CN102807599A - 一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 - Google Patents
一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102807599A CN102807599A CN201110148084XA CN201110148084A CN102807599A CN 102807599 A CN102807599 A CN 102807599A CN 201110148084X A CN201110148084X A CN 201110148084XA CN 201110148084 A CN201110148084 A CN 201110148084A CN 102807599 A CN102807599 A CN 102807599A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- moving phase
- protein
- inclusion body
- renaturation
- concentration
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
本发明属于生物技术领域，提供了一种纯化包涵体蛋白的方法，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱货pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱。本发明在离子交换层析复性的基础上，提供了能使变性蛋白或者包涵体蛋白快速、简便的纯化的工艺，在蛋白纯化的同时，也可以达到了蛋白复性的目的；与其他的复性方法相比，两种流动相的设置，大大简化了操作步骤，提高了蛋白在高浓度下的复性的效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种纯化包涵体蛋白并复性的方法。
背景技术
蛋白质的纯化和复性问题是生物工程中的难点和热点，不仅涉及到分子生物学、细胞生物学等的重大的问题，而且涉及到目前基因工程产品的生产和成本，尤其对大规模生产药用蛋白。一股复性方法存在的缺点是：主要是低浓度下的低复性率，使得整个工艺过程需要大量的缓冲液、大体积的容器、大量的操作时间，这些大大降低了生产的效率，增加了生产成本。聚集体的形成是低活性收率的主要原因。当蛋白在高浓度下折叠复性时，伸展的肽链由于疏水基团的外露，更加的容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。由于聚集体的形成至少涉及到两个蛋白多肽链，所以是二级或者更高级的反应，蛋白的浓度越高，聚集体的形成就越快、越多，这大大制约了包涵体蛋白的大量生产。
目前国内外工业生产中最经常使用的复性手段有稀释复性法、透析复性法等。稀释法复性蛋白是将包涵体蛋白用复性缓冲液直接进行稀释，而达到其复性的目的，存在着复性时间长、缓冲液用量大、容器体积大、不适合大规模生产；而透析法复性蛋白是将包涵体蛋白放在透析袋中，用不断更换的复性缓冲液逐步将袋中的变形剂透析出来，而达到其复性目的，缺点在于：容易造成蛋白与透析膜之间的吸附，并且由于需要经常更换复性缓冲液，增加了操作步骤和操作时间；这两种方法都存在缓冲液体积大，不仅给后续的村话工艺带来了不便，增加了缓冲液的使用量，提高了生产成本，而且要增大设备的处理量，不适于工业生产。
层析方法是生物技术中最经常使用的分离手段。层析介质及层析环境对蛋白比较温和，处理的蛋白的浓度可以很高，操作简单，完成操作需要的时间短，所以最近也被用来进行复性。利用凝胶过滤层析进行复性是新近发展的复性手段，蛋白在通过凝胶过滤层析介质的同时脱去了变性剂，蛋白发生折叠复性；但是这种过程中变性剂的瞬间脱落，也容易造成聚集体的形成，不溶性的聚集体会造成柱子的堵塞；凝胶过滤层析本身对上样量限制的要求同样限制了这种方法的工业应用。
层析法复性蛋白还包括疏水层析法和离子层析法，都是将蛋白包涵体在层析柱上直接吸附。疏水层析法的步骤为：(1)先将层析柱用高盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附；(3)降低盐浓度，将蛋白洗脱出来；该方法完全除去变性剂，并使蛋白在层析介质上折叠复性，但是这种方法仅适于表明疏水很强的蛋白质，否则疏水层析使用的高浓度的盐离子容易造成蛋白的盐析沉淀。并且一些蛋白在高盐的情况下的活性不高，而离子层析法的步骤为：(1)先将层析柱用低盐或无盐缓冲液平衡，(2)蛋白进柱，进行吸附，(3)提高盐浓度，将蛋白洗脱出来；但该方法一股都用于复性后的蛋白的纯化过程(CN 1064968C，US 4705845，US 4705848，EP 0505846AI，WO 00/03011)，并没有直接使用离子交换层析复性融合蛋白，但是没有洗脱过程的双梯度的设置，难免出现聚集体和错误的二硫键的配对，降低了复性的收率。并且把处在高浓的变性剂条件下的变性蛋白加入到没有变性剂的柱子中时，因为变性剂浓度的瞬时降低，大大增加了聚集体形成的可能。使用不含变性剂的缓冲液复性后的蛋白，不仅仅降低了复性的收率，而且一些目标蛋白吸附在层析介质上没有洗脱出柱，使蛋白的质量回收很低，并且污染了层析柱。有人使用此种过程复性变性的天然溶菌酶蛋白，蛋白的质量收率仅仅在10％左右。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高浓度条件下，高效纯化包涵体蛋白质的方法。
