MX2010009885A

MX2010009885A - Composiciones y métodos para la terapia y diagnóstico de citomegalovirus.

Info

Publication number: MX2010009885A
Application number: MX2010009885A
Authority: MX
Inventors: Ole Olsen
Original assignee: Theraclone Sciences Inc
Priority date: 2008-03-10
Filing date: 2009-03-10
Publication date: 2010-11-30
Also published as: JP2011518123A; WO2009114560A2; CN102015766A; IL208086A; US8852594B2; EP2257571B1; US20090324613A1; US8268309B2; JP5544309B2; JP2013199490A; US20150191531A1; AU2009223688A1; CN102015766B; IL208086A0; EP2257571A2; JP2016034984A; US20120263734A1; IL236601A0; AU2009223688B2; HK1151304A1

Abstract

La presente invención provee nuevos anticuerpos anti-citomegalovirus y composiciones y métodos relacionados. Estos anticuerpos se pueden usar en el diagnóstico, prevención y tratamiento de infección por citomegalovirus.

Description

COMPOSICIONES Y METODOS PARA LA TERAPIA Y DIAGNOSTICO i CITOMEGALOVIRUS REFERENCIA CRUZADA CON SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud provisional USSN 61/068,798, presentada el 10 de marzo de 2009, cuyo contenido, en su totalidad,: se considera parte de la presente, como referencia.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona, en términos generales, a la terapia y monitoreo de la infección! por citomegalovirus (CMV). De manera más específica,; la invención se relaciona con anticuerpos específicos \ contra CMV humano (HCMV) y también se relaciona con su fabricación y uso. Estos anticuerpos son útiles en composiciones farmacéuticas para la prevención y tratamiento dé la infección por CMV y para su diagnóstico y monitoreo.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El CMV se asocia con un alto grado de morbilidad y mortalidad. La infección con citomegalovirus (CMV) >es común y se ha estimado que entre 50% y 85% de personas en los Estados Unidos han padecido una infección por; CMV cuando tenían alrededor de 40 años de edad. Aunque la infección por CMV no produce síntomas en los adultos sanos, los grupos de alto riesgo, que incluyen a los receptores de trasplantes de órganos inmunodeprimidos y los individuos infectados por VIH están en riesgo de desarrollar a enfermedad asociada a CMV. Por otra parte, el CMV es una importante causa de infección congénita en los países desarrollados, que da lugar a retardo mental y deficiencias en el desarrollo. El CMV es un miembro de la familia de los herpesvirus en cualquier especie. En humanos, el CMV, también conocido como HCMV se designa como herpesvirus 5 (HHV-5) . El CMV es el miembro más grande de la familia herpesvirus, tiene un genoma ADN bicatenario de más de 240 kbp, que puede codificar más de 200 productos proteicos potenciales . El CMV también se conoce como betaherpesvirinae , ya que es un virus herpes que infecta células mononucleares y linfocitos. El ser humano es el único hospedero natural para la infección por CMV, aunque otros mamíferos se infectan con otras formas de CMV. La atención médica para los pacientes que sufren una enfermedad asociada al CMV consiste en un soporte nutricional, asistencia de apoyo para síndromes orgánicos terminales (en particular, neumonía en pacientes inmunodeprimidos) y terapia antiviral específica. Al menos tres terapias antivirales están aprobadas por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA - Food and Drug Administration) para el tratamiento o prevención de la infección CMV. Estos incluyen los nucleósidos ganciclovir (GCV) y cidofovir y también el foscarnet. El GCV se usa comúnmente como terapia preventiva en receptores de trasplantes con alto riesgo de desarrollar la enfermedad. El aciclovir también se ha utilizado como profilaxis para trasplante de órganos sólidos, pero la biodisponibilidad es poca y no hay datos que respalden su uso en niños. Las inmunoglobulin s también se han usado como inmunización pasiva para la prevención de la enfermedad asociada al CMV. En general, aunque estos medicamentos han mostrado eficacia para el tratamiento o la prevención de la infección por CMV, los nucleósidos, sobre todo, están asociados a graves efectos secundarios que incluyen anemia y otros problemas sanguíneos. Por lo tanto, su uso en niños es limitado. Es evidente que existe la necesidad de nuevos agentes útiles en el tratamiento y prevención de la infección CMV sintomática y enfermedades asociadas, en particular, para el tratamiento de niños.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN La invención proporciona un anticuerpo anti-CMV aislado o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo incluye: I: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos SNHGIH (SEQ ID NO: 36) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos VISSDGDDDRYADSVKG (SEQ ID NO: 37); (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38); y (b) una región VL' que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45); II: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de SNYGMH (SEQ ID NO: 48) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGSNEHYADSVKG (SEQ ID NO: 49) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYLA (SEQ ID NO : 53) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54); -III: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos SSNGIH (SEQ ID NO: 57) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDANDKQYADSVKG (SEQ ID NO: 58) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO : 59); y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de ASIRAT (SEQ ID NO: 64) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) ; IV: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de SNHGIH (SEQ ID NO: 36) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAHYADSVRG (SEQ ID NO: 68); (iii) uña región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69); y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74); (ii) una ' región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) ; V: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de SNHGIH (SEQ ID NO: 36) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAHYADSVRGR (SEQ ID NO: 79) ;, (114.) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO : 80) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76); VI: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de SDYGMH (SEQ ID NO: 85) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNTHYADSVRG (SEQ ID NO: 86); (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASKRAT (SEQ ID NO: 92) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 93); VII: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de SXXGXH (SEQ ID NO: 95), SXXGIH (SEQ ID NO: 98) o SXYGMH (SEQ ID NO: 101) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISXDXXXXXYADSVRG (SEQ ID NO: 96) o VISXDGXNXHYADSVXG (SEQ ID NO: 99); (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGXCSXXXCYSGLXDY (SEQ ID NO: 100), EGRCIEEXCYSGQIDY (SEQ ID NO: ;102) ;. o DGXCPDXXCYSGLIDY (SEQ ID NO: 103); y (b) una región, VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGXYXA (SEQ ID NO: 111) o RASQSVGXYLA (SEQ ID NO: 114) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de XASXRAT (SEQ ID NO: 112) o DASXRAT (SEQ ID NO: 115) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XQRXXWPPLT (SEQ ID NO: 113) , HQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 116) o QQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 117) . La invención también proporciona un anticuerpo anti-CMV aislado o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo comprende: I: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos i de GFTFSN (SEQ ID NO: 39) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGDDDR (SEQ ID NO: 40) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38); y^ (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45); II: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de GLTFSN (SEQ ID NO: 118) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGSNEH (SEQ ID NO: 51) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) ;, y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54); III: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos GFTFSS (SEQ ID NO: 60) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDANDKQ (SEQ ID NO: 61) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de ASIRAT (SEQ ID NO: 64); (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) ; IV: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de KFIFSN (SÉQ ID NO: 70) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76); V: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de FIFSN (SEQ ID NO: 70) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO: 80) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) ,· (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76); VI: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de GLTFSD (SEQ ID NO : 88) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNTH (SEQ ID NO: 89) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASKRAT (SEQ ID NO: 92) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 93); VII: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de XXXFSX (SEQ ID NO: 104) o GXTFSX (SEQ ID NO: 107); (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISXDXXXXX (SEQ ID NO: 105) o VISKDGTNXH (SEQ ID NO: 108) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XGXCXXXXCYSGXXDY (SEQ ID NO: 106) , DGXCXXXXCYSGLXDY (SEQ ID NO: 109) o EGRCIEEXCYSGQIDY (SEQ ID NO: 110); y (b) una región VL que incluye (i) un región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGXYXA (SEQ ID NO: 111) o RASQSVGXYLA (SEQ ID NO: 114) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de XASXRAT) (SEQ ID NO: 112) O DASXRAT (SEQ ID NO: 115); (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XQRXXWPPLT (SEQ ID NO: 113), HQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 116) o QQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 117) . La invención también proporciona un anticuerpo anti-CMV aislado que incluye: (a) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ :ID NO: 35 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 o (b) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52 o (c) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 63 o (d) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o (e) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 o (f) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91. El anticuerpo anti-CMV de la invención se une a un epítope de la glucoproteína b (gB) proteína de envoltura del virus CMV. En un aspecto de la invención, el epítope comprende el sitio 1 del determinante antigénico 2 de gB, gp 116. La invención proporciona una composición que incluye uno o más de los anticuerpos descritos aquí. En ciertas modalidades, la composición también incluye un tratamiento antiviral. Ejemplos no limitativos de tratamientos antivirales son: ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir y la inmunoglobulina intravenosa (IVIG - intravenous immunoglobulin) . En otras modalidades, la composición también incluye un segundo anticuerpo anti-CMV . La invención también proporciona un anticuerpo anti-C V, como los descritos en la presente, en dónde el anticuerpo está operablemente unido a un agente terapéutico o a una etiqueta detectable. La invención proporciona un método para el tratamiento o prevención de una infección CMV en un individuo, que incluye administrarle al individuo la composición que aquí se describe. En un aspecto, este método también incluye administrar un tratamiento antiviral. Los tratamientos antivirales incluyen, entre otros, los siguientes ejemplos: ganciclovir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir y la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) . En otro aspecto del método anterior, la composición que contiene un anticuerpo anti-CMV se administra antes o después de la exposición a CMV, a una dosis suficiente para neutralizar la infección por CMV. Se proporcionan métodos adicionales de la invención, para determinar la presencia de una infección CMV en un paciente, que incluyen las siguientes etapas: (a) poner en contacto un muestra biológica obtenida [ del paciente con un anticuerpo descrito en la presente; (b) detectar la cantidad de anticuerpo que se une a la muestra biológica; y (c) comparar la cantidad de anticuerpo que se une a la muestra biológica con un valor de control y a partir de aquí determinar la presencia de virus de influenza en el paciente. La invención también proporciona un estuche : que incluye un anticuerpo descrito en la presente. Como alternativa o además, la invención proporciona un anticuerpo humano monoclonal aislado, en donde el anticuerpo monoclonal se une a un epítope en el dominio extracelular del complejo glucoproteína gB de un citomegalovirus (CMV) . En una modalidad preferida, el CMV es CMV humano (HCMV) . En otra modalidad preferida, el anticuerpo se aisla de una célula B a partir de un donante humano . En algunos aspectos de la invención, el epítope del anticuerpo monoclonal humano aislado incluye la región AD-2 del complejo CMV gB. De manera específica, el epítope incluye los aminoácidos en las posiciones 70-88 de un polipéptido CMV gB, en donde los números de posición de los aminoácidos son según la SEQ ID NO: 30. Como alternativa, el epítope incluye los aminoácidos en las posiciones 65-93 de un complejo CMV gB, en donde los números de posición de los aminoácidos son según la SEQ ID NO: 30. Otro epítope alternativo incluye los aminoácidos en las posiciones 60-98 de un complejo CMV gB, en donde los números de posición de los aminoácidos son según la SEQ ID NO: 30. En ciertas modalidades de la invención, el epítope del anticuerpo descrito aquí está constituido total o parcialmente por la secuencia de aminoácidos NETIYNTTLKYGDWGV (SEQ ID NO: 32) o (SEQ ID NO : 33) en donde X-. = aminoácido E o T, X2 = T o V, X3 = Y o R, X4 = T o L, X5 = L o A, X6 = K o S, X7 = Y O V, X8 = G o D, X9 = D o F, X10 = V o S, XX1 = V o Q, X12 = G o ninguno, X13 = V o ninguno y X14 = N o ninguno. En otra modalidad, el epítope está constituido total o parcialmente por la secuencia de aminoácidos SHRANETIYNTTLKYGDTTGTNTTK (SEQ ID NO: 31) . El anticuerpo monoclonal humano aislado de la invención es 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 4P12, 5P9 o 9C16. Como alternativa o además, la invención proporciona un anticuerpo que se une al mismo epítope que 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 4P12, 5P9 o 9C16. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado que se une al mismo epítope que 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 4P12, 5P9 o 9C16. La invención también proporciona un anticuerpo monoclonal humano aislado anti-CMV o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo incluye una región variable de cadena pesada (VH) que incluye las CDRl y CDR2, en donde la región está codificada por una secuencia de línea germinal humana IGHV3 VH o una secuencia de ácido nycleico que es homologa a la secuencia génica de la línea germinal VH. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico que es homologa a la secuencia de la línea germinal es al menos 90% homologa a la secuencia de línea germinal IGHV3. El anticuerpo de la invención también incluye una región variable de cadena ligera (VL) codificada por una secuencia de línea germinal humana IGKV3 VL o una secuencia nucleotídica que es homologa a la secuencia génica de línea germinal VL. En un aspecto, la secuencia de ácido nucleico es homologa a la secuencia de la línea germinal VL es al menos 90% homologa a la secuencia de la línea germinal IGKV3 VL.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGÜRAS La Figura 1 muestra la alineación de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de los anticuerpos anti-CMV humanos indicados. La Figura 1A presenta una alineación de las regiones variables de cadena pesada gamma y la Figura IB presenta una alineación de las regiones variables de cadena ligera kappa. Las secuencias consenso se presentan debajo de cada alineación. El color rojo es A D F W Y S o T; el verde claro es P; el azul claro es N o Q; el amarillo es C o M, el azul muy claro es A G I L; el azul oscuro es R H o K. Es sólo una ayuda visual para comparar las secuencias. La Figura 2 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 2F10 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia de un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 3 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 2M16 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia dé ün péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 4 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 2N9 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia de un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas . La Figura 5 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 3C21 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia dé un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas.

