CN101054405B - 一种高效复性膜蛋白的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效复性膜蛋白的方法,该方法首先将溶解的包涵体蛋白在疏水层析柱中进行纯化,然后采用分子筛进行脱盐,最后在离子交换层析柱中进行变性剂浓度洗脱及盐浓度梯度洗脱,诱导蛋白逐渐正确折叠复性,恢复其天然活性。整个过程不使用任何小分子添加物(如GSSG,GSH、PDI等分子伴侣等),降低了成本。该方法具有连续性强、操作简便、成本低廉的特点,通过本法可以获得纯度≥98%高均一性、高活性目标蛋白。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域的蛋白质纯化、复性技术,主要涉及原核细胞表达重组膜蛋白包涵体的复性并纯化的方法,尤其是含有Ig domain的蛋白质的复性方法。
背景技术
当前生物技术获得了飞速的发展,使得大规模生产目标蛋白成为可能。一些含量稀少、不易提取的蛋白,可以通过基因重组技术在宿主细胞重高效表达,最经常使用的宿主细胞是大肠杆菌。大肠杆菌表达目标蛋白具有快速、大量、廉价的优点。但是外源蛋白在大肠杆菌种的大量表达,常常形成蛋白的聚集体,即包涵体。包涵体是无规则伸展肽链的聚集体,没有生物活性,需要对包涵体蛋白进行溶解后复性。
然而,蛋白质的复性问题一直是生物工程中的一个难点和热点。其关键问题来自于复性过程中聚集体的形成。当蛋白在高浓度下折叠复性时,伸展的肽链由于疏水基团的外露,更加容易由于疏水相互作用或者分子间的错配的二硫键形成聚集体。经典的复性方法一般采用稀释法和透析法,前者将变性蛋白直接加入复性缓冲液,高蛋白浓度下往往形成大量沉淀,因而复性时要求很低的蛋白浓;而后者操作繁琐,不利于放大。超滤法复性可以将变性剂用复性缓冲液连续置换,使变性剂浓度缓慢降低,而蛋白浓度不会明显降低,而且便于自动化操作,但剪切力可能导致复性好的蛋白质重新变性而降低活性收率。其它改进的经典复性方法还有脉冲复性、滴加复性和膜管流加复性,它们均不能从根本上解决聚集沉淀的问题。
文献报道稀释复性时在溶液中加入低浓度的助溶剂,如2~3M脲、1~2M盐酸胍、渗透质、表面活性剂(CATB、磷脂等)可以提高活性回收,但结果表明这些方法适用于少数几种蛋白质,且复性的蛋白质浓度依旧较低。还有人从肽链在体内折叠的原理出发,将分子伴侣和折叠酶用于蛋白质的体外折叠复性,取得了良好的效果,但这种方法更增加了生产成本,因此不利于大规模使用。
层析法复性是近年来基于层析分离原理的基础上发展起来的一种新的复性方法。这种方法对蛋白比较温和,处理的蛋白浓度可以很高,操作简单、周期短,被广泛用于进行蛋白质复性,因此逐渐发展成一种将纯化和复性结合起来的复合式纯化方法。
目前,层析复性的方法主要有:(1)亲和层析复性,包括固定化分子伴侣、固定化脂质体、巯基配基共价层析、底物配基亲和层析、金属螯合层析等,它们或者能结合不稳定的折叠中间体或者对蛋白质的复性有诱导效果,可以加快活性中心的形成,从而提高活性收率;(2)凝胶过滤层析,蛋白在通过凝胶层析介质的同时脱去了变性剂,蛋白发生折叠复性,但是这种过程中变性剂的瞬间脱出,也容易造成聚集体的形成,不容的聚集体会造成柱子的堵塞;凝胶过滤层析本身对上样量限制的要求同样限制了这种方法的工业应用。(3)疏水层析,是将欲分离的混合蛋白质在高盐浓度下与疏水配体结合,然后逐渐降低盐浓度,将蛋白洗脱出来。这种方法可以完全取出变性剂,并使蛋白在层析介质上折叠复性,但是一些蛋白在高盐的情况下活性不高,而且疏水层析适用的高浓度的盐离子容易造成蛋白的盐析沉淀。(4)离子交换层析复性,利用蛋白质的电荷将其吸附,通过改变洗脱剂的变性剂浓度使其复性,其优点也是有效地防止蛋白质的聚集。