本发明提供了一种纯化包涵体蛋白的方法，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱货pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱：其具体步骤是：
1)酸性/碱性流动相I或者其它溶液溶解的包涵体蛋白进经流动相I平衡后的离子交换层析柱，包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上；
2)然后用酸性/碱性流动相II梯度取代酸性/碱性流动相I对包涵体蛋白溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度长度为1-5个的柱体积，流动相II中的变性剂的浓度低于流动相I中的变性剂的浓度
所述的变性剂为脲、Triton或Tween；在流动相I中的浓度为6～10mol/L；在流动相II中的浓度为0.5～3mol/L；所述的流动相I为酸性缓冲液，pH为3～7；流动相II为碱性缓冲液，pH为8～11；流动相I为碱性缓冲液，pH为8～11；流动相II为酸性缓冲液，pH为3～7；所述的酸性缓冲液为含单一硼酸盐、醋酸盐或碳酸盐的酸性缓冲液或为混合酸性缓冲液；所述的离子交换层析介质可为DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose FastFlow、Q Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow。
蛋白质复性过程中，变性剂的除去是影响蛋白复性收率的关键步骤。本发明采用高浓度变性剂可使致密的包涵体溶解，如脲的浓度在6～10mol/L，盐酸胍的浓度为4～8mol/L时，蛋白的多肽链以伸展的形式存在；高浓度的变性剂条件下，蛋白多肽链之间不会因为疏水相互作用形成聚集体；理论上说，除去变性剂及其他的使蛋白解折叠的因素，多肽链可以逐步折叠复性。但是，一股传统的复性方法，是使变性剂浓度瞬时降低，甚至降到零点，这样，蛋白在折叠时，会产生一些折叠中间体，这些中间体具有较强的疏水表面，由于此时变性剂浓度很低，不再具有溶解聚集体的作用，聚集体就会大量产生，有时甚至观察到复性溶液中白色的沉淀。而本发明采用的变性剂浓度逐渐降低的梯度洗脱或pH值逐渐降低或升高的梯度洗脱；可在此过程中逐步折叠复性，满足了蛋白多肽链各个疏水部位逐步包埋的需要；既可提高蛋白复性的效率，降低聚集体的形成；同时，最终蛋白的缓冲液中含有低浓度的变性剂(脲为2～3mol/L，盐酸胍为1～2mol/L)，可以增加复性后的蛋白肽链的柔韧性，明显提高蛋白的复性效率。
一股蛋白，当缓冲液中的pH值离蛋白的等电点越远，蛋白之间形成聚集体或者蛋白形成沉淀的可能性就越小；同时，不同的蛋白，不同折叠程度时的稳定性，对pH有不同的要求，蛋白最适活性的pH值也有不同；这样，选用不同的pH值，在一个pH值下使变性的蛋白稳定，并有助于其他的操作，而蛋白折叠时的pH值的逐步变化，可以大大稳定蛋白的折叠的构象，减少错误折叠的可能，并使折叠后的蛋白处在最适的pH值下。特别对于含有二硫键的蛋白，酸性条件下，可以避免此时二硫键的形成，而蛋白不同部位的二硫键形成时的pH值得要求不同，从酸性到碱性的pH值得梯度变化，可以避免二硫键错配的可能，满足不同位置二硫键形成的要求。如果为了使蛋白的二硫键形成，直接使蛋白处在高碱性环境中，一些错配的二硫键不能重新交换重排，也会降低复性的效率。
相对于变形的蛋白在溶液中的复兴过程，变性的蛋白肽链吸附在层析介质上折叠复性，可以避免蛋白多肽链之间由于折叠中间体的疏水相互作用形成聚集体。因为在溶液中复性，蛋白肽链是活动的，多肽链之间很容易相互接触形成聚集体。吸附在层析介质上，每个多肽链自主的折叠，很少发生之间的折叠而形成聚集体。所以吸附层析复性可以大大降低聚集体的形成。并且，在离子交换层析中，吸附的蛋白多肽链位点是亲水的位点，疏水位点处在溶液中折叠复性，不会干扰蛋白的折叠。
本发明在高浓度的变性剂条件下(流动相I)使变性的蛋白吸附，降低了吸附过程中由于变性剂浓度的突然降低而产生聚集体的可能；同时设置变性剂浓度或pH值的梯度或变性剂浓度及pH值得梯度同时变化，使伸展的蛋白肽链在一个逐步变化的环境中折叠复性，条件温和，降低了错误折叠、二硫键错配和形成聚集体的可能，目的就是使目标蛋白在高浓度下获得高的活性回收。最终洗脱液中(流动相II)部分变性剂的存在，不但提高了活性回收，而且有助于吸附的蛋白全部被洗脱下来，克服了前期的专利中的蛋白回收和活性回收较小的缺点。两个梯度同时的设置，减少了操作步骤，节省了操作时间，适于大规模生产。并且，在复性的同时，又能达到目标蛋白与杂质蛋白的分离。
