CN109609534A - 一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型orf2蛋白的方法及其应用 - Google Patents

一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型orf2蛋白的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用，1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签His6‑SUMO基因和PVC3‑ORF2基因；2)将获得的3种基因连接，获得融合基因；3)将获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；4)将获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；5)将获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；6)将培养获得的重组表达菌体回收、破碎并分离纯化得猪圆环病毒3型ORF2蛋白；不但获得表达量较高的可溶性蛋白，且达到了较高的免疫还原性。

Description

一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其 应用
技术领域
本发明涉及一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用，属于生物技术领域。
背景技术
猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是圆环病毒属的代表种，是一种共价闭合、单股环状DNA病毒，而且是迄今发现最小的动物病毒。2015年以前，全球范围内仅发现猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)两个型。2015年6月，美国北卡罗来纳州某商品化猪场暴发PDNS疫情，与以往相比，该次疫情更为严重。PaLinski等借助新一代测序技术(NGS)从患病母猪及流产胎儿体内首次鉴定出一种新型病毒，该病毒符合国际病毒分类委员会(ICTV)圆环病毒分类标准，因此命名为猪圆环病毒3型(PCV3)。
PCV3与PCV1和PCV2一样，病毒粒子呈二十面体结构，其基因组为单股DNA，全长2000bp，包含3个主要开放阅读框(ORF)，其中ORF2全长642bp，编码由214个氨基酸组成的衣壳蛋白(Cap)。Cap蛋白为PCV的主要结构蛋白，诱导动物机体产生特异性免疫应答。PCV3在细胞上的增殖滴度很低，很难应用传统的灭活疫苗和弱毒疫苗。新型的疫苗如DNA疫苗，免疫效率并不高；而亚单位疫苗比DNA疫苗有更好的免疫力。
猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗已有关于使用原核表达ORF2截短蛋白的报道，但原核表达常以包涵体形式存在，涉及到变性、复性等操作繁琐步骤和成本高等不利因素，而杆状病毒则有表达成本高，蛋白纯化困难等缺点。
发明内容
为了解决现有技术手段的不足，本发明提供一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，不但获得表达量较高的可溶性蛋白，且达到了较高的免疫还原性。
本发明所采用的技术方案是这样的，一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，包括以下步骤：
1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签His6-SUMO基因和PVC3-ORF2基因，其中，所述的PVC3-ORF2基因包含序列表中SEQ ID NO:2序列；
2)将步骤1)获得的3种基因连接，获得融合基因GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2，该融合基因包含序列表中SEQ ID NO:3序列；
3)将步骤2)获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；
4)将步骤3)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；
5)将步骤4)获得的重组大肠杆菌表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；
6)将步骤5)培养获得的重组大肠杆菌表达菌体破碎并分离纯化得猪圆环病毒3型ORF2蛋白。
优选地，所述的步骤3)中大肠杆菌表达载体为pET28a。
优选地，步骤4)所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)。
优选地，步骤6)的具体过程为：离心收集步骤5)获得的重组表达菌株，进行超声波破碎，离心，弃沉淀，收集上清液，经GST琼脂糖凝胶亲和层析纯化，收集纯化的融合蛋白GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2，用SUMO蛋白酶进行酶切，酶切液用镍琼脂糖凝胶亲和层析，去除GST-His6-SUMO融合标签及SUMO蛋白酶，收集流穿液，即得纯化的蛋白PVC3-ORF2。
