JP6362276B2 - 変異型アミノ酸オキシダーゼおよびアミン化合物のラセミ体のデラセミ化方法 - Google Patents

Description

本発明は、アミノ酸以外のアミン化合物を基質とすることができる新規の変異型アミノ酸オキシダーゼ、および、当該変異型アミノ酸オキシダーゼを用いたアミン化合物のデラセミ化方法、および、当該デラセミ化方法を利用して光学活性アミン化合物を製造する方法に関するものである。

光学活性アミンは、特に医薬・農薬品の合成のための貴重な合成中間体である。しかし、通常の化学的方法により光学活性アミンを製造する場合には、ラセミ体から必要な光学活性体を光学分割するか、高価な光学活性触媒を使う必要があり、製造コストが高いという問題や、目的化合物の光学純度や収率が比較的低いという問題がある。そこで、近年、得られる化合物の光学純度が高いといった理由などから、酵素を用いて光学活性アミンを製造する方法が開発されている。

酵素を用いた光学活性アミンの製造方法としては、例えば、ケトンの還元的アミノ基付加反応、速度論的光学分割法、デラセミ化法などが知られている。ケトンの還元的アミノ基付加反応は、ケトンを基質としてトランスアミナーゼやアミンデヒドロゲナーゼを用いてキラルアミンを得る方法である（非特許文献１〜４）。速度論的光学分割法としては、ラセミ体アミン誘導体の一方のエナンチオマーのみに作用するＣａｎｄｉｄａ ａｎｔａｒｃｔｉｃａ由来またはＢｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｐｌａｎｔａｒｉｉ由来のリパーゼを用いる方法や、リパーゼの使用と金属触媒Ｐｄ／Ｃを用いる転移水素化による未反応のアミンのラセミ化とを組み合わせる方法が知られている（特許文献１，非特許文献５）。デラセミ化法は、酵素を用いて酸化−還元反応を周期的に繰り返すことによって、一方のエナンチオマーを他方に立体反転させることにより理論収率１００％で目的の光学活性アミンを合成することができる方法である。

製造効率の良いデラセミ化法としては、例えば、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のモノアミンオキシダーゼの第３３６番目のアスパラギンがセリンに変換されたＳ立体選択的変異型酵素や、Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｘｙｄａｎｓ ＩＨ−３５Ａ由来アミンオキシダーゼを非選択的還元剤と組み合わせて使用して、（Ｒ）−アミン化合物を合成する方法が知られている（特許文献２，非特許文献６〜７）。

国際公開第２００３／０３５８７８号パンフレット 特開２０１０−１７８７４７号公報

Biotechnol．Bioeng．73：179-187（2001） Chimia 53：584-589（1999） Biotechnol．Bioeng．65：206-211（1999） Angew．Chem．Int．Ed．51：3969-3972（2012） Chimia 50：668-669（1996） J．Am．Chem．Soc．128：2224-2225（2006） Can．J．Chem．90：39-45（2012）

ところで、アミノ酸のアミノ基を酸化する反応は生体内におけるアミノ酸の異化などにおける重要なものであり、この反応を触媒する微生物、植物、動物由来のアミノ酸オキシダーゼとしては様々な報告がある。しかし、これら酵素はアミノ酸を基質とするものであり、天然のアミノ酸オキシダーゼがアミノ酸以外のアミノ化合物を基質とするとの報告はない。

また、最近、上述したとおり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ由来のモノアミンオキシダーゼを改変することでＳ立体選択的にアミンを酸化して（Ｒ）−アミン化合物を得たとの報告はある。しかし、Ｒ立体選択的にアミン化合物を酸化する酵素は報告されていない。

従って、従来の酵素は立体選択性が低かったり（Ｒ）−アミン化合物を基質にできないといった理由から、例えばラセミ体であるアミン化合物のＲ体を酵素により選択的に酸化することにより高純度の（Ｓ）−アミン化合物を得ることはできなかった。

そこで本発明は、アミノ酸以外の（Ｒ）−アミン化合物を基質とすることができる新規な変異型アミノ酸オキシダーゼを提供することを目的とする。また、本発明は、当該アミノ酸オキシダーゼを用いたアミン化合物のデラセミ化方法、および、当該デラセミ化方法を利用して光学活性アミン化合物を製造する方法を提供することも目的とする。

本発明者らは、上記目的を達成するため鋭意検討した。その結果、ブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼが特定の（Ｒ）−アミン化合物を基質とすることができ、また、当該酵素の特定アミノ酸を変換することにより（Ｒ）−アミン化合物に対する活性がさらに向上することを見出して、本発明を完成した。

本発明を以下に示す。

［１］ 下記（１）〜（３）の何れかの変異型アミノ酸オキシダーゼ。

（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第２２８番目のアミノ酸がチロシンまたはロイシンに置換され、第２８３番目のアルギニンがグリシン、アラニンまたはシステインに置換されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；
（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼであり、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；または
（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ（ただし、該変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において上記第２２８および２８３番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。

本発明において、「Ｃ_6-12アリール基」とは、炭素数が６以上、１２以下の芳香族炭化水素基をいう。例えば、フェニル基、インデニル基、ナフチル基、ジフェニル基を挙げることができる。これらのうち、フェニル基が好ましい。

「ヘテロアリール基」は、窒素原子、酸素原子または硫黄原子等のヘテロ原子を少なくとも１個有する５員環芳香族ヘテロシクリル基、６員環芳香族ヘテロシクリル基または縮合環芳香族ヘテロシクリル基を意味する。「ヘテロアリール基」としては、ピロリル基、イミダゾリル基、ピラゾリル基、チエニル基、フリル基、オキサゾリル基、イソキサゾリル基、チアゾリル基、イソチアゾリル基、チアジアゾール基等の５員環ヘテロアリール基；ピリジニル基、ピラジニル基、ピリミジニル基、ピリダジニル基等の６員環ヘテロアリール基；ベンゾフラニル基、インドリル基、クロメニル基、キノリニル基、イソキノリニル基等の縮合環ヘテロアリール基が含まれる。

「Ｃ_1-6アルキル基」とは、炭素数が１以上、６以下の直鎖状または分岐鎖状の一価脂肪族飽和炭化水素基をいう。例えば、メチル基、エチル基、ｎ−プロピル基、イソプロピル基、ｎ−ブチル基、イソブチル基、ｓ−ブチル基、ｔ−ブチル基、ｎ−ペンチル基、ｎ−ヘキシル基等を挙げることができる。これらのうち、Ｃ_1-4アルキル基が好ましく、Ｃ_1-2アルキル基がより好ましく、メチル基が特に好ましい。

