全に不活性化された（ｐＨ＝９．７才４０℃及びツイーン８０（ＴＭ）培地） 、、このエステラーゼそのものはｐＨ−９，Ｔ−４０℃（ツイーン８０（ＴＭ） の存在下又は不存在下）で数時間安定である。（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンエステ ルの工業的プロセスで適用されるエステル濃度での立体選択的加水分解中に、加 水分解によって生じたナプロキセンによって酵素が不活性化された。従ってナプ ロキセンの高収率は得られなかった。

工業的プロセスで通用されるエステル濃度とは１０　ｇ　７１２以上のエステル 濃度を意味する。

酵素カルボキシルエステラーゼはいくつかの他の立体特異的エステラーゼ加水分 解反応に用い得る。しかしながら、エステルの工業的に興味ある出発濃度で反応 を行う場合には、これらの反応の生産物（酸）がしばしば酵素を不活性化するこ とが見い出されている。

カルボキシルエステラーゼはジクロホップ（ｄｉｃｌｏｆｏｐ）エステルの立体 特異的加水分解による対応する純粋な鏡像体（Ｓ）−酸の生成に用いることがで き、このプロセスはヨーロッパ特許公開（ＥＰ−Ａ）０２９９５５９に記述され ている。生成したジクロホップは工業的に魅力ある変換条件下で酵素を不活性化 するであろう。

該酵素を不活性化する他の化合物は例えば２−ナフトキシ酢酸、イブプロフェン 、２−ナフトール及びフェノールである。

文献によると酵素はそれらの低い熱安定性によって不活性化されることが知られ ている。高められた温度で酵素の折りたたみの展開（ｕｎｆｏｌｄｉｎｇ　、変 性、アンホールディング）が起こる。熱処理は特に水素結合の切断を引き起こす 〔例えば、Ｒ，Ｄ、　Ｓｃｔ＋ｍｉｄ。

Ａｄｖａｎｃｅｓ　ｉｎ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　 　（生化学工学の進歩）＋　２．　Ｇｈｏｓｅ、　Ｆｉｅｃｈｌｅｒ及びＢ］ａ ｋｅｔ＋ｒｏｕｇｈ　　（［）　、スプリンガー、ベルリン（１９７９）、４１ 〜１１５頁〕。しかしながら、酵素のアンホールディングは酵素の固定化または 架橋によって小さくすることができる。例えば、グルタルアルデヒドによる架橋 によってパパイン（Ｒｏｙｅｒら、ＦＥＭＳ　Ｌｅｔｔ　、　　８０　（１９７ ７）　　１）及びズブチロペプチダーゼ（Ｂｏｕｄｒａｎｔら、Ｂｉｏｔｅｃｂ ｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ。

１８　（１９７６）１７１９）の熱安定性が改善された。

実のところ熱安定化の機構はよく分っていない。Ｅ、　Ｔ、　Ｒｅｅｓｅ及びＭ 、　Ｍａｎｄｅｒｓ　（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ、　Ｂｉｏｅｎｇ、　　２２　（ ２）　　１９８０．３２６−３３６頁）は架橋（グルタルアルデヒド処理）が熱 安定性及びセルラーゼ活性の増加をもたらさないことを示し、た。同様な結果が 　Ｎ、　　Ｗ、　　Ｕｇａｒｏｖａ　　（Ｂｉｏｋｈｉｍｉｙａ　　４２　　（ ７）　　、　１　９　７　７　、１２１２−１２２０）によって見い出されてお り、グルタルアルデヒドによるバーオキンダーゼの修飾が熱安定性の２゜５倍の 減少を与えたことが報告されている。

先行技術は特定の問題に対する一般的に適用できない非常に特異的な解決策しか 提示していない。さらに、カルボキシルエステラーゼは通常の反応条件（４５℃ まで）では熱的に不活性化されず、反応条件下で一定の化合物によってのみ不活 性化される。かかる種類の不活性化について先行技術の何も記述していない。

タンパク質の不活性化の原因となるアミノ酸残基が知られている場合、化学的修 飾への別のアプローチが可能となる。その場合に、例えばＡｕ５ｕｂｅｌら［Ｃ ｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒ０ｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｉｏ− ｇｙ　（分子生物学における最近のプロトコル）、ジョン・ウィリー−アンド・ サン社、１９８７、ニューヨーク）〕によって記述された部位特異的変異によっ て該残基を別のものに置き代えることができる。このようにして例えばＢ、アル カロフィラス　（Ｂ。