优选地，所述的重组猪圆环病毒3型ORF2蛋白包含下面任意一种多肽：
i)含有序列表中SEQ ID NO:1序列的多肽；
ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；
iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。
本发明还提供一种由上述方法制备的猪圆环病毒3型ORF2蛋白。
本发明还提供一种由上述方法制备的重组大肠杆菌表达菌株。
本发明还提供一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，由上述的猪圆环病毒3型ORF2蛋白中，加入佐剂，混合均匀，获得猪圆环病毒3型ORF2亚单位疫苗。
有益效果：
1、本发明选用大肠杆菌来表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白，与使用原核和杆状病毒等表达ORF2蛋白相比，具有表达周期短，表达量高的优点，并且优化蛋白表达的的方法更为简单快捷，经优化后其表达量显著高于现有技术描述的PCV3-ORF2蛋白表达量。
2、本发明使用GST和带有His6亲和标签的SUMO助溶标签，增加了猪圆环病毒3型ORF2蛋白的可溶性，在菌体裂解液上清中，获得了表达量较高的可溶性蛋白；同时，使用GST和SUMO串联标签构建的融合蛋白可以借助SUMO蛋白酶进行切除，最后得到的纯化蛋白接近猪圆环病毒3型天然结构，达到较高的免疫原性。
3、应用此方法制备猪圆环病毒3型亚单位疫苗，不涉及到强毒，没有致病性，能够产生较高的免疫原性，同时安全性得到了保证；另外，制备方法简单、方便，成本低、疫苗效价高。
4、应用本方法，猪圆环病毒3型ORF2基因在大肠杆菌中获得了高的表达，经SDS-PAGE和仔猪免疫试验鉴定具有良好的生物活性；因此，所得到大肠杆菌表达菌株可用于PCV3亚单位疫苗及PCV3诊断试剂等生产中，生产成本低，纯化方法简单，疫苗防治效果好，可用于工业上大规模生产猪圆环病毒3型的疫苗及诊断试剂，具有良好的应用前景。
附图说明
图1：PCR扩增GST-HSUMO-PVC3-ORF2基因大小；泳道1和泳道2为GST-HSUMO-PVC3-ORF2基因，泳道3为Marker；
图2：菌落PCR鉴定结果；泳道1-10分别为挑取的1-10#单克隆，泳道11为阴性对照，泳道12为阳性对照，泳道13为Marker；
图3：猪圆环病毒3型ORF2蛋白纯化SDS-PAGE电泳图；泳道1为收集的全菌液，泳道2为超声破碎后上清液，泳道3为样品在谷胱甘肽-琼脂糖树脂柱流穿液，泳道4用TBS液洗脱杂蛋白，泳道5为5mM谷胱甘肽洗脱液，泳道6为10mM谷胱甘肽洗脱液，泳道7为20mM谷胱甘肽洗脱液，泳道8为谷胱甘肽填料，泳道9为Marker；
图4：猪圆环病毒3型ORF2蛋白纯化并切除标签SDS-PAGE电泳图；泳道1为Marker，泳道2为纯化并切除标签的猪圆环病毒3型ORF2蛋白；
图5：猪圆环病毒3型ORF2亚单位疫苗免疫抗体水平变化。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解为，以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。以下实施例中所使用的生物材料、化学试剂以及未提及的具体实验方法，均为本领域材料、试剂及按照常规实验方法进行。
实施例1猪圆环病毒3型ORF2蛋白的合成
1)猪圆环病毒3型ORF2蛋白基因(PVC3-ORF2基因)的合成
以Porcine circovirus 3(GenBank:AOO87130.1)的Capsid protein蛋白的氨基酸序列为基础，如序列表中SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，再通过大肠杆菌密码子优化反向编译成核苷酸序列，并在整个片段两端加入酶切位点，使其适宜在大肠杆菌中表达(委托通用生物系统(安徽)有限公司合成)，最后的基因序列如：SEQ ID NO:2，命名为PCV3-ORF2，具体构建方法：
应用OLigo6.0引物设计软件设计PCR引物(PPVC3-ORF2F，PPVC3-ORF2R)，引物序列如下：
PPVC3-ORF2F：5'-ATGCGCCATCGCGCGATTTTT-3'
PPVC3-ORF2R：5'-ATCCTCGAGTTACAGCACGCTTTTATAG-3'
在PPVC3-ORF2R 5'端加上Xho I酶切位点，利用该对引物以PCV3-ORF2为模板扩增猪圆环病毒3型ORF2蛋白的基因(PVC3-ORF2)，目的片段长约654bp；
2)促溶标签GST基因的合成
应用OLigo6.0引物设计软件设计PCR引物(PGST F，PGST R)，引物序列如下：
PGST F：5'-ATCCCATGGGTATGTCCCCTATACTAGGT-3'PGST R：5'-GACTTCTGAGTCCGACATCAGGGGCCCCTGGAACAG-3'
