CN109593700A - 一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟e2蛋白的方法与及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法，包括以下步骤：1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签SUMO基因、猪瘟E2基因；2)将步骤1)获得的3种基因连接，获得融合基因；3)将步骤2)获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；4)将步骤3)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；5)将步骤4)获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；6)回收、蛋白酶水解并分离纯化猪瘟E2蛋白，应用本发明的制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗，具有抗原纯度高、生物活性强，同时制备疫苗过程简单，生产成本低。

Description

一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法与及其 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法及其应用。

背景技术

猪瘟在欧洲称为古典猪瘟(Classical Swine Fever，CSF)是由猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus，CSFV)引起猪的一种急性、热性、接触性传染病，病死率高，其病理特征是小血管壁变性，内脏器官多发性出血、梗塞、坏死，是一种危害性极大的猪传染病，世界动物卫生组织(OIE)将其定为A类传染病，我国《动物防疫法》将其列为一类传染病。猪瘟是目前危害我国养猪业发展的主要疫病之一。其症状特别严重、传播迅速、无国界，猪瘟的爆发往往造成巨大的经济损失，并且引发严重的公共卫生问题。

猪瘟病毒属于黄病毒科猪瘟病毒属成员，为单股正链线状RNA病毒。病毒粒子呈球形，直径为40-50nm，具有脂蛋白囊膜，囊膜表面有许多长达6-8nm的糖蛋白纤突。CSFV基因组长约12.5kb，仅含有1个开放性阅读框(ORF)，此ORF编码约3898个氨基酸残基，分子量约438kDa的多聚蛋白。在病毒与宿主细胞蛋白酶的作用下将其加工为12种成熟蛋白，包括4种结构蛋白C，Erns，E1和E2，和8种非结构蛋白Npro，p7，NS2，NS3，NS4A，NS4B，NS5A，NS5B。E2是CSFV最主要的免疫原性蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗CSFV强毒株的攻击，也是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。

控制猪瘟流行的重要手段是疫苗接种。目前我国市场上常用的猪瘟疫苗有3种，即猪瘟脾淋活疫苗(脾淋苗)、猪瘟乳兔组织活疫苗(组织苗)、猪瘟细胞活疫苗(细胞苗)。组织苗和脾淋苗的免疫原性虽然比较好，但是由于在生产中需要大量健康动物，生产过程中人工劳动强度大、成本高，有接种副反应，动物福利及生物安全问题，不容易大规模生产等影响了此类苗的广泛应用。细胞苗是通过体外培养犊牛睾丸细胞扩增病毒制备而成，优点是抗原滴度较高能产生较高的保护性抗体；更易规模化生产，但是，由于在疫苗生产需要使用原代细胞，因此该疫苗也存在较多缺陷，如：原代细胞培养批次差异大且无细胞病变，不易控制病毒滴度；原辅材料涉及犊牛睾丸细胞和牛血清，容易形成BVDV污染的风险(BovineViral Diarrhea Virus，牛病毒性腹泻病毒)。

鉴于现有猪瘟疫苗的种种缺陷和不足，以及随着现代基因工程技术和细胞技术的发展，许多科研人员试图以现代分子生物学手段研制出可以克服现有疫苗缺陷的新型猪瘟疫苗。这些新型的猪瘟疫苗有病毒活载体疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗、大肠杆菌表达蛋白的亚单位疫苗、昆虫杆状病毒表达的蛋白亚单疫苗。目前得到应用的有昆虫杆状病毒表达的E2蛋白亚单位疫苗，但该系统制备目的蛋白的产量不会很高，一般只有200-300mg/L，很难达到500mg/L的产量，生产及使用成本很高，不利于大规模推广应用。

大肠杆菌体外表达的重组E2蛋白具有抗原性好、表达量大、容易纯化、可规模化生产的优势，制备的基因工程疫苗安全、高效，不存在潜在的危害环境和人类安全的危险因素。但重组猪瘟E2蛋白含有多对二硫键，大肠杆菌表达极易形成没有生物活性的包涵体，二硫键错配会造成复性非常困难，很难获得有生物活性的重组猪瘟E2蛋白。因此，迫切需要解决重组猪瘟E2蛋白生物活性问题。