ａｌｃａｌｏｐｈｉｌｕｓ＞セリンプロテアーゼの酸化抵抗がメチオニン残基を セリン残基で置き代えることによって改善された（ヨーロツパ特許出願０３２８ ２２９）。

既知の安定化技術は本酵素にそのまま通用できない。なぜなら、化学的化合物に よる不活性化が役割を演する場合不活性化の性質が異なるからである。

主所二皿！ 本発明はナプロキセン等の化合物の不存在下で高められた安定を示し、かかる化 合物の立体特異的加水分解に用い得る修飾されたカルボキシルエステラーゼに関 する。従って、本発明は光学的に活性な物質を立体特異的に加水分解する方法で あって、（Ｓ）−ナプロキセン１５ｍｇ／ｍ１と４０℃で１．５時間接触させた 場合に野性型に比べ高められた安定性を示すカルボキシルエステラーゼの存在下 に、該物質を加水分解することよりなる方法を提供する。この修飾されたカルボ キシルエステラーゼは野性型カルボキシルエステラーゼの少なくとも１つの塩基 性アミノ酸残基の位置で置換または修飾を行うことによって得ることができる。

盟皿皇里見鼠脱里 第１図はバチルス・ズブチリス・クイＩ　−８（ＣＢ　Ｓ　６７９．８５）から のカルボキシルエステラーゼの遺伝子のコード領域のヌクレオチド配列を示す。

第２図は野性型カルボキシルエステラーゼ及びいくつかの変異方ルポキシルエス テラーゼの活性を示すニー・−野性型カルボキシルエステラーゼ”　　　　Ｌｙ ｓ　３４　Ｇｌｕ　　変異体”　　　　Ｌｙｓ　８１　Ｇｌｕ　　変異体−Ｚ　 −Ｌｙｓ　２１７　Ｇｌｕ変異体第３図はカルボキシルエステラーゼの活性に対 するホルムアルデヒド処理の影響を示すニ ーｅ−ホルムアルデヒド処理後 −＋−ホルムアルデヒド及びナプロキセン処理後第４図はカルボキシルエステラ ーゼ及び修飾したカルボキシルエステラーゼを用いるナプロキセンエステルの変 換を示す。

−・−未修飾酵素 −＋−グルタルアルデヒド修飾 一＊−コハク酸無水物修飾 一口−グリオキサール修飾 −Ｘ−グルタルアルデヒド修飾 −１−ホルムアルデヒド修飾 第５図はそれぞれカルボキシルエステラーゼ及び修飾したカルボキシルエステラ ーゼを用いる（Ｒ，Ｓ）−ジクロホンプエチルエステルの変換を示す。

股立企工盪皇豆里 本出願で用いられる用語「カルボキシルエステラーゼ」はバチルス株から得られ 、立体特異的にＳ−ナプロキセンを加水分解することができるエステラーゼを指 称する。

カルボキシルエステラーゼは４５℃までの温度で安定である。

ナプロキセン等の化合物の存在下に本酵素は急速に不活性化される。本酵素は４ ０℃で（Ｓ）−ナプロキセン１５１Ｉ１ｇ／ｍ１の存在下に１．５時間以内で活 性を実質的に失う、酵素の不活性化は酵素の凝集によって伴われる。この不活性 化または不安定化は熱不活性化によるものではなく、本酵素へのナプロキセン等 の化合物の化学的作用に関与することが見い出されている０本発明はカルボキシ ルエステラーゼ中の正に荷電したアミノ酸残基が不安定化に関与するという発見 に基づいている。ナプロキセン酸が酵素表面の遊離アミノ酸と反応して、ナプロ キセン酸の疎水性張出部分が酵素の折りたたみ（ｆｏｌｄｉｎｇ）を妨害するの を可能にしているのかも知れない。このアンホールディングはナプロキセンの存 在下でのタンパク質分解に対する酵素の増加した感受性として感知される。これ らの塩基性残基を置き代える（タンパク質工学的手法に付す）か化学的に修飾す ることによって、これらのアミノ酸の正電荷を除去するかまたは逆にし得る。こ れによって酵素へのナプロキセン酸の結合が防止される。この点に関し、はんの わずかなかつあまり親水性でない化学基を用いて酵素を修飾できることが注目さ れるべきである。例えばベンズアルデヒドは本酵素の安定性について前向きの作 用（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｅｆｆｅｃｔ）を有さない。また、正に荷電した残基の 化学修飾に対する感受性がより小さい正電荷を有する他の残基への取変え、例え ばリジンのアルギニンへの置き代え〔例えばＲ，Ｄ、　Ｓｃｈｍｉｄ　、生化学 工学の進歩１２、Ｇｈｏｓｅ。