在PGST F 5'端加上Nco I酶切位点，利用该对引物以pGEX-6p-1质粒为模板扩增GST基因，目的片段长约716bp；
3)促溶标签His6-SUMO的合成
应用OLigo6.0引物设计软件设计PCR引物(PHis6-SUMO F，
PHis6-SUMO R)，引物序列如下：
PHis6-SUMO F：5'-CTGTTCCAGGGGCCCCTGATGTCGGACTCAGAAGTC-3'
PHis6-SUMO R：5'-AATCGCGCGATGGCGCATTTGGCCACCAATCTGTTC-3'
利用该对引物以pET28a-His6-SUMO质粒为模板扩增His6-SUMO基因，目的片段长约333bp；
4)融合基因GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2的合成
利用引物(PGST F，PPVC3-ORF2R)以GST基因、His6-SUMO基因和PVC3-ORF2基因为模板扩增得到GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2基因，目的片段长约1635bp；
以上PCR扩增体系为50μL扩增体系：ddH2O 32μL；10xKOD Buffer 5μL；dNTP(2mM)5μL；MgSO4(25mM)3μL；上游引物(10μmoL/L)1.5μL；下游引物(10μmoL/L)1.5μL；模板1μL；KOD酶1μL反应条件为94℃5min；98℃30s，58℃30s，68℃60s，循环35次；16℃10min，产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图1)。
经确定GST-HSUMO-PVC3-ORF2融合基因片段正确后，用PCR回收试剂盒回收该基因片段。
5)将上述融合基因连接到大肠杆菌表达载体pET28a(+)上，构建pET28a-GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2质粒；
①利用NcoI和XhoI限制性内切酶对融合基因和载体pET28a进行双酶切，40μL反应体系为：限制性内切酶NcoI 1μL；限制性内切酶XhoI 1μL；融合基因片段及载体30μL；10x Fbuffer 4μL；ddH2O 4μL；酶切温度为37℃，酶切时间为3小时，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，切取正确的条带，用胶回收试剂盒回收基因片段和载体片段。
②将酶切后回收的融合基因及载体片段利用T4 DNA Ligase进行连接，10μL反应体系为：融合基因片段6μL；载体2μL；10xT4 DNA Ligase buffer 1μL；T4 DNA Ligase 1μL；连接反应温度为22℃，连接时间为1小时。
3)将上述的连接产物转化进入大肠杆菌感受态细胞DH5a中，具体操作为：在无菌条件下，将10μL连接产物加入大肠杆菌DH5α感受态内，冰浴20min；取出置于42℃，热激90s；再迅速置于冰浴2min；加入500μL无抗LB液体培养基,37℃恒温摇床复苏培养45min；6000r/min离心3min,去掉上清400uL；剩余重悬菌体后均匀涂布卡那霉素抗性平板，置于37℃培养12小时。挑取单菌落，接种于含卡那霉素抗性的LB液体培养基，培养6小时做菌落PCR鉴定；
①利用引物T7pro和T7ter以上述单菌落的菌液为模板进行菌落PCR鉴定，PCR扩增体系为20μL扩增体系：ddH2O11.8μL；10xKOD Buffer 2μL；dNTP(2mM)2μL；MgSO4(25mM)1.2μL；上游引物(10μmoL/L)0.75μL；下游引物(10μmoL/L)0.75μL；模板1μL；KOD酶0.5μL反应条件为94℃5min；98℃30s，58℃30s，68℃60s，循环35次；16℃10min，以水为模板作为阴性对照，并以GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2基因为模板作为阳性对照；
②将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(见图2)，筛选出阳性克隆，再将阳性克隆的菌液扩大培养，用小量质粒抽提试剂盒对pET28a-GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2质粒进行抽提，利用NcoⅠ和XhoⅠ限制性内切酶对抽提的质粒进行双酶切鉴定。
5)将抽提得到的pET28a-GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2质粒转化进入大肠杆菌感受态细胞BL21(DE3)中，培养后采用为异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，离心后收菌；
①转化完成后选择性地挑取3个单菌落进行培养，培养至OD值为0.6左右，取出部分菌液采用终浓度为1mmoL/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，诱导表达时间为2小时，诱导表达完成后，12000rpm离心，收得菌体；