La Figura 6 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 3G7 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia de un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 7 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 4P12 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia: dé un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 8 es una gráfica que representa la unión del anticuerpo anti-CMV humano 5J12 al péptido AD2 del epítope CMV gpll6, en presencia o ausencia de un péptido competitivo, tal como se indica. La gráfica muestra la fluorescencia asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 9 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 2F10. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 10 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 2M16. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas . La Figura 11 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 2N9. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas . La Figura 12 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 3C21. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas . La Figura 13 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 3G7. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas . La Figura 14 es una gráfica que representa la neutralización del virus CMV por el anticuerpo anti-CMV humano 4P12. Las gráficas muestran la cantidad de inhibición viral asociada con las concentraciones de anticuerpo indicadas. La Figura 15 es una serie de gráficas del % de infectividad relativa contra la concentración de la cepa viral de citomegalovirus humano (HCMV) (VR1814) utilizando 6 anticuerpos anti-HCMV (las 2 filas en la parte superior) y 2 controles (fila en la parte inferior) a diluciones de 30 a 0.003 9/t?1 en las tres líneas celulares humanas. La Figura 16 es una serie de gráficas del % de infectividad relativa contra la concentración de cepa virales HCMV (8818, 8819 y 8824) utilizando 6 anticuerpos anti-HCMV (las 2 filas en la parte superior) y 2 controles (fila en la parte inferior) a diluciones de 30 a 0.003 µg/ml en líneas celulares de fibroblastos humanas. La Figura 17 es una serie de gráficas del % de infectividad relativa contra la concentración del aislado clínico HCMV (8819) utilizando 6 anticuerpos anti-HCMV (las 2 filas en la parte superior) y 2 controles (fila en la parte inferior) a concentraciones variables en líneas celulares epiteliales y endoteliales humanas. La Figura 18 es una serie de gráficas del % de infectividad relativa contra la concentración de la cepa viral CMV de cobayo (GPCMV) (V545/32) utilizando 6 anticuerpos anti-HCMV (las 2 filas en la parte superior) y 2 controles (fila en la parte inferior) a concentraciones variables en células JH4.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Lá presente invención, en términos generales, está dirigida a composiciones y su uso en diagnóstico, prevención y terapia de la infección por citomegalovirus (CMV) . Según se describirá más adelante, las composiciones ilustrativas de la presente invención incluyen, entre otros, anticuerpos específicos contra HCMV y fragmentos y derivados de los mismos. En una modalidad, los anticuerpos anti-CMV de la invención se unen total o parcialmente a la secuencia de aminoácidos SHRANETIYNTTLKYGDTTGTNTTK (SEQ ID NO: 31) o NETIYNTTLKYGDVVGVN (SEQ ID NO: 32) . Con la máxima preferencia, los anticuerpos anti-CMV de la invención se unen total o parcialmente a la secuencia de aminoácidos NIX3NX4TX5X6X7X8X9X10X11X12X13X14 (SEQ ID NO : 33) en donde Xx = aminoácido E o T, X2 = T o V, X3 = Y o R, X4 = T o L, X5 = L o A, X6 = K o S, X7 = Y o V, X8 = G o D, X9 = D o F, X10 = V o S, XX1 = V o Q, X12 = G o ninguno, X13 = V o ninguno y X14 = N o ninguno. Los anticuerpos monoclonales anti-CMV ej emplificativos que se unen a este epítope son los anticuerpos 2F10, 2M16, 2N9, 4P12, 5P9, 9C16 aquí descritos. Los aminoácidos que abarcan las CDR según lo define Clothia, C. et al. (1989, Nature, 342: 877-883) están en letras itálicas y los definidos por Kabat E.A. et al. (1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., NIH Publication No. 91-3242 U.S. Department of Health and Human Services) están resaltados con negritas en las secuencias descritas en los ejemplos de la presente. Una persona con experiencia ordinaria en la técnica reconocerá con facilidad que hay varios métodos estándar para definir las CDR dentro de la región variable de un anticuerpo. Dos de los más utilizados se presentan aquí. La persona con experiencia ordinaria en la técnica también reconocerá con facilidad que la invención comprende otros métodos reconocidos en la técnica para delinear las CDR. El anticuerpo 2F10 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 35) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en la SÉQ ID NO: 34 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 42) codificada por la secuencia de ácido nucleico ; que se presenta en la SEQ ID NO: 41. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 2F10 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: SNHGIH (SEQ ID NO : 36), VISSDGDDDRYADSVKG ,(SEQ JD NO: 37) y DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 2F10 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), DASNRAT (SEQ ID NO : 44) y LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 2F10 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: GFTFSN (SEQ ID NO: 39), VISSDGDDDR (SEQ ID NO: 40) y DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 2F10 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), DASNRAT (SEQ ID NO: 44) y LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45). El anticuerpo 2M16 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 47) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en la SÉQ ID NO: 46 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 52) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta en la SEQ ID NO: 94. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 2M16 tienen las siguiente secuencias según la definición de Kabat: SNYGMH (SEQ ID NO: 48), VISSDGSNEHYADSVKG (SEQ ID NO: 49) y DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 2M16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53), DASNRAT (SEQ ID NO: 44) y QQRSNWPPLT (SEQ 'ID NO: 54) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 2M16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: GLTFSN (SEQ ID NO: 118), VISSDGSNEH (SEQ ID NO: 51) y DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) . Las CDR de^ cadena ligera del anticuerpo 2M16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53), DASNRAT (SEQ ID NO: 44) y QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54). El anticuerpo 2N9 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 56) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en la SEQ ID NO: 55 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 63) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta en la SEQ ID NO: 62. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 2N9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: SSNGIH (SEQ ID NO: 57), VISSDANDKQYADSVKG (SEQ ID NO: 58) y DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 2N9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), ASIRAT (SEQ ID NO: 64) y HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo , 2N9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: GFTFSS (SEQ ID NO : 60), VISSDANDKQ (SEQ ID NO: 61) y DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 2N9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) , ASIRAT (SEQ ID NO: 64) y HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) . El anticuerpo 4P12 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 67) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en la SEQ ID NO: 66 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 73) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta en la SEQ ID NO: 72. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 4P12 tiene las siguientes secuencias según la definición de Kabat: SNHGIH (SEQ ID NO: 36), VISKDGTNAHYADSVRG (SEQ ID NO: 68) y EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 4P12 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) , DASIRAT (SEQ ID NO: 75) y QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 4P12 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: KFIFSN (SEQ ID NO: 70), VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) y EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 4P12 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) , DASIRAT (SEQ ID NO: 75) y QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) . El anticuerpo 5P9 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 78) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en la SEQ ID NO: 77 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 82) codificada por la secuencia' de ácido nucleico que -se presenta en la SEQ ID NO: 81. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 5P9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: SNHGIH (SEQ ID NO: 36) , VISKDGTNAHYADSVRGR (SEQ ID NO: 79) y EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO: 80) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 5P9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) , DASIRAT (SEQ ID NO: 75) y QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 5|P9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: KFIFSN (SEQ ID NO : 70) , VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) y EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO: 80) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 5P9 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) , DASIRAT (SEQ ID NO: 75) y QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) . El anticuerpo 9C16 incluye una región variable de cadena pesada (SEQ ID NO: 84) codificada por la secuencia de ácido nucleico que se presenta más adelante en l > SEQ ',?? NO: 83 y una región variable de cadena ligera (SEQ ID NO: 91) codificada por la secuencia de ácido nucleico ¡ que se presenta en la SEQ ID NO: 90. Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 9C16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat: SDYGMH (SEQ ID NO: 85), VISKDGTNTHYADSVRG (SEQ ID NO: 86) y DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) . Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 9C16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Kabat : RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), DASKRAT (SEQ ID NO: 92) y HQRSSWPPLT (SEO ID NO: 93) . Las CDR de cadena pesada del anticuerpo 9C16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: GLTFSD (SEQ ID NO: 88), VISKDGTNTH (SEQ ID NO: 89) y DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87). Las CDR de cadena ligera del anticuerpo 9C16 tienen las siguientes secuencias según la definición de Clothia: RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), DASKRAT (SEQ ID NO: 92) y HQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 93) . Un anticuerpo anti-CMV contiene una variable de cadena pesada que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 35, 47, 56, 67, 78 u 84 y una variable de cadena ligera que tiene la secuencia de aminoácidos de las SEQ ID Nos: 42, 52, 63, 73, 82 ó 91. De preferencia, las tres CDR de cadena pesada incluyen una secuencia de aminoácidos que al menos es 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de la SNHGIH (SEQ ID NO: 36), VISSDGDDDRYADSVKG (SEQ ID NO: 37), DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38), SNYGMH (SEQ ID NO: 48), VISSDGSNEHYADSVKG (SEQ ID NO: 49), DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50), SSNGIH (SEQ ID NO: 57), VISSDANDKQYADSVKG (SEQ ID NO: 58), DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59), VISKDGTNAHYADSVRG (SEQ ID NO: 68), EGRCIEENCYSGQIDY (S Q ID NO: 69), VISKDGTNAHYADSVRGR (SEQ ID NO: 79), EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO : 80), SDYGMH (SEQ ID NO : 85), VISKDGTNTHYADSVRG (SEQ ID NO : 86), DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) (según se determina por el método Kabat) o GFTFSN (SEQ ID NO: 39) , VISSDGDDDR (SEQ ID NO: 40) , DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO : 38), GLTFSN (SEQ ID NO: 39), VISSDGSNEH (SEQ ID NO: 51) , DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) , GFTFSS (SEQ ID NO: 60) , VISSDANDKQ ( SEQ ID NÓ : 61) , DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59), KFIFSN (SEQ ID NO: 70), VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) , EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) , EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO : 80) , GLTFSD (SEQ ID NO: 88), VISKDGTNTH (SEQ ID NO : 89), DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87), GLTFSN (SEQ ID NO: 118) (según se determina por el método Clothia) y una cadena ligera con tres CDR que incluye una secuencia de aminoácidos que al menos es 90%, 92%, 95%, 97%, 98%, 99% o más, idéntica a la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43), DASNRAT (SEQ ID NO: 44), LQRNTWPPLT (SEQ ID NO : 45) RASQSVGRYLA (SEQ, ID NO: 53) , QQRSN PPLT (SEQ ID NO: 54) , ASIRAT (SEQ ID NO: 64) , HQRSNWPPLT (SEQ ID NO : 65), RASQSVGRYMA ( SEQ ID NO: 74), DASIRAT (SEQ ID NO: 75), QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76), DASKRAT (SEQ ID NO: 92), HQRSS PPLT (SEQ ID NO: 93) (según se determina por el método Kabat) o RASQSVGGYLA (SEQ ID Nt): 43), DASNRAT (SEQ ID NO: 44), LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45,), RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53), QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54), ASIRAT (SEQ ID NO: 64) , HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) , RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74), DASIRAT (SEQ ID NO: 75), QQRSS PPLT (SEQ ID NO: 76), DASKRAT (SEQ ID NO: 92), HQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 93) (según se determina por el método Clothia) . El anticuerpo se une a CMV gB. La cadena pesada del anticuerpo anti-CMV se deriva de un gen de línea germinal V (variable) , ppr ejemplo, el gen de línea germinal IGHV3. Los anticuerpos anti-CMV de la invención incluyen una región de cadena pesada variable (VH) codificada por una secuencia génica de la línea germinal humana IGHV3. Las secuencias de la línea germinal IGHV3 se muestran, por ejemplo, en los números de acceso M99663, X92214, L06616, L06617, M77327 y M77339. Los anticuerpos anti-CMV de la invención incluyen una región VH que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es al menos 80% homologa a la secuencia génica de la línea germinal X. De preferencia, la secuencia de ácido nucleico es al menos 90%, 95%, 96%, 97% homologa a la secuencia génica de ;la línea germinal IGHV3 y con más preferencia, al meno 98%, 99% homologa a la secuencia génica de la línea germinal IGHV3. La región VH del anticuerpo anti-CMV es al menos 80% homologa a la secuencia de aminoácidos de la región VH codificada por la secuencia génica de la línea germinal IGHV3 VH. De preferencia, la secuencia de aminoácidos de la región VH del anticuerpo anti-CMV es al menos 90%, 95%, 96%, 97% homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia génica de la línea germinal IGHV3 y con más preferencia, al menos 98%, 99% homologa a la secuencia génica de la línea germinal IGHV3. Los anticuerpos anti-CMV de la invención también incluyen una región variable de cadena ligera (VL) codificada por una secuencia génica de la línea germinal IGKV3 humana. Una secuencia génica de la línea germinal IGKV3 VL humana se muestra, por ejemplo, en los números de acceso X01668, K02768, X17264, L19271 y L19272. Como alternativa, los anticuerpos anti-CMV incluyen una región VL que está codificada por una secuencia de ácido nucleico que es al menos 80% homologa a la secuencia génica de ,1a línea germinal IGKV3. De preferencia, la secuencia dé ácido nucleico es al menos 90%, 95%, 96%, 97% homologa a la secuencia génica de la línea germinal IGKV3 y con más preferencia, al menos 98%, 99% homologa a la secuencia génica de la línea germinal IGKV3. La región VL del anticuerpo anti-CMV es al menos 80% homologa a la secuencia de aminoácidos de la región VL codificada por la secuencia génica de la línea germinal IGKV3. De preferencia, la secuencia de aminoácidos de la región VL del anticuerpo anti-CMV es al menos 90%, 95%, 96%, 97% homologa a la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia génica de la línea germinal IGKV3 y con más preferencia, al menos 98%, 99% homologa a la secuencia génica de la línea germinal IGKV3. A menos que se defina de otro modo, los términos técnicos y científicos usados con relación a la presente invención tienen los significados que comúnmente adoptan los técnicos con experiencia ordinaria. Por otra parte, a menos que el contexto lo requiera, los términos en singular incluyen el plural y los términos en plural incluyen el singular. En general, la nomenclatura utilizada con relación a las técnicas aquí descritas de cultivó de tejidos y celular, biología molecular, química de proteínas y oligo o polinucleótidos e hibridación, es la de uso común en la técnica. Se usan técnicas estándar para ADN recombinante , síntesis de oligonucleótidos y cultivo y transformación de tejidos (por ejemplo, electroporación, lipofección) . Las reacciones enzimáticas y las técnicas de purificación se llevan a cabo según las especificaciones del fabricante o según la práctica común en la técnica o bien como se describe en la presente. ' La práctica de la presente invención empleará, a menos que de manera específica se indique de otro modo, los métodos convencionales de virología, inmunología, microbiología, biología molecular y técnicas de ADN recombinante, al alcance de los expertos en la técnica, muchos de estos métodos se describen más adelante con fines ilustrativos. Estas técnicas se explican exhaustivamente en la literatura. Véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory manual (2nd Ed., 1989); Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (1982) ; DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II, (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed. , 1984); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, Eds . , 1985); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., 1984); Animal Cell Culture (R. Freshney, ed. , 1986); Perbal , A Practical Guide to Molecular Cloning (1984) . La nomenclatura utilizada con relación a los procedimientos y técnicas de laboratorio aquí descritas de química analítica, química orgánica sintética y química médica y farmacéutica, es la que comúnmente se utiliza en la técnica. Se utilizan técnicas estándar para síntesis química, análisis químico, preparación, formulación y suministro farmacéuticos y tratamiento de pacientes. Las siguientes definiciones son útiles para comprender la presente invención: El término "anticuerpo" (Ab - antibody) incluye anticuerpos monoclonales , anticuerpos policlonales , anticuerpos multiespecíficos (por ejemplo, anticuerpos biespecífieos) y fragmentos de anticuerpos, siempre que tengan la actividad biológica deseada. En la presente, el término " inmunoglobulina" (Ig) se indistintamente con el término "anticuerpo" . Un "anticuerpo aislado" es aquel que se ha separado y/o recuperado de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que interferirían con los usos de diagnóstico o terapéuticos del anticuerpo, estos ¡ pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteicos y no proteicos. En modalidades preferidas, el anticuerpo se purifica: (1) a más de 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry y con la máxima preferencia a más de 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso' dé un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no redúctoras mediante el uso de azul de Coomassie o de preferencia, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye él anticuerpo in si tu dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, es común que el anticuerpo aislado se prepare por al menos uno de los pasos de purificación. La unidad básica del anticuerpo de cuatro cadenas es una glucoproteína heterotetramérica compuesta de, dos cadenas ligeras (L) idénticas y dos cadenas pesadas (H) idénticas. Un anticuerpo IgM consta de 5 de la unidad básica heterotetramérica junto con un péptido adicional denominado cadena J y por lo tanto, contiene 10 sitios de unión al antígeno, mientras que los anticuerpos ; IgA segregados pueden polimerizarse para formar ensamblados polivalentes que incluyen 2 a 5 de las unidades básicas de 4 cadenas junto con la cadena J. En el caso de las IgG, la unidad de 4 cadenas es por lo general de aproximadamente 150,000 daltones . Cada cadena L está unida a una cadena H por un enlace covalente disulfuro, mientras que las dos cadenas H están unidas entre sí por uno o más enlaces disulfuro dependiendo del isotipo de cadena H. Cada, una de las cadenas H y L también tienen puentes disulfuro dentro de la cadena, separados en forma regular. Cada cadena H tiene en la terminal N un dominio variable (VH) seguido de tres dominios constantes (CH) para cada una de las cadenas a y ? y cuatro dominios CH para los isotipos µ y e. Cada cadena L tiene en la terminal N, un dominio variable (VL) seguido de un dominio constante (CL) en su otro extremo. La VL está alineada con la VH y la CL está alineada con el primer dominio constante de la cadena pesada (CHI) . Residuos de aminoácidos particulares forman una interfaz entre los dominios variables de cadena ligera y cadena pesada. El apareamiento de una VH y una Vb forma un solo sitio de unión al antígeno. Para consultar acerca de la estructura y propiedades de las diferentes clases de i anticuerpos, véase, por ejemplo, Basic and Clinical Immunology, 8th ed. , Daniel P. Stites, Abba I. Terr and Tristram G. Parslow (eds.), Appleton & Lange, Nprwalk, Conn. , 1994, pág . 71 y Capítulo 6. La cadena L de cualquier especie de vertebrados se asigna a uno de dos tipos muy distintos, denominados kappa (?) y lambda (?) , con base en la secuencia de aminoácidos de sus dominios constantes (CL) . Dependiendo de la secuencia de aminoácidos del dominio constante de sus cadenas pesadas (CH) , las inmunoglobulinas se pueden asignar a diferentes clases de isotipos. Hay cinco clases de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, que tienen cadenas pesadas designadas como alfa (a) , delta (d) , epsilon (e) , gamma (?) y mu (µ) , respectivamente. Las clases ? y a también se dividen en subclases con base en diferencias relativamente pequeñas en la secuencia CH y la función, por ejemplo, el ser humano expresa las siguientes subclases: lgG1# igG2, lgG3, lgG4, IgA1 e lgA2. El término "variable" se refiere al hecho de que ciertos segmentos de los dominios V difieren ampliamente en secuencia, entre los anticuerpos. El dominio V participa en la unión al antígeno y define la especificidad de un anticuerpo particular para su antígeno particular. Sin embargo, la variabilidad no está distribuida de ¡manera uniforme a través de la extensión de 110 aminoácidos de los dominios variables. En lugar de esto, las regiones V constan de tramos relativamente invariables denominados regiones de armazón (FR) de 15 a 30 aminoácidos separados por regiones cortas de demasiada variabilidad denominadas "regiones hipervariables " que tienen cada una 9 a 12 aminoácidos de largo. Los dominios variables de cadenas ligeras y pesadas nativas contienen cada una cuatro FR, que en su mayoría adoptan la configuración de hoja |ß, conectadas por tres regiones hipervariables, que forman bucles que se conectan y en algunos casos forman parte de la estructura de hoja ß. Las regiones hipervariables en cada cadena están juntas en cercana proximidad gracias a las FR y en la otra cadena las regiones hipervariables contribuyen a la formación del sitio de unión al antígeno (véase Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) . Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo al antígeno pero tienen varias funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC -antibody dependent cellular cytotoxicity) . El término "región hipervariable" se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo que son los responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable incluye, por lo general, residuos de aminoácidos a partir de una "región determinante de complementariedad" o "CDR" (por ejemplo, alrededor de aproximadamente 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) residuos en la región VL y alrededor de aproximadamente 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) residuos en la región VH al numerarlos según el sistema de numeración de Kabat; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) ; y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" (por ejemplo, residuos 24-34 (Ll), 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en la región VL y 26-32 (Hl) , 52-56 (H2) y 95-101 (H3) en la región VH al numerarlos según el sistema de numeración de Clothia; Clothia y Lesk, J. Mol. Biol . 196:901-917 (1987); y/o aquellos residuos de un "bucle hipervariable" /CDR (por ejemplo, residuos 27-38 (Ll), 56-65 (L2) y 105-120 (L3 ) en la región VL y 27-38 (Hl) , 56-65 (H2) y 105-120 (H3) en la región VH al numerarlos según el sistema de numeración IMGT; Lefranc, M.P. et al. Nucí. Acids Res. 27:209-212 (1999) , Ruiz, M. et al. Nucí. Acids Res. 28:219-221 (2000) ). Como característica, opcional, el anticuerpo tiene inserciones simétricas en uno o más de los siguientes puntos 28, 36 (Ll) , 63, 74-75 (L2) y 123 (L3) en VL y 28, 36 (Hl) , 63, 74-75 (H2) y 123 (H3) en VH al numerarlos según AHo; Honneger, A. y Plunkthun, A. J. Mol. Biol . 309 : 657-670 (2001) ) . El término "residuo de ácido nucleico de línea germinal" se refiere a un residuo de ácido nucleico que se encuentra de manera natural en un gen de la línea germinal que codifica una región variable o constante. El "gen de línea germinal" es el ADN encontrado en una célula germinal (es decir, una célula destinada a transformarse en un óvulo o en esperma) . Una "mutación de línea germinal" se refiere a un cambio heredable en un ADN particular que se ha dado en una célula germinal o cigoto en el estado de célula sola y que cuando se transmite a la progenie, la mutación se incorpora en cada una de las células del organismo.' Una mutación de línea germinal es lo opuesto a una mutación somática que se adquiere en una sola célula del cuerpo. En algunos casos, los nucleótidos en una secuencia de ADN de línea germinal que codifican para una región variable mutan (es decir, mutación somática) y son reemplazados con un nucleótido diferente. El término "anticuerpo monoclonal" se refiere a un anticuerpo obtenido de una población de anticuerpos prácticamente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que incluye la población son idénticos excepto por las posibles mutaciones que ocurren en forma natural y que pueden estar presentes en cantidades minoritarias. ¡ Los anticuerpos monoclonales son bastante específicos,! se dirigen contra un solo sitio antigénico. Por otra; parte, en comparación con las preparaciones de anticuerpos policlonales que incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopes) , cada anticu rpo monoclonal se dirige contra un solo determinante ' del antígeno. Además de su especificidad, los anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que se pueden sintetizar sin ser contaminados por otros anticuerpos. El calificativo "monoclonal" no debe interpretarse en el sentido de qué se requiera un método particular para la producción j del anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales útiles en la presente invención se preparan por, la metodología del hibridoma descrita primero por Kohler ét al., Nature, 256:495 (1975) o se puede hacer mediante el uso de los métodos de ADN recombinante en células I bacterianas o eucariotas animales o vegetales (véase, [ pór ejemplo, Patente de los Estados Unidos Núm. 4 , 816, 567) .; Los "anticuerpos monoclonales" también se aislan de geriotecás de anticuerpos de fagos mediante las técnicas descritas por Clackson et al., Nature, 352: 624-628 (1991) y Majrks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991), por ejemplo. ! i Los anticuerpos monoclonales incluyen anticuerpos "quiméricos", en los cuales una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico u homólogo a las correspondientes secuencias en anticuerpos derivados de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como los fragmentos de estos anticuerpos, siempre qüe presenten la actividad biológica deseada (véase, Patente de los Estados Unidos Núm. 4,816,567; y Morrison et al., Proc . Nati. Acad. Sci . USA 81:6851-6855 (1984)). La presente invención proporciona secuencias de unión al antígeno de dominio variable derivadas de anticuerpos humanos. Por lo tanto, los anticuerpos quiméricos de interés primordial incluyen los anticuerpos que contienen uno o más secuencias de unión al antígeno humanas (por ejemplo, CDR) y que contienen una o más secuencias derivadas de un anticuerpo no humano, por ejemplo, una secuencia de la región FR o C. Por otra parte, los anticuerpos quiméricos de interés primordial en la presente, incluyen aquellos que tienen una secuencia de unión al antígeno de dominio variable humano de una clase o subclase de anticuerpo y otra secuencia, por ejemplo, una secuencia de la región FR o C, derivada de otra clase o subclase de anticuerpo. Los anticuerpos quiméricos de interés también incluyen aquellos ' que contienen secuencias de antígeno de dominio variable relacionadas con los que se describen aquí o derivadas de diferentes especies, por ejemplo, primates no humanos (por ejemplo, mono del viejo mundo, simio, etc.) . Los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos primatizados y humanizados. Por otra parte, los anticuerpos quiméricos pueden incluir residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para refinar más el desempeño del anticuerpo. Para mayores detalles, véase, Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323-329 (1988);; y Presta, Curr. Op. Struct . Biol . 2:593-596 (1992). En general, se considera que un "anticuerpo humanizado" es un anticuerpo que tiene incorporados uno o más residuos de aminoácidos a partir de una fuente no humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos , con frecuencia se denominan residuos "importados", los cuales normalmente se obtienen de un dominio variable "importado".