Ｆ　１ｅｃｈ　ｌｅｒ及びＢｌａｋｅｂｒｏｕｇｈ編、スブリンガー、ベルリン （１９７９）、４１−１１５つが酵素の安定化を起こさせるかも知れない。

かくのごとく、さらなる−面において本発明は野性型カルボキシルエステラーゼ を該カルボキシルエステラーゼ中の正に荷電した塩基性アミノ酸残基と反応し得 る少なくとも１つの基を有する化合物で処理することによって生産した修飾カル ボキシルエステラーゼを提供する。これによってより高い生産物濃度及びより高 い収率が可能となる。ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、グリオキサール 等のアルデヒド（モノ−もしくはジアルデヒド）及びグルタル酸無水物、コハク 酸無水物等の無水物がカルボキシルエステラーゼを処理するのに用い得る化合物 の例である。

一般に０．０５−１０Ｖ／Ｖ％（反応混合物に基づいて計算）の化合物（安定化 剤）を野性型カルボキシルエステラーゼを含有する反応混合物に加える。代表的 にはこの剤を０．１−５Ｖ／Ｖ％加える１本酵素の安定化中ｐｏは少なくともｐ Ｈ−７、代表的にはｐＨ７−１０に維持する。

アルデヒド、無水物等の化合物の添加によって実質上すべてのカルボキシルエス テラーゼが安定化されることが見い出されている。ホルムアルデヒド、モノアル デヒドまたは無水物を用いて安定化が起こる事実は酵素が分子内架橋ではなくホ ルムアルデヒドや無水物によって化学的に修飾されることを示している。

本発明のさらなる一面によれば、その酵素をコード化する遺伝子の発現によって 得ることができ、その野性型エステラーゼと存在する少なくとも１つの塩基性ア ミノ酸残基において異なり、かつ運用中改善された性質を示す新規酵素、特に修 飾カルボキシルエステラーゼが提供される。一定のリジン、アルギン（ａｒｇｉ ｎｅ）及びヒスチジン残基がカルボキシルエステラーゼの不活性化に関与するこ とが驚くべきことに見い出された。

かくして本発明は安定化されたまたは修飾された酵素、特に安定化されたまたは 修飾されたカルボキシルエステラーゼであって、対応する野性型酵素中の少なく とも１つの塩基性アミノ酸残基を置き代え、ついで該変異遺伝子を発現すること によって生産した該酵素、または該塩基性アミノ酸をある種の化学化合物の作用 によって修飾した該酵素に関する。

カルボキシルエステラーゼのＤＮＡ配列の決定（実施例１参照）後、該エステラ ーゼを部位特異的変異ＣＡｕ５ｕｂｅｌ　ら、１９８７、サン社、ニューヨーク 〕の技術で変異させることによって該エステラーゼのリジン、アルギニン及びヒ スチジン残基を置き代えることができる。この様にして例えば正に荷電した塩基 性リジン及び／またはアルギニン残基を中性（非荷電）または負に荷電した残基 （例えばグルタミン、セリンまたはグルタミン酸）によって置き代えることがで きる。同様にカルボキシルエステラーゼの不安定化に関与する他の残基（例えば ヒスチジン）を他の残基に置き代えることができる。

修飾された酵素は工業的通用中、例えばナプロキセンエステルの加水分解中改善 された性質を示す、ここに用いた改善された性質とは、対応する野性型酵素〆比 べて改善された安定性に由来する高い変換性能、及び特にある種の化学化合物に 対する改善された安定性を意味する。

ここに用いられた「カルボキシルエステラーゼ」はバチルス株から得られる、Ｓ −ナプロキセンエステルを立体特異的に加水分解し得るエステラーゼを意味する 。好ましくは、該酵素はバチルス・ズブチリス株、より好ましくはバチルス・ズ ブチリス・タイニー８株（ＣＢＳ６７９．８５）から得られるエステラーゼに実 質上等しいか、等しい。

バチルス・ズブチリス・タイＩ−８株から得られるエステラーゼに実質上等しい 、酵素とはエステラーゼをコード化するＤＮＡ配列がバチルス・ズブチリス・タ イＩ−８株からのエステラーゼをコード化するＤＮＡ配列とヌクレオチド配列に おいて少なくとも７０％の相同性を有することを意味する。