以上层析复性方法各有所长,任何一种方法都并非适合所有蛋白质的复性。单独使用某一种方法可能会实现成功复性,但活性目标蛋白的得率和纯度难以实现双赢。尤其是某些复性后蛋白的应用对于纯度有极高需求,仅仅对其进行一次性地复性纯化是不够的。而蛋白复性之后再对其进行二次纯化损失较大。另外,研究发现利用高纯度的包涵体蛋白进行复性,其效率较不纯的包涵体复性得率更高。
目前层析复性蛋白质的成功例子已有很多,但利用其进行膜蛋白的复性还是难点。膜蛋白是一类结构独特的蛋白质,膜蛋白镶嵌于膜脂的特性使这一类蛋白质处于细胞与外界的交界部位,它介导细胞与外界之间的信号传导,并执行很多基本的和重要的细胞生物学功能。例如,它们构成了各种神经信号分子、激素和其他底物的受体;构成了各种离子跨膜的通道;以及构成呼吸链和转运蛋白。据估计,膜蛋白约占所有序列编码蛋白的1/3,其中只有很小的部分结构得以解析,而研究膜蛋白在的精细拓扑结构和功能具有重要意义,因此必须在体外表达,而自身的复杂结构使得原核系统表达得到的往往都是包涵体蛋白。又因其具有较强的疏水性,复性的难度也较一般蛋白困难很多。
发明内容
本发明的目的在于,提供一种高效复性膜蛋白的方法,该方法能够高效复性膜蛋白包涵体蛋白质并获得高纯度、高均一性的活性目标蛋白。
为了实现上述任务,本发明采取如下的技术解决方案:
一种高效复性膜蛋白的方法,其特征在于,首先将溶解的包涵体蛋白在疏水层析柱中进行纯化,然后采用分子筛进行脱盐,最后在离子交换层析住中进行变性剂浓度洗脱及盐浓度梯度洗脱,诱导蛋白逐渐正确折叠复性,恢复其天然活性,其具体步骤包括:
(1)疏水层析:
a.层析柱平衡:用第一流动相平衡常规疏水层析柱;
b.变性蛋白吸附:用含0~0.2M还原剂的第一流动相溶解包涵体蛋白质,然后加入到层析柱中,使其与介质吸附,继续用第一流动相冲洗2~10个柱体积以除去未结合蛋白;
c.变性蛋白质洗脱纯化:流动相进行梯度洗脱1~15个柱体积,收集洗脱峰,第二个峰为目标蛋白;
(2)凝胶过滤层析:
用第二流动相平衡常规凝胶过滤层析介质;上样目标蛋白,收集流出蛋白峰,即为脱盐的蛋白;
(3)离子交换层析:
a.层析柱平衡:用第三流动相平衡常规离子交换层析介质;
b.变性蛋白吸附:脱盐的蛋白流经离子交换层析柱,包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上,第三流动相冲洗2~10个柱体积以除去未结合蛋白;
c.变性蛋白洗脱复性:用第四流动相梯度洗脱1~8个柱体积,使蛋白质解吸并逐渐形成天然结构。
本发明在离子交换层析复性的基础上,提供了能使包涵体蛋白快速、高效的复性的工艺,蛋白复性的同时,可以实现与其他杂蛋白进行分离纯化的目的,与其他的复性方法相比,第一步疏水层析纯化步骤的添加,大大提高了蛋白的复性效率,更获得了极高的纯度。
本发明带来的技术效果是:
(1)采用高载量的疏水介质第一步纯化,提高了蛋白复性率;
(2)采用凝胶过滤更换缓冲系统,方法简单快速,操作过程温和,对蛋白损伤小;
(3)采用离子交换层析同时进行蛋白质复性纯化,获得了高纯度的活性蛋白质;
(4)复性过程所有步骤中无需添加任何小分子辅助物质(如GSSG,GSH、PDI等分子伴侣等),成本低廉。
附图说明
图1是疏水层析色谱图;
图2是疏水层析电泳图;图中的标号分别是,1、原样;2、硫酸胺沉淀;3、穿过峰;4、峰f1(有紫外吸收的非蛋白小分子);5、峰f2(杂蛋白);6、目标蛋白;7、Marker。