La humanización tradicionalmente se lleva a cabo ségúñ él método de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332:323|-3=7 (1988); Verhoeyen et al., Science, 239:1534-1536 (198|8)), sustituyendo las secuencias de región hipervariable importadas por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. En consecuencia, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de los Estados Unidos Núm. 4,816,567), en los que esencialmente menos de un dominio variable humano intacto se' ha sustituido por la secuencia correspondiente de una especie no humana . Un "anticuerpo humano" es un anticuerpo que contiene sólo secuencias presentes en un anticuerpo producido en forma natural por un ser humano. Más aún, un anticuerpo humano de la invención es un anticuerpo humano nativo en el que el anticuerpo se encuentra en forma natural en un ser humano, en comparación con un anticuerpo humano recombinante , en que las cadenas pesadas y ligeras individuales se aislan a partir de seres humanos pero de ensamblan al azar creando todas las formas de anticuerpos naturales y no naturales (de los cuales un número insignificante de combinaciones se han aislado de un: ser humano) . De manera especifica, los anticuerpos humanos nativos son aquellos que se generan naturalmente como resultado del funcionamiento de un sistema inmune humano intacto. La utilidad de los anticuerpos nativos en el tratamiento de enfermedades virales humanas se ha establecido a través de la experiencia con globulinas humanas hiperinmunes . Los anticuerpos nativos, como clase, difieren en algunos aspectos de los que se obtienen por métodos de genoteca recombinantes (de fagos o ratones transgénicos) y tienen propiedades distintivas que los hacen principios terapéuticos ideales para enfermedades humanas. (Véase, Dessain et al., Exploring the Native Human Antibody Repertoire to Créate Antiviral Therapeutics in Current Topics in Microbiology and Immunology 317: 155-183 (2008) , ® Springer-Verlag, New York) . En particular, en las genotecas de anticuerpos nativos expresados a partir de células B humanas existe una ventaja específica con respecto a los anticuerpos derivados de fagos, debido a que hay limitaciones en el método de fagos para recrear todos los apareamientos de cadena pesada y cadena ligera nativos u originales, impidiendo así la incorporación de importantes estructuras de anticuerpos en una genoteca de fagos generada. Por lo tanto, es deseable obtener anticuerpos humanos nativos de alta calidad expresados a partir de células humanas B, para detección, diagnóstico, tratamiento y terapia de patógenos mediante un método de alto rendimiento. Los anticuerpos humanos de la invención, sin embargo, contienen residuos o modificaciones no encontradas en un anticuerpo humano natural, incluidas aquellas modificaciones y secuencias variantes descritas aquí. Estas se hacen normalmente para refinar más o aumentar el desempeño del anticuerpo. Un anticuerpo "intacto" es aquel que comprende un sitio de unión al antígeno y también una región GL y al menos los dominios constantes de cadena pesada CH 1, CH 2 y CH 3. Los dominios constantes pueden ser dominios constantes de una secuencia nativa (por ejemplo, dominios constantes de una secuencia nativa humana) o variantes de secuencias de aminoácidos de las mismas. De preferencia, el anticuerpo intacto tiene una o más funciones efectorás. Un "fragmento de anticuerpo" incluye una porción de un anticuerpo intacto, de preferencia, la región de unión al antígeno o variable del anticuerpo intacto. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen los fragmentos Fab, Fab' , F(ab')2 y Fv; diabodies, anticuerpos lineales (véase la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,641,870; Zapata et al., Protein Eng . 8(10): 1057-1062 [1995] ) ; moléculas de anticuerpo de cadena simple y anticuerpos multiespecífieos formados a partir de fragmentos de anticuerpo. La expresión "fragmento funcional o análogo" de un anticuerpo es un compuesto que tiene en común ,1a actividad biológica cualitativa con un anticuerpo de longitud completa. Por ejemplo, un fragmento funcional ; o análogo de un anticuerpo anti-IgE es aquel que sé puede unir a una inmunoglobulina igE de tal manera que impida o reduzca considerablemente la capacidad de esa molécula para unirse al receptor de alta afinidad FceRI . La digestión de anticuerpos con papaína produce dos fragmentos de unión al antígeno idénticos, denominados fragmentos "Fab" y un fragmento residual "Fe", designación que refleja la capacidad para cristalizar con facilidad. Él fragmento Fab consta de una cadena L completa junto con el dominio de región variable de la cadena H (VH) y el primer dominio constante de una cadena pesada (CH 1) . Cada fragmento Fab es monovalente en cuanto a la unión al antígeno, es decir, tiene un solo sitio de unión al antígeno. El tratamiento de un anticuerpo con pepsina da un fragmento grande simple F(ab')2 que aproximadamente corresponde a dos fragmentos Fab unidos por disulfuro, que tienen actividad de unión al antígeno divalente y aún son capaces de reticularse con el antígeno. Los fragmentos Fab ' difieren de los fragmentos Fab porque tienen unos pocos residuos adicionales en la terminal carboxilo del dominio CH1 que incluye una o más cisteínas de la región bisagra del anticuerpo. Fab'-SH es la designación que aquí se da' a Fab1 en donde los residuos cisteína de los dominios constantes tienen un grupo tiol libre. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 originalmente se produjeron como pares de fragmentos Fab' que tienen cisteínas de bisagra entre ellos. También se conocen otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpos . El fragmento "Fe" incluye las porciones carboxi terminales de las dos cadenas H unidas entre sí por disulfuros. Las funciones efectoras de los anticuerpos se determinan por secuencias en la región Fe, esta región es también la parte reconocida por los receptores Fe (FcR) encontrados en ciertos tipos de células. "Fv" es el fragmento de anticuerpo mínimo que contiene reconocimiento completo del antígeno y sitió de unión al antígeno. Este fragmento consta de un dimero de un dominio de región variable de cadena pesada y uno de cadena ligera en asociación estrecha no covalente . Del plegamiento de estos dos dominios se generan seis bucles hipervariables (tres bucles de cada cadena H y L) que contribuyen a los residuos de aminoácidos para la unión al antígeno y confieren al anticuerpo su especificidad de unión al antígeno. Sin embargo, incluso un dominio variable simple (o la mitad de un Fv que incluya solo tres CDR específicas para un antígeno) tiene la habilidad de reconocer y unirse al antígeno, aunque con una afinidad menor que el sitio de unión íntegro . "Fv de cadena simple" también abreviado como " sFv" o "scFv" son fragmentos de anticuerpos que contienen los dominios de anticuerpos VH y VL conectados en una sola cadena polipeptídica . De preferencia, el polipéptido sFv también incluye un conector polipeptídico entre los dominios VH y Vh que permite al sFv formar la estructura deseada para la unión al antígeno. Para una revisión de- los sFv, véase Pluckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol . 113, Rosenburg y Moore eds . , Springer-Verlag, New York, págs . 269-315 (1994); Borrebaeck 1995, véase más adelante. El término "diabodies" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpos preparados construyendo fragmentos sFv (véase párrafo anterior) con conectores cortos (aproximadamente 5 a 10 residuos) entre los dominios VH Y vL de tal manera que se logre el acoplamiento de los dominios V dentro de la cadena pero no entre las cadenas y se obtenga como resultado un fragmento bivalente, es decir, un fragmento que tenga dos sitios de unión al antígeno. Los diajbodies biespecíficos son heterodímeros de dos fragmentps sFv de "cruzamiento" en los cuales los dominios VH y VL 'de los dos anticuerpos están presentes en diferentes cadenas polipeptídicas . Los diabodies se describen exhaustivamente, por ejemplo, en los documentos EP 404,097, WO 93/11161 y Hollinger efc al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90 : 6444 6448 (1993) . Un anticuerpo que se "internaliza" es aquel que es capturado por la célula (es decir, entra) al unirse a un antígeno en una célula de mamífero (por ejemplo, un polipéptido de superficie celular o receptor) . La internalización del anticuerpo incluye fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanos o quiméricos y conjugados de anticuerpos. Para ciertas aplicaciones terapéuticas , está prevista la internalización in vivo. El número de moléculas de anticuerpo internalizadas es suficiente o adecuado para matar una célula o inhibir su proliferación, en especial una célula infectada. Dependiendo de la potencia del anticuerpo o el conjugado de anticuerpo, en algunos casos, la captura de un solo anticuerpo en la célula es suficiente para matar la célula diana a la cual se une el anticuerpo. Por ejemplo, ciertas toxinas son bastante potentes para exterminar, de tal manera qué la internalización de un mol de toxina conjugada al anticuerpo es suficiente para matar la célula infectada. Se dice que un anticuerpo es " inmunoespecífico" , "específico" o "se une específicamente" frente a un antígeno si reacciona a un nivel detectable con el antígeno, de preferencia, con una constante de afinidad, Ka, mayor o igual a aproximadamente 104 M"1 o mayor o igual a 105 M"1 , mayor o igual a 106 M"1 , mayor o igual a 107 "1 o mayor o igual a 108 M"1. La afinidad de un anticuerpo, por su antígeno cognado también se expresa como la constante de disociación KD, y en ciertas modalidades, el anticuerpo HuM2e se une de manera específica a M2e si se une con una KD menor o igual a 10"4 M, menor o igual a aproximadamente 10"5 M, menor o igual a aproximadamente 10"6 M, menor o igual a 10~7 M o menor o igual a 10"8 M. Las afinidades de los anticuerpos se determinan fácilmente mediante las técnicas convencionales, por ejemplo, las descritas por Scatchard et al. (Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 51:660 (1949)). Las propiedades de unión de un anticuerpo con antígenos, células o tejidos de las mismas se determinan y evalúan mediante métodos de inmunodetección que incluyen, por ejemplo, ensayos de inmunofluorescencia, como inmunohistoquímica (IHC - immuno-histochemistry) y/o clasificación celular activada por fluorescencia (FACS -fluorescence-activated cell sorting) . Un anticuerpo que tiene una "característica biológica" de un anticuerpo designado, es aquel que posee una o más de las características biológicas del anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos. Por ejemplo, fen ciertas modalidades, un anticuerpo con una característica biológica de un anticuerpo designado se une al mismo epítope al que se une el anticuerpo designado y/o tiene una función efectora común con el anticuerpo designado. El término anticuerpo "antagonista" se usa en el sentido más amplio e incluye un anticuerpo que en forma total o parcial bloquea, inhibe o neutraliza una actividad biológica de un epítope, polipéptido o célula a los qué se une de manera específica. Los métodos para identificar anticuerpos antagonistas incluyen poner en contacto: un polipéptido o célula a la que se une específicamente un anticuerpo antagonista candidato con el anticuerpo antagonista candidato y medir un cambio detectable en una o mas actividades biológicas normalmente asociadas con el polipéptido o célula. Un anticuerpo que "induce apoptosis" es aquel que induce muerte celular programada según se determina por unión de anexina V, fragmentación de ADN, contracción celular, dilatación del retículo endoplásmico, fragmentación celular y/o formación de vesículas de membrana (denominadas cuerpos apoptóticos) . De preferencia, la célula es una célula infectada. Existen varios métodos para evaluar los eventos celulares asociados con la apoptosis. Por ejemplo, el desplazamiento de fosfatidil serina (PS) se puede medir mediante la unión de anexina; la fragmentación de ADN se puede evaluar a través de escalonamiento de ADN; y la condensación de cromatina nuclear junto con la fragmentación de ADN se evalúa por el aumento de células hipodiploides . De preferencia, el anticuerpo que induce apoptosis es aquel que da lugar a una inducción aproximada de 2 a 50 veces más, de preferencia aproximadamente de 5 a 50 veces más y con la máxima preferencia aproximadamente 10 a 50 veces más de unión de ^anexina con relación a la célula sin tratar, en un ensayo de unión a anexina. Las "funciones efectoras" de un anticuerpo se refieren a las actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de una secuencia nativa o una región Fe variante de una secuencia de aminoácidos) dé un anticuerpo y que varían con el isotipo de anticuerpo. Ejemplos de funciones efectoras del anticuerpo incluyen: unión a Clq y citotoxicidad dependiente del complemento; unión al receptor Fe; citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; descenso regulado de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor de célula B) ; y activación de célula B. La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual la Ig segregada se une a receptores Fe (FcRs) presentes en ciertas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) y permite que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porta el antígeno y posteriormente maten á la célula diana con citotoxinas. Los anticuerpos "arman" a las células citotóxicas y son requeridas para el exterminio. Las células primarias para mediar la ADCC, las células NK, expresan sólo FcyRIII, mientras que los raonocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión de FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3, p g. 464 de la publicación de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol . 9:457-92 (1991) . Para evaluar la actividad ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo ADCC in vitro, como se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,500,362 o la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,821,337. Las células efectoras útiles en estos ensayos incluyen las células mononucleares de sangre periférica (PBMC - peripheral blood mononuclear cells) y las células asesinas naturales (NK - Natural Killer) . Como alternativa o además, la actividad ADCC de la molécula de interés se evalúa in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que describe Clynes et al., en PNAS (USA) 95:652-656 (1998) . El término "receptor Fe" o "FcR" describe un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En ciertas modalidades, el FcR es un FcR humano de secuencia nativa. Más aún, un FcR preferido es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye receptores de las subclases FcyRI , FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y como alternativa las formas divididas de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen FcyRIIA (un "receptor activador") y FcyRIIB (un "receptor inhibidor"), los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplásmicos . El receptor activador FcyRIIA contiene un motivo de activación con base en tirosina de inmunoreceptor (ITAM - immunoreceptor tyrosine-based activation motif) en su dominio citoplásmico . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene un motivo de inhibición con base en tirosina de inmunoreceptor (ITIM - immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif) en su dominio citoplásmico, (véape revisión de M. Daeron, Annu. Rev. Immunol . 15:203-234 (1997)). Los FcR se revisan en Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-92 (1991); Capel et al., Immunomethods 4:25-34 (1994); y de Haas et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) . Otros FcRs, incluidos los que se identifiquen en Un futuro, están comprendidos aquí por el término "FcR". El término también incluye el receptor neonato, FcRn, el cual es responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) y Kitn et al., J. Immunol. 24:249 (1994)). Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. De preferencia, las células expresan al menos el FcyRIIl; y realizan la función efectora ADCC. Ejemplos de leucocitos humanos que participan en la ADCC incluyen células PBMC, células NK, monocitos, células T citotóxicas y neutrófilos; se prefieren las células PBMC y las NK. Las células efectoras se aislan de una fuente natural, por ejemplo, de sangre . El término "citotoxicidad dependiente del complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La activación de la ruta clásica del complemento se inicia con la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que se unen a su antígeno cognado. Para evaluar la activación del complemento, se realiza un ensayo CDC, por ejemplo, como el que se describe en Gazzano-Santoro et al., J. Immunol . Methods 202:163 (1996). El término "citomegalovirus " también conocido como CMV, se refiere a un miembro de la familia herpesvirus de cualquier especia, incluida la humana. El CMV también se conoce como Betaherpesvirinae , porque es un virus de herpes que infecta células mononucleares y linfocitos. El término "citomegalovirus humano o HCMVV 'se refiere a un miembro de la familia CMV que infecta al ser humano. El HCMV es un herpesvirus con un tamaño genómico de 230 Kbp, que codifica más de 70 proteínas virales. El HCMV también se designa como herpesvirus humano 5 (HHV-5) . Para el propósito de tratar una infección, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluidos el ser humano, los animales domésticos y de granja, de zoológico, de deportes, mascotas como perros y gatos, ganado vacuno, caballos, ovejas, cerdos, cabras, conejos, etc. De preferencia, el mamífero es el ser humano. Los términos "tratar" o "tratamiento" o "alivio" se refieren tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas; en donde el objetivo es prevenir o reducir (disminuir) el estado o trastorno patológico enfocado. Aquellos que necesitan el tratamiento incluyen los que ya tienen el trastorno así como los que están propensos a tenerlo o aquellos en quienes se tiene que prevenir el trastorno. Un individuo o mamífero se "trata" con éxito por una infección si después de recibir una cantidad terapéutica de un anticuerpo según los métodos de la presente invención, el paciente manifiesta una reducción observable y medible o la ausencia de uno o mas de los siguientes signos: reducción en el número de células infectadas o ausencia de las mismas; reducción del por ciento de células totales que están infectadas; y/o alivio en algún grado de uno o más de los síntomas asociados con la infección específica; reducción de la morbilidad y la mortalidad y mejoría en los aspectos de calidad de vida. Los parámetros anteriores para evaluar un tratámierito exitoso y la mejoría de la enfermedad, son fácilmente medibles mediante los procedimientos de rutina con los que cuenta un médico. El término "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a la cantidad de un anticuerpo o un medicamento eficaz para "tratar" una enfermedad o trastorno en un individuo o en un mamífero. Véase la definición dada eh lo anterior para "tratar". El término administración "crónica" se refiere a la administración de los principios activos de manera continua en oposición a la forma aguda, para mantener el efecto terapéutico inicial (actividad) durante un periodo de tiempo prolongado. La administración "intermitente'1 es el tratamiento que no se hace de manera consecutiva sin interrupción, sino más bien es cíclico. La administración "en combinación con" uno o más de otros agentes terapéuticos, incluye la administración simultánea (concurrente) y consecutiva en cualquier orden. El término "vehículos" incluye vehículos, excipientes o estabilizantes farmacéuticamente aceptables, que sean atóxicos para la célula o el mamífero qué se expone a ellos a las dosis y concentraciones empleadas. Con frecuencia, el vehículo fisiológicamente aceptable es una solución acuosa con pH regulado. Los ejemplos de vehículos fisiológicamente incluyen amortiguadores como fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantés que incluyen el ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (aproximadamente menos de 10 residuos) ; proteínas como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílicos como polivinilpirrolidona; aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; alcoholes de azúcar como manitol o sorbitol; contraiones formadores de sales como sodio; y/o surfactantes no iónicos como TWEEN® polietilenglicol (PEG) y PLURONICS®. El término "agente citotóxico" en el sentido que se utiliza en la presente se refiere a una sustancia, que inhibe o impide la función de las células y/o provoca la destrucción de las células. El término incluye isótopos radioactivos (por ejemplo, At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32 e isótopos radioactivos de Lu) , antineoplásicos como metotrexato, adriamicina, alcaloides de la vinca (vincristina, vinblastina, etopósido) , doxorubicina, melfalan, mitomicina C, clorambücil, daunorubicina u otros agentes intercalantes, enzimas y fragmentos de las mismas como las enzimas nucleolíticas, antibióticos y toxinas como toxinas de molécula pequeña o toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluidos los fragmentos y/o variantes de las mismas y los agentes antitumorales o antineoplásicos que se describen más adelante. También se describen más adelante otros agentes citotóxicos. Un "agente inhibidor de proliferación" se refiere a un compuesto o composición que inhibe la proliferación de una célula, in vitro o in vivo. Los ejemplos de agentes inhibidores de proliferación incluyen agentes que bloquean la evolución del ciclo celular, por ejemplo, los que inducen el cese de Gl y de la fase M. Los bloqueadores de la fase clásicos incluyen los alcaloides de la vinca (vincristina, vinorelbina y vinblastina) , taxanos e inhibidores de topoisomerasa II como doxorubicina, epirubicina, daunorubicina, etopósido y bleomicina. Los medicamentos que detienen Gl también influyen en el cese de la fase S, por ejemplo, los agentes alquilantes de ADN como tamoxifeno, prednisona, dacarbazina, mecloretamina, cisplatino, metotrexato, 5-fluorouracilo y ara-C. Se puede encontrar más información en la obra The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel eds . , Cápitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes and antineoplasici drugs" de Murakami et al. (W B Saunders : Philadelphia, 1995) , en especial la pág. 13. Los taxanos (paclitaxel y docetáxel) son antineoplásicos derivados del árbol denominado tejo. .El docetáxel (TAXOTERE®, Rhone-Poulenc Rorer) , derivado del tejo europeo, es un análogo semisintético del paclitaxel (TAXOL®, Bristol-Myers Squibb). El paclitaxel1 y el docetaxel estimulan en ensamblado de microtúbulos a partir de dímeros de tubulina y estabilizan los microtúbulos a impedir la despolimerización, lo cual da lugar a la inhibición de la mitosis celular. El término "marcador" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con el anticuerpo para generar una anticuerpo marcado" . El marcador es detectable en sí mismo (por ejemplo, marcadores con radioisótopos o marcadores fluorescentes) o en el caso de un marcador enzimático, se cataliza la alteración química detectable de un compuesto o composición sustrato. El término "epítope etiquetado" se refiere a un polipéptido quimérico que incluye un polipéptido fusionado a un "polipéptido etiqueta" . El polipéptido etiqueta tiene suficientes residuos para proporcionar u epítope contra el cual se puede hacer un anticuerpo, incluso es lo suficientemente corto para no interferir con la actividad del polipéptido al que se fusiona. El polipéptido etiqueta es de preferencia, bastante exclusivo para que el anticuerpo casi no reaccione en forma cruzada con otros epítopes. Los polipéptidos etiqueta adecuados tienen, en general, al menos seis residuos de aminoácidos y normalmente entre aproximadamente 8 y 50 residuos de aminoácidos (de preferencia, entre aproximadamente 10 y 20 residuos de aminoácidos) . Una "molécula pequeña" se define con un peso molecular inferior a aproximadamente 500 daltones. Los términos "ácido nucleico" y "polinucleótido" se usan indistintamente para referirse a ARN, ADN mono o bicatenarios o a polímeros mixtos. Los polinucléótidos incluyen secuencias genómicas, extragenómicas y secuencias de plásmidos y segmentos génicos más pequeños de manipulación genética que expresan o están adaptados paira expresar polipéptidos . Un "ácido nucleico aislado" es un ácido nucleico que está esencialmente separado de otras secuencias de: ADN genómico así como proteínas o complejos como ribosomas y polimerasas que naturalmente se encuentran con una secuencia nativa. El término abarca una secuencia de ácido nucleico que se ha extraído de su entorno natural e incluye aislados de ADN clonado o recombinante y análogos obtenidos por síntesis química o síntesis biológica por sistemas heterólogos . Un ácido nucleico esencialmente puro incluye formas aisladas del ácido nucleico. Por supuesto, esto se refiere al ácido nucleico tal como se aisla originalmente y no excluye genes o secuencias que se adicionan después de manera artificial al ácido nucleico aislado. El término "polipéptido" se usa con su significado convencional, es decir, como una secuencia de aminoácidos . Los polipéptidos no se limitan a una longitud específica del producto. Péptidos, oligopéptidos y proteínas están incluidos dentro de la definición de polipéptido y los términos se usan de manera indistinta a menos que específicamente se indique de otro modo. Este término tampoco se refiere o excluye modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, por ejemplo, glucosilaciones , acetilaciones , fosforilaciones y lo similar, así como a otras modificaciones conocidasi en la técnica, tanto naturales como no naturales. Un polipéptido puede ser una proteína completa o una secuencia de la misma. Los polipéptidos particulares de interés en el contexto de esta invención son subsecuencias de aminoácidos que incluyen CDR y que son capaces de unirse a CMV o a una célula infectada por CMV. Un "polipéptido aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. En modalidades preferidas, el polipéptido aislado se purifica (1) a más 'de 95% en peso de anticuerpo según se determina por el método de Lowry y con la máxima preferencia a más de 99% en peso; (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de aminoácidos N-terminal o interna mediante el uso de un secuenciador de copa giratoria; o (3) hasta homogeneidad por SDS-PAGE en condiciones reductoras o no reductoras mediante el uso de azul de Coomassie o de preferencia, tinción con plata. El anticuerpo aislado incluye el anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del entorno natural del anticuerpo no estará presente. Sin embargo, es común que el anticuerpo aislado se prepare por al menos uno de los pasos de purificación. Un polinucleótido de "secuencia nativa" es aquél que tiene la misma secuencia nucleotídica que un polinucleótido derivado de la naturaleza. Un polipéptido de "secuencia nativa" es aquel que tiene la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido (por ejemplo, un anticuerpo) derivado de la naturaleza (por ejemplo, de cualquier especie) . Estos polinucleótidos y polipéptidos de secuencia nativa se aislan de la naturaleza o se producen por medios sintéticos o recombinantes. Una "variante" de polinucleótido es un polinucleótido que, por lo general, difiere de un polinucleótido específicamente descrito en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Estas variantes son de origen natural o se generan en forma sintética, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias polinucleotídicas de la invención y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido codificado según se describe en la presente y/o usando cualquiera de las varias técnicas conocidas en el campo de la técnica. Una "variante" de polipéptido es un polipéptido que, por lo general, difiere de un polipéptido específicamente descrito aquí, en una o más sustituciones, deleciones, adiciones y/o inserciones. Estas variantes1 son de origen natural o se generan en forma sintética, por ejemplo, modificando una o más de las secuencias polipeptídicas de la invención y evaluando una o más actividades biológicas del polipéptido según se describe en la presente y/o usando cualquiera de las varias técnicas conocidas en el campo de la técnica. Las modificaciones se hacen en la estructura de los polinucleótidos y polipéptidos de la presente invención y aun así obtener una molécula funcional que codifique, una variante o derivado del polipéptido con las características deseables. Cuando es conveniente alterar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido para crear un equivalente o incluso una variante o porción mejorada de un polipéptido de la invención, el experto en la técnica normalmente cambia uno o más de los codones de la secuencia de ADN codificante . Por ejemplo, ciertos aminoácidos se sustituyen con otros aminoácidos en una estructura proteica sin que haya una pérdida considerable de su habilidad para unirse a otros polipéptidos (por ejemplo, antígenos) o células.