ハイブリッドの安定性に対する異なる因子の影響を分析して導かれた以下の式を 検出し得る相同性を決定するために用いた：Ｔ＋＊−８１＋１６．６　（ｌｏｇ 　１０　Ｃｉ　）　＋０．４　（％Ｇ＋Ｃ）−６００／ｎ−１，５（％不適当な 組合せ（ｍｉｓｍａｔｃｈ）ＣＡｕｓｕｂｅｌ　らによって編集された「分子生 物学における最近のプロトコル」、１９８７−１９８８）ｎ　　　プローブの最 短鎖長 Ｃｉ　　　　イオン強度（Ｍ） Ｇ＋Ｃ塩基組成 Ｔｍ　　　ハイブリッド形成温度 ３００塩基のプローブ長さを想定した場合、３００塩基以上の断片内で少なくと も６７％の相同性を示す相同遺伝子を検出することができた。相同性パーセンテ ージの決定においてはバチルスのＧＣ含量は５０％と想定した［Ｎｏｒｍｏｒｅ 　、　１９７３、Ｌａ５ｋｉｎ及びＬｅｃｈｏｖａｌｉｅｒ編、Ｈａｎｄｂｏｏ ｋ　ｏｆ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　（微生物学ハンドブック）　、ＩＩＳ、 ＣＲＣ出版社、ポカレイトン、フロリダ〕。このことはバチルス・ズブチリス・ タイＩ−８カルボキシルエステラーゼと少なくとも７０％の相同性を有する修飾 カルボキシルエステラーゼは本発明に包含されることを意味する。

この明細書に引用されたすべての刊行物及び特許出願はあたかも個々の刊行物ま たは特許出願が参考に加入されて示されているかのようにここに加入する。

以上の本発明を明瞭さと理解のため例示説明と実施例によっていくらか詳細に記 述したが、後述の請求の範囲の精神及び範囲を逸脱することなくこれにある種の 変化及び修飾を加えることができることは本発明の教示に照らし当業者に容易に 理解されよう。

以下の実施例は本発明をさらに例示する。

実施例１ バチルス・ズブチリス・１−８５／　ｐＮＡＲＴ−７（ＣＢ５６７３．８６）の カルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列の決定 米国特許４８８６７５０に記載されたバチルス・ズブチリス１−８５／　ｐＮＡ ＲＴ−７（ＣＢＳ６７３．８６）に由来するカルボキシルエステラーゼのアミノ 酸配列を以下のようにして決定したＯ３ａｎｇｅｒら（Ｐｒｏｃ、　　Ｎａｔｌ 、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７５　　（１９７７）、５４６３）によって 記述されたジデオキシ連鎖終止反応法によってＰＮＡＲＴ−７の２，２旧ｎｄＤ Ｉ−）１ｉｎｄＩＩＩ挿入断片のヌクレオチド配列を決定した。該配列内に３０ ｋＤのタンパク質をコード化し得る唯一つの大きな読取り枠を検出できた。この 読取り枠のヌクレオチド配列からこのカルボキシルエステラーゼのアミノ酸配列 が導かれた。第１図はこのカルボキシルエステラーゼのＤＮＡ＆列及び導かれた アミノ酸配列を示す。アミノ酸の１文字コードを以下の表に示すコ 八　アラニン　　　　　　　し　ロイシンＲアルギニン　　　　　　Ｋ　リジン Ｎ　アスパラギン　　　　　Ｍ　メチオニンＤ　アスパラギン酸　　　　Ｆ　フ ェニルアラニンＣシスティン　　　　　　Ｐ　プロリンＱ　グルタミン　　　　 　　Ｓ　セリンＥ　グルタミン酸　　　　　Ｔ　トレオニンＧ　グリシン　　　 　　　　Ｗ　トリプトフアンＨヒスチジン　　　　　　Ｙ　チロシン■　イソロ イシン　　　　　Ｖ　バリン実施例２ カルボキシルエステラーゼ中のりジン残基の変異バチルス・ズブチリス・タイＩ −８（ＣＢＳ６７９．８５）中のカルボキシルエステラーゼをコード化するＤＮ Ａ断片（ｐＮＡＲＴ−２に由来する２、　ＯＫｂのＢ１１Ｉ−Ｈｉ口ｄｍ断片、 Ｅ　Ｐ　−Ａ　−２３３６５６参照）をベクターｐＴＺ１８Ｒ中にクローン化し た。供給者〔ファーマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　）　］の指示に従って一本鎖 ＤＮＡを用意した。この一本！１　Ｄ　Ｎ　Ａを記述された（Ａｕｓｕｂｅｌ　 ら、前出）ようなオリゴヌクレオチド特異的突然変異誘発に服せしめた。カルボ キシルエステラーゼの１１のりジン残基をグルタミン残基で一度に１つ置き代え るために１１の異なる変異誘発反応を行った。さらに、各異なるリジン−グルタ ミン突然変異をコード化するＩＩの異なるオリゴヌクレオチドの混合物を突然変 異誘発プロトコルに含めた１２番目の反応を行った０反応】−１１からの変異エ ステラーゼをヨー・ロフパ特許公開（ＥＰ−Ａ）２３３６５６に記述されたよう にして（もっともｐＵＮ１２１の代りにベクターｐＴＺ１８Ｒを用いた）Ｅ、コ リＤＨＩ　　（ＡＴＣＣ３３８４９）中で生産させ、（Ｓ）−ナプロキセン存在 下での安定性についてテストした（実施例３に記述）。変異エステラーゼの残基 活性を決定するために、反応１２からの変異体の混合物を微量力価プレート（ｍ ｉｃｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅｓ　）に分配し、β−ナフトール及び堅牢な青 （ｆａｓｔ−ｂｌｕｅ　）に基づくカラーアッセイを用いてナプロキセンの存在 下での安定性についてテストした。２００００の候補変異体をスクリーニングす るために自動ピベフティングロボットを用いた。１２の異なる変異誘発反応に由 来するより安定な変異酵素を選択し、さらなる性格づけのために用いた。