「ハロゲン原子基」にはフッ素原子基、塩素原子基、臭素原子基およびヨウ素原子基が含まれ、より好ましくはフッ素原子基または塩素原子基、最も好ましくはフッ素原子基である。

Ｃ_6-12アリール基またはヘテロアリール基が置換基を有する場合、置換基数は特に制限されないが、例えば、１個以上、５個以下とすることができ、１個以上、３個以下が好ましく、１個または２個がより好ましい。また、置換基数が２以上である場合、置換基は互いに同一であってもよく、異なっていてもよい。

［２］ 変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）において、第２２８番目のアミノ酸がロイシンであり、第２８３番目のアルギニンがグリシンである上記［１］に記載の変異型アミノ酸オキシダーゼ。かかる変異型アミノ酸オキシダーゼが、最も（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性が高く、好適である。

［３］ 基質となる（Ｒ）−アミン化合物が下記式（Ｉ）で表されるものである上記［１］または［２］に記載の変異型アミノ酸オキシダーゼ。本発明に係るアミノ酸オキシダーゼは、特に、下記式（Ｉ）で表される（Ｒ）−アミン化合物を基質とすることができ、効率的に酸化することができる。

［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
［４］ 上記［１］〜［３］の何れかに記載の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードすることを特徴とする核酸。かかる核酸は、本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素の製造に有用である。

［５］ 上記［４］に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。かかる形質転換体は、本発明に係るＬ−トリプトファン脱水素酵素の製造に有用である。

［６］ 下記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物ラセミ体をデラセミ化する方法であって、

［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
上記アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に上記変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物を下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン化合物とする工程を含むことを特徴とする方法。

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
［７］ さらに、還元剤を作用させることにより上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）とする工程を含む上記［６］に記載の方法。かかる工程を行うことにより、上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に戻すことができる。また、当該アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）は、本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼにより、イミン化合物（ＩＩＩ）に変換される。これら工程を繰返すことにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）を実質的に（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）へデラセミ化することができる。なお、これら工程は交互に繰返してもよいし、または、反応液中に本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼと還元剤を添加することにより同時並行して実施してもよい。

［８］ 下記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物ラセミ体から下記式（ＩＶ）で表される（Ｓ）−アミン化合物を製造する方法であって、

［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
上記アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に上記変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物を下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン化合物とする工程、および、

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
さらに、還元剤を作用させることにより上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）とする工程を含むことを特徴とする方法。

本発明に係る新規の変異型アミノ酸オキシダーゼは、特定の（Ｒ）−アミン化合物を高い特異性で基質とすることができ、イミン化合物へ選択的に変換することができる上に、熱安定性が高い。また、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを用いて、アミン化合物のラセミ体をデラセミ化することができ、ラセミ体からＳ体を得ることが可能になる。

野生型アミノ酸オキシダーゼの特定位置に変異を導入した変異型酵素の（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンに対する基質特異性を試験した結果を示すグラフである。 本発明に係る変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを精製したもののＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真である。 本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼの比活性と温度の関係を示すグラフである。 本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼの熱安定性を試験した結果を示すグラフである。 （ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンに本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させた場合の経時的変化を試験した結果である。●は（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンの濃度を示し、○は（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンの濃度を示す。 （ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンに本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼと還元剤を作用させた場合の経時的変化を試験した結果である。●は（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンの濃度を示し、○は（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンの濃度を示す。

以下、先ず、本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼにつき説明する。

本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼは、上記（１）〜（３）の何れかのものである。

（１）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第２２８番目のアミノ酸がチロシンまたはロイシンであり、第２８３番目のアルギニンがグリシン、アラニンまたはシステインに置換されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；
（２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第２２８および２８３番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼであり、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；または
（３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ（ただし、該変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において上記第２２８および２８３番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。

上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）は、ブタ腎臓から単離された野生型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１）において、第２８３番目のアルギニンをグリシン、アラニンまたはシステインに置換し、また、第２２８番目のチロシンはそのままにするか或いはロイシンに置換したものである。

変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）は、後記の実施例において確かめられている通り、野生型アミノ酸オキシダーゼの基質である（Ｒ）−アミノ酸（Ｄ−アミノ酸）を基質としない一方で、特定の（Ｒ）−アミン化合物を高い特異性で基質とすることができ、イミン化合物へ選択的に変換することができる上に、熱安定性が高い。

本発明において酵素が「（特定の）アミノ酸配列を有する」とは、その酵素のアミノ酸配列が特定されたアミノ酸配列を含んでいればよく、且つ、その酵素の機能が維持されていることを意味する。その酵素において特定されたアミノ酸配列以外の配列としては、ヒスチジンタグや固定化のためのリンカー配列の他、−Ｓ−Ｓ−結合などの架橋構造などが挙げられる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼ（２）において、「第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸を除く領域」とは、変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）のアミノ酸配列中、第１〜２２７番目、第２２９〜２８２番目および第２８４番目以降の領域をいう。