发明内容

本发明主要目的是提供一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法，包括如下步骤：

1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签SUMO基因、猪瘟E2基因；

2)将步骤1)获得的3种基因与大肠杆菌表达载体连接连接，得到含融合基因的重组表达载体；

3)将步骤2)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；

4)将步骤3)获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；

5)回收、蛋白酶水解并分离纯化猪瘟E2蛋白。

优选地，本发明所述的步骤1)中猪瘟E2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO 2。

优选地，所述的促溶标签GST基因包含序列表中的SEQ ID NO 3序列。

优选地，所述的促溶标签SUMO基因包含序列表中的SEQ ID NO5序列。

优选地，本发明所述的步骤2)融合基因，包括但不限于GST-SUMO-E2和SUMO-GST-E2，优选为GST-SUMO-E2。

优选地，本发明所述的步骤2)中大肠杆菌表达载体为市售商品化表达载体，优选的为pET系列表达载体，更优的为pET28a，所得的含融合基因的重组表达载体为pET28a-GST-SUMO-E2，其为经PCR鉴定的，所述的PCR鉴定的引物为T7pro和T7ter，其序列为5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’。

优选地，本发明所述的步骤3)所述大肠杆菌为市售商品化表达菌株，优选的为Origami衍生的系列表达菌株，更优的Rosetta-gami(DE3)pLys，最优的为Rosetta-gami 2(DE3)pLysS。

优选地，本发明所述的重组猪瘟E2蛋白包含下面任意一种多肽：

i)含有序列表中SEQ ID NO1序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备的猪瘟E2蛋白，该猪瘟E2蛋白为可溶蛋白，具有良好的生物活性。

本发明的另一目的在于提供一种由上述方法制备的重组大肠杆菌表达菌株，为Rosetta-gami 2(DE3)pLysS/pET28a-GST-SUMO-E2，其是经过PCR鉴定与诱导表达筛选的高表达重组大肠杆菌。

本发明还提供了一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，在上述制备的猪瘟E2蛋白中，加入佐剂，混合均匀，获得猪瘟E2蛋白亚单位疫苗。

有益效果

1)本发明提供一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法，采用GST-SUMO-E2融合表达，配合具有促进蛋白二硫键折叠的表达宿主菌株Rosetta-gami 2(DE3)pLysS，增加了猪瘟E2蛋白的可溶性，在细胞裂解液上清中获得了表达量较高的可溶性的生物活性蛋白。

2)本法明重新考虑了大肠杆菌的密码子偏好性以及二级结构情况，对猪瘟E2基因核苷酸序列进行了优化，得到了表达量较高的重组蛋白。

3)考虑到蛋白纯化困难的缺点，本发明重组蛋白含有GST和His6两种亲和标签，纯化工艺简单，省去蛋白复性等繁琐步骤。

4)应用此方法制备的猪瘟E2亚单位疫苗，不涉及到强毒，没有致病性，能过在临床使用后产生较高的免疫原性同时安全性得到保证。

综上，猪瘟E2基因在大肠杆菌中获得了可溶表达，经SDS-PAGE和AGP试验鉴定具有良好的生物活性。因此，该基因工程菌可用于猪瘟E2亚单位疫苗的生产中，生产成本较低，纯化方法简单，疫苗防治效果好，在工业上大规模生产猪瘟E2的疫苗上具有良好的应用前景。

附图说明

图1为猪瘟E2基因片段大小；

图2为GST基因片段大小；

图3为SUMO基因片段大小；

图4为pET28a-GST-SUMO-E2菌液PCR鉴定电泳图；

图5为重组GST-SUMO-E2蛋白表达SDS-PAGE电泳图；

图6为重组GST-SUMO-E2蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；

图7为制备的猪瘟E2蛋白亚单位疫苗阻断率对比图

具体实施方式

为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员在不偏离本发明的精神和范围下对本发明技术方案的细节和形式进行的任何修改和替换，均落入本发明的保护范围内。下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。

实施例1猪瘟E2蛋白抗原制备

1)猪瘟E2基因的合成

以Classical Swine Fever Virus(GenBank:AAB50409.1)的E2蛋白的氨基酸序列为基础，如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，再通过大肠杆菌密码子优化反向编译成核苷酸序列，并在其两端加入BamHI和XhoI酶切位点，使其适宜在大肠杆菌中表达(委托通用生物系统(安徽)有限公司合成)，最后的基因序列如：SEQ ID NO:2，命名为E2。