実施例３ 変異カルボキシルエステラーゼの安定性実施例２に記載したよ・うにして構築し た変異カルボキシルエステラーゼの安定性を以下のようにしてテストした。（Ｓ ）−ナプロキセン０．１０　ｇを含有する９ｍＡの溶液を２４Ｕのカルボキシル エステラーゼを含有する１ｍ、６の添加に先立って４０℃で１５分インキュベー トした。最終的な混合物はナプロキセン１０ｇ／ｊ！、ＭＯＰ３１ｍＭ、グリシ ン２０ｍＭ、カルボキシルエステラーゼ２、４　ＬＪ　／　ｍρ、ｐＨ８，７５ であった。酵素溶液の添加及び混合の直後に第１回目の５０μｌのサンプルを採 取した（０分サンプル）。

０１１５．３０．４５．６０．９０．１２０．１８０及び２４０分のインキュベ ーション時点で５０μβずつのサンプルを採取し、Ｂ　Ｓ　Ａ　０．２％を含有 する１　００ｍＭＭ０　Ｐ　Ｓ緩衝液ｐ）１８．７５で直ちに５ｍｌに希釈した 。これらのサンプル中のカルボキシルエステラーゼ活性を以下に示すごとき「分 析方法」に従ってアッセイした。

ナプロキセンの存在下で増加した安定性を有するいくつかの変異酵素、例えばリ ジン３４、リジン８１またはりジン２１７がグルタミンによって置き代えられた 変異体が得られた。

構築した変異体の大部分は予想された如く減少した安定性または減少した活性を 示した。しかしながら、１１の可能なリジンから３つの位置の各々の変異が酵素 の活性を保持しつつ増加した安定性を生じさせることができるという観察は部位 特異的突然変異誘発の可能性を示している。さらに、この実験ではグルタミンへ の変異体のみを構築した。リジンの他の残基による置き代えも良好なまたはより 良好な結果を与えることができた。この点に関し、リジンのアルギニンによる置 き代えが以下の理由から好ましい。

１、　アルギニンはリジンと同じ正の電荷を有する。

２、　アルギニンのε−７ミノ基はリジンのそれよりアルキルくはカルホキノル 基による修飾を受けにくい。

現在利用し得る変異体に基づいて組合せによってより良い変異体を構築すること も可能である。上述したナプロキセン１０ｇ／ｌと共の該酵素のインキュベーシ ョンの増加する期間後の酵素活性をアッセイすることによって決定した不活性化 プロフィールを３つのりジン−グルタミン変異体及び野性型酵素について第１表 に示す。

第１表 ２４０　　　４　　　３８　　　８　　　Ｂこれらの結果を第２図にも表す。

芳丘直魚 カルボキシルエステラーゼは０．１Ｍ　　ＭＯＰＳ　（３−　（Ｎ−モルホリノ 〕プロパンスルホンＭ）ｐＨ７．５中２５℃で（Ｓ）−ナプロキセンメチルエス テル０．　３　ｍｌ１ｇ／　ｍ　ｊ！　、、ツイーン８０　（ＴＭ）２％、ＢＳ Ａ　（ウシ血清アルブミン）ｌＩＩＩｇ／ｍｊ！の存在下にアッセイする．用い たＨＰＬＣ系はアセトニトリル：０．０３Ｎリン酸塩（３　４　：　６　６）　 ｐＨ３．２、流量１．　５　ｍ　！！　／ａ＋ｉｎで溶出した逆相カラム（Ｗａ ｔｅｒｓからのＮｏｖａｐａｋ　ＣＮ　Ｒａｄｉａｌ　Ｐａｋカートリッジ）で ある。