また、「１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列」における「１から数個」の範囲は、欠失等を有するアミノ酸オキシダーゼが、（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する限り特に限定されるものではない。前記「１から数個」の範囲は、（Ｒ）−アミン化合物に対する高い酸化活性を有するアミノ酸オキシダーゼである可能性が高いことから、例えば、１個以上、３０個以下とすることができ、好ましくは１個以上、２０個以下、より好ましくは１個以上、１０個以下、さらに好ましくは１個以上、７個以下、一層好ましくは１個以上、５個以下、特に好ましくは１個以上、３個以下、１個以上、２個以下、または１個程度とすることができる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼ（３）において、「上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して少なくとも９５％の配列同一性を有するアミノ酸配列」における「配列同一性」は、当該アミノ酸配列の同一性を有するアミノ酸オキシダーゼが、（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する酵素である限り、特に限定されない。前記アミノ酸配列の配列同一性は９５％以上であれば特に限定されないが、好ましくは９６％以上、より好ましくは９７％以上、さらに好ましくは９８％以上、さらに好ましくは９９％以上、特に好ましくは９９．５％以上である。本発明において「配列同一性」という語は、２以上のアミノ酸配列の互いに対するアミノ酸の同一性の程度を指す。従って、ある二つのアミノ酸配列の同一性が高い程、それらの配列の同一性ないし類似性は高い。２種類のアミノ酸配列が同一性を有するか否かは、配列の直接の比較によって解析することが可能であり、具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて解析することができる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼ（３）において、「ただし、該変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において上記第２２８および２８３番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする」における「変異」とは、具体的にはアミノ酸の欠失または置換を意味する。つまり、上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（３）のアミノ酸配列において、配列同一性の判断の基準となる上記（１）の変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列における第２２８および２８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸が、上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）のアミノ酸配列における第２２８および２８３番目のアミノ酸と同一であることを意味する。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼ（３）において、配列同一性の判断の基準となる上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）のアミノ酸配列における第２２８および２８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸は、上述した配列同一性ないし相同性の解析により調べることができる。具体的には、市販の配列解析ソフトウェア等を用いて、配列番号１に示されるアミノ酸配列または上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）のアミノ酸配列に対して解析対象のアミノ酸配列のアライメント解析を行えば、上記第２２８および２８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸を検索することが可能である。このようなアライメント解析の手法は当業者に広く知られている。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼ（２）または（３）において、「（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する」とは、何れかの（Ｒ）−アミン化合物に対して、特に（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）の範囲に含まれる少なくとも何れか１つの化合物に対して、対象となる変異型アミノ酸オキシダーゼが酸化活性を示すことをいう。当該試験の具体的な条件は、後記の実施例を参照すればよい。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼは、上記（１）から（３）に規定される範囲に属するものである限りその由来は特に限定されるものではない。例えば、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼは、各種遺伝子工学的技術により製造した組換えタンパク質であってもよいし、化学合成により製造した合成タンパク質であってもよく、或いは配列番号１に示されるアミノ酸配列からなる変異型アミノ酸オキシダーゼの遺伝子ホモログを有する特定の生物種（例えば、細菌）に変異原を与えることにより本発明の変異型酵素を産生し得る変異体を獲得して、該変異体が産生するタンパク質を抽出および精製することによって製造したタンパク質であってもよい。

遺伝子工学技術により本発明の組換えタンパク質を製造する場合には、上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）〜（３）の何れかをコードする核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を作製し、各種発現ベクターに組み込むことにより、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを発現させることができる。本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を作製するに当たり、配列番号１に示されるアミノ酸配列における第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸または該アミノ酸に相応するアミノ酸を上記（１）に記載の所定のアミノ酸に置換するため、或いは上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（２）のアミノ酸配列においてアミノ酸の欠失、置換および／または付加を施すため、或いは上記変異型アミノ酸オキシダーゼ（３）のアミノ酸配列において配列番号１のアミノ酸配列と所定の同一性を有するタンパク質をコードする核酸を準備するためには、例えば、エラープローンＰＣＲ法、ＤＮＡシャッフリング法、各種部位特異的変異導入法などにより、任意の塩基の欠失、置換および／または挿入を行うことができる。このようにして作製した本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を適当な発現系に導入することにより、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを製造することができる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを製造するために利用可能な発現系としては、特に限定させるものではないが、例えば各種生物種（ホスト）において組換えタンパク質の発現を可能とする発現ベクターを利用することができる。利用可能な発現ベクターとしては、細菌や真菌類（例えば、酵母類）などの微生物、植物、昆虫細胞、哺乳類細胞などのホストにおいてタンパク質の発現を可能とする各種発現ベクターを用いることが可能であり、ウイルスベクター（ファージベクターを含む）でもプラスミドベクターであってもよい。或いは、ウサギ網状赤血球ライセート、小麦胚芽ライセート、大腸菌ライセート等を用いた無細胞タンパク質発現系を用いて、本発明のタンパク質を製造してもよい。

特定の生物種をホストとして用いた発現系で本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを発現させる場合には、上記本発明のタンパク質をコードする核酸をベクター上に搭載し、このベクターによって宿主細胞を形質転換した後、形質転換させた宿主細胞を培養して培養物中に前記遺伝子がコードするタンパク質を蓄積し、蓄積したタンパク質を収集することを含む、製造方法により調製することができる。

本発明のタンパク質をコードする核酸、該核酸を含むベクター、該ベクターにより形質転換された形質転換体は本発明の一態様である。これら核酸、ベクターおよび形質転換体は、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列が決定されれば、当業者であれば常法に従って調製可能である。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸の取得方法は特に限定されない。例えば、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼないし配列番号１に記載のアミノ酸配列と相同性を有する遺伝子を各種細菌から単離し、該遺伝子をコードする核酸を調製して、上記第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸の置換を行って、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造してもよい。また、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸は、配列番号１に記載のアミノ酸配列または配列番号１に記載のアミノ酸配列と一定の同一性を有する公知のアミノ酸配列の情報に基づいて、化学合成、遺伝子工学的手法または突然変異誘発などの当業者に既知の任意の方法で作製することができる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸は、具体的には、例えば配列番号１に記載のアミノ酸をコードするＤＮＡに対し、変異原となる薬剤と接触作用させる方法、紫外線を照射する方法、遺伝子工学的手法等を用いて行うことができる。また、遺伝子工学的手法の一つである部位特異的変異誘発法は特定の位置に特定の変異を導入できる手法であることから、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造する上で、核酸に部位特異的な変異を導入するために有用である。

例えば、ＰＣＲ法により本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造するための材料を取得することもできる。例えば、ブタ腎臓のゲノムＤＮＡから配列番号１のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを増幅できるように設計した１対のプライマーを用いてＰＣＲを行う。ＰＣＲの反応条件は適宜設定することができる。増幅されたＤＮＡ断片は、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。さらに、増幅されたＤＮＡ断片を、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）等の宿主で増幅可能な適切なベクター中にクローニングすることにより得られたベクターも本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造するための材料として用いることができる。

上述の通り準備した、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を製造するための材料において、上記第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸に対応するアミノ酸をコードする塩基配列（コドン）に各種変異導入法を用いて塩基の置換を施し、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸、または該核酸を含むベクターを製造することができる。なお、上記したプローブまたはプライマーの調製、ゲノムライブラリーの構築、ゲノムライブラリーのスクリーニング、並びに目的遺伝子のクローニングなどの操作は当業者に既知である。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸は適当なベクター中に挿入した状態で使用することができる。本発明で用いるベクターの種類は特に限定されず、例えば、自立的に複製するベクター（例えばプラスミド等）でもよいし、あるいは、宿主細胞に導入された際に宿主細胞のゲノムに組み込まれ、組み込まれた染色体と共に複製されるものであってもよい。好ましくは、ベクターは発現ベクターである。発現ベクターにおいて上記核酸には、転写に必要な要素（例えば、プロモータ等）が機能的に連結されている。プロモータは宿主細胞において転写活性を示すＤＮＡ配列であり、宿主の種類に応じて適宜選択することができる。