具体构建方法：用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取含有E2基因的质粒pET28a-E2、以pET28a-E2为模板使用下述引物扩增E2片段，用BamHI与XhoI两种内切酶切E2片段，用胶回收试剂盒进行E2片段切胶回收。

采用的引物：

BamHI-E2-F：

5'-ATCGGATCCCTGGCTTGCAAAGAAGATTAC-3'

XhoI-E2-R：

5'-ATCCTCGAGATCAGAATGACGATCGGTAAC-3'

在上下游引物5'端分别加上BamH I和XhoI酶切位点，目的片段长约1026bp。

2)促溶标签GST基因的合成

通过PCR技术将GST基因序列克隆，并在GST序列N端增加6*HIS标签及NcoI酶切位点，C端增加HindIII酶切位点；所构建的GST的基因序列如SEQ ID NO:3所示，所构建的GST氨基酸序列SEQ ID NO:4所示；

具体构建方法：用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取空载质粒pGEX-6P-1、以pGEX-6P-1为模板使用下述引物扩增GST片段，用NcoI与HindIII两种内切酶切GST片段，置于37度反应3小时，用胶回收试剂盒进行GST片段切胶回收。

采用引物：

NcoI-H6-GST-F：

5'-ATACCATGGGTCACCATCACCATCACCATTCCCCTATACTAGGTTATTG-3'

HindIII-GST-R：

5'-ATCAAGCTTCAGGGGCCCCTGGAACAGAAC-3'

在上下游引物5'端分别加上Nco I和HindIII酶切位点，目的片段长约725bp。

3)促溶标签SUMO基因的合成

通过PCR技术将GST基因序列克隆，并在SUMO序列两端分别增加HindIII和BamHI酶切位点；所构建的SUMO的基因序列如SEQ ID NO:5所示核苷酸序列，所构建的SUMO的氨基酸序列SEQ ID NO:6所示；

具体构建方法：用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取空载质粒pET28a-SUMO、以pET28a-SUMO为模板使用下述引物扩增SUMO片段，用HindIII与BamHI两种内切酶切SUMO片段，置于37度反应3小时，用胶回收试剂盒进行SUMO片段切胶回收。

采用引物：

HindIII-SUMO-F：

5'-ATCAAGCTTATGTCGGACTCAGAAGTCAAT-3'

BamHI-SUMO-R：

5'-ATCGGATCCTTGGCCACCAATCTGTTCTCT-3'

在上下游引物5'端分别加上HindIII和BamHI酶切位点，目的片段长约315bp。

4)载体pET28a片段双酶切回收

用质粒提取试剂盒(购自Axygen公司)提取空载质粒pET28a，用NcoI与XhoI两种内切酶切pET28a质粒，用胶回收试剂盒回收pET28a片段。

5)目的片段与载体的连接转化

将E2、GST和SUMO片段与pET28a片段，进行连接，按照以下20μl反应体系配置：E2片段4μl；GST片段4μl；SUMO片段4μl；pET28a片段4μl；T4连接酶2μl；10x T4buffer 2μl，置于16℃反应14小时，之后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态内；反应程序如下：无菌条件下，将10μl连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态内，冰浴30min；取出置于42℃，热激90s；再置于冰浴3min；加入500μl LB液体培养基,37℃恒温摇床复苏培养45min；5000r/min离心5min,去掉上清500μl；剩余重悬菌体后均匀涂布含有50μg/L卡那霉素、1ng/mL四环素、10μg/L链霉素和34μg/L氯霉素四种抗生素的LB平板(0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％氯化钠，0.15％琼脂粉)，置于37℃培养16小时，挑取单菌落，接种于含有50μg/L卡那霉素、1ng/mL四环素、10μg/L链霉素和34μg/L氯霉素四种抗生素的LB液体培养基(0.5％酵母粉，1％胰蛋白胨，1％氯化钠)，培养6小时，以通用引物T7pro和T7ter为引物，其序列为5’-TAATACGACTCACTATAGGG-3’和5’-TGCTAGTTATTGCTCAGCGG-3’进行PCR鉴定，经鉴定正确的菌液抽提质粒并送上海杰李生物有限公司测序正确，重组质粒构建完成，命名为pET28a-GST-SUMO-E2。