Puesto que es su capacidad de unión y la naturaleza de una proteína los que define la actividad biológica funcional de la proteína, se pueden hacer ciertas sustituciones de aminoácidos en la secuencia proteica y por supuesto su secuencia codificante de ADN subyacente y obtener, sin embargo, una proteína con propiedades similares. Se prevé así, hacer varios cambios en las secuencias peptídicas de las composiciones descritas o secuencias de ADN correspondientes que codifican estos péptidos, sin que haya una pérdida considerable de su utilidad o actividad biológica . En muchos casos, una variante de polipéptido contiene una o más sustituciones conservativas. Una "sustitución conservativa" es aquella en la que un aminoácido se sustituye con otro aminoácido que tiene propiedades similares, de manera que un experto en la técnica de la química de péptidos podría preveer la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido prácticamente permanecen sin alterarse. Al hacer tales cambios, se toma en cuenta el índice hidropático de los aminoácidos. En general ¡ se reconoce en la técnica la importancia del índice hidropático de los aminoácidos en cuanto a conferir una función biológica interactiva a una proteína (Kyte y Doolittle, 1982) . Se acepta que el carácter hidropático relativo del aminoácido contribuye a la estructura secundaria de la proteína resultante, que a su vez define la interacción de la proteína con otras moléculas, por ejemplo, enzimas, sustratos, receptores, ADN, anticuerpos, antígenos, y lo similar. A cada aminoácido se le ha asignado un índice hidropático con base en sus características de hidrofobicidad y carga (Kyté y Doolittle, 1982). Estos valores son: isoleucina (+4.5), valina (+4.2), leucina (+3.8), fenilalanina (+2.8), cisteína/cistina (+2.5), metionina (+1.9), alanina (+1.8), glicina (-0.4), treonina (-0.7), serina (-0.8), triptófano (-0.9), tirosina (-1.3), prolina (-1.6), histidina (-3.2), glutamato (-3.5), glutamina (-3.5), aspartato (-3.5), asparagina (-3.5), lisina (-3.9) y arginina (-4.5). Es sabido en la técnica, que ciertos aminoácidos pueden ser sustituidos por otros aminoácidos que tengan un índice o grado hidropático similar y aun así den lugar a una proteína con actividad biológica similar, es decir, obtener una proteína funcionalmente equivalente. Al hacer esto cambios, se prefiere la sustitución de aminoácidos cuyos índices hidropáticos estén dentro de + 2, en particular se prefieren aquellos que estén dentro + 1 en incluso se prefieren sobre todo los que estén dentro de ± 0.5. También se sabe en la técnica que la sustitución de aminoácidos similares se puede hacer de manera eficaz con base en su hidrofilicidad . La Patente de los Estados . Unidos Núm. 4,554,101 expone que la mayor hidrofilicidad promedio local de una proteína, en el grado que es controlada por la hidrofilicidad de sus aminoácidos adyacentes, se correlaciona con una propiedad biológica de la proteína. Según se describe en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4,554,101, se han asignado los siguientes valores de hidrofilicidad a residuos de aminoácidos: arginina (+3.0), lisina (+3.0), aspartato (+3.0 ± 1) , glutamato (+3.0 + 1), serina (+0.3), asparagina (+0.2), glutamina (+0.2), glicina (0), treonina (-0.4), prolina (-0.5 ± 1), alanina (-0.5), histidina (-0.5), c.isteína (-1.0), metionina (-1.3), valina (-1.5), leucina (-1.8), isoleucina (-1.8), tirosina (-2.3), fenilalanina (-2.5), triptófano (-3.4) . Se entiende que un aminoácido se puede sustituir por otro que tenga un valor de hidrofilicidad similar y seguir obteniendo una proteína biológicamente equivalente y en particular, inmunológicamente equivalente. En estos cambios, la sustitución de aminoácidos cuyos valores de hidrofilicidad están dentro ± 2, en particular se prefieren aquellos que están dentro + 1 en incluso se prefieren sobre todo los que están dentro de + 0.5. Como se señaló en lo anterior, las sustituciones de aminoácidos tienen como base, en general, la relativa similitud de los sustituyentes de la cadena lateral de aminoácidos, por ejemplo, su hidrofobicidad, hidrofilicidad, carga, tamaño, y lo similar. Las sustituciones ej emplificativas que toman en consideración varias de las características anteriores, son muy conocidas para el experto en la técnica e incluyen: arginina y lisina; glutamato y aspartato; serina y treonina; glutamina y asparagina; y valina, leucina e isoleucina. Las sustituciones de aminoácidos también se hacen con base en la similitud en cuanto a polaridad, carga, solubilidad, hidrofobicidad, hidrofilicidad y/o la naturaleza anfifática de los residuos. Por ejemplo, los aminoácidos de carga negativa incluyen ácido aspártico y ácido glutámico; los aminoácidos de carga positiva incluyen lisina y arginina; y los aminoácidos con grupos principales polares sin carga que tienen valores de hidrofilicidad similares incluyen leucina, isoleucina y valina; glicina y alanina; asparagina y glutamina; y serina, treonina, fenilalanina y tirosina. Otros grupos de aminoácidos que pueden representar cambios conservativos incluyen: (1) 'ala, pro, gly, glu, asp, gln, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; y (5) phe, tyr, trp, his. Una variante puede contener también o de manera alternativa, cambios no conservativos. En una modalidad preferida, polipéptidos variantes difiere: dé una secuencia nativa por sustitución, deleción o adición ^de cinco aminoácidos o menos. Las variantes también (o de manera alternativa) se modifican, por ejemplo, por la deleción o adición de aminoácidos que tienen mínima influencia en la inmunogenicidad, la estructura secundaria y la naturaleza hidropática del polipéptido. Los polipéptidos incluyen una secuencia señal (o líder) en el extremo N terminal de la proteína, que de manera simultánea a la traducción o posterior a la misma dirige la transferencia de la proteína. El polipéptido también puede estar conjugado, por ejemplo, fusionado en marco a un conector u otra secuencia para facilitar la síntesis, purificación o identificación del polipéptido (por ejemplo, poli-His) o para intensificar la unión del polipéptido a un soporte sólido. Por ejemplo, un polipéptido se conjuga a una región Fe de inmunoglobullna. Al comparar secuencias de polinucleótido y polipéptido, se dice que dos secuencias son "idénticas" si la secuencia de nucleótidos o aminoácidos en las dos secuencias es la misma cuando se alinea para ; máxima correspondencia, tal como se describe más adelante. Las comparaciones entre dos secuencias, por lo general, se hacen comparando las secuencias con respecto a una ventana de comparación para identificar y comparar regiones locales de similitud de secuencia. Una "ventana de comparación" se refiere a un segmento de al menos aproximadamente 20 posiciones contiguas, por lo regular, 30 a aproximadamente 75, 40 a aproximadamente 50, en el cual una secuencia se compara con una secuencia de referencia del mismo número de posiciones contiguas, después de que las dos secuencias se alinean en grado óptimo. La alineación óptima se secuencias para comparación se puede hacer mediante el programa Megalign en el paquete Lasergene de software bioinformático (D ASTAR, Inc. Madison, WI) , utilizando los parámetros predef nidos. Este programa comprende varios esquemas de alineación descritos en las siguientes referencias: Dayhoff, M.O. (1978) A model of evolutionary change in proteiñs Matrices for detecting distant relationships . En Dayhoff, M.O. (ed.) Atlas of Protein Sequence and Strücture, National Biomedical Research Foundation, Washington DC, Vol. 5, Supl. 3, págs. 345-358; Hein J. (1990) Unified Approach to Alignment and Phylogenes, págs. 626-645 Meth ds in Enzymology vol. 183, Academic Press, Inc., San Diego, CA; Higgins, D.G. y Sharp, P.M. (1989) CABIOS 5 : Í51-153 ; Myers, E.W. y Muller W. (1988) CABIOS 4:11-17; Rpbihson, E.D. (1971) Co b. Theor 11:105; Santou, N. Nes, M. (1987) Mol. Biol. Evol. 4:406-425; Sneath, P.H.A. y Sokal, ¡R.R. (1973) Numerical Taxonomy - The principies and Practice of Numerical Taxonomy, Freeman Press, San Francisco, CA; Wilbur, W.J. y Lipman, D.J. (1983) Proc . Nati. Acad. Sci.