本发明所选用的离子交换层析介质可为DEAE Sepharose Fast Flow、SP SepharoseFast Flow、Q Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow等；对于大分子量的蛋白，需要介质的粒径及孔径都比较大，以提供足够的空间使伸展的蛋白多肽链折叠；对于小分子的蛋白，过大的粒径容易造成体积的浪费；碱性条件下溶解的包涵体蛋白一股含有负电荷，可选用阴离子交换层析介质，如Pharmacia公司的SP Sepharose Fast Flow等介质；酸性条件下溶解的包涵体蛋白一股很有正电荷，可选用阳离子交换层析介质，如Pharmacia公司的DEAE Sepharose Fast Flow、SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose FastFlow等。
选择合适的梯度长度同样很重要。一个柱体积的梯度对容易折叠的蛋白是最佳的选择，难于折叠的或者多聚体的蛋白需要增加梯度的长度，从两个柱体积到几个柱体积都可以。
选择合适的流速，既要节约时间，又要使目标蛋白充分折叠。越是难于折叠的蛋白，则折叠速度越慢；或者多聚体蛋白需要多聚体组装的过程，则流速越低越好。
变性剂梯度的设置，选择非离子型的变性剂如脲，在高浓度的变性剂(如6mol/L脲)的环境(流动相I)中蛋白吸附到介质上，可以避免此时蛋白聚集体的形成。洗脱缓冲液含有低浓度的变性剂(如1mol/L脲)，浓度的选择依据复性蛋白的洗出试剂，如对溶菌酶采用1mol/L脲，此时洗脱出的复性的蛋白溶液中的脲浓度在2mol/L左右，此时对于这种蛋白活性回收也最高。
pH值梯度的设置(以天然溶菌酶为例)，吸附时的pH酸性(3～6)较好，一方面可以增加蛋白的吸附量，又可以避免此时蛋白分子间和分子内二硫键的形成。洗脱时，pH值为碱性(8.7～10)较好，此时利于二硫键的形成，又不会增加二硫键的错配的几率。高的pH值同样有助于此种复性蛋白的洗脱。
选择合适的温度范围，对于一股的包涵体蛋白，适用的温度范围在4度到25度。温度较高时，可以促进蛋白折叠的反应，但是也同时提高了蛋白折叠过程中副反应的速度。低温下各种反应速度降低，会影响蛋白复性的速度。一股情况下，对于快速的已于折叠的蛋白，在25度下可以获得较高的收率。而对于蛋白折叠缓慢，或者需要多聚体的组装过程的蛋白，在低温下较好。
本发明在离子交换层析复性的基础上，提供了能使变性蛋白或者包涵体蛋白快速、简便的纯化的工艺，在蛋白纯化的同时，也可以达到了蛋白复性的目的；与其他的复性方法相比，两种流动相的设置，大大简化了操作步骤，提高了蛋白在高浓度下的复性的效率。
具体实施方式
实施例1，复性变性的天然鸡卵白溶菌酶：
本实施例使用的离子交换层析柱为SP Sepharose Fast Flow预装柱，柱体积为5mL；
溶解天然鸡卵白溶菌酶的缓冲液为0.05mol/L的Tris-HCL，pH 6.0，并含8mol/L脲素和0.1mol/LDTT；
平衡、上样及冲洗缓冲液(流动相I)为0.05mol/L Tris-HCL，pH 6.0，并含6mol/L脲脲素和3mmol/LGSD，0.3mmol/LGSSG；
洗脱缓冲液(流动相II)为0.1mol/L Tris-HCl，pH9.5，并含1mol/L脲、0.3mol/L NaCl、3mmol/L GSH、0.3mmol/L GSSG；
上样8mg变性天然鸡卵白溶菌酶，使用的流速为0.4mL/min，一个柱体积的梯度(5mL)；变性并同时纯化过程中脲浓度降低梯度(由6mol/L降低到1mol/L)和pH值梯度(pH从6升高到9.5)，获得的活性回收为95％，蛋白回收为98％。
结果显示：变性的天然鸡卵白溶菌酶经过本发明的方法复性后，洗脱出两个峰，峰1是变性蛋白中含有还原剂DTT的吸收峰；峰2是变性后天然鸡卵白溶菌酶洗脱峰。
实施例2，复性并同时纯化包涵体蛋白Fe-SOD
本实施例使用的离子交换层析柱为Q Sepharose Fast Flow预装柱，体积5mL；
溶解包涵体蛋白Fe-SOD的缓冲液为0.05mol/L PBS缓冲液，pH 8.5，并含有10mol/L脲和3％Triton X-100；
平衡和进样缓冲液(流动相I)为0.05mol/L PBS，pH 8.5，并含有6mol/L脲，0.01mol/L FeCl3和3％Triton X-100；
洗脱缓冲液(流动相II)为0.1mol/L PBS，pH 6.5.并含有1mol/L脲，0.01mol/LFeCl3，0.2％Triton X-100，0.2mol/L NaCl，
上样4mg包涵体蛋白Fe-SOD复性溶液，0.3mL/min的流速，两个柱体积的梯度。
此过程使用含有混合变性剂(脲和TritonX-100)的洗脱缓冲液(流动相II)，增加了包涵体蛋白Fe-SOD的溶解性，最终获得了92.5％的蛋白回收，活性回收为48％，在60分钟之内完成操作。而稀释复性需要40小时以上，蛋白终浓度为40μg/mL，活性回收为12％；
SDS-PAGE分析显示复性后的蛋白是电泳纯。Fe-SOD包涵体经过本发明的方法复性(离子交换层析复性)后的活性，比稀释复性的活性收率提高很多，并且同时具有纯化作用，收集的样品为纯品。
实施例3：复性并同时纯化包涵体蛋白人溶菌酶
本实施例使用的离子交换层析柱为SP Sepharose Fast Flow 7mL；
溶解包涌体蛋白的缓冲液为0.05mol/L Tris-HCl，pH 5.5，并含有8mol/L脲和0.1mol/L dithiothreitol(DTT)；