6)GST-SUMO-E2蛋白表达

将重组表达载体pET28a-GST-SUMO-E2质粒转化大肠杆菌Rosetta-gami 2(DE3)pLys，获得阳性基因工程菌Rosetta-gami2(DE3)pLysS/pET28a-GST-SUMO-E2，挑取阳性转化子培养至OD600达到0.6，加入终浓度为1mmol/L IPTG，于22℃诱导8小时，4℃7000r/min离心10min收集菌体，加入30ml TBS重悬菌体，超声破碎菌悬液至溶液清亮，12000r/min离心10min，所收集的上清和沉淀液采用SDS-PAGE分析检测目的蛋白的表达。

7)GST-SUMO-E2蛋白纯化

含有GST-SUMO-E2蛋白的大肠杆菌细胞裂解上清与50％谷胱苷肽-琼脂糖树脂填料匀浆混合，每100ml上清加10ml填料，于4℃下轻摇8-12小时；

细胞裂解上清与填料混合物于置于重力纯化柱内，细胞裂解上清流穿，向填料中加入30倍填料体积的TBS洗涤填料；

GST-SUMO-E2融合蛋白可用ULP蛋白酶切割，每毫升填料加入100单位ULP蛋白酶及1ml TBS，将填料及酶液倒入离心管中，颠倒离心管数次混匀，室温下震荡2～4h；

4℃以1500g(2800r/min)离心5min，最后得到上清小心移至新管中，即为猪瘟E2蛋白。

12％SDS-PAGE分析每一步洗涤，洗脱样品得蛋白成分。

结果与分析

1、重组大肠杆菌表达载体pET28a-GST-SUMO-E2载体构建E2，GST，SUMO三个基因PCR扩增后产物经琼脂糖凝胶电泳结果见图1、2、3，图1第1孔为E2目的片段，大小为1026bp，第2孔为DL2000Marker；图2第1孔为GST目的片段，大小为725bp，第2孔为DL2000Marker；图3第1孔为SUMO目的片段，大小为315bp，第2孔为DL2000Marker。

构建好的重组质粒以通用引物T7pro和T7ter为引物，进行PCR鉴定，电泳结果见图4，第1孔为阴性对照，第2-9孔为不同重组子PCR条带第10孔为阳性对照，第11孔为DS10000Marker，由图可知，在2400bp左右有目的条带。

2、GST-SUMO-E2蛋白表达

取诱导后的培养液7000rpm离心6min，收集菌体，弃尽上清，30ml TBS(25mM Tris、150mM NaCl，pH7.4)重悬菌体，50％功率超声破碎20min，全菌取样30ul，12000rpm，4℃离心10min，上清取样30μl，以上样品加等体积2X SDS-PAGE loading buffer，100℃加热10min，然后离心取上清电泳，电泳前10min时，100V稳压电泳，待溴酚蓝指示剂进入分离胶后200V稳压电泳至溴酚蓝带迁移至离凝胶底部，取出凝胶用考马斯亮兰染色液染色，随后转入脱色液中，脱色至背景清晰。结果见附图5，其中，第1孔为预染分子量蛋白质Marker；第2孔为诱导后收获的细胞裂解液全液；第3孔为诱导后收获的细胞裂解液上清，从图中可发现破碎的细胞全菌及上清中出现81KD的目的条带，与预期相符合。

3、猪瘟E2蛋白纯化

使用GST亲和层析的方法，纯化GST-SUMO-E2蛋白，摸索大肠杆菌细胞裂解上清与谷胱甘肽-琼脂糖树脂填料的结合条件及浓度以及摸索用ULP蛋白酶切割GST-SUMO融合蛋白的浓度及反应时间、温度等参数，最后获得纯化的猪瘟E2蛋白，将纯化好的蛋白，进行SDS-PAGE电泳，电泳结果见图6，其中，第1孔为预染分子量蛋白质Marker；第2孔为纯化的猪瘟E2蛋白，出现约40kd目的大小的条带。

实施例2猪瘟E2蛋白亚单位疫苗制备与免疫试验

用Bradford蛋白定量试剂测定由实施例1制备好的纯化猪瘟E2蛋白原液浓度，将蛋白浓度调节终浓度为到0.1mg/ml再与法国SEPPIC佐剂GEL01配比，佐剂添加体积占总体积的10％，进行混合均匀搅拌后，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于2-8℃备用。

