CN104531725A - 一种可被4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法，属于生物工程技术领域。本发明所述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列为如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌酰基载体蛋白基因序列或如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽基因中的一种。通过包含上述序列的表达载体构建的大肠杆菌的重组表达系统，获得包含目标蛋白的融合蛋白，经酶AcpS或Sfp催化进行4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，然后进行固定化，实现固定目标蛋白。该固定化方法反应条件温和，操作非常简便，固定化效率高，固定的目标蛋白稳定并保持非常高的活性，具有极大的市场价值与应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，特别涉及一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列及其用于固定蛋白质的方法。
背景技术
固定化蛋白(酶)呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点，而且因为具有节省资源与能源、减少或防治污染的生态环境效应而符合可持续发展的战略要求，在生物医药、食品、生物分析及生物学的基础研究领域具有广泛的应用。传统的蛋白(酶)固定方法包括包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。包埋法制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的蛋白(酶)活力回收。交联法利用游离蛋白(酶)的氨基酸残基与双官能团或多功能团交联剂反应而被固定化，可获得单位浓度较高的固定化蛋白(酶)。吸附法包括物理吸附和离子结合法，工艺简便及条件温和是其显著特点。目前上述的各种酶固定化方法存在各自的不足，包埋法中高分子凝胶或半透膜的分子尺寸选择性不利于大分子底物与产物的扩散，交联法因为较激烈的共价反应而使蛋白(酶)活力损失较大，吸附法中固定的蛋白(酶)易受反应介质pH、离子强度等的影响而从载体上脱落。共价结合法因蛋白(酶)分子与载体之间的共价结合而呈现良好的稳定性及重复使用性，是目前研究最为活跃的一类蛋白(酶)固定化方法，然而非定向的共价固定由于蛋白(酶)在固体介质表面的不均匀分布，常导致蛋白(酶)活性损失较大。目前已开发的蛋白(酶)定向固定化方法，如利用蛋白(酶)与相应抗体的特异性作用、蛋白(酶)与相应配基的特异性相互作用等，操作流程复杂，效率较低，这些不足限制了固定化蛋白(酶)的广泛应用，成为急待解决的主要问题。目前现有的蛋白质(酶)固定化技术操作流程复杂，缺乏特异性。开发简便、温和、适用的固定化方法等是目前固定化蛋白(酶)研究的重要方向，也是目前研究热点之一。
发明内容
为克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列。
本发明的另一目的提供基于上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法。
本发明的上述目的通过如下方案予以实现：一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，优选为如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)基因序列或如核苷酸序列SEQ ID NO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽基因中的一种。
上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，所编码的具有生物活性的短肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4所示。
一种重组表达载体，包含上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，用于将目的蛋白与其融合表达。
上述的重组表达载体的具体制备步骤为：将可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列与目的基因重组融合构建到表达载体获得；所述的表达载体优选为表达载体pET系列载体。
一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌的重组表达系统；具体为：将上述重组表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养至OD600为0.5～0.7，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于30℃诱导蛋白表达10h；5000g，10min，4℃离心收集菌体，获得表达融合目标蛋白的大肠杆菌。
一种基于上述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法，由上述的大肠杆菌的重组表达系统，获得包含目标蛋白的融合蛋白，经酶AcpS或Sfp催化进行4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，然后进行固定化，实现固定目标蛋白。
所述的固定化为在固定化缓冲液中按1mg：0.2ml的比例将重组蛋白与SulfoLink coupling resin(Thermo Scientific)混合，30℃温浴1h，实现蛋白固化。
所述的固定化缓冲液为50mmol Tris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8.5。