上样缓冲液(流动相I)为0.05mol/L Tris-HCl，pH 5.5，并含有6mol/L脲、3mmol/LGSH和0.3m6mol/L GSSG；
洗脱缓冲液(流动相II)为0.1mol/L Tris-HCl，pH 10.0，并含有1mol/L脲、0.2mol/L(NH4)2SO4、3mmol/L GSH和0.3mmol/L GSSG，流速为0.4mL/min，一个柱体积的梯度，上样蛋白8mg；
复性后蛋白的比活平均为42618U/mg，蛋白收率98％，终蛋白浓度1-1.2mg/mL；复性的时间从稀释复性的8.5小时缩短到离子交换层析的2个小时以内。结果显示，本实施例的电泳图谱同样达到电泳纯。
本发明的方法具有提供复性率和纯化目标蛋白的双重作用。本方法与传统的稀释复性、简单的离子交换方法或单梯度离子交换层析方法相比，具有较大的优势。
Claims (4)
1.一种纯化包涵体蛋白的方法，其特征在于，该方法为将溶解的包涵体蛋白在离子交换层析柱中进行变性剂浓度的梯度洗脱或pH值的梯度洗脱或同时进行变性剂的浓度梯度洗脱及pH值的梯度洗脱；其具体步骤是：
1)酸性/碱性流动相I或者其它溶液溶解的包涵体蛋白进经流动相I平衡后的离子交换层析柱，包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上；
2)然后用酸性/碱性流动相II梯度取代酸性/碱性流动相I对包涵体蛋白溶液进行梯度洗脱，洗脱梯度长度为1-5个的柱体积，流动相II中的变性剂的浓度低于流动相I中变性剂的浓度；
所述的变性剂为脲、Triton或Tween；在流动相I中的浓度为6～10mol/L；在流动相II中的浓度为0.5～3mol/L；所述的流动相I为酸性缓冲液，pH为3～7；流动相II为碱性缓冲液，pH为8～11。
2.按权利要求1的方法，其特征在于，流动相I为碱性缓冲液，pH为8～11；流动相II为酸性缓冲液，pH为3～7。
3.按权利要求1的方法，其特征在于，所述的酸性缓冲液为含单一硼酸盐、醋酸盐或碳酸盐的酸性缓冲液或为混合酸性缓冲液。
4.按权利要求1的方法，其特征在于，所述的离子交换层析介质为DEAE SepharoseFast Flow、SP Sepharose Fast Flow、Q Sepharose Fast Flow或CM Sepharose Fast Flow。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110148084XA CN102807599A (zh) | 2011-06-02 | 2011-06-02 | 一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201110148084XA CN102807599A (zh) | 2011-06-02 | 2011-06-02 | 一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102807599A true CN102807599A (zh) | 2012-12-05 |
Family
ID=47231485
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201110148084XA Pending CN102807599A (zh) | 2011-06-02 | 2011-06-02 | 一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102807599A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113004375A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-22 | 华南农业大学 | 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1219793C (zh) * | 2002-12-16 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种复性蛋白质的方法 |
| CN100336824C (zh) * | 2005-12-19 | 2007-09-12 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种重组蛋白的高效变复性的方法 |
| CN100387614C (zh) * | 2001-09-27 | 2008-05-14 | 中国科学院过程工程研究所 | 包涵体蛋白复性并同时纯化的方法 |
-
2011
- 2011-06-02 CN CN201110148084XA patent/CN102807599A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN100387614C (zh) * | 2001-09-27 | 2008-05-14 | 中国科学院过程工程研究所 | 包涵体蛋白复性并同时纯化的方法 |
| CN1219793C (zh) * | 2002-12-16 | 2005-09-21 | 中国科学院过程工程研究所 | 一种复性蛋白质的方法 |