見い出された保持時間はメチルエステルについて６．９分、ナプロキセンについ て４．６分であった。１単位（Ｕ）は下記条件下で１分間にＩ　Ｘ　１　０−’ ｍｏｌの（Ｓ）−ナプロキセンメチルエステルを加水分解する酵素の量として定 義される。

実施例４ バチルス・ズブチリス１−８　５／　ｐＮＡＰＴ−７及びバチルス・リケニホル ミスＴ９からのカルボキシルエステラーゼの製造ヨーロッパ特許出願ＥＰ−Ａ− ２３３６５６に記述したようにしてバチルス・ズブチリスＩ−８　５／　ｐＮＡ ＰＴ−７　（ＣＢＳ６７３、８６）を増殖させた．該出願の実施例１４と同様に して該酵素を単離した．限外濾過濃縮物を凍結乾燥した．該乾燥物の活性は約２ ４０ＯＬＩ／ｇであワた。

別の実験ではＥＰ”Ａ−２　５　ｓ　４　ｓ　ｓに記述されたプロトコルを用い てｐＮＡＰＴ−７をバチルス・リケニホルミス１゛９中に形質転換した。プロテ アーゼ陰性、αーアミラーゼ陰性及．び胞子形成陰性であるこの菌株はカルボキ シルエステラーゼの醗酵及び回収に有利である．該酵素はバチルス・ズブチリス １　　８５／ｐＮＡＰＴ−７からのエステラーゼとして同様に得られ、同様の活 性を示した．活性は実施例３の「分析方法ｊに従って決定した。

実施例５ ホルムアルデヒドによるカルボキシルエステラーゼの修飾凍結乾燥酵素４０ｍｇ ／ｍｆｆｉ、ＭＯＰＳ　（３−　（Ｎ−モルホリノ〕プロパンスルホン酸）２５ ０＋ｏＭ、ＰＨ７．５及び増加する濃度（０．０１−　１．　０％）のホルムア ルデヒドを含有するカルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８５ ／　ｐＮＡＰＴ−７　（ＣＢＳ６７３、８６）由来）溶液を潴製した。該修飾剤 の濃度は反応混合物のｖ　／　ｖ％として与えた。溶液を２０℃で１時間放置し た。ついで該サンプルの一部を直接酵素活性測定に用い、また該サンプルの一部 を酵素活性測定に先立って（Ｓ）−ナプロキセン１５ｍｇ／ｍ１と共に４０℃で １．５時間まずインキエベートした。結果を第２表に示す。

残存活性は一定の化学処理後に残存する活性であって化学処理なしの活性に相対 させた活性を意味する．該活性は実施例３の「分析方法ｊに従って測定する。

第２表 ０、０１　　　　　　　　　１０５　　　　　　　　　　　　　７０、０２５　 　　　　　　　９９　　　　　　　　　　　　　７０、０５　　　　　　　　１ ００　　　　　　　　　　　　　８０、１　　　　　　　　　　９５　　　　　 　　　　　　　２００、２５　　　　　　　　　９３　　　　　　　　　　　　 ４５０、５　　　　　　　　　８７　　　　　　　　　　　　６０１、０　　　 　　　　　　６４　　　　　　　　　　　　６１２、５　　　　　　　　　４７ 　　　　　　　　　　　　４５５、０３６４１ １０、０　　　　　　　　　１１　　　　　　　　　　　　１にの結果は第３図 にも示す．未処理酵素はナプロキセンと共の４０℃で１．５時間のインキュベー う・四ンで完全に不活性化されることが分る．エステラーゼのホルムアルデヒド 処理により活性の部分的損失が起こる．しかしながら、１％以上のホルムアルデ ヒド濃度で処理した修飾酵素はナプロキセン（　１　５ｍｇ／ｍ　１　）と共の ４０℃で１．５時間のインキュベーションで完全に安定である。

実施例６ カルボキシルエステラーゼのホルムアルデヒドによる修飾凍結乾燥酵素１０ｍｇ ／ｍｎ、ＭＯＰＳ２５０ｗ＋Ｍ、ｐｉ（７．５及びホルムアルデヒド２％を含有 するカルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８　５／ｐＮＡＰＴ −７　　（ＣＢＳ６　７３．８　６））溶液を２０℃で１時間攪拌した。該サン プルをＭＯＰＳｐＨ７，５１００１に対して透析した。実施例３の「分析方法」 に従ってエステラーゼ活性を測定した。残存活性は６０％であった。