②将上述菌体进行SDS-PAGE电泳，通过电泳结果筛选出目的蛋白表达量最高的克隆的菌液，再将其扩大培养，同样地，培养至OD值为0.6左右，采用异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达，分别于37℃诱导4小时；22℃诱导8小时；4℃7000r/min离心6min收集菌体，加入pH7.4的TBS重悬菌体，超声破碎菌悬液至溶液清亮，12000r/min离心10min，所收集的上清和沉淀液采用SDS-PAGE分析检测目的蛋白的表达。
6)将菌体破碎并分离纯化猪圆环病毒3型ORF2蛋白；
利用谷胱甘肽-琼脂糖树脂纯化，其步骤如下：
①根据谷胱甘肽-琼脂糖树脂能够结合的蛋白量及上清液蛋白含量计算所需的谷胱甘肽-琼脂糖树脂填料的量；
②装填谷胱甘肽-琼脂糖树脂柱子，并用大量清水冲洗，备用；
③将超声后离心的上清进行上柱，收集穿出液；
④用pH7.4的TBS洗脱杂质；
⑤用10mM谷胱甘肽进行洗脱；
每一步都取样30μL，加入30μL的2xLoading Buffer，进行SDS-PAGE(见图3)。
酶切处理：将纯化得到的蛋白用SUMO酶进行酶切，37℃酶切2小时，之后再进行去标签，
利用Smart-NI柱去标签，其步骤如下：
①根据Smart-NI柱能够结合的蛋白量及上清液蛋白含量计算所需的Smart-NI柱填料的量；
②装填Smart-NI柱，并用大量清水冲洗，备用；
③将酶切后的蛋白溶液进行上柱，收集穿出液；
④用pH7.4的TBS洗脱杂质；
⑤用2mM的咪唑进行洗脱；
⑥用20mM的咪唑进行洗脱；
⑦用50mM的咪唑进行洗脱；
⑧用250mM的咪唑进行洗脱；
每一步都取样30μL，加入30μL的2xLoading Buffer，进行SDS-PAGE。
最终得到纯化后并切除标签的猪圆环病毒3型ORF2蛋白见图4。
实施例2猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗制备与免疫试验
1)猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗制备
用Bradford蛋白定量试剂测定由实施例1制备好的纯化猪圆环病毒3型ORF2蛋白原液浓度，将蛋白浓度调节终浓度为到0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL四个浓度，再与法国SEPPIC佐剂GEL01配比，佐剂添加体积占总体积的10％，进行混合均匀搅拌后，按照现行版中国兽药典附录要求无菌检验、粘度测定、稳定性测定合格后，放置于2-8℃备用。
2)猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗免疫试验
将制备好的0.01mg/mL、0.05mg/mL、0.1mg/mL、0.2mg/mL四个浓度的亚单位疫苗分别免疫25日龄PCV3抗体阴性仔猪，每组5头，另设一组未免疫组作为空白对照组，每次免疫疫苗量为2mL，免疫后每两周采血一次(即第2、4、6、8、10周)，用猪圆环病毒3型ORF2蛋白包被ELISA板，建立间接ELISA方法测定抗体水平，并评估抗体水平变化情况(见图5)。
由图5可以看出不同浓度的猪圆环病毒3型ORF2蛋白亚单位疫苗在免疫仔猪后仔猪产生抗体水平相较于对照组有显著差异。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 镇江瑞华生物科技有限公司
<120> 一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法及其应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 214
<212> PRT
<213> 猪圆环病毒3型(Porcine circovirus 3)
<400> 1
Met Arg His Arg Ala Ile Phe Arg Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Arg
1 5 10 15
Arg Arg His Arg Arg Arg Tyr Ala Arg Arg Arg Leu Phe Ile Arg Arg
20 25 30
Pro Thr Ala Gly Thr Tyr Tyr Thr Lys Lys Tyr Ser Thr Met Asn Val
35 40 45
Ile Ser Val Gly Thr Pro Gln Asn Asn Lys Pro Trp His Ala Asn His
50 55 60
Phe Ile Thr Arg Leu Asn Glu Trp Glu Thr Ala Ile Ser Phe Glu Tyr
65 70 75 80
Tyr Lys Ile Leu Lys Met Lys Val Thr Leu Ser Pro Val Ile Ser Pro
85 90 95
Ala Gln Gln Thr Lys Thr Met Phe Gly His Thr Ala Ile Asp Leu Asp