选用15头3-4周龄长白猪(猪瘟病毒抗原抗体均为阴性，免疫抑制性疾病(蓝耳病、圆环病毒病)抗原阴性猪进行试验，分为3组，每组5头，第1组作为对照组，2组为猪瘟病毒E2重组亚单位疫苗组100μg/头份，第3组免疫猪瘟脾淋苗，在同等条件下隔离饲养，一免后21d以相同剂量与途径加强免疫一次，免疫后每周取血1次，分离血清，二免后28d用阻断ELISA方法测定抗体效价。

由图7结果可以看出，猪瘟E2蛋白亚单位疫苗阻断率明显高于市场上某品牌的脾淋苗。在一免28天时所产生的抗体(阻断率＞70％)理论上已经足以保护猪群免受猪瘟病毒的感染。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 镇江瑞华生物科技有限公司

<120> 一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法与及其应用

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 336

<212> PRT

<213> 猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus )

<400> 1

Leu Ala Cys Lys Glu Asp Tyr Arg Tyr Ala Ile Ser Ser Thr Asn Glu

1 5 10 15

Ile Gly Leu Leu Gly Ala Gly Gly Leu Thr Thr Thr Trp Lys Glu Tyr

20 25 30

Asn His Asp Leu Gln Leu Asn Asp Gly Thr Val Lys Ala Ile Cys Val

35 40 45

Ala Gly Ser Phe Lys Val Thr Ala Leu Asn Val Val Ser Arg Arg Tyr

50 55 60

Leu Ala Ser Leu His Lys Glu Ala Leu Pro Thr Ser Val Thr Phe Glu

65 70 75 80

Leu Leu Phe Asp Gly Thr Asn Pro Ser Thr Glu Glu Met Gly Asp Asp

85 90 95

Phe Gly Phe Gly Leu Cys Pro Phe Asp Thr Ser Pro Val Val Lys Gly

100 105 110

Lys Tyr Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Ser Ala Phe Tyr Leu Val Cys

115 120 125

Pro Ile Gly Trp Thr Gly Val Ile Glu Cys Thr Ala Val Ser Pro Thr

130 135 140

Thr Leu Arg Thr Glu Val Val Lys Thr Phe Arg Arg Asp Lys Pro Phe

145 150 155 160

Pro His Arg Met Asp Cys Val Thr Thr Thr Val Glu Asn Glu Asp Leu

165 170 175

Phe Tyr Cys Lys Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Val Lys Gly Glu Pro

180 185 190

Val Val Tyr Thr Gly Gly Leu Val Lys Gln Cys Arg Trp Cys Gly Phe

195 200 205

Asp Phe Asn Glu Pro Asp Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile Gly Lys Cys

210 215 220

Ile Leu Ala Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Ile Val Asp Ser Thr Asp Cys

225 230 235 240

Asn Arg Asp Gly Val Val Ile Ser Thr Glu Gly Ser His Glu Cys Leu

245 250 255

Ile Gly Asn Thr Thr Val Lys Val His Ala Ser Asp Glu Arg Leu Gly

260 265 270

Pro Met Pro Cys Arg Pro Lys Glu Ile Val Ser Ser Ala Gly Pro Val

275 280 285

Arg Lys Thr Ser Cys Thr Phe Asn Tyr Ala Lys Thr Leu Lys Asn Lys

290 295 300

Tyr Tyr Glu Pro Arg Asp Ser Tyr Phe Gln Gln Tyr Met Leu Lys Gly

305 310 315 320

Glu Tyr Gln Tyr Trp Phe Asp Leu Asp Val Thr Asp Arg His Ser Asp

325 330 335

<210> 2

<211> 1011

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cgtctggctt gcaaagaaga ttaccgctac gcgatcagca gtaccaacga aattggtctg 60