また、上記ベクターにおいて、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸は、必要に応じて、適切なターミネータに機能的に結合されてもよい。本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を含むベクターは更に、ポリアデニレーションシグナル（例えばＳＶ４０またはアデノウイルス５Ｅ１ｂ領域由来のもの）、転写エンハンサ配列（例えばＳＶ４０エンハンサ）などの要素を有していてもよい。Ｌ−アミノ酸オキシダーゼの遺伝子を含む組換えベクターは更に、該ベクターが宿主細胞内で複製することを可能にするＤＮＡ配列を具備してもよく、その一例としてはＳＶ４０複製起点（宿主細胞が哺乳類細胞のとき）が挙げられる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を含むベクターはさらに選択マーカーを含有してもよい。選択マーカーとしては、例えば、ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）またはシゾサッカロマイセス・ポンベＴＰＩ遺伝子等のようなその補体が宿主細胞に欠けている遺伝子、または例えばアンピシリン、カナマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、ネオマイシンもしくはヒグロマイシンのような薬剤耐性遺伝子を挙げることができる。本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸、プロモータ、および所望によりターミネータおよび／または分泌シグナル配列をそれぞれ連結し、これらを適切なベクターに挿入する方法は当業者に周知である。

さらに、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードする核酸を含むベクターを適当な宿主に導入することによって、本発明の形質転換体を作製することができる。本発明のベクターを導入される宿主細胞は、細胞内で本発明のベクターが複製されるものであれば任意の細胞でもよい。さらに、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを発現する形質転換体を作製する場合には、ベクターの複製に加えて、言うまでもなく本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼの発現が可能となる任意の細胞である。このような宿主細胞の例としては、細菌、酵母、真菌および高等真核細胞等が挙げられる。

上記の形質転換体は、本発明のベクターの複製を可能にする条件下、或いは本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼの発現を可能にする条件下で適切な栄養培地中で培養する。本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを発現させた場合、形質転換体の培養物（形質転換体および培養培地を含む）から、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを単離精製するには、通常のタンパク質の単離精製法を用いればよい。例えば、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼが、細胞内に溶解状態で発現した場合には、培養終了後、細胞を遠心分離により回収し水系緩衝液に懸濁後、超音波破砕機等により細胞を破砕し、無細胞抽出液を得る。該無細胞抽出液を遠心分離することにより得られた上清から、通常のタンパク質の単離精製法、即ち、溶媒抽出法、硫安等による塩析法、脱塩法、有機溶媒による沈殿法、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）セファロース等のレジンを用いた陰イオン交換クロマトグラフィー法、Ｓ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ＦＦ（ファルマシア社製）等のレジンを用いた陽イオン交換クロマトグラフィー法、ブチルセファロース、フェニルセファロース等のレジンを用いた疎水性クロマトグラフィー法、分子篩を用いたゲルろ過法、アフィニティークロマトグラフィ一法、クロマトフォーカシング法、等電点電気泳動等の電気泳動法等の手法を単独あるいは組み合わせて用い、本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを精製標品として得ることができる。

本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを用いることによって、特定のアミン化合物のラセミ体をデラセミ化し、光学活性アミン化合物を得ることが可能になる。以下、実施の順番に従って本発明に係るデラセミ化方法を説明する。

・ 酵素反応工程
先ず、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に本発明の変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）をイミン化合物（ＩＩＩ）とする。その結果、反応液中には実質的に（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）のみが残留することになり、デラセミ化が達成される。

反応液の溶媒としては、主に水を用いる。水としては、超純水、純水、精製水、蒸留水、イオン交換水、水道水、井戸水など、上記酵素反応を阻害しないものであれば特に制限されない。また、基質化合物である（Ｒ）−アミン化合物が水に溶解し難いような場合には、酵素反応を阻害しない範囲で、メタノールやエタノールなどのアルコール系溶媒；テトラヒドロフランなどのエーテル系溶媒；アセトンなどのケトン系溶媒；ジメチルホルムアミドやジメチルアセトアミドなどのアミド系溶媒などの水混和性有機溶媒を適量添加してもよい。

本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼとアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）の反応液における濃度は適宜調整すればよく、予備実験などで決定すればよい。例えば、本発明に係る変異型アミノ酸オキシダーゼの濃度は、０．１Ｕ／ｍＬ以上、３０Ｕ／ｍＬ以下程度とすることができる。また、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）の濃度としては、１ｍＭ以上、５０ｍＭ以下とすることができる。なお、本発明において、１Ｕは、（Ｒ）−フェニルアラニン（（Ｄ）−フェニルアラニン）または（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを基質とし、３０℃で１分間反応させた場合に１μｍｏｌのＨ₂Ｏ₂を生成する酵素量をいうものとする。

反応液のｐＨも適宜調整すればよいが、７．０以上、９．０以下程度に調整することが好ましい。また、反応液のｐＨを上記範囲に維持するために、緩衝剤や緩衝液を用いてもよい。

反応温度と反応時間も適宜調整すればよい。反応温度としては、例えば、２０℃以上、６０℃以下程度とすることができる。また、反応時間は、（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）の濃度が十分に低減されるまでとし、具体的には予備実験などで決定すればよいが、例えば、３０分間以上、６００分間以下程度とすることができ、６０分間以上が好ましい。

当該工程により、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）が本発明酵素により酸化され、イミン化合物（ＩＩＩ）となる。よって、当該イミン化合物（ＩＩＩ）と下記式（ＩＶ）で表される（Ｓ）−アミン化合物とを、例えばカラムクロマトグラフィなどにより分離し、光学純度の高い（Ｓ）−アミン化合物（Ｖ）を得ることができる。

［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
・ 還元反応工程
本発明に係るアミン化合物（ＩＩ）のデラセミ化方法では、さらに、還元剤を作用させることにより上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）としてもよい。

当該工程により、（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）は、イミン化合物（ＩＩＩ）を経てアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）となり、当該アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）中の（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）は本発明酵素により再びイミン化合物（ＩＩＩ）となる。即ち、上記酵素反応工程と還元反応工程が同時または交互に進行することにより、原料であるアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）がそのまま維持されるのみでなく、（Ｒ）−アミン化合物（Ｉ）も（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）に変換されることになり、光学純度の高い（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）が効率良く製造されることになる。