| CN100336824C (zh) * | 2005-12-19 | 2007-09-12 | 百奥泰生物科技(广州)有限公司 | 一种重组蛋白的高效变复性的方法 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113004375A (zh) * | 2021-03-15 | 2021-06-22 | 华南农业大学 | 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白 |
| CN113004375B (zh) * | 2021-03-15 | 2022-07-01 | 华南农业大学 | 一种高效介导重组多肽形成包涵体的小分子蛋白 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6471183B2 (ja) | 生体分子の精製 | |
| US20170173537A1 (en) | Apparatus and methods for fractionation of biological products | |
| ES2601889T3 (es) | Método y aparato para purificación cromatográfica | |
| Mukherjee | Isolation and purification of industrial enzymes: advances in enzyme technology | |
| JP2018048162A (ja) | フロースルー式での生物製剤からのタンパク質凝集体の除去 | |
| ES2250544T3 (es) | Procedimiento para la purificacion de proteinas de interferon por cromatografia de intercambio cationico. | |
| KR20070001968A (ko) | 항체 정제 방법 | |
| AU2010203836A1 (en) | Separation method using single polymer phase systems | |
| WO2010082894A1 (en) | Precipitation of biomolecules with negatively charged polymers | |
| Aires-Barros et al. | Fundamentals of biological separation processes | |
| CN100387614C (zh) | 包涵体蛋白复性并同时纯化的方法 | |
| CN105111390B (zh) | 一种金属螯合纳米介质及制备方法和应用于强化包涵体蛋白复性与集成纯化的方法 | |
| AU2002335952B2 (en) | Method of protein purification | |
| CN103497248A (zh) | 一种从细胞培养上清中分离纯化抗体的方法 | |
| CN102807599A (zh) | 一种纯化包涵体蛋白并复性的方法 | |
| US6310186B1 (en) | Purification of biological preparations | |
| Kadir et al. | Production and downstream processing of biotech compounds | |
| He et al. | Purification of lysozyme by multistage affinity filtration | |
| CN101054405B (zh) | 一种高效复性膜蛋白的方法 | |
| JP2014529330A (ja) | 単一ユニットクロマトグラフィー抗体精製 | |
| CN103626834B (zh) | 一种重组蛋白复性方法 | |
| Jin et al. | A combined refolding technique for recombinant human interferon-γ inclusion bodies by ion-exchange chromatography with a urea gradient | |
| CN107400169A (zh) | 一种肿瘤血管阻断剂融合蛋白的纯化方法 | |
| CN107365388A (zh) | 多聚体蛋白的制备方法 | |
| Wang et al. | Chromatographic refolding of proteins: molecular action and column control |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C02 | Deemed withdrawal of patent application after publication (patent law 2001) | ||
| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Application publication date: 20121205 |