ctgggtgcag gcggtctgac caccacctgg aaagaataca accacgatct gcagctgaac 120

gatggtaccg tcaaagcgat ttgcgttgca ggtagcttta aagtcaccgc gctgaacgtt 180

gttagtcgtc gttatctggc gtctctgcat aaagaagcac tgccgaccag cgttaccttt 240

gaactgctgt tcgacggtac caatccgtct accgaagaaa tgggcgacga ttttggcttc 300

ggtctgtgtc cgtttgatac cagtccggtc gtcaaaggca aatacaacac caccctgctg 360

aacggtagcg cgttttatct ggtttgtccg attggttgga ccggcgttat tgagtgtacc 420

gcagttagtc cgaccaccct gcgtaccgaa gttgtcaaaa ccttccgtcg cgataaaccg 480

tttccgcatc gtatggattg cgttaccacc accgtcgaaa acgaagacct gttctactgc 540

aaactgggcg gtaattggac ctgcgttaaa ggcgaaccgg tagtttatac cggcggtctg 600

gttaaacagt gccgttggtg cggctttgat tttaacgaac cggacggtct gccgcattat 660

ccgatcggca aatgcattct ggcgaacgaa accggttatc gcatcgtaga tagcaccgat 720

tgtaatcgcg acggcgttgt tattagcacc gaaggttctc acgagtgtct gattggcaac 780

accaccgtca aagttcacgc atctgacgaa cgtctgggtc cgatgccgtg tcgtccgaaa 840

gaaattgtta gctctgcagg tccggttcgt aaaaccagtt gcaccttcaa ctacgcgaaa 900

accctgaaaa acaaatacta cgagccgcgc gacagctatt tccagcagta catgctgaaa 960

ggcgaatacc agtactggtt tgatctggac gttaccgatc gtcattctga t 1011

<210> 3

<211> 687

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60

ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120

tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180

ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240

atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300

gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360

gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420

acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480

gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540

aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600

tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660

ctggaagttc tgttccaggg gcccctg 687

<210> 4

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu

20 25 30

Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu

35 40 45

Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys

50 55 60

Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn

65 70 75 80

Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu

85 90 95

Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser

100 105 110

Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu

115 120 125

Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn

130 135 140

Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp

145 150 155 160

Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu

165 170 175

Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr

180 185 190

Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala

195 200 205

Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Glu Val Leu

210 215 220

Phe Gln Gly Pro Leu

225

<210> 5

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

atgtcggact cagaagtcaa tcaagaagct aagccagagg tcaagccaga agtcaagcct 60

gagactcaca tcaatttaaa ggtgtccgat ggatcttcag agatcttctt caagatcaaa 120

aagaccactc ctttaagaag gctgatggaa gcgttcgcta aaagacaggg taaggaaatg 180

gactccttaa gattcttgta cgacggtatt agaattcaag ctgatcagac ccctgaagat 240

ttggacatgg aggataacga tattattgag gctcacagag aacagattgg tggccaa 297

<210> 6

<211> 99

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Met Ser Asp Ser Glu Val Asn Gln Glu Ala Lys Pro Glu Val Lys Pro

1 5 10 15

Glu Val Lys Pro Glu Thr His Ile Asn Leu Lys Val Ser Asp Gly Ser

20 25 30

Ser Glu Ile Phe Phe Lys Ile Lys Lys Thr Thr Pro Leu Arg Arg Leu

35 40 45

Met Glu Ala Phe Ala Lys Arg Gln Gly Lys Glu Met Asp Ser Leu Arg

50 55 60

Phe Leu Tyr Asp Gly Ile Arg Ile Gln Ala Asp Gln Thr Pro Glu Asp

65 70 75 80

Leu Asp Met Glu Asp Asn Asp Ile Ile Glu Ala His Arg Glu Gln Ile

85 90 95

Gly Gly Gln

Claims (10)

1.一种利用大肠杆菌制备生物活性猪瘟E2蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签SUMO基因、猪瘟E2基因；

2)将步骤1)获得的3种基因与大肠杆菌表达载体连接连接，得到含融合基因的重组表达载体；

3)将步骤2)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；

4)将步骤3)获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；

5)回收、蛋白酶水解并分离纯化猪瘟E2蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中猪瘟E2基因序列包含序列表中的SEQ ID NO 2序列。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促溶标签GST基因包含序列表中的SEQ ID NO 3序列。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的促溶标签SUMO基因包含序列表中的SEQ ID NO 5序列。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)融合基因为GST-SUMO-E2。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤2)中大肠杆菌表达载体为pET28a；步骤3)所述大肠杆菌表达菌株为Rosetta-gami 2(DE3)pLysS。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤6)中所述的重组猪瘟E2蛋白包含下面任意一种多肽：

i)含有序列表中SEQ ID NO1序列的多肽；

ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；

iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。

8.一种由权利要求1～7任一权利要求所述方法制备的猪瘟E2蛋白。

9.一种由权利要求1～7任一权利要求所述方法制备的重组大肠杆菌表达菌株。

10.一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，由权利要求8所述的猪瘟E2蛋白中，加入佐剂，混合均匀，获得猪瘟E2蛋白亚单位疫苗。