還元剤としては、例えば、水素化ホウ素ナトリウム、水素化ホウ素リチウム、水素化ジイソブチルアルミニウム、水素化アルミニウムリチウム、シアノトリヒドロホウ酸ナトリウム、ボランを用いることができる。

還元剤の使用量は適宜調整すればよいが、イミン化合物（ＩＩＩ）を十分に還元できる量を使用することが好ましい。例えば、原料であるアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に対して、１．５倍モル以上、１００倍モル以下程度用いることが好ましい。

なお、還元反応工程は、上記酵素反応工程を行った後、（Ｓ）−アミン化合物（ＩＶ）の存在下、或いは（Ｓ）−アミン化合物（Ｖ）を分離してから行ってもよいし、還元反応工程と上記酵素反応工程とを同時に行ってもよい。即ち、上記酵素反応工程の反応液に還元剤を添加し、生成したイミン化合物（ＩＩＩ）を直ぐに還元してアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）とし、酵素反応に付せるようにしてもよい。

本願は、２０１３年２月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３−３３７０７号に基づく優先権の利益を主張するものである。２０１３年２月２２日に出願された日本国特許出願第２０１３−３３７０７号の明細書の全内容が、本願に参考のため援用される。

以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はもとより下記実施例によって制限を受けるものではなく、前・後記の趣旨に適合し得る範囲で適当に変更を加えて実施することも勿論可能であり、それらはいずれも本発明の技術的範囲に包含される。

なお、酵素の（Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性は、以下のように測定した。

試験例１： 酵素の（Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性の測定
（１） （Ｒ）−アミノ酸酸化活性の測定用試薬の調製
表１の配合に従って調製した。

（２） （Ｒ）−アミン酸化活性の測定用試薬の調製
表２の配合に従って調製した。

（３） （Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性の測定条件
（Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性は、基質の酸化で生成される過酸化水素量を、表１または表２の発色液を用いた比色法で求めた。具体的には、１ｃｍ石英セル中、酵素液に対して１０倍容量の各測定用試薬を加えて総量を１ｍＬとし、３０℃で１時間反応させ、マイクロプレートリーダーで５０５ｎｍの吸光度を測定した。ブランクでは、基質の代わりに蒸留水を添加した。得られた吸光度変化より、下記計算式に基づいて各酸化活性を算出した。尚、本試験例における１Ｕは、（Ｒ）−フェニルアラニンまたは（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを基質とし、１分間に１μｍｏｌのＨ₂Ｏ₂を生成する酵素量とした。

（４） （Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性の計算式
活性値（Ｕ／ｍｌ）＝｛ΔＡｂｓ５０５／ｍｉｎ（ΔＡｂｓ５０５ｓａｍｐｌｅ−ΔＡｂｓ５０５ｂｌａｎｋ）×１（ｍｌ）×希釈倍率｝／｛４．６６×１．０（ｃｍ）×０．１（ｍｌ）｝
１（ｍｌ）：全液量
４．６６：ミリモル吸光係数
１．０ｃｍ：セルの光路長
０．１（ｍｌ）：酵素サンプル液量
（５） 比活性の測定
単位液量あたりの酵素含量を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法プロテインアッセイキット（Ｂｉｏｒａｄ社製）を用いて測定した。上記活性測定法により単位液量あたりの活性値を測定し、単位液量あたりの活性値を単位液量あたりの酵素含量で割ることで、（Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性に関する比活性を求めた。

実施例１： 本発明に係る変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの調製
（１） ブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子の調製
アッセンブルＰＣＲによりブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を作製した。用いたプライマー（配列番号３〜３５）を表３に示す。

アッセンブルＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０× Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ、表３で示したプライマーの１００ｐｍｏｌ／μＬ混合液２μＬ、およびＥｘ Ｔａｑ ５ｕｎｉｔとした。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２０秒間、（ｉｉ）５０℃で３０秒間、（ｉｉｉ）５５℃で１．５分間、および（ｉｉ）から（ｉｉｉ）までを３５サイクルとした。

上記ＰＣＲ産物を用い、大腸菌を形質転換した。ライゲーション反応の組成は、ＰＣＲ産物５μＬ、ｐＴ７ Ｂｌｕｅ Ｔ−Ｖｅｃｔｅｒ（Ｎｏｖａｇｅｎ）１μＬ、ライゲーションミックス（タカラバイオ社製）６μＬとし、１６℃で３０分間反応させた。大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ ＪＭ１０９）のコンピテントセル１００μＬに、１２μＬのライゲーション反応液を加え、ヒートショック法で形質転換した。８０μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地（１．０％ポリペプトン，０．５％イースト抽出物，１．０％ＮａＣｌ）に生育したコロニーを数株選抜してプラスミド抽出し、０．７％アガロース電気泳動により、インサートの有無の確認を行った。

別途、ブタ腎臓（由来Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子配列のシーケンシングを行った。具体的には、遺伝子の両方の鎖についてシーケンシングを行うためユニバーサルプライマーＴ７プロモータープライマーとＵ−１９ｍｅｒプライマーを用い、シーケンス反応を行った。反応液組成は、１．６μＬの上記いずれかのプライマー、１．６μＬの鋳型ＤＮＡ、１μＬのＢｉｇＤｙｅプレミックスソリューション、１．６μＬの５× ＢｉｇＤｙｅ シーケンシングバッファーと２．８μＬの滅菌水の混合物とし、全量を１０μＬに調整した。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９６℃で２分間、（ｉｉ）９６℃で１０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で５秒間、（ｉｖ）６０℃で４分間、（ｖ）（ｉｉ）〜（ｉｖ）を２５回、および（ｖｉ）７２℃で５分間とした。ＰＣＲ産物に１μＬの０．１２５Ｍ ＥＤＴＡと３５μＬのエタノールを加え、室温で１５分間放置した後、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，８分間，４℃）により沈殿させた。上清を廃棄した後、７０％エタノールを添加して撹拌後、再度遠心分離した。その後、２０μＬのＨｉ Ｄｉ Ｆｏｒｍａｍｉｄｅを加え、１００℃で５分間加熱した後に、氷水で急冷したものにつき、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ３５００ Ｇｅｎｅｔｉｃ Ａｎａｌｙｚｅｒで塩基配列の解読をした。得られたシーケンスデータの解析はＧｅｎｅｔｙｘで行い、それぞれのプライマーで増幅した断片を連結した。解読されたブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子配列に対応するアミノ酸配列を配列番号１に示す。