USA 50:726-730. Como alternativa, la alineación óptima de secuencias para comparación se hace por el algoritmo de identidad local de Smith y Waterman (1981) Add. APL. Math. 2:482, por el algoritmo de alineación de identidad de Needleman y Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48:443, por la búsqueda de métodos de similitud de Pearson y Lipman (198'8) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 85:2444, por implementaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA y TFASTA en el paquete de Wisconsin Genetics Spftware Package, Genetics Computer Group (GCG) , 575 Science Dr., Madison, WI) , o por inspección. Un ejemplo preferido de algoritmos que son adecuados para determinar el por ciento de identidad de secuencia y la similitud de secuencia son los algoritmos BLAST y BLAST 2.0, los cuales se describen en Altschul et al. (1977) Nucí. Acids Res. 25:3389-3402 y Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-410, respectivamente. BLAST y BLAST 2.0 se usan, por ejemplo, con los parámetros descritos aquí, para determinar el por ciento de identidad de secuencia para los polinucleótidos y polipéptidos de la invención. El software para hacer el análisis BLAST está disponible al público a través de del National Center for Biotechnology Information. En un ejemplo ilustrativo, las puntuaciones acumulativas se calculan utilizando, para los nucleótidos, los parámetros M (puntuación de compensación para un par de residuos coincidentes, siempre >0) y N (puntuación de penalización para residuos no coincidentes; siempre <0) . La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detiene cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en una cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa tiende a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cada secuencia. Los parámetros W, T y X de algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. El programa BLASTN (para secuencias nucleotídicas) usa por defecto una longitud de texto. (W) de 11 y una expectativa (E) de 10 y las alineaciones de la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff (1989) Proc. Nati. Acad. Sci . USA 89:10915), (B) de 50, expectativa (E) de 10, M = 5, N = 4 y la comparación de las dos hebras . Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. ¡La extensión de los aciertos de palabra en cada dirección se detienen cuando: la puntuación de alineación acumulativa disminuye en una cantidad X a partir de su valor máximo alcanzado; la puntuación acumulativa tiende a cero o por debajo de cero debido a la acumulación de una o más alineaciones de residuos de puntuación negativa; o se llega al final de cada secuencia. Los parámetros W, T y X de algoritmo BLAST determinan la sensibilidad y velocidad de la alineación. En un enfoque, el "porcentaje de identidad de secuencia" se determina comparando dos secuencias alineadas en grado óptimo con respecto a una ventana de comparación de al menos 20 posiciones, en donde la porción d$ la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos en la ventana de comparación, puede comprender adiciones, deleciones (es decir, huecos (gaps) ) de 20 por ciento o menos, por lo regular, 5 a 15 por ciento o 10 a 12 por ciento, en comparación con las secuencias de referencia (las cuales no tienen ni adiciones ni deleciones) con alineación óptima de las dos secuencias. El porcentaje se calcula determinando el número de posiciones a las cuales se muestran idénticas las bases de ácido nucleico o los residuos de aminoácidos, para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posición en la secuencia de referencia (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando los resultados por 100 para obtener el porcentaje de identidad de secuencia. El término "homología" se refiere al porcentaje de residuos en la variante de la secuencia de polinucleótidos o polipéptidos que son idénticos a la secuencia no variante después de alinear las secuencias e introducir gaps, en caso necesario, para lograr el máximo porcentaje de homología. En modalidades particulares las variantes polinucleotídicas y polipeptídicas tienen al menos 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 98% ó 99% de homología de polinucleótidos o polipéptidos respecto a un polinucleótido o polipéptido descrito aquí. El término "vector" incluye vectores de expresión o vectores lanzadera. Normalmente, el constructo plásmido también incluirá un origen de replicación (por ejemplo, el origen de replicación ColEl) y un marcador seleccionable (por ejemplo, resistencia a ampicilina o tetraclclina) , para replicación y selección, respectivamente, de los plásmidos en bacterias. Un "vector de expresión" se refiere a un vector que contiene las secuencias de control necesarias o elementos reguladores para la expresión de los anticuerpos, incluidos los fragmentos de anticuerpo de la invención, en bacterias o células eucariotas . Los vectores adecuados se describen más adelante. En el sentido que se utiliza en la presente especificación y las reivindicaciones adjuntas, las* 'formas singulares "un", "una" y "el", "la", incluyen referencias al plural a menos que el contexto lo requiera de otro modo.