本发明提供的蛋白(酶)固定化技术应用可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的蛋白质(短肽)作为融合标签，与目标蛋白融合表达，利用4’-磷酸泛酰巯基乙胺的巯基(-SH)与固体介质上的活性基团特异性反应，形成牢固的共价键，将目标蛋白稳定地固定到固体介质上，且目标蛋白在固体介质表面分布均匀，活性高；同时进行固定化反应时条件温和，不会导致蛋白质变性，整个固定化反应可在1小时内完成，效率极高。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
本发明通过PCR扩增得到一个大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)基因及合成一个可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽基因，分别将其与目标蛋白(酶)基因融合，建立在大肠杆菌的重组表达系统，获得融合的目标蛋白(酶)，经相应的酶催化进行4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，然后进行固定化，该固定化方法反应条件温和，操作非常简便，固定化效率高，固定的目标蛋白(酶)稳定并保持非常高的活性，具有极大的市场价值与应用前景。
本发明提供的蛋白质(酶)固定化技术应用可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的蛋白(短肽)作为融合标签，与目标蛋白融合表达，不仅可以降低目标蛋白在表达过程中的包涵体形成，还可以利用4’-磷酸泛酰巯基乙胺上的巯基(-SH)与固体介质上的活性基团特异性反应，形成牢固的共价键，将目标蛋白(酶)稳定地固定到固体介质上。本专利提供的技术可将目标蛋白(酶)定向固定，目标蛋白(酶)在固体介质表面分布均匀，活性高；同时进行固定化反应时条件温和，不会导致蛋白质(酶)变性，整个固定化反应在1小时内完成。该技术可广泛应用于固定化蛋白(酶)、生物分析、食品、蛋白质分析等领域。
附图说明
图1为大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)经4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰后介导的绿色荧光蛋白(GFP)的固定效果图。A：GFP蛋白的直接固定化(对照)；B：ACP经4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰后介导的GFP固定化。
图2为4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽介导的绿色荧光蛋白(GFP)固定效果图。A：GFP蛋白的直接固定化(对照)；B：4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽介导的GFP固定化。
图3为ACP经4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰后介导的绿色荧光蛋白(GFP)固定化的时间梯度图。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1 一个大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)基因的克隆。
(1)大肠杆菌总DNA的提取
1)挑大肠杆菌MG1655的单菌落于LB液体培养基，37℃培养过夜。
2)5000g离心力离心10min，收集菌体，参照TIANGEN公司的DNA提取说明书，获得大肠杆菌的基因组DNA。
(2)ACP基因的克隆
1)设计2条引物：
2)用F1、R1引物扩增获得一个融合ACP基因(SEQ ID NO：1)，将获得的融合ACP基因片段分别用Nco I与EcoR I酶切，连接到pET28b载体。
(3)ACP与绿色荧光蛋白(GFP)的融合表达
1)表达载体的构建
将GFP基因用EcoR I和Hind III从中间载体pET30a-GFP切下，连接到含有融合ACP基因的表达载体pET28b，菌落PCR、酶切鉴定，测序。
2)融合蛋白ACP-GFP的表达
将上述构建的包含ACP-GFP基因的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取培养基平板上长出的单个克隆，接种至液体LB培养基中培养过夜，按1:100扩大培养至0D600为0.5～0.7，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于30℃诱导蛋白表达10h。5000g，10min，4℃离心收集菌体，获得表达融合蛋白ACP-GFP的大肠杆菌。
实施例2 可被4’‐磷酸泛酰巯基乙胺修饰短肽基因的克隆及其与GFP基因的融合表达。
(1)可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰短肽基因的克隆
1)设计3条引物：
2)以GFP基因为模板，用F2、F3、R2引物扩增获得一个融合基因S-GFP(所述的融合基因S-GFP中包含通过引物F2、F3、R2引入可被4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列SEQ ID NO：2)。引物R2、F3、F2分别依次作为第一轮、第二轮、第三轮PCR的上引进行PCR扩增。
将获得的融合基因S-GFP片段用Hind III与EcoR I酶切，连接到pET28b载体。
(2)融合的GFP基因(S-GFP)的表达
1)表达载体的构建
将融合的GFP基因(S‐GFP)用EcoR I和Hind III酶切，连接到含突变ACP(mACP，该mACP为利用PCR介导的定点突变技术将36-Ser突变成36-Ala)的表达载体pET28b，菌落PCR、酶切鉴定，测序。
2)融合蛋白mACP-S-GFP的表达
将上述构建的表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取培养基平板上长出的单个克隆，接种至液体LB培养基中培养过夜，按1:100扩大培养至0D600为0.5～0.7，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)，于30℃诱导蛋白表达10h。5000g，10min，4℃离心收集菌体。