次に、ブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を増幅した。具体的には、上記クローニングで得られたプラスミドを鋳型ＤＮＡとし、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ反応液の組成は、水３５μＬ、１０× Ｅｘ Ｔａｑ ｂｕｆｆｅｒ ５μＬ、２ｍＭ ｄＮＴＰ ５μＬ、１００ｐｍｏｌ／μＬ プライマー５（５’−ｔｔｔｇａａｔｔｃｔａａｇｇａｇｇａｃｔａｇｃｔｃａｔｇｃｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｇａｔｔ−３’，配列番号３６）１μＬ、１００ｐｍｏｌ／μＬプライマー６（５’−ａａｔａａｇｃｔｔｔｃａｇａｇｇｔｇｇｇａｔｇｇｔｇｇｃａｔ−３’，配列番号３７）１μＬ、鋳型ＤＮＡ１００ｎｇおよびＥｘ Ｔａｑ ５ｕｎｉｔとした。プライマー５およびプライマー６には、それぞれＢａｍＨＩおよびＨｉｎｄＩＩＩの制限酵素サイトを設けた。ＰＣＲ反応の条件は、（ｉ）９８℃で５分間、（ｉｉ）９６℃で２０秒間、（ｉｉｉ）５０℃で３０秒間、（ｉｖ）５５℃で１．５分間、および（ｉｉ）〜（ｉｖ）までを２８サイクルとした。

得られたブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を用い、大腸菌を形質転換した。即ち、上記ＰＣＲ反応で得られたＰＣＲ産物５μＬに、１μＬ ＢａｍＨＩと１μＬ ＨｉｎｄＩＩＩを加え、３７℃で１時間インキュベートし、制限酵素処理を行った。ライゲーション反応は、５μＬのＤＮＡ、１μＬのｐＵＣ１８（増幅遺伝子と同様の制限酵素処理を行ったもの）、６μＬのライゲーションＭｉｘとし、１６℃で３時間インキュベートしプラスミドｐＤＡＯを作製した。得られたプラスミドｐＤＡＯを、ヒートショック法により大腸菌に導入した。

上記形質転換大腸菌で（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ遺伝子を発現させ、その活性を測定した。８０μｇ／ｍＬのアンピシリンと１ｍＭのＩＰＴＧを含む５ｍＬのＬＢ培地（１．０％ポリペプトン，０．５％イースト抽出物，１．０％ＮａＣｌ，ｐＨ７．０）に形質転換大腸菌を植菌し、３７℃で２４時間培養した。遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，５分間，４℃）により集菌し、０．１％ ２−メルカプトエタノールを含む１０ｍＭリン酸カリウムバッファーで洗浄した後、１ｍＬの同バッファーに懸濁した。得られた菌体液を１５分間超音波処理し、遠心分離（１５，０００ｒｐｍ，１５分間，４℃）で得られた上清を無細胞抽出液とした。上記試験例１の活性測定法により、（Ｒ）−アミノ酸酸化活性と（Ｒ）−アミン酸化活性を測定した。

（２） ブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの基質特異性の改変
ブタ腎臓由来の野生型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列（配列番号１）の２２８番目のチロシンおよび２８３番目のアルギニンに注目し、それぞれのアミノ酸残基に飽和変異を導入した。具体的には、Ｑｕｉｋｃｈａｎｇｅ Ｍｕｌｔｉ ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー社製）を用い、上記実施例１（１）で調製したプラスミドｐＤＡＯを鋳型とし、以下のプライマー（配列番号３８〜４１）を用いてＰＣＲを行った。

5’-agaggcatctacaactctccannnatcattccagggctgc-3’
5’-gcagccctggaatgatnnntggagagttgtagatgcctct-3’
5’-tgaatatactggcttcnnnccagtacgccccca-3’
5’-tgggggcgtactggnnngaagccagtatattca-3’
得られたＰＣＲ産物を用いて、ヒートショック法により大腸菌ＪＭ１０９を形質転換した。９６穴プレートを用い、０．５ｍＭ ＩＰＴＧと８０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＬＢ培地で３７℃、２４時間培養後、遠心分離によって集菌した。回収された大腸菌を、５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８）で懸濁し、超音波破砕により無細胞抽出液を調製した。

上記無細胞抽出液につき、上記試験例１に従って、（Ｒ）−アミン酸化活性を測定した。また、上記で得られた変異体酵素遺伝子を鋳型とし、２２８番目のチロシンに対して同様の方法で飽和変異を行い、（Ｒ）−アミン酸化活性を測定した。結果を、ブタ腎臓由来（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ（野生型）を用いて（Ｒ）−フェニルアラニン（（Ｄ）−フェニルアラニン）を酸化した場合の比活性０．１１Ｕ／ｍｇを１００％とした場合の相対活性として図１に示す。なお、図１において、黒塗りのカラムは（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを基質とした場合ではなく、（Ｒ）−フェニルアラニンを基質とした場合の結果である。野生型の（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを用いて（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンを酸化した場合には、反応の進行は認められず、比活性はほとんど０であった。

図１のとおり、２８３番目のアルギニンがグリシン、アラニンまたはシステインに置換された変異体酵素において、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンの酸化活性が確認された。また、２８３番目のアルギニンがグリシン、アラニンまたはシステインに置換された変異体酵素のいずれにおいても、２２８番目のチロシンがロイシンに置換した変異体酵素において（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンの酸化活性の向上が見られた。特に２８３番目のアルギニンがグリシンで且つ２２８番目のチロシンがロイシンに置換した変異型酵素（配列番号２）が、野生型酵素と比較しても優れた（Ｒ）−アミン酸化活性を示した。

実施例２： ブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの精製
上記実施例１で得られた２８３番目のアルギニンがグリシンで且つ２２８番目のチロシンがロイシンに置換された変異型酵素（配列番号２）を精製した。なお、以下、精製に用いたリン酸カリウムバッファー（ＫＰＢ）は、０．１％ ２−メルカプトエタノールを含むものとする。