Anticuerpos La presente invención también proporciona anticuerpos anti-CMV y anti-CMV específicos que incluyen un polipéptido de la presente invención, incluidos aquellos polipéptidos codificados por una secuencia polinucleotídica expuesta en el Ejemplo 1 y secuencias de aminoácidos expuestas en el Ejemplo 1 y la Figura 1 y fragmentos y variantes de los mismos. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo designado aquí como 2F10, 2M16, 2N9, 3.C21, 4P12, 5P9, 9C16. Estos anticuerpos de preferencia se unen o específicamente se unen a células infectadas por CMV en comparación con células de control no infectadas del mismo tipo celular. En modalidades preferidas, estos anticuerpos se unen a la glucoproteína B (gB) de CMV. En modalidades particulares, los anticuerpos de la presente invención se unen al sitio I AD2 del epítope CMV gpll6 que tiene la secuencia de aminoácidos SHRA ETIYNTTLKYGDTTGTNTTK (SEQ ID NO: 31) . Como comprenderá el técnico experimentado, la descripción general de los anticuerpos de la presente y los métodos para prepararlo y utilizarlos también se aplican a constituyentes polipeptídicos de anticuerpos individuales y a fragmentos de anticuerpos . Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos monoclonales o policlonales . Sin embargo, en modalidades preferidas, son monoclonales. En modalidades particulares, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos humanos. Los métodos para producir anticuerpos monoclonales y policlonales son conocidos en la técnica y se describen, en general, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 6,824,780. Normalmente, los anticuerpos del presente invención se producen en forma recombinante, con los vectores y métodos disponibles en la técnica, tal como se describe más adelante. Los anticuerpos humanos también se generan mediante células B activadas in vitro (véanse las Patentes de los Estados Unidos Núms . 5,567,610 y 5, 229, 275) . Los anticuerpos humanos también se producen en animales transgénicos (por e emplo, ratones) que tengan capacidad para producir un repertorio completo de anticuerpos humanos en ausencia de producción ,de inmunoglobulina endógena. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigótica del gen de la región de unión de cadena pesada (JH) del anticuerpo en ratones mutántes quiméricos y de línea germinal da como resultado la total inhibición de la producción de anticuerpo endógeno;. La transferencia de la matriz génica de inmunoglobulina de línea germinal humana a estos ratones mutantes de línea germinal da lugar a la producción de anticuerpos humanos al estímulo del antígeno. Véase, por ejemplo, Jakoboyits <et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggemann et al., Year in Immuno., 7:33 (1993); Patentes de los Estados Unidos Núms. 5,545,806, 5,569,825, 5,591,669 (todas de GenPharm) ; Patente de los Estados Unidos Núm. 5,545,807; y WO 97/17852. Estos animales están manipulados genéticamente para producir anticuerpos humanos que incluyen un polipéptido de la presente invención. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos quiméricos que contienen secuencias derivadas de fuentes humanas y no humanas. En modalidades particulares, estos anticuerpos quiméricos son humanizados o primatizados® . En la práctica, los anticuerpos humanizados son normalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de la región hipervariable y posiblemente algunos residuos FR son sustituidos por residuos de sitios análogos en anticuerpos de roedores. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos quiméricos también incluyen anticuerpos totalmente humanos, en donde la región hipervariable humana o una o más CDR se retienen, pero una o más de otras regiones de la secuencia se han reemplazado por las secuencias correspondientes de un animal no humano. La elección de las secuencias no humanas:, tanto ligeras como pesadas, que se usan para producir los anticuerpos quiméricos, es importante para reducir la antigenicidad y las respuestas del anticuerpo humano anti-no humano, cuando el anticuerpo está destinado para uso terapéutico humano. También es importante que los anticuerpos quiméricos mantengan alta afinidad de unión por el antígeno y otras propiedades biológicas favorables . Para lograr esta meta, según un método preferido, los anticuerpos quiméricos se preparan por un proceso de análisis de las secuencias progenitoras y varios productos quiméricos conceptuales, utilizando modelos tridimensionales de las secuencias progenitoras humanas y no humanas. Los modelos de inmunoglobulina tridimensionales, por lo general, se encuentran disponibles y son familiares para el experto en la técnica. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulinas candidato seleccionadas. La revisión de estas representaciones permite el análisis de la función más probable de los residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidato, es decir, el análisis de residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidato para unirse a su antígeno. De esta manera, se pueden seleccionar los residuos FR y combinarse a partir de las secuencias del receptor e importadas de tal manera que se logren las características deseadas en el anticuerpo, por ejemplo, mayor afinidad por el antígeno diana. En general, los residuos de la región hipervariable son los que de una manera directa y más esencial influyen en la unión al antígeno. Como se señaló en lo anterior, los anticuerpos (o inmunoglobulinas ) se pueden dividir en cinco diferentes clases, con base en las diferencias en las secuencias de aminoácidos de la región constante de las cadenas pesadas. Todas las inmunoglobulinas de una clase dada tienen regiones constantes de cadena pesada muy similares. Estas diferencias se pueden detectar por estudios de secuencias o en forma más común, por medios serológicos (es decir, por el uso de anticuerpos dirigidos a estas diferencias) . Los anticuerpos o sus fragmentos, de la presente invención, son de cualquier clase y por lo tanto, pueden tener cadena pesada gamma, mu, alfa, delta o epsilon. Una cadena gamma es gamma 1, gamma 2, gamma 3 o gamma 4; y una cadena alfa es alfa 1 o alfa 2. En una modalidad preferida, un anticuerpo de la presente invención o fragmento del mismo, es una IgG. La IgG se considera la inmunoglobulina más versátil, porque 'es capaz de llevar a cabo todas las funciones de las moléculas de inmunoglobulina. La IgG es la principal Ig del suero y la única clase Ig que atraviesa la placenta. La IgG ¡también fija el complemento, aunque la subclase IgG4 no lo hace. Los macrófagos, monocitos, PMN y algunos linfocitos tienen receptores de Fe para región Fe de la IgG. No todas: las subclases se unen por igual; la IgG2 y la lgG4 no se unen a los receptores de Fe. Una consecuencia de la unión a los receptores de Fe en PMN, monocitos y macrófagos es que la célula puede entonces internalizar mejor el antígéno. La IgG es una opsonina que aumenta la fagocitosis. La unión de IgG a los receptores de Fe en otros tipos de células da como resultado la activación de otras funciones. Los anticuerpos de la presente invención pueden ser de cualquier subclase de IgG. En otra modalidad preferida, un anticuerpo de la presente invención o un fragmento del mismo, es una IgE. La IgE es la Ig sérica menos común ya que se une muy bien con los receptores Fe en basófilos y mastocitos incluso antes de interactuar con el antigeno. Como consecuencia de su unión a basófilos y mastocitos, la IgE participa 'en reacciones alérgicas. La unión del alérgeno a la IgE en las células da como resultado la liberación de varios mediadores farmacológicos que dan lugar a síntomas alérgicos. La IgE también tiene una función en enfermedades por parásitos helmínticos. Los eosinófilos tienen receptores de Fe para IgE y la unión de eosinófilos a helmintos recubiertos con IgE da como resultado la muerte del parásito. La IgE no fija el complemento. En varias modalidades, los anticuerpos de la presente invención y sus fragmentos, contienen una cadena ligera variable que es kappa o lambda. La cadena lambda es de cualquier subtipo, que incluye, por ejemplo, lambda 1, lambda 2 , lambda 3 y lambda 4. Como se señaló en lo anterior, la presente invención también proporciona fragmentos de anticuerpo que incluyen un polipéptido de la presente invención. En ciertas circunstancias tiene ventajas usar fragmentos de anticuerpo en lugar de los anticuerpos completos. Por ejemplo, el tamaño más pequeño de los fragmentos permite una rápida depuración y conduce a una mejor penetración a ciertos tejidos, como los tumores sólidos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos incluyen: fragmentos Fab, Fab 1 , F(ab')2 y Fv; diabodies; anticuerpos lineares; anticuerpos de cadena simple y anticuerpos multiespecíficos formados a partir de fragmentos de anticuerpos . Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente estos fragmentos se derivaban de anticuerpos intactos mediante digestión proteolítica (véase, por ejemplo, Morimoto et al., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992); y Brennan et al., Science, 229:81 (1985)). Sin embargo, estos fragmentos ahora .se pueden producir directamente por células hospederas recombinantes . Los fragmentos de anticuerpo Fab, Fv y ScFv se pueden expresar y segregar en E. coli, permitiendo así la fácil producción de grandes cantidades de estos fragmentos. Los fragmentos Fab'-SH se pueden recuperar en forma directa de E. coli y acoplarse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). Según otro enfoque, los fragmentos F(ab')2 se pueden aislar a partir de un cultivo de células hospederas recombinantes. Los fragmentos Fab y F(ab')2 con mayor vida media in vivo que incluyen residuos de epítope de unión a receptor de salvamento, se describen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,869,046. Para el técnico experimentado serán evidentes otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpo. En otras modalidades, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Véase WO 93/16185; Patentes de los Estados Unidos Núms . 5,571,894 y 5,587,458. Fv y sFv son las únicas especies con sitios de combinación intactos que carecen de regiones constantes. De este modo, son adecuados para una reducción de la. uni,ón inespecífica durante el uso in vivo. Se pueden construir proteínas de fusión sFv para obtener la fusión de: una proteína efectora en la terminal amino o en la terminal carboxi de una sFv. Véase, Antibody Engineering, ed.

Borrebaeck, véase referencia anterior. El fragmento de anticuerpo es también un "anticuerpo lineal", por ejemplo, tal como se describe, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,641,870. Estos fragmentos de anticuerpo lineal pueden ser monoespecíficos o biespecíficos . En ciertas modalidades, los anticuerpos de la presente invención son biespecíficos o multiespecíficos . Los anticuerpos biespecíficos son anticuerpos que tienen especificidades de unión frente al menos dos epítopes diferentes. Los anticuerpos biespecíficos ej emplificativos se unen a dos epítopes diferentes de un antígeno simple. Otros de estos anticuerpos combinan un primer sitió de unión al antígeno con un sitio de unión para un segundo antígeno. Como alternativa, una rama anti-CMV se combina con una rama que se une a una molécula activadora en un leucocito, por ejemplo, una molécula receptor de célula T (por ejemplo, CD3) o receptores de Fe para IgG (FcyR) , co o FcyRI (CD64) , FcyRII (CD32) y FcyRIII (CD16) , a fin |de enfocar y localizar mecanismos de defensa celular para la célula infectada. Los anticuerpos biespecíficos también se usan para localizar agentes citotóxicos para las células infectadas. Estos anticuerpos tienen una rama de unión a CMV y una rama que se une al agente citotóxico (por ejemplo, saporina, anti-interferón-a, alcaloides de la vinca, cadena ricina A, metotrexato o isótopo radioactivo hapteno) . Los anticuerpos biespecíficos se preparan como anticuerpos de longitud completa o como fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos F(ab*)2). El documento WO 96/16673 describe un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRIII y la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,837,234 expone un anticuerpo biespecífico anti-ErbB2/anti-FcyRI . Un anticuerpo anti-ErbB2/Fcoc se presenta en el documento WO 98/02463, La Patente de los Estados Unidos Núm. 5,821,337 da a conocer un anticuerpo anti-ErbB2/anti-CD3. Los métodos para hacer anticuerpos biespecíficos son conocidos en la técnica. La producción tradicional de anticuerpos biespecíficos de longitud completa tiene como base la coexpresión de dos pares de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen diferentes especificidades (Millstein et al., Nature, 305:537-539 (1983)). Debido a la distribución aleatoria de las cadenas pesadas y ligeras de la inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadrotas) producen una mezcla potencial de diez diferentes moléculas de anticuerpos, de las cuales una tiene la estructura biespecífica correcta. La purificación de la molécula correcta se hace, por lo regular, mediante cromatografía por afinidad, que es más bien laboriosa : el rendimiento de los productos es bajo. Procedimientos similares se exponen en el documento WO 93/08829 y en el artículo de Traunecker et al., EMBO J., 10:3655-^3659 (1991) . Según un enfoque diferente, los dominios variables del anticuerpo con las especificidades de unión deseadas (sitios de combinación antígeno-anticuerpo) se fusionan con las secuencias del dominio constante de la inmunoglobulina . De preferencia, la fusión es con un dominio constante de cadena pesada de Ig, que incluya al menos parte de las regiones de bisagra, CH2 y CH3. De preferencia, la primera región constante de cadena pesada (CH1) que contiene el sitio necesario para la unión de la cadena ligera, está presente en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de inmunoglobulina, y si se desea, la cadena ligera de inmunoglobulina, se insertan en vectores de expresión separados y se transfectan simultáneamente en una célula hospedera adecuada. Esto representa mayor flexibilidad al justar las proporciones recíprocas de los tres fragmentos polipeptídicos en modalidades en las que las proporciones desiguales de las tres cadenas polipeptídicas usadas en la construcción permite el rendimiento óptimo del anticuerpo biespecífico deseado. Sin embargo, es posible insertar las secuencias codificantes para dos o para las tres cadenas polipeptídicas en un solo vector de expresión cuando la expresión de al menos dos cadenas polipeptídicas en proporciones iguales da como resultado altos rendimientos o cuando las proporciones no afectan significativamente el rendimiento de la combinación de cadenas deseada. En una modalidad preferida de este enfoque, los anticuerpos biespecíficos están constituidos por una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en una rama y un para de cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina híbrida (que provee una segunda especificidad de unión) en la otra rama. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina que no convienen, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una mitad de la molécula biespecífica ofrece una forma fácil de separación. Este enfoque se expone en el documento WO 94/04690. Para más detalles acerca de la generación de anticuerpos biespecíficos , véase por ejemplo, Suresh et al., Methods in Enzymology, 121:210 (1986). Según otro enfoque descrito en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,731,168, la interfaz entre un para de moléculas de anticuerpo se puede manipular genéticarente para aumentar al máximo el porcentaje de heterodímeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante . La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3. En este método, una o más cadenas pequeñas laterales de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan con cadenas laterales más grandes (por ejemplo, tirosina o triptófano) . En la interfaz de la segunda molécula de anticuerpo se crean "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar a las cadenas laterales grandes al reemplazar las cadenas laterales grandes de aminoácidos con las pequeñas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto provee un mecanismo para aumentar el rendimiento del heterodímero con respecto a otros productos finales no deseados como los homodímeros . Los anticuerpos biespecífieos incluyen anticuerpos reticulados o "heteroconjugados" . Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconjugado se une a la avidina y el otro a la biotina. Estos anticuerpos : se han propuesto, por ejemplo, para dirigir células del sistema inmune a células no deseadas (Patente de los Estados Unidos Núm. 4,676,980) y para el tratamiento de la infección por VIH (WO 91/00360, WO 92/200373 y EP 03089). Los anticuerpos heteroconjugados se hacen a través de cualquier método de ? . reticulación que convenga. Los agentes de reticulación adecuados son bien conocidos en la técnica, también :se exponen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 4,676,980 junto con varias técnicas de reticulación.