実施例７ グルタルアルデヒドによるカルボキシルエステラーゼの修飾凍結乾燥酵素１０ｍ ｇ／ｍ１、ＭＯＰ３２５０ｍＭ、ｐＨ７，５及びグルタルアルデヒド２％を含有 するカルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８５／　ｐＮＡＰＴ −７（ＣＢＳ６７３．８６）に由来）溶液を２０℃で１時間攪拌した。該サンプ ルをＭＯＰ３１００ｍＭ、ｐＨ７，５に対して透析した。実施例３の「分析方法 」に従ってエステラーゼ活性を測定したところ残存活性は６８％であった。

実施例日 グリオキサールによるカルボキシルエステラーゼの修飾凍結乾燥酵素２０ｍｇ／ ｍｊ！、炭酸塩２５０＋ｎＭＳｐＨ９，２及びグリオキサール０．８％を含有す るカルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８５／　ｐＮＡＰＴ− ７（ＣＢＳ６７３．８６）に由来）溶液を２０℃で１時間攪拌した。該サンプル を炭酸塩２５０ｍＭ、ｐ）１９．２に対して透析した。実施例３の「分析方法」 に従って、該物質のエステラーゼ活性を測定したところ、残存活性は４５％であ った。

実施例９ コハク酸無水物によるカルボキシルエステラーゼの修飾凍結乾燥酵素１０ｍｇ／ ｍｌＸＭＯＰ３０．５Ｍ、ｐＨ８゜０及びコハク酸無水物Ｏ１３％を含有するカ ルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８５／　ｐＮＡＰＴ−７（ ＣＢＳ６７３．８６）に由来）溶液を２０℃で１時間攪拌した。実施例３の「分 析方法」に従ってエステラーゼ活性を測定したところ、残存活性は６２％であっ た。

実施例１０ グルタル酸無水物によるカルボキシルエステラーゼの修飾凍結乾燥酵素１０ｍｇ ／ｍ！２、ＭＯＰ３０．５Ｍ、ｐＨ８，０及びグルタル酸無水物０．３％を含有 するカルボキシルエステラーゼ（バチルス・ズブチリス１−８５／　ｐＮＡＲＴ −７（ＣＢＳ６７３．８６）に由来）溶液を２０℃で１時間撹拌した。実施例３ の「分析方法」に従ってエステラーゼ活性を測定したところ、残存活性は７２％ であった。

実施例１１ 修飾カルボキシルエステラーゼを用いる（Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンメチルエステ ルの変換 （Ｒ，Ｓ）−ナプロキセンメチルエステル３００ｍｇを２％ツイーン８０　　（ ＴＭ）１０ｍｌ１に加えた。ｐＨを９．０に調節した。ついで実施例６−１０に 記述した如くして調製した修飾酵素５．５Ｕを加えた。２．５Ｍ水酸化ア〉′モ ニウムを用いる滴定によってｐＨを９．０に維持した。反応を４０℃で行った。

その間ＨＰＬＣによって変換の程度を追跡した。未修飾酵素を用いる変換を基準 として用いた。第４図に示した結果は修飾酵素が未処理酵素よりはるかに高い変 換を達成することを示している。

実施例１２ 一グルタルアルデヒド修飾カルボキシルエステラーゼを用いる（Ｒ，Ｓ）−ジク ロホップエチルエステルの変換（Ｒ，Ｓ）−ジクロホップエチルエステル７５０ ｍｇを１％ツイーン８０　　（ＴＭ）２５ｍｌに加えた。ｐＨを９．０に調節し た。つ、いで修飾酵素１０Ｕを加えた。修飾酵素はわずか０．１５％のグルタル アルデヒドを加えた以外実施例７に記載されたようにして得た。

０、１　Ｍ　ＮａＯＨを用いる滴定によってｐＩ（を９．０に維持した。温度は ２０℃であった。その間ＨＰＬＣによって変換の程度を追跡した。

未修飾酵素を用いる変換を基準として用いた。第５図に示した結果は修飾酵素が 未処理酵素よりはるかに高い変換を達成することを示している。

活　　性　　％ 時間（分）　　　　　Ｆｉｇ、　’１ ＋／Ｉ、Ａア７．Ｔ、い、、、　　　　　　Ｆｉｇ、３国際：Ａ査報告 Ｉｍｘａ＋ｍｍムｓ＋ｉ＆ｕ＋ｍｓｍ　ＰＣＴ／ＮＬ　９０１０００！、Ｒ国際 調査報告

Claims (20)