（１） 無細胞抽出液の調製
５ｍＬの８０ｍＭアンピシリンを含むＬＢ培地で、２８３番目のアルギニンがグリシンで且つ２２８番目のチロシンがロイシンに置換された変異型酵素をコードする遺伝子により形質転換された大腸菌を、２００ｒｐｍ、３７℃で２４時間前培養した。前培養液を、８０ｍＭアンピシリンと１ｍＭ ＩＰＴＧを含むＬＢ培地５００ｍＬに植菌し（全量５Ｌ）、２Ｌバッフルを用いて、３００ｒｐｍ、３７℃で１日振とう培養した。大型遠心機を用い、８，０００ｒｐｍ、４℃で５分間遠心分離することにより集菌し、１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）で洗浄した後、培地５Ｌ分の菌体を、８０ｍＬの１０ｍＭ ＫＰＢに懸濁した。８０ｍＬの菌体液を１５分間超音波処理し、８，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離することにより得られた上清を無細胞抽出液とした。

（２） 硫安分画
上記無細胞抽出液を氷中にてスターラーで撹拌しながら硫酸アンモニウムを２０％飽和になるように添加し、３０分間攪伴した後、大型遠心機を用いて８，０００ｒｐｍ、４℃で１５分間遠心分離することにより上清を得た。得られた上清液に硫安アンモニウムを３５％飽和になるように添加し、上記と同条件で遠心分離し、沈殿を得た。得られた沈殿に１０ｍｌの１０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）を加えて懸濁し、５Ｌの同緩衝液（×２回）で１晩透析した。

（３） 陰イオン交換カラムクロマトグラフィ
１０ｍＭ ＫＰＢにより平衡化したＤＥＡＥ−トヨパール樹脂１００ｍｌをカラムに充填し、透析した酵素液を吸着させた。１００ｍＬの１０ｍＭ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、１０ｍＭ ＫＰＢ １００ｍｌおよび５０ｍＭ ＮａＣｌを含む１０ｍＭ ＫＰＢ １００ｍｌを用いて、グラジエントによりＮａＣｌ濃度を徐々に上げ、酵素を溶出させた。フラクションコレクターを用いて、２０ｍｌずつ試験管にフラクションを採取し、活性が認められたフラクションを集め、１０ｍＭ ＫＰＢにより１晩透析した。

（４） 疎水性カラムクロマトグラフィ
２０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ ＫＰＢにより平衡化したＢｕｔｙｌ−トヨパール樹脂１０ｍｌをカラムに充填し、２０％硫酸アンモニウムを含む酵素液を吸着させた。５０ｍＬの硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ ＫＰＢでカラムを洗浄した後、５０ｍｌの２０％硫酸アンモニウムを含む１０ｍＭ ＫＰＢおよび１０ｍＭ ＫＰＢを用いて、グラジエントにより硫酸アンモニウム濃度を徐々に下げ、酵素を溶出させた。活性が認められたフラクションを集め、１０ｍＭ ＫＰＢにより１晩透析した。各精製段階における酵素量や（Ｒ）−アミン酸化活性などを表４に示す。

（５） ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動によるブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの精製度の確認
泳動ゲルとして、３６％アクリルアミド５．２５ｍｌ、０．６８Ｍトリス−ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．８）８．２５ｍＬ、１％ＳＤＳ １．５８ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ １８７μＬ、２％ＡＰＳ ５６２μＬの組成を有するゲル５μＬに、３６％ポリアクリルアミド０．５ｍＬ、０．１７９Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）３．５ｍＬ、１％ＳＤＳ ０．５ｍＬ、１０％ＴＥＭＥＤ １２５μＬ、２％ＡＰＳ ３７５μＬの組成を有する濃縮ゲルを重層したものを用い、緩衝液（グリセロール２００μＬ、１Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）４０μＬ、水３６０μＬ、２−メルカプトエタノール２００μＬおよび１０％ＳＤＳ ２００μＬ）と等量混合した精製酵素サンプル１０μＬを、ランニング緩衝液（トリス３．０ｇ、グリシン１４．１ｇおよびＳＤＳ１０ｇ）中、２０ｍＡで電気泳動を行った。その後、タンパク染色液（ＣＢＢ２．５ｇ、メタノール５００ｍＬ、酢酸５０ｍＬおよび水４５０ｍＬ）で１時間染色し、脱色液（メタノール：酢酸：水＝３：１：６）でバンドが鮮明になるまで脱色した。分子量マーカーとして、ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ（９７，２００）、ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ ａｌｂｕｍｉｎ （６６，４０９）、Ｏｖａｌｂｕｍｉｎ（４４，２８７）、ｃａｒｂｏｎｉｃ ａｎｈｙｄｒａｓｅ（２９，０００）、ｓｏｙｂｅａｎ ｔｒｙｐｓｉｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（２０，１００）およびｌｙｓｏｚｙｍｅ（１４，３００）を含むもの（タカラバイオ株式会社）を用いた。得られたＳＤＳ−ＰＡＧＥの写真を図２に示す。

実施例３： ブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの基質特異性
上記試験例１の（Ｒ）−アミン酸化活性の測定条件において、基質化合物として、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンの代わりに種々のアミン類またはアミノ酸を用い、酵素活性を測定した。基質としてα−メチルベンジルアミンを用いた時の比活性と、各基質を用いた時の比活性とを比較し、α−メチルベンジルアミンに対する活性を１００％としたときの他の基質に対する相対活性を求めた。結果を表５に示す。

表５に示すように、本発明に係る変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼは、野生型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの基質であるフェニルアラニンには全く活性を示さない。また、（Ｓ）−α−メチルベンジルアミン誘導体や、フェニル基上に置換基としてメトキシ基やメチル基が導入された（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン、シクロヘキサン化合物、アキラル化合物に対する活性は低い。それに対して、（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン誘導体に対しては、極めて高い酸化活性を示した。

実施例４： ブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの至適温度
上記試験例１に示した測定法を用いて、２０℃から６０℃まで５℃刻みに温度を変化させ、各温度における変異型（Ｒ）−アミン酸化活性を測定した。結果を図３に示す。

図３に示すとおり、本発明に係るブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの至適温度は４５℃であった。

実施例５： ブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼの熱安定性
本発明に係るブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを、２０℃から７０℃までの各温度で３０分間熱処理した後、上記試験例１に示した測定法を用いて（Ｒ）−アミン酸化活性を測定した。結果を図４に示す。

図４に示すとおり、本発明に係るブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼは、４５℃の熱処理で８６％の残存活性を示し、５０℃の熱処理でも４６％の残存活性を示した。かかる結果より、本発明に係るブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼは、熱に対して比較的安定であることが明らかとなった。