100 105 110
Gly Ala Trp Thr Thr Asn Thr Trp Leu Gln Asp Asp Pro Tyr Ala Glu
115 120 125
Ser Ser Thr Arg Lys Val Met Thr Ser Lys Lys Lys His Ser Arg Tyr
130 135 140
Phe Thr Pro Lys Pro Ile Leu Ala Gly Thr Thr Ser Ala His Pro Gly
145 150 155 160
Gln Ser Leu Phe Phe Phe Ser Arg Pro Thr Pro Trp Leu Asn Thr Tyr
165 170 175
Asp Pro Thr Val Gln Trp Gly Ala Leu Leu Trp Ser Ile Tyr Val Pro
180 185 190
Glu Lys Thr Gly Met Thr Asp Phe Tyr Gly Thr Lys Glu Val Trp Ile
195 200 205
Arg Tyr Lys Ser Val Leu
210
<210> 2
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcgccatc gcgcgatttt tcgccgccgc ccgcgcccgc gccgccgccg ccgccatcgc 60
cgccgctatg cgcgccgccg cctgtttatt cgccgcccga ccgcgggcac ctattatacc 120
aaaaaatata gcaccatgaa cgtgattagc gtgggcaccc cgcagaacaa caaaccgtgg 180
catgcgaacc attttattac ccgcctgaac gaatgggaaa ccgcgattag ctttgaatat 240
tataaaattc tgaaaatgaa agtgaccctg agcccggtga ttagcccggc gcagcagacc 300
aaaaccatgt ttggccatac cgcgattgat ctggatggcg cgtggaccac caacacctgg 360
ctgcaggatg atccgtatgc ggaaagcagc acccgcaaag tgatgaccag caaaaaaaaa 420
catagccgct attttacccc gaaaccgatt ctggcgggca ccaccagcgc gcatccgggc 480
cagagcctgt ttttttttag ccgcccgacc ccgtggctga acacctatga tccgaccgtg 540
cagtggggcg cgctgctgtg gagcatttat gtgccggaaa aaaccggcat gaccgatttt 600
tatggcacca aagaagtgtg gattcgctat aaaagcgtgc tg 642
<210> 3
<211> 1635
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atgtccccta tactaggtta ttggaaaatt aagggccttg tgcaacccac tcgacttctt 60
ttggaatatc ttgaagaaaa atatgaagag catttgtatg agcgcgatga aggtgataaa 120
tggcgaaaca aaaagtttga attgggtttg gagtttccca atcttcctta ttatattgat 180
ggtgatgtta aattaacaca gtctatggcc atcatacgtt atatagctga caagcacaac 240
atgttgggtg gttgtccaaa agagcgtgca gagatttcaa tgcttgaagg agcggttttg 300
gatattagat acggtgtttc gagaattgca tatagtaaag actttgaaac tctcaaagtt 360
gattttctta gcaagctacc tgaaatgctg aaaatgttcg aagatcgttt atgtcataaa 420
acatatttaa atggtgatca tgtaacccat cctgacttca tgttgtatga cgctcttgat 480
gttgttttat acatggaccc aatgtgcctg gatgcgttcc caaaattagt ttgttttaaa 540
aaacgtattg aagctatccc acaaattgat aagtacttga aatccagcaa gtatatagca 600
tggcctttgc agggctggca agccacgttt ggtggtggcg accatcctcc aaaatcggat 660
ctggaagttc tgttccaggg gcccctgatg tcggactcag aagtcaatca agaagctaag 720