图3是离子交换层析色谱图;
图4是离子交换层析电泳图及western blot图;图中的标号分别是,11、离子交换洗脱峰;12、Marker;13、Western blot;
图5是圆二色谱分析图;
下面结合附图及发明人给出的实施例对本发明作进一步详细描述。
具体实施方式
申请人结合长期对膜蛋白的性质研究,综合各层析复性方法的特点,发明了一种简单、快速、高效的膜蛋白复性、纯化方法,获得的高纯度、高均一性、高活性的产物蛋白能广泛应用于各类研究(如蛋白质结构研究等),同时此法具有大规模放大的潜能。
本发明的方法是利用疏水层析和离子交换组合系统复性、纯化蛋白质,其特征在于,该方法首先将溶解的包涵体蛋白在疏水层析柱中进行纯化,然后采用分子筛进行脱盐,最后在离子交换层析住中进行变性剂浓度洗脱及盐浓度梯度洗脱,诱导蛋白逐渐正确折叠复性,恢复其天然活性,其具体步骤包括:
一、疏水层析:
(1)层析柱平衡:用第一流动相I平衡常规疏水层析介质;第一流动相I为含0~200mM还原剂、2~10M变性剂、0~4M无机盐、pH2~9的缓冲液;流速为1~10ml/min。
(2)变性蛋白吸附:将变性缓冲液(第一流动相I)溶解的包涵体蛋白质,加到疏水层析柱上,使变性蛋白质的疏水部位与层析介质上的疏水基团结合,流速为1~10ml/min。
(3)变性蛋白质洗脱纯化:包涵体蛋白质溶解液被上述疏水介质吸附后,用第一流动相I冲洗2~10个柱体积,然后用流动相II梯度取代第一流动相I对包涵体进行梯度洗脱(0~100%,1~15个柱体积),洗脱纯的目标蛋白质;流速为1~10ml/min。
所述的方法中优选的盐为无机盐,如硫酸铵、氯化钠等;变性剂为2~10M脲或2~7M盐酸胍,活性剂为表面活性剂为曲拉通(Triton)或吐温(Tween);所述的还原剂为含游离巯基的化合物,可以是巯基乙醇、二硫苏糖醇或二硫赤鲜糖醇等;优选疏水性的介质是丁基琼脂糖介质(Butyl Sepharose FF)、苯基琼脂糖介质(Phenyl Sepharose HP)、辛基琼脂糖介质(Octyl SepharoseFF)。
二、凝胶过滤层析:
第二流动相II平衡凝胶过滤层析柱后,加入疏水层析第一步纯化后的包涵体蛋白,收集流出蛋白峰,便可将分离包涵体蛋白纯品,实现脱盐。优选凝胶过滤介质是Sephadex G~25,流速为1~10ml/min。
三、离子交换层析:
(1)离子柱平衡:用第三流动相III平衡常规离子交换层析介质;流动相III为0~0.2M还原剂、2~10M变性剂、0~4M无机盐、pH2~9、0.05~0.1%表面活性剂的缓冲液;流速为1~10ml/min。
(2)变性蛋白吸附:上一步纯化的包涵体蛋白流经第三流动相III平衡后的离子交换层析柱,包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上;流速为1~10ml/min。
3)变性蛋白洗脱复性:步骤2)中纯化的包涵体蛋白质被上述选择的离子交换介质吸附后,用第三流动相III冲洗2~10个柱体积,然后用第四流动相IV梯度洗脱(0~100%,1~8个柱体积),使蛋白质解吸并逐渐形成天然结构。洗脱流速为1~10ml/min;第四流动相IV的变性剂的浓度低于第三流动相III中的变性剂的浓度;流速为1~10ml/min。
上述的离子交换层析介质可为DEAE Sepharose Fast Flow、Q SepharoseFast Flow。
