PT1931704E

PT1931704E - Produção e purificação de il-29

Info

Publication number: PT1931704E
Application number: PT06816409T
Authority: PT
Inventors: Bruce L Zamost; Geoffrey F Lee; Robert M Dedinsky
Original assignee: Zymogenetics L L C; Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 2005-10-04
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2011-03-28
Also published as: US20130143270A1; AU2006299339B2; EP1931704B1; US20080096252A1; US20100222552A1; CA2625208A1; ATE491722T1; IL227691A0; JP5364375B2; ES2357152T3; IL189994A; US7759092B2; JP2012235789A; US20100003722A1; AU2006299339A1; US7968315B2; DE602006018969D1; CY1112323T1; US8759027B2; US20120015403A1

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Método de produção de um polipeptídeo IL-29 compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira de E. coli ompT deficiente e/ou fhuA deficiente compreende um vector de expressão compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados: (i) um promotor de transcrição; (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo IL-29 compreendendo resíduos de aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 1-183 da SEQ ID NO: 4 ou resíduos de aminoácidos 1-176 da SEQ ID NO: 6; e (iii) um terminador de transcrição; num primeiro meio de crescimento sob condições em que o polipeptídeo IL-29 codificado é expresso num balão de agitação para um OD600 de 5 a 20; (b) inoculação de um recipiente de fermentação com 1 a 5% v/v de meio num frasco agitado contendo células hospedeiras; (c) cultura de células hospedeiras num segundo meio de crescimento a um pH de 6,2 a 7,2, onde uma solução de alimentação de carboidratos é alimentado no tanque de fermentação de 6 a 8 horas decorrido o tempo de fermentação; (d) adição de um agente indutor ao tanque de fermentação de 20 a 30 horas decorrido o tempo de fermentação; e (e) colheita das células hospedeiras a 48 a 56 horas decorrido o tempo de fermentação.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, em que a solução de alimentação de carboidratos compreende um glicerol ou glicose, na concentração de 10 a 30 g/L de meio de crescimento, e uma taxa de alimentação de 5-15 gramas de glicerol ou glicose por litro por hora. 1
3. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o vector de expressão compreende ainda um intensificador de translação.
4. Método de acordo com a reivindicação 3, em que o intensificador de translação é a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13.
5. Método de acordo com a reivindicação 1, em que o agente indutor do passo (d) é tiogalactopiranoside isopropilico, de preferência em que o tiogalactopyranoside isopropilico é adicionado à cultura a uma concentração de 0,5 nM a 2 mM.
6. Método de recuperação de um polipeptideo IL-29 de células de E. coli de um ompT deficiente e/ou um fhuA deficiente compreendendo: (a) cultivar a célula hospedeira compreende um vector de expressão compreendendo os seguintes elementos operacionalmente ligados: (i) um promotor de transcrição; (ii) uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptideo IL-29 compreendendo resíduos de aminoácidos 1-182 da SEQ ID NO: 2, resíduos de aminoácidos 1-183 da SEQ ID NO: 4 ou resíduos de aminoácidos 1-176 da SEQ ID NO: 6; e (iii) um terminador de transcrição; em meio de crescimento sob condições em que o polipeptideo IL-29 codificado é expresso; (b) adição de um agente indutor para induzir a expressão do polipeptideo IL-29; (c) colheita das células hospedeiras; (d) lisar as células hospedeiras; (e) centrifugar as células hospedeiras lisadas; (f) recuperar o sedimento do corpo de inclusão; 2 (g) solubilizar o sedimento do corpo de inclusão em 4-6 M de hidrocloreto de guanidina e 10-50 mM de ditiotreitol por 1-2 horas a 15-25°C; e (h) adicionar o polipeptideo IL-29 solubilizado para um tampão redobrado compreendendo 0,05-0,5% de polietileno glicol, sal, 0,5 M - 1,25 M de arginina e uma mistura de moléculas reduzidas e oxidadas por 1-26 horas a uma temperatura de 40-30°C e um pH 7,3-8,5, em que o polipeptideo IL-29 solubilizado é redobrado; (i) atenuar a reacção redobrada ajustando o pH para 5,5-6,5; (j) diluição da solução redobrada extinta de 1,5 a 10 vezes em água ou tampão de baixa força iónica, pH 5-7; e (k) filtragem da solução redobrada extinta diluída através de filtros para remover partículas ou precipitado.
7. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as células hospedeiras procarióticas da etapa (d) são lisadas por homogeneização.
8. Método de acordo com a reivindicação 6, em que as células hospedeiras procarióticas lisadas da etapa (e) são centrifugadas por centrifugação em lote ou contínua.
9. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o polipeptideo IL-29 da etapa (h) é adicionado ao tampão de renaturação numa concentração final de 0,05-3,0 mg/mL.
10. Método de acordo com a reivindicação 6, em que a mistura de moléculas reduzidas e oxidadas do tampão de renaturação são seleccionadas do grupo consistindo em cisteína e cistina, ditiotreitol e cistina glutationa reduzida e glutationa oxidada e glutationa oxidada e ditiotreitol.
11. Método de purificação de um polipeptideo IL-29 compreendendo: (a) fornecer o polipeptideo IL-29 de acordo com o passo (k) da reivindicação 6; 3 (b) carregar a solução filtrada compreende o polipeptídeo IL-29 redobrado da etapa (a) num coluna de cromatografia de troca catiónica equilibrada com acetato de sódio em pH 5,5; (c) eluição do polipeptídeo IL-29 vinculado com o cloreto de sódio em acetato de sódio, pH 5,5; e (d) adaptar o eluido com sulfato de amónio para uma concentração de 1 M, e passar o polipeptídeo IL-29 ajustado eluato através de um filtro de 0,45 mM.