【特許請求の範囲】
1. １．野性型カルボキシルエステラーゼに関して修飾された修飾カルボキシルエス テラーゼであって、立体特異的エステラーゼが加水分解反応において工業的プロ セスで適用されるエステル濃度で野性型カルボキシルエステラーゼに比較して改 善された安定性を示す修飾カルボキシルエステラーゼ。
2. ２．野性型カルボキシルエステラーゼに関して修飾された修飾カルボキシルエス テラーゼであって、（Ｓ）−ナプロキセン１５ｍｇ／ｍｌと４０℃で１．５時間 接触させた場合、野性型カルボキシルエステラーゼに比べて高められた安定性を 示す修飾カルボキシルエステラーゼ。
3. ３．野性型カルボキシルエステラーゼが第１図のＤＮＡに少なくとも７０％相同 なＤＮＡによってコード化されているか、または野性型カルボキシルエステラー ゼがバチルス・ズブチリス・タイ１−８カルボキシルエステラーゼに少なくとも ７０％相同であり、また修飾カルボキシルエステラーゼが野性型カルボキシルエ ステラーゼ中に存在する少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基において野性型エ ステラーゼと異なる請求の範囲１または２の修飾カルボキシルエステラーゼ。
4. ４．塩基性アミノ酸残基が野性型カルボキシルエステラーゼを少なくとも１つの アルデヒド基または無水物基を有する化合物で処理することによって改変されて いる請求の範囲１−３のいずれか１つの修飾カルボキシルエステラーゼ。
5. ５．該化合物が好ましくはホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、ダリオキサ −ル、グルタル酸無水物及びコハク酸無水物よりなる群から選ばれるアルデヒド または無水物である請求の範囲４の修飾カルボキシルエステラーゼ。
6. ６．塩基性アミノ酸残基が別のアミノ酸残基によって置き代えられている請求の 範囲１−３のいずれか１つの修飾カルボキシルエステラーゼ。
7. ７．塩基性アミノ酸残基がリジン、アルギニンまたはヒスチジン残基である請求 の範囲３または６の修飾カルボキシルエステラーゼ。
8. ８．塩基性アミノ酸残基がＬｙｓ３４、Ｌｙｓ８１またはＬｙｓ２１７である請 求の範囲了の修飾カルボキシルエステラーゼ。
9. ９．塩基性アミノ酸残基がグルタミンまたはアルギニンによって置き代えられて いる請求の範囲６−８のいずれか１つの修飾カルボキシルエステラーゼ。
10. １０．野性型カルボキシルエステラーゼがバチルス・ズブチリス株、好ましくは バチルス・ズブチリス・タイ１−８（ＣＢＳ６７９．８５）株から得られるカル ボキシルエステラーゼに等しいか実質上等しい請求の範囲１−９のいずれか１つ の修飾カルボキシルエステラーゼ。
11. １１．野性型カルボキシルエステラーゼの少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基 を修飾するか置き代えることを特徴とする野性型カルボキシルエステラーゼを安 定化する方法。
12. １２．野性型エステラーゼを塩基性アミノ酸残基を中和し得る試薬で処理するこ とを特徴とする野性型カルボキシルエステラーゼを安定化する方法。
13. １３．試薬がアルデヒドまたは無水物である請求の範囲１２の方法。
14. １４．アルデヒドがホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド及びグリオキサ−ル よりなる群から選ばれる請求の範囲１３の方法。
15. １５．無水物がグルタル酸無水物またはコハク酸無水物である請求の範囲１３の 方法。
16. １６．請求の範囲１１−１５のいずれか１つの方法によって製造した修飾カルボ キシルエステラーゼ。
17. １７．野性型カルボキシルエステラーぜに関して修飾されたカルボキシルエステ ラーゼを生産する方法であって、該野性型エステラーゼをコード化する遺伝子を 修飾して少なくとも１つの塩基性アミノ酸残基についてのコドンを別のアミノ酸 残基についてのコドンと置き代えて修飾された遺伝子を得、ついで 得られた修飾遺伝子を発現させて該修飾カルボキシルエステラーゼを生産するこ とよりなる方法。
18. １８．請求の範囲１７の方法によって製造された修飾カルボキシルエステラーゼ 。
19. １９．カルボキシルエステラーゼを用いて立体特異的加水分解を行う方法であっ て、該立体特異的加水分解を起こすのに有効な量の請求の範囲１−１０、１６ま たは１８のいずれか１つの修飾カルボキシルエステラーゼとエステルとを接触さ せることよりなる方法。
20. ２０．（Ｒ，Ｓ）−２−置換プロピオン酸エステル、好ましくはナプロキセン、 イブプロフェンもしくはジクロホップエステルを立体特異的に加水分解して対応 する鏡像体（Ｓ）−酸を主として与える請求の範囲１９の方法。