Las técnicas para generar anticuerpos específicos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la literatura. Por ejemplo, los anticuerpos biespecíficos se pueden preparar mediante enlace químico. Brennan et al., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se fragmentan para generar fragmentos F(ab')2. Estos fragmentos se reducen en presencia de acomplejante de ditiol, arsenito de sodio, para estabilizar los ditíoles vecinales y evitar la formación de disulfuro intermolecular. Los fragmentos generados se convierten entonces a derivados tionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados Fab'-TNB se reconvierte luego al Fab'-tiol! por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar del otro derivado Fab'-TNB para formar el anticuerpo biespecífico . Los anticuerpos biespecíficos producidos se pueden usar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas. Los progresos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab'-SH de E. cp'li que se pueden acoplar químicamente para formar anticuerpos biespecíficos . Shalaby et al., J. Exp. ed., 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecífico F(ab')2 totalmente humanizado. Cada fragmento Fab ' fue segregado por separado a partir de E. coli y sometido a unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecífico . El anticuerpo biespecífico así formado tuvo la capacidad de unirse a células que sobreexpresan el receptor ErbB2 y a células T humanas normales y también de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxica humanos contra los tumores de mama humanos elegidos como objetivo. También se han descrito varias técnicas para producir y aislar fragmentos de anticuerpo biespecíficos , directamente a partir de cultivos de células recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecíficos mediante cierres de leucina. Kostelny et al., J. Immuriol . , 148 (5) : 1547-1553 (1992). Los péptidos del cierre de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab1 de dos anticuerpos diferentes por medio de fusión gériica.

Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región de bisagra para formar monómeros que después se reoxidaron y formaron los heterodímeros del anticuerpo. Este método también se puede utilizar para la producción de homodímeros de anticuerpo. La tecnología "diabody" descrita por Hollinger et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para hacer fragmentos de anticuerpo biespecíficos . Los fragmentos comprenden una región VH conectada a una región VL mediante un conector que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios en la misma cadena. En consecuencia, los dominios VH y VL de un fragmento necesariamente se unen con los dominios VL y VH complementarios de otro fragmento formando así dos sitios de unión al antígeno. También se ha reportado otra estrategia para hacer fragmentos de anticuerpo biespecífieos mediante el uso de dineros Fv (sFv) de cadena simple. Véase, Gruber et al., J. Immunol . , 152:5368 (19,94). Se prevén anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se preparan anticuerpos triespecíficos . Tutt et al., J. Immunol. 147:60 (1991). Un anticuerpo multivalente se puede internalizar (y/o catabolizár) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que expresa un antígeno con el cual se une el anticuerpo. Los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos multivalentes con tres o más sitios de unión al antígeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , los cuales se pueden producir con facilidad a través de la expresión recombinante de ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente contiene un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antígeno. Los dominios de dimerización preferidos incluyen una región Fe o una región de bisagra. En este escenario, el anticuerpo contiene una región Fe y tres o más sitios de unión al antígeno, amino terminal, para la región Fe. El anticuerpo multivalente preferido incluye de tres a aproximadamente ocho, pero de preferencia, ', cuatro sitios de unión al antígeno. El anticuerpo multivalente incluye al menos una cadena polipeptídica (y de preferencia, dos cadenas polipeptídicas) , en donde la q las cadenas de polipéptido contienen dos o más dominios variables. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptido incluyen VD1- (XI) n-VD2- (X2) n-Fc, en donde VD1 es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptido de una región Fe, XI y X2 representan un aminoácido o un polipéptido y n es 0 6 1. Por ejemplo, la o las cadenas de polipéptido incluyen: cadena de la región VH-CHl-conector flexible-VH-CHÍ-Fc ; o cadena de la región VH-CH1-VH-CH1-Fc . El anticuerpo multivalente, de preferencia, también incluye al menos dos (y de preferencia, cuatro) polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente , por ejemplo, contiene de aproximadamente dos a ocho polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera. Los polipéptidos del dominio variable de la cadena ligera previstos en la presente un dominio variable de cadena ligera y como característica opcional también contienen un dominio CL. Los anticuerpos de la presente invención también incluyen anticuerpos de cadena simple.

En modalidades particulares, los anticuerpos de la presente invención son anticuerpos internalizantes. Se prevén modificaciones en la secuencia de aminoácidos de los anticuerpos aquí descritos. Por ejemplo, se mejora la afinidad de unión y/u otras propiedades biológicas del anticuerpo. Las variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo se preparan introduciendo cambios en los nucleótidos correspondientes de ¡un polinucleótido que codifica al anticuerpo o una cadena del mismo o bien, por síntesis de péptidos. Modificaciones ej emplificativas incluyen, por ejemplo, deleciones y/o inserciones y/o sustituciones de residuos dentro de las secuencias de aminoácidos del anticuerpo. Cualquier combinación de deleción, inserción y sustitución se hace para llegar al anticuerpo final, siempre que el constructo final tenga las características deseadas. Los cambios de aminoácidos también pueden alterar los procesos del anticuerpo posteriores a la traducción, por ejemplo, cambiar el número o posición de los sitios de glucosilación . Cualquiera de las variaciones y modificaciones descritas en lo anterior para los polipéptidos de la presente invención están incluidas en los anticuerpos de la presente invención. Un método útil para la identificación de ciertos residuos o regiones del anticuerpo que son las ubicaciones preferidas para la mutagénesis , es el denominado "mutagénesis por barrido de alanina" según lo describe Cunningham y Wells en Science, 244:1081-1085 (1989) . En éste, se identifica un residuo o grupo de residuos objetivo (por ejemplo, residuos con carga como arg, asp, his lys y glu) y se sustituyen por un aminoácido de carga neutra o negativa (con la máxima preferencia, alanina o polialanina) y afectar la interacción de los aminoácidos con el ahtígeno PSCA. Aquellas ubicaciones de aminoácidos que demuestren sensibilidad funcional frente a las sustituciones sei afinan introduciendo variantes adicionales o distintas en los sitios de sustitución. De este modo, mientras que el sitio para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, la naturaleza de la mutación, en sí, no necesita estar predeterminada. Por ejemplo, para analizar el desempeño de una mutación en un sitio dado, se lleva a cabo mutagénesis aleatoria o por barrido de ala, en el codón o región elegidos como objetivo y las variantes del anti- anticuerpo expresadas se escanean respecto a la actividad deseada. Las inserciones en la secuencia de aminoácidos incluyen fusiones amino y/o carboxi terminal que varían en cuanto a longitud de un residuo a polipéptidos que contienen un ciento o más residuos, así como inserciones intrasecuencia de residuos de aminoácidos simples o múltiples. Ejemplos de inserciones terminales incluyen un anticuerpo con un residuo metionilo N terminal o el anticuerpo fusionado a un polipéptido citotóxico. Otras variantes de inserción de un anticuerpo incluyen la fusión de la terminal N o C del anticuerpo a una enzima (por ejemplo, para ADEPT) o un polipéptido que aumente la vida media sérica del anticuerpo. Otro tipo de variante es una variante de sustitución de aminoácido. Estas variantes tienen al menos un residuo de aminoácido en la molécula de anticuerpo sustituida por un residuo diferente. Los sitios de mayor interés para la mutagénesis de sustitución incluyen las regiones hipervariables , pero también se prevén las alteraciones de FR. Se consideran las sustituciones conservativas y no conservativas. Modificaciones básicas en las propiedades biológicas del anticuerpo se llevan a cabo ,' por sustituciones selectivas que difieren significativamente en su efecto para mantener: (a) la estructura del esqueleto del polipéptido en el área de la sustitución, por ejemplo, la conformación de hoja o helicoidal, (b) la carga o hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana, o (c) el volumen de la cadena lateral . Cualquier residuo de cisteína que no participe en la conservación de la conformación adecuada del anticuerpo también se sustituye, por lo general, con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y prevenir la reticulación anormal. Por el contrario, se adicionan enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (en particular, si el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo como el fragmento Fv) . Un tipo de variante de sustitución implica la sustitución de uno o más residuos de la región hipervariable de un anticuerpo progenitor. Por lo general, la o las variantes resultantes seleccionadas para desarrollarse después, tienen mejores propiedades biológicas con relación al anticuerpo progenitor a partir del cual se generan. Una forma conveniente para generar estas variantes de sustitución incluye la maduración de afinidad mediante el uso de despliegue de fagos. En resumen, varios sitios de la región hipervariable (por ejemplo, 6 - 7) son mutados para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Las variantes de anticuerpo así generadas se despliegan en su forma monovalente a partir de partículas de fagos filamentosos como fusiones al producto génico III del M13 empacado dentro de cada partícula. Las variantes desplegadas de los fagos se tamizan respecto a su actividad biológica (por ejemplo, afinidad de unión) tal como se expone en la presente. A fin de identificar los sitios de la> región hipervariable candidatos para modificación, se realiza mutagénesis por barrido de alanina para identificar residuos de la región hipervariable que contribuyan significativamente a la unión al antígeno. Como alternativa o de manera adicional, se analiza una estructura cristalina del complejo antígeno-anticuerpo para identificar los puntos de contacto entre el anticuerpo y un antígeno o célula infectada. Estos residuos de contacto y los residuos circundantes son candidatos para sustitución según las técnicas elaboradas aquí. Una vez que estas variantes se generan, el conjunto de variantes se somete a tamizaje en la forma aquí descrita y los anticuerpos con propiedades superiores en uno o más ensayos pertinentes se seleccionan para desarrollo posterior. Otro tipo de variante de aminoácido del anticuerpo altera el patrón original de glucosilación del anticuerpo. Alterar significa eliminar una o más entidades carbohidrato que se encuentran en el anticuerpo y/o adicionar uno o más sitios de glucosilación que no estján presentes en el anticuerpo. La glucosilación de anticuerpos es, por lo regular, enlace a N o enlace a O. Enlace a N se refiere a la unión de la entidad carbohidrato con una cadena lateral de un residuo asparagina. Las secuencias de trípéptido asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, en donde X es cualquier aminoácido con excepción de prolina, son las secuencias de reconocimiento para la unión enzimática de la entidad carbohidrato con la cadena lateral de aspajragina. Así, la presencia de cualquiera de estas secuencias de tripéptido en un polipéptido genera un sitio de glucosilación potencial. La glucosilación de enlace O se refiere a la unión de uno de los azúcares N-acetilgalactosamina, galactosa o xilosa a un ácido hidroxiamino, más comúnmente serina o treonina, aunque también se pueden usar 5-hidroxiprolina o 5-hidroxilisina . La adición de sitios de glucosilación al anticuerpo se lleva a cabo en forma conveniente alterando la secuencia de aminoácidos de tal manera que contenga una o más de las secuencias de tripéptido descritas, en lo anterior (para sitios de glucosilación de enlace a N) . La alteración también se hace por la adición o sustitución de uno o más residuos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original (para sitios de glucosilación de enlace a O) . El anticuerpo de la invención está modificado con respecto a la función efectora, por ejemplo, para aumentar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y/o la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) del anticuerpo. Esto se puede lograr al introducir una o más sustituciones de aminoácidos en una región Fe del anticuerpo. Como alternativa o de manera adicional, se introducen residuos de cisteína en la región Fe, lo que permite la formación de enlaces disulfuro entre las cadenas, en esta región. El anticuerpo homodimérico asi generado puede tener mejor capacidad de internalización y/o mayor capacidad de exterminio celular dependiente del complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) . Véase, Carón et al., J. Exp. Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B.J. Immunol . 148:2918-2922 (1992). También se preparan anticuerpos homodiméricos con mayor actividad anti-infección, por medio de reticulantes heterobifuncionales, según se describe en Wolff et al., Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). Como alternativa, ¡un anticuerpo se manipula genéticamente para tener doble región Fe y por ello puede tener mayores capacidades para la lisis del complemento y la ADCC. Véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). A fin de aumentar la vida media sérica del anticuerpo, se incorpora en el anticuerpo un epítope de unión a receptor de salvamento (en especial, un fragmento de anticuerpo) según se describe, por ejemplo, en :la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,739,277. El térmi'no "epítope de unión a receptor de salvamento" se refiere a un epítope de la región Fe de una molécula de IgG (por ejemplo, IgG^ IgG2, IgG3 o IgG4) que es responsable de aumentar la vida media sérica in vivo de la molécula de IgG. Los anticuerpos de la presente invención también se modifican para incluir un marcador o epítope etiquetado, por ejemplo, para usarse en purificación o aplicaciones de diagnóstico. La invención también pertenece a la terapia con inmunoconj ugados que incluyen un anticuerpo conjugado con antineoplásico, por ejemplo, un agente citotóxico o un inhibidor de proliferación. Los agentes quimioterapéu icos útiles en la generación de estos inmunoconjugados ya se han descrito en lo anterior. También se prevén en la presente los conjugados de un anticuerpo y una o más toxinas de molécula pequeña, por ejemplo, calicheamicina, maitansinoides, auristatina un tricoteno y CC1065, y los derivados de estas toxinas que tengan actividad de toxina. En una modalidad preferida, un anticuerpo (de longitud total o fragmento) de la invención, se conjuga con una o más moléculas de maitansinoide . Los maitansinoides son inhibidores mitotóticos que actúan por inhibición de la polimerización de tubulina. La maitansina primero se aisló del arbusto Maytenus serrata de África oriental (Patente de los Estados Unidos Núm. 3,896,111). Después, se descubrió que ciertos microbios también producían maitansinoides, como los ésteres de maitansinol y C-3 maitansinol (.Patente de los Estados Unidos Núm. 4,151,042) . El maitánsinol sintético y sus derivados y análogos se describen, , por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms . 4,137,230; 4,248,870; 4,256,746; 4,260,608; 4,265,814; 4,294,757; 4,307,016; 4,308,268; 4,308,269; 4,309,428; 4,313,946; 4,315,929; 4,317,821; 4,322,348; 4,331,598; 4,361,650; 4,364,866; 4,424,219; 4,450,254; 4,362,663; 4,371,533. En un intento para mejorar su índice terapéutico, la maitansina y los maitansinoides se han conjugado con anticuerpos que se unen específicamente a antígenos de células tumorales. Los inmunoconj ugados que contienen maitansinoides y su uso terapéutico se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos, Ñúms . 5,208,020, 5,416,064 y la Patente Europea EP 0 425 235 Bl .