实施例3 目的蛋白GFP的固定化
(1)融合蛋白ACP-GFP的固定化
表达融合蛋白ACP-GFP的大肠杆菌培养物10ml，离心收集的菌体在4ml缓冲液(50mM NaH2PO4,0.3M NaCl,20mM imidazole,pH 8.0)中超声破碎细胞，经Ni柱亲和层析柱纯化，将获得的高纯度融合蛋白透析，用酶AcpS对纯化的融合蛋白进行4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰，再透析到固定化缓冲液(50mmolTris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8.0)，测定蛋白浓度，将约1mg的重组蛋白与0.2ml SulfoLink coupling resin(Thermo Scientific)混合，30℃温浴1h，测定固定化前后重组蛋白浓度的变化，计算重组蛋白的固定量，用包含50mML-cysteine·HCl的缓冲液冲洗柱子3次，最后用50mmol的磷酸盐缓冲液保存固定化的蛋白。
大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)经4’‐磷酸泛酰巯基乙胺修饰后介导的绿色荧光蛋白(GFP)的固定效果如图1所示，经修饰后ACP介导的GFP固定化效果(图1B)明显优于对照组GFP蛋白的直接固定化(图1A)。
大肠杆菌酰基载体蛋白(ACP)修饰后介导的绿色荧光蛋白(GFP)固定化的时间梯度如图3所示，15min时GFP的固定量已经快速达到6mg/ml；当到45min时，GFP固定量已经基本达到最大固定量9mg/ml。
(2)4’‐磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽介导的GFP固定化
表达融合蛋白mACP-S-GFP的培养物10ml，离心收集的菌体在4ml缓冲液(50mM NaH2PO4,0.3M NaCl,20mM imidazole,pH 8.0)中超声破碎细胞，添加特异性蛋白酶TEV切割表达的融合蛋白，获得目的蛋白S-GFP，经Ni亲和层析柱纯化，将获得的高纯度的融合蛋白透析，用酶Sfp对纯化的融合蛋白进行修饰，再透析到固定化缓冲液(50mmol Tris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8.0)，测定蛋白浓度，将约1mg的重组蛋白与0.2ml SulfoLink coupling resin(ThermoScientific)混合，30℃温浴1h,测定固定化前后重组蛋白浓度的变化，计算重组蛋白的固定量，用包含50mM L-cysteine·HCl的缓冲液冲洗柱子3次，最后用50mmol的磷酸盐缓冲液保存固定化的蛋白。
4’‐磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽介导的绿色荧光蛋白(GFP)固定效果如图2所示，经4’‐磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽介导的GFP固定化效果(图2B)明显优于对照组GFP蛋白的直接固定化(图2A)。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，其特征在于为如核苷酸序列SEQ ID NO:1所示的大肠杆菌酰基载体蛋白基因序列或如核苷酸序列SEQ IDNO:2所示的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的短肽基因中的一种。
2.根据权利要求1所述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，其特征在于：所编码的具有生物活性的短肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4所示。
3.一种重组表达载体，其特征在于包含权利要求1所述的可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列，将其用于与目的基因融合表达。
4.根据权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，具体制备步骤为：将可被4’磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列与目的基因重组融合构建到表达载体获得；所述的表达载体为表达载体pET系列载体。
5.一种包含上述重组表达载体的大肠杆菌的重组表达系统，其特征在于具体为：将权利要求4所述的重组表达载体转化进大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，培养至OD600为0.5～0.7，加入终浓度为0.5mM的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，于30℃诱导蛋白表达10h；5000g，10min，4℃离心收集菌体，获得表达融合目标蛋白的大肠杆菌。
6.一种基于可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法，其特征在于：由权利要求5的大肠杆菌的重组表达系统，获得包含目标蛋白的融合蛋白，经酶AcpS或Sfp催化进行4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰，由4’-磷酸泛酰巯基乙胺的高活性巯基介导固定化，实现固定目标蛋白。
7.根据权利要求6所述的基于可被4’-磷酸泛酰巯基乙胺修饰的序列固定蛋白质的方法，其特征在于：所述的固定化为在固定化缓冲液中按1mg：0.2ml的比例将重组蛋白与Sulfo Link coupling resin混合，30℃温浴1h，实现蛋白固化；
所述的固定化缓冲液为50mmol Tris HCl，5mmol EDTA-Na，pH 8.5。
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