実施例６： 本発明酵素による（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンからの（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンの光学分割

上記実施例２にて精製した変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを用いて、α−メチルベンジルアミンの光学分割を実施した。５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）、１０ｍＭ （ＲＳ）−α−メチルベンジルアミン、および上記実施例２で得た本発明に係る変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ１．５Ｕを含む反応液１ｍＬを３０℃でインキュベートした。反応開始から５，１０，１５，３０，６０，９０および１２０分後に反応液試料を採取し、以下のＨＰＬＣにより分析した。

分析条件カラム： ＣＲＯＷＮＰＡＫ ＣＲ（＋）（ダイセル社製）
移動相： ５％メタノールを含む６０ｍＭ過塩素酸
流速： ０．８ｍｌ／ｍｉｎ
検出波長： ２００ｎｍ
カラム温度： ３０℃
（Ｒ）−および（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンの保持時間を下記に記す。

（Ｓ）−α−メチルベンジルアミン： １１．６分
（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン： １２．６分
結果を図５に示す。図５のとおり、本発明酵素により（Ｒ）−α−メチルベンジルアミン（図５中「●」）は選択的に酸化されてメチルベンジルイミンに変換され、さらに水溶媒中、より安定なアセトフェノンに変換されて、反応開始から６０分後にはほぼ０％になっている。それに対して、（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンの濃度（図５中「〇」）はほぼ５ｍＭのまま維持されている。α−メチルベンジルアミンとメチルベンジルイミンおよびアセトフェノンとは異なる化合物であるので、カラムクロマトグラフィなどで容易に分離できる。かかる結果により、本発明酵素によって、（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンから（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンが得られることが実証された。

実施例７： ブタ腎臓由来変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを用いたα−メチルベンジルアミンのデラセミ化法

上記実施例２にて精製した変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼを用いて、α−メチルベンジルアミンのデラセミ化法を実施した。５０ｍＭ ＫＰＢ（ｐＨ８．０）、５ｍＭ （ＲＳ）−α−メチルベンジルアミン、２５０ｍＭ水素化ホウ素ナトリウム、および上記実施例２で得た本発明に係る変異型（Ｒ）−アミノ酸オキシダーゼ３Ｕを含む反応液１ｍＬを３０℃でインキュベートした。反応開始から１８０分後まで適時反応液試料を採取し、上記実施例６で示した条件のＨＰＬＣにより分析した。結果を図６に示す。図６のとおり、本発明酵素により（Ｒ）−α−メチルベンジルアミンは選択的に酸化されてメチルベンジルイミンに変換され、その濃度（図６中「●」）はほぼ０％になった。それに対して、ラセミ体（ＲＳ体）中の（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンは反応せず、また、上記メチルベンジルイミンは還元剤の存在により再び（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンに還元されるので、その濃度（図６中「〇」）は、当初のラセミ体の濃度である５ｍＭに近付いていった。かかる結果により、本発明酵素と還元剤の併用によって、（ＲＳ）−α−メチルベンジルアミンから（Ｓ）−α−メチルベンジルアミンを効率的に得られることが実証された。

本発明により、光学分割剤、光学活性医薬、光学活性農薬などの合成中間体として有用な光学活性のα−アミン化合物を効率的に製造でき、光学活性α−アミン化合物の事業化が見込まれる。

Claims (8)

1. 下記（１）〜（３）の何れかの変異型アミノ酸オキシダーゼ。
   （１）配列番号１に示されるアミノ酸配列において、第２２８番目のアミノ酸がチロシンまたはロイシンに置換され、第２８３番目のアルギニンがグリシン、アラニンまたはシステインに置換されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；
   （２）上記（１）に規定されるアミノ酸配列において、第２２８番目および第２８３番目のアミノ酸を除く領域中で１または数個のアミノ酸が欠損、置換および／または付加されたアミノ酸配列を有する変異型アミノ酸オキシダーゼであり、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ；または
   （３）上記（１）に規定されるアミノ酸配列に対して９５％以上の配列同一性を有するアミノ酸配列を有し、かつ（Ｒ）−アミン化合物に対する酸化活性を有する変異型アミノ酸オキシダーゼ（ただし、該変異型アミノ酸オキシダーゼのアミノ酸配列において上記第２２８および２８３番目のアミノ酸配列に対応するアミノ酸は変異しないものとする）。
2. 変異型アミノ酸オキシダーゼ（１）において、第２２８番目のアミノ酸がロイシンであり、第２８３番目のアルギニンがグリシンである請求項１に記載の変異型アミノ酸オキシダーゼ。
3. 基質となる（Ｒ）−アミン化合物が下記式（Ｉ）で表されるものである請求項１または２に記載の変異型アミノ酸オキシダーゼ。
   ［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
4. 請求項１〜３の何れかに記載の変異型アミノ酸オキシダーゼをコードすることを特徴とする核酸。
5. 請求項４に記載の核酸を含むベクターにより形質転換されたものであることを特徴とする形質転換体。
6. 下記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物ラセミ体をデラセミ化する方法であって、
   ［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
   上記アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に請求項１〜３のいずれかに記載の変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物を下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン化合物とする工程を含むことを特徴とする方法。
   ［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
7. さらに、還元剤を作用させることにより上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）とする工程を含む請求項６に記載の方法。
8. 下記式（ＩＩ）で表されるアミン化合物ラセミ体から下記式（ＩＶ）で表される（Ｓ）−アミン化合物を製造する方法であって、
   ［式中、Ｒ¹は置換基を有していてもよいＣ_6-12アリール基または置換基を有していてもよいヘテロアリール基を示し、Ｒ²はＣ_1-6アルキル基を示し、Ｃ_6-12アリール基およびヘテロアリール基が有していてもよい置換基はハロゲン原子基である］
   上記アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に請求項１〜３のいずれかに記載の変異型アミノ酸オキシダーゼを作用させることにより、アミン化合物ラセミ体（ＩＩ）に含まれる（Ｒ）−アミン化合物を下記式（ＩＩＩ）で表されるイミン化合物とする工程、および、
   ［式中、Ｒ¹とＲ²は上記と同義を示す］
   さらに、還元剤を作用させることにより上記イミン化合物（ＩＩＩ）をアミン化合物ラセミ体（ＩＩ）とする工程を含むことを特徴とする方法。