12. Método de acordo com a reivindicação 11, em que o polipeptídeo IL-29 é eluido a partir da coluna de troca catiónica para formar um lote de cerca de 0,7 M - 0,8 M de cloreto de sódio após o uso de eluição por gradiente linear de 0-2M de cloreto de sódio.
13. Método de acrdo com a reivindicação 11 compreendendo ainda: (e) carregar o polipeptídeo IL-29 da etapa (d) numa coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica equilibrada com 50 mM de acetato de sódio, 1,5 M de sulfato de amónio, pH 5,5; (f) eluição do polipeptídeo IL-29 com 50 mM de acetato de sódio linear, 1,5 M de sulfato de amónio a 50 mM de acetato de sódio, sem sulfato de amónio, pH 5,5; (g) diluir o eluido cerca de 6 vezes com água ou tampão de baixa força iónica e passando o polipeptídeo IL-29 diluído eluido através de um filtro de 0,2 mM ou 0,45 pm.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que o polipeptídeo IL-29 é eluido a partir da coluna de cromatografia de interacção hidrofóbica em cerca de 0,75 M de sulfato de amónio a 0 M de sulfato de amónio.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 compreendendo ainda: (h) carregamento do polipeptídeo IL-29 da etapa (g) numa coluna de cromatografia de troca catiónica de alto desempenho equilibrada com 5 0 mM de acetato de sódio compreendendo 0-300 mM de cloreto de sódio, pH 5,5; e 4 (i) eluição do polipeptídeo IL-29 com uma alta concentração de cloreto de sódio em 50 mM de acetato de sódio, pH 5,5, numa etapa ou formato de gradiente de eluição.
16. Método de acordo com a reivindicação 15, em que o polipeptídeo IL-29 eluido da coluna de cromatografia de troca catiónica de alto desempenho em cerca de 0,4 M de cloreto de sódio a 0,6 M de cloreto de sódio após o uso de gradiente de eluição de 300 a 800 mM de cloreto de sódio.
17. Método de concentrar o polipeptídeo IL-29 compreendendo: (a) fornecer o polipeptídeo IL-29 de acordo com o passo (i) da reivindicação 15; (b) adicionar o polipeptídeo IL-29 para uma placa de fluxo tangencial e sistema de filtragem de quadros compreendendo uma ou mais membranas de corte de peso molecular de 30-10 kDa; (c) a aplicação de uma pressão transmembrana de 15-25 psi para o sistema parta ultrafiltrar a solução para uma concentração maior; e (d) filtragem do polipeptídeo IL-29 concentrado através de uma membrana de 0,2 pm.
18. Método de purificação do polipeptídeo IL-29 monopeguilatado compreendendo: (a) fornecer 3-5 g/L de polipeptídeo IL-29 produzido por qualquer reivindicação anterior numa solução tampão de acetato de sódio; (b) adição de 10-20 mM de cianoborohidrido sódico à solução da etapa (a); (c) adição de um excesso molar de 2 vezes de polietileno glicol derivatizado para a solução do passo (b); e (d) misturar a solução da etapa (c) por 10-18 horas a 16-20°C. 5
19. Método de purificação do polipeptideo IL-29 monopeguilado compreendendo: (e) fornecer o polipeptideo IL-29 monopeguilado de acordo com a etapa (d) da reivindicação 18; (f) diluição da solução do passo (e) 2 vezes com 50 mM de acetato de sódio, pH 5,5; (g) filtrar a solução de passo (f) através de uma membrana de 0,2 pm; (h) carregar a solução da etapa (g) para uma coluna de cromatografia de troca catiónica de alto desempenho equilibrada com 50 mM acetato de sódio, 200 mM de sódio cloreto, pH 5,5; (i) eluar o polipeptideo IL-29 monopeguilado da coluna de cromatografia de troca catiónica de alto desempenho com 50 mM de acetato de sódio linear, 500 mM de gradiente de cloreto de sódio, pH 5,5; (j) adição do polipeptideo IL-29 monopeguilado para uma placa de filtração tangencial de fluxo e sistema de armação compreendendo uma ou mais membranas de corte de peso molecular de 30-10 kDa; (k) aplicação de uma pressão transmembrana de 15-25 psi para o sistema paqra ultrafiltrar a solução para uma concentração mais elevada; (l) utilização do sistema para troca de tampão do polipeptideo IL-29 concentrado numa formulação tampão apropriada por diafiltração; e (m) filtragem do polipeptideo IL-29 concentrado monopeguilado através de uma membrana de 0,2 pm.
20. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o polietileno glicol compreende 20 kDa e 30 kDa de mono-metoxiPEG-propionaldeído.
21. Método de acordo com a reivindicação 19, em que o polietileno glicol é N-terminal ligado ao polipeptideo IL-29.
22. Método de acordo com a reivindicação 15 ou a reivindicação 17, em que o polipeptideo IL-29 é pelo 6 menos 98% puro através da análise de sódio dodecil sulfato de gel de poliacrilamida e agregados são menos de 0,2% por exclusão de tamanho HPLC.
23. Método de acordo com a reivindicação 17, em que o polipeptideo IL-29 tem um nivel de endotoxina inferior a 10 unidades de endotoxina por miligrama de polipeptideo IL-29 num ensaio de lisado de Limulus amoebocyte baseado em USP <85>.
24. Método de acordo com a reivindicação 18, em que o polipeptideo IL-29 monopeguilado é pelo menos 99% monopeguilado como medido por HPLC de fase reversa.
25. Método de acordo com a reivindicação 6, em que o vector de expressão compreende ainda um intensificador de translação.
26. Método de acordo com a reivindicação 25, em que o intensificador de translação é a sequência de ácido nucleico da SEQ ID NO: 13. 7