ccagaggtca agccagaagt caagcctgag actcacatca atttaaaggt gtccgatgga 780
tcttcagaga tcttcttcaa gatcaaaaag accactcctt taagaaggct gatggaagcg 840
ttcgctaaaa gacagggtaa ggaaatggac tccttaagat tcttgtacga cggtattaga 900
attcaagctg atcagacccc tgaagatttg gacatggagg ataacgatat tattgaggct 960
cacagagaac agattggtgg ccaaatgcgc catcgcgcga tttttcgccg ccgcccgcgc 1020
ccgcgccgcc gccgccgcca tcgccgccgc tatgcgcgcc gccgcctgtt tattcgccgc 1080
ccgaccgcgg gcacctatta taccaaaaaa tatagcacca tgaacgtgat tagcgtgggc 1140
accccgcaga acaacaaacc gtggcatgcg aaccatttta ttacccgcct gaacgaatgg 1200
gaaaccgcga ttagctttga atattataaa attctgaaaa tgaaagtgac cctgagcccg 1260
gtgattagcc cggcgcagca gaccaaaacc atgtttggcc ataccgcgat tgatctggat 1320
ggcgcgtgga ccaccaacac ctggctgcag gatgatccgt atgcggaaag cagcacccgc 1380
aaagtgatga ccagcaaaaa aaaacatagc cgctatttta ccccgaaacc gattctggcg 1440
ggcaccacca gcgcgcatcc gggccagagc ctgttttttt ttagccgccc gaccccgtgg 1500
ctgaacacct atgatccgac cgtgcagtgg ggcgcgctgc tgtggagcat ttatgtgccg 1560
gaaaaaaccg gcatgaccga tttttatggc accaaagaag tgtggattcg ctataaaagc 1620
gtgctgtaac tcgag 1635

Claims (8)

1.一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)分别克隆促溶标签GST基因、促溶标签His6-SUMO基因和PVC3-ORF2基因，其中，所述的PVC3-ORF2基因包含序列表中SEQ ID NO:2序列；
2)将步骤1)获得的3种基因连接，获得融合基因GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2，该融合基因包含序列表中SEQ ID NO:3序列；
3)将步骤2)获得的融合基因与大肠杆菌表达载体连接，得到含融合基因的重组表达载体；
4)将步骤3)获得重组表达载体转化入大肠杆菌表达菌株感受态细胞中，获得包含融合基因的重组大肠杆菌表达菌株；
5)将步骤4)获得的重组表达菌株进行培养，利用IPTG诱导融合蛋白表达；
6)将步骤5)培养获得的重组表达菌体破碎并分离纯化得猪圆环病毒3型ORF2蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，其特征在于，所述的步骤3)中大肠杆菌表达载体为pET28a。
3.根据权利要求1所述的一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，其特征在于，步骤4)所述大肠杆菌表达菌株为BL21(DE3)。
4.根据权利要求1所述一种利用大肠杆菌表达猪圆环病毒3型ORF2蛋白的方法，其特征在于：所述的重组猪圆环病毒3型ORF2蛋白包含下面任意一种多肽：
i)含有序列表中SEQ ID NO:1序列的多肽；
ii)与i)所述多肽至少80％同源的多肽；
iii)含i)和ii)所述多肽的免疫原性部分的多肽。
5.根据权利要求1所述一种猪圆环病毒3型ORF2蛋白疫苗的制备方法，其特征在于：步骤6)的具体过程为：离心收集步骤5)培养获得的重组表达菌体，进行超声波破碎，离心，弃沉淀，收集上清液，经GST琼脂糖凝胶亲和层析纯化，收集纯化的融合蛋白GST-His6-SUMO-PVC3-ORF2，用SUMO蛋白酶进行酶切，酶切液用镍琼脂糖凝胶亲和层析，去除GST-His6-SUMO融合标签及SUMO蛋白酶，收集流穿液，即得纯化的蛋白PVC3-ORF2。
6.一种由权利要求1～5任一权利要求所述方法制备的猪圆环病毒3型ORF2蛋白。
7.一种由权利要求1～5任一权利要求所述方法制备的重组大肠杆菌表达菌株。
8.一种猪瘟E2蛋白亚单位疫苗的制备方法，其特征在于，由权利要求1所述的猪圆环病毒3型ORF2蛋白中，加入佐剂，混合均匀，获得猪圆环病毒3型ORF2亚单位疫苗。
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