疏水相互作用层析是基于蛋白质表面的疏水性氨基酸和固相介质表面疏水配基之间的吸附作用的一种分离方法.不同蛋白质表面的疏水性氨基酸数量不同,分布和种类也不同,所以可以在疏水介质上进行分离.同理,折叠的和未折叠的蛋白质的疏水性不同,有望在介质上发生不同的吸附,并且利用在层析柱中的运动实现彼此分离。但这种方法仅适于表面疏水性很强的蛋白,否则疏水层析使用的高浓度的盐离子容易造成蛋白的盐析沉淀,并且一些蛋白在高盐的情况下活性不高。且变性的天然蛋白质的疏水基团都暴露在外,在复性过程中介质具有人工分子伴侣的特性,它既可以吸附变性的天然蛋白质又可以吸附折叠中间体,疏水配基在蛋白质周围的存在会引起系统自由能的变化,因为蛋白质内部疏水基团的相互结合和蛋白质与疏水介质的吸附作用是个竞争过程,因此它可能破坏蛋白质折叠热力学平衡,导致错误折叠。疏水吸附对于蛋白质折叠来说也是双面剑:既可以促进正确折叠也可以促进错误折叠。疏水相互作用层析介质能够和蛋白质的疏水残基相结合,对蛋白质有保护作用,但是因为蛋白质的折叠过程是疏水残基逐渐内卷并被亲水残基包埋的过程,如果蛋白质的大部分疏水残基被结合可能会阻止蛋白质的折叠。膜蛋白表面也存在大量疏水残基,因此应用疏水层析不适于进行复性,却十分利于分离膜蛋白实现纯化之目的。
使用凝胶过滤更换缓冲系统,方法简单快速,与透析、超滤等普通方法相比操作过程温和,对蛋白损伤小,也在某种程度上也是对蛋白的又一次纯化,为下一步复性做好准备。
离子交换层析的复性效果好,且能够使复性和纯化同时进行,蛋白质复性过程中,溶解的包涵体蛋白首先与层析介质结合,一般此步骤为混杂的包涵体蛋白吸附到层析柱上,层析柱和蛋白质之间会发生多点吸附,变性剂的除去的过程即为蛋白质复性的过程,但那些未经纯化的蛋白质样品可能造成某些蛋白质的洗脱困难,使收率降低。纯化之后的包涵体蛋白质经离子交换层析,复性的同时也是二次纯化的过程,这样获得的活性蛋白质具有更高的纯度。
申请人根据膜蛋白自身的特征结合各种介质的优劣,选择采用疏水层析和离子交换层析组合系统进行膜蛋白复性。
以下是发明人给出的一个具体实例。
HAb18G是一个单次跨膜糖蛋白,胞外4个半胱氨酸形成2个二硫键构成IgSF典型的半球型结构域。申请人利用pET系统构建了原核表达质粒,转化大肠杆菌Rossetta菌株,IPTG诱导表达HAb18G蛋白,得到包涵体形式的目标蛋白。
1.疏水层析:
使用的疏水介质为Phenyl-Sepharose HP,XK16/20层析柱,体积为25~30ml;层析系统为AKTA purifier-100系统。
首先用Tris~Cl缓冲液(0.02~0.05M,pH6.0~9.0,6~8M脲)溶解HAb18G包涵体;第一流动相I(0.02~0.05M Tris~Cl,pH6.0~9.0,6~8M脲,1.0~2.0M硫酸铵)平衡疏水层析柱,加入溶解的包涵体蛋白,使其与介质吸附,并继续用第一流动相I冲洗5倍柱体积;然后用第二流动相II(0.02~0.05MTris~Cl,pH6.0~9.0,含6~8M脲素)以15CV(柱体积)梯度洗脱(如图1,2所示)。如附图1所示疏水层析实现了目标蛋白的分离,无穿过峰损失;附图2电泳银染结果可见分离的目标蛋白纯度达95%。
上样流速为1ml/min~3ml/min,洗脱流速为2ml/min~5ml/min;
2.凝胶过滤层析置换缓冲体系:
使用的凝胶过滤介质为G-25,XK26/20层析柱,体积为35~40ml;层析系统为AKTA purifier-100系统。
首先用第二流动相II平衡层析柱,上样疏水层析得到的纯品目标蛋白,恒定流速为4~10ml/min,收集蛋白峰,实现脱盐。
3.离子交换层析复性、再次纯化包涵体蛋白:
本实施例使用的离子交换介质为DEAE Sepharose Fast Flow,XK16/20层析柱,体积为25~30ml;层析系统为AKTA purifier-100系统。
首先用第三流动相III(0.02~0.05M Tris~Cl,pH6.0~9.0,并含6~8M脲素,0.05%Triton X-100)平衡离子交换层析柱;上样脱盐的纯目标蛋白,使其与介质吸附,并继续用第三流动相III冲洗2-10个柱体积,使Triton X-100充满于整个层析柱;然后用第四流动相IV(0.02~0.05MTris-Cl,pH6.0~9.0,含0~2M脲素,1M NaCl)以15CV(柱体积)梯度洗脱(如图1,2所示),过程中脲浓度梯度降低、盐浓度梯度升高。
上样流速为1-3ml/min,洗脱流速为2-5ml/min;
从附图3离子交换色谱可见单一洗脱峰。附图4电泳银染结果显示复性后天然结构蛋白纯度达98%以上;
4.复性结果:附图4 werstern blot结果显示复性之后的HAb18G具有天然生物活性;附图5圆二色谱图显示蛋白质二级结构,图中黑实线为复性之后的HAb18G二级结构,与复性之前(虚线所示)相比,在215nm处有一负峰,为典型Ig domain天然结构。
Claims (2)
1.一种高效复性膜蛋白的方法,该方法首先将溶解的包涵体蛋白在疏水层析柱中进行纯化,然后采用分子筛进行脱盐,最后在离子交换层析柱中进行变性剂浓度洗脱及盐浓度梯度洗脱,诱导蛋白逐渐正确折叠复性,恢复其天然活性,其特征在于,所述的膜蛋白为膜蛋白HAb18G,其具体步骤包括:
(1)疏水层析:
a.层析柱平衡:用第一流动相平衡介质为丁基琼脂糖介质、苯基琼脂糖介质或辛基琼脂糖介质的疏水层析柱;
b.变性蛋白吸附:用第一流动相溶解包涵体蛋白质,然后加入到层析柱中,使其与介质吸附,上样流速为1ml/min~3ml/min;继续用第一流动相冲洗2~10个柱体积以除去未结合蛋白;
c.变性蛋白质洗脱纯化:用第二流动相进行梯度洗脱1~15个柱体积,洗脱流速为2ml/min~5ml/min,收集洗脱峰,第二个峰为目标蛋白;
(2)凝胶过滤层析:
用第二流动相平衡G-25,XK26/20凝胶过滤层析柱;上样目标蛋白,恒定流速为4~10ml/min,收集流出蛋白峰,即为脱盐的蛋白;
(3)离子交换层析:
a.层析柱平衡:用第三流动相平衡介质为DEAE Sepharose Fast Flow,XK16/20的离子交换层析柱;
b.变性蛋白吸附:脱盐的蛋白流经离子交换层析柱,包涵体蛋白可逆地被吸附在层析介质上,上样流速为1~3ml/min,第三流动相冲洗2~10个柱体积以除去未结合蛋白;
c.变性蛋白洗脱复性:用第四流动相梯度洗脱15个柱体积,洗脱流速为2~5ml/min,使蛋白质解吸并逐渐形成天然结构;
所述的第一流动相为0.02~0.05M Tris~Cl,pH 6.0~9.0,6~8M脲,1.0~2.0M硫酸铵;
第二流动相为0.02~0.05M Tris~Cl,pH 6.0~9.0,含6~8M脲素;
第三流动相为0.02~0.05M Tris~Cl,pH 6.0~9.0,并含6~8M脲素,0.05%Triton X-100;
第四流动相为0.02~0.05M Tris-Cl,pH 6.0~9.0,含0~2M脲素,1M NaCl。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述的第一流动相还含有含0~0.2M的还原剂,还原剂为含游离巯基的化合物,它们是巯基乙醇、二硫苏糖醇或二硫赤藓糖醇。
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