Liu et al., Proc . Nati. Acad. Sci. USA 93:8618-8623 (1996) describe inmunoconjugados que incluyen un mai ansirioide denominado DM1 unido al anticuerpo monoclonal C242 dirigido contra cáncer colorrectal humano. Se encontró que el conjugado es bastante citotóxico frente a células de cáncer de colon cultivadas y mostró actividad antitumoral en un ensayo de proliferación tumoral in vivo. Se preparan conjugados anticuerpo-maitansirioide por unión química de un anticuerpo a una molécula de maitansinoide sin disminuir en forma importante la actividad biológica del anticuerpo o de la molécula de maitansinoide . Se ha demostrado que un promedio de¡ 3 a 4 moléculas de maitansinoide conjugadas por anticuerpo es eficaz para aumentar la citotoxicidad de células diana sin afectar negativamente la función o solubilidad del anticuerpo, aunque se esperaría que incluso una molécula de toxina/anticuerpo aumentara la citotoxicidad con respecto al uso del anticuerpo solo. Los maitansinoides son muy conocidos en la técnica y se pueden sintetizar mediante lás técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. Maitansinoides adecuados se exponen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,208,020 y en otras patentes y publicaciones mencionadas anteriormente. Los maitansinoides preferidos son el maitansinol y análogos del maitansinol modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, por ejemplo, varios ésteres de maitansinol. Existen muchos grupos conectores que se conocen en la técnica para producir conjugados de anticuerpo, que incluye, por ejemplo, los que se exponen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,208,020 o en la Patente EP 0 425 235 Bl y en Chari et al., Cáncer Research 52:127-131 (1992) . Los grupos conectores incluyen grupos disulfuro, tioéteres, grupos lábiles frente a ácidos, grupos fotolábiles, grupos lábiles frente a peptidasa o grupos lábiles frente a estearasa, tal como se describe en, las patentes ya mencionadas, se prefieren los grupos disulfuro y tioéter. Los inmunocon ugados se hacen utilizando una variedad de agentes de acoplamiento de proteínas bifuncionales como N-succinimidil-3- (2-piridilditio) rópionato (SPDP) , succinimidil-4 - (lámaleimidometil ) ciclohexan- 1 -carboxilato , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (como clorhidrato de dimetil adipimidato) , ésteres activos (como suberato de disuccinimidilo) , aldehidos (como glutaraldehído) , compuestos bis-azido (como bis- (p-azidobenzoil ) hexandiamina) , derivados bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoílo) -etilendiamina) , diisociaiiatos (como toluen-2 , 6-diisocianato) y compuestos fluorados biactivos (como 1 , 5 -difluor- 2 , 4 -dinitrobenceno) . En particular, se prefieren agentes de acoplamiento que incluyen el N-succinimidil-3- (2-piridilditio) própionato (SPDP) (Carlsson et al., Biochem. J. 173:723-737 [1978]) y N-succinimidil-4 - (2-piridiltio) pentanoato (SPP) , para proveer un enlace disulfuro. Por ejemplo, se puede preparar una ricina inmunotoxina tal como se describe en el artículo de Vitetta et al., Science 238: 1098 (1987). El ácido ,1-isotiocianatobencil-3 -metilidietilen triiminopentaacético (MX-DTPA) marcado con carbono 14, es un agente quelante ejemplificativo para la conjugación de radionucleótido al anticuerpo. Véase WO 94/11026. El conector es un "conector escindible" que facilita la liberación del medicamento citotóxico en la célula. Por ejemplo, se puede usar un conector lábil frente a ácidos, Cáncer Research 52:127-131 (1992); Patente de los Estados Unidos Núm. 5,208,020). Otro inmunocon ugado de interés incluye un anticuerpo conjugado con una o más moléculas de calicheamicina. Los antibióticos de la familia calicheamicina tienen la capacidad de producir rompimientos de ADN bicatenario a concentraciones subpicomolares . Para la preparación de conjugados de la familia calicheamicina, véase las Patentes de los Estados Unidos Núms . 5,712,374, 5,714,586, 5,739,116, 5,767,285, 5,770,701, 5,770,710, 5,773,001, 5,877,296 (todas de American Cyanamid Company) .

Otro medicamento al cual se conjuga el anticuerpo es el antifolato QFA. Tanto la calicheamicina como el QFA, tienen sitios intracelulares de acción y no cruzan fácilmente la membrana plasmática. Por lo tanto, la captación celular ;de estos agentes a través de internalización mediada, por anticuerpos aumenta mucho sus efectos citotóxicos. Ejemplos de otros agentes que se conjugan con los anticuerpos de la invención, incluyen ¡ BCNU, estreptozoicina, vincristina y 5 - fluorouracilo, la familia de compuestos conocidos colectivamente como complejo LL- E33288 descritos en las Patentes de los Estados | Unidos Núms. 5,053,394, 5,770,710, así como las esperamicinas (Patente de los Estados Unidos Núm. 5,877,296). Las toxinas con actividad enzimática y fragmentos de las mismas que se utilizan, incluyen, por ejemplo, cadena de difteria A, fragmentos activos de toxina difteria que no se unen, cadena exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modeccina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleuritis fordii, proteínas de diantina, proteínas de fitolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de momordica carantia, cureína, crotina, inhibidor de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina, fenomicina, enomicina y tricotecenes . Véase, por ejemplo, WO 93/21232. La presente invención también comprende1 un inmunoconjugado formado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolítica (por ejemplo, ribonucleasa o ADN endonucleasa como desoxirribonucleasa ; DNasa) . ! Para la destrucción selectiva de células infectadas, el anticuerpo contiene un átom : muy radioactivo. Existen disponibles varios isótopos radioactivos para la producción de anticuerpos radioconjugados anti-PSCA. Los ejemplos incluyen At211, I1?1, I125, Y90, Re18G, Re188, Sm15\ Bi212, P32 , Pb212 e isótopos radioactivos de Lu. Cuando el conjugado se usa para í diagnóstico, contiene un átomo radioactivo para estudios gammagráficos , por ejemplo, tc99m o I123, o una marca de Igiro para generación de imagen por resonancia magnética nuqlear ( MR - nuclear magnetic resonance) (también conocida como imagen de resonancia magnética, (mri - magnetic resonance imaging) , como yodo 123, yodo 131, indio 111, flúor] 19, carbono 13, nitrógeno 15, oxígeno 17, gadolinio, manganeso o hierro. La radiomarca u otra etiqueta se incorporan, en él conjugado según las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se biosintetiza o sintetiza por síntesis química de aminoácidos por medio de precursores adecuados de aminoácidos que incluyan, por ejemplo, flúor 16 en lugar de hidrógeno. Marcadores como tc99m o I123, Re186, Re188 e ;inm se unen al péptido a través de un residuo de cisteínai El itrio 90 se puede unir a través de un residuo de lisiná. Él método IODOGEN (Fraker et al., (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun. 80:49-57, se usa para incorporar yodo 123'. La publicación "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press 1989) describe con detalle j. otros métodos . Como alternativa, se produce una proteína de fusión que incluye el anticuerpo y el agente citotóx co, por ejemplo, mediante técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN incluye regiones respectivas que codifican las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre si o separadas por una región que codifica un péptido conector que no destruye las propiedades deseadas del conjugado. Los anticuerpos de la presente invención también se usan en la terapia con profármacos mediada por enzimas dependientes de anticuerpos (ADEPT - antibody dependent enzyme mediated prodrug therapy) , por conjugación del anticuerpo con una enzima activadora de un profármaco que convierte al profármaco (por ejemplo, un , agente quimioterapéutico peptidilo, véase WO 81/01145) 'en un medicamento antineoplásico activo (véase, por ejemplo, WO 88/07378 y Patente de los Estados Unidos Núm. 4,975,278). El componente enzimático del inmunoconjugado útil para la ADEPT incluye cualquier enzima con capacidad para actuar en un profármaco de tal manera que lo convierta en su forma citotóxica más activa. Las enzimas que son útiles en el método de esta invención incluyen, entre otras, la fosfatasa alcalina que es útil para convertir profármacos que contienen fosfato en medicamentos libres; arilsulfatasa útil para convertir profármacos que contienen sulfatos en medicamentos libres; citosina desaminasa útil' paira convertir 5-fluorocitosina atóxica en el medicamento antineoplásico 5-fluorouracilo; proteasas , como serratia proteasa, termolisina, subtilisina, carboxipeptidasas y catepsinas (como catepsinas B y L) , que son útiles para convertir profármacos que contienen péptidos en medicamentos libres; D-alanilcarboxipeptidasas, útiles para convertir profármacos que contienen sustituyentes D-aminoácidos; enzimas que hidrolizan carbohidratos como la ß-galactosidasa y neuraminidasa, útiles para convertir profármacos glucosilados en medicamentos libres; ß-lactamasa útil para convertir medicamentos derivatizados con ß-lactamas en medicamentos libres; y penicilinamidasas , como penicilina V amidasa o penicilina G amidasa, útiles para convertir medicamentos derivatizados en sus nitrógenos amínicos con grupos fenoxiacetilo o fenilacetilo , respectivamente, en medicamentos libres. Como alternativa, se pueden usar anticuerpos con actividad enzimáticá, también conocidos en la técnica como "abzimas" ( "abzymes" ) , para convertir los profármacos de la invención en medicamentos activos libres (véase, por ejemplo, Massey, Nature 328: 457-458 (1987)). Los conjugados anticuerpo-abzima, según se describe aquí se pueden preparar para suministrar la abisma a una población de células infectadas . Las enzimas de esta invención se unen por covalencia a los anticuerpos por medio de técnicas muy conocidas, como lo es el uso de reactivos de reticulación heterobifuncionales mencionados en lo anterior. Como alternativa, proteínas de fusión que incluyen al menos la región de unión al antígeno de un anticuerpo de la invención acoplada con al menos una porción funcionálmente activa de una enzima de la invención, se construyen mediante las técnicas de ADN recombinante muy conocidas en el campo técnico (véase, por ejemplo, Neuberger et al., Nature, 312: 604-608 (1984). Se prevén aquí otras modificaciones del anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo está unido a una variedad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol; Él anticuerpo también se presenta incorporado en microcápsulás preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microc psulás de gelatina , y microc psulás de poli (metilmetacrilato, respectivamente), en sistemas coloidales de suministro de medicamentos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, I6th edition, oslo, A. Ed. , (1980) . Los anticuerpos aquí expuestos también se pueden formular como inmunoliposomas . Un "liposoma" es una pequeña vesícula compuesta de varios tipos de lípidos, fosfolípidos y/o surfactante, el cual es útil para el suministro de un medicamento a un mamífero. Los componentes del lipósoma están dispuestos, por lo regular, en una formación bicapa, similar a la configuración lipídica de las membranas biológicas. Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan por los métodos conocidos en la técnica, como los que se describen en las publicaciones de Epstein et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980); Patentes: dé los Estados Unidos Núms . 4,485,045 y 4,544,545; y WO 97/38731 publicada el 23 de octubre de 1997. Los liposomas con tiempo de circulación mejorado, se exponen en la Patente de los Estados Unidos Núm. 5,013,556. Liposomas particularmente útiles se generan por el método de evaporación en fase inversa con una composición lipídica que incluye fosfatidil'colina, colesterol y fosfatidiletanolamina derivatizada con PEG (PEG-PE) . Los liposomas se extruyen a través de filtros con tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab 1 del anticuerpo de la presente invención se pueden conjugar con los liposomas según se describe en el artículo de Martin et al . , J. Biol . Chem. 257:286-288 (1982) mediante la reacción de intercambio de disulfuro. Como característica opcional dentro del liposoma está contenido un agente quimioterapéutico . Véase, Gabizon et al., J. National Cáncer Inst. 81(19)1484 (1989). Los anticuerpos de la presente invención o fragmentos de los mismos, pueden tener una variedad de características biológicas o funcionales. En ciertas modalidades, estos anticuerpos son anticuerpos específicos contra CMV, lo que indica que se unen de manera específica o preferencial al CMV o al HCMV, respectivamente, en comparación con otros virus. En modalidades particulares, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo antagonista, el cual parcial o totalmente bloquea o inhibe una actiyidad biológica de un polipéptido o célula a la cual se une de manera específica o preferencial. En otras modalidades, un anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo inhibidor de proliferación el cual parcial o totalmente bloquea o inhibe la proliferación de una célula infectada a la cual se une. En otra modalidad, un anticuerpo de la presente invención induce apoptosis. En otra modalidad más, un anticuerpo de la presente invención induce o promueve la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos' ó la citotoxicidad dependiente del complemento.

Polinucleótidos La presente invención, en otros aspectos, provee composiciones de polinucleótidos. En modalidades preferidas, estos polinucleótidos codifican un polipéptido de la presente invención, por ejemplo, una región de una cadena variable de un anticuerpo que se une al CMV. Como será también reconocido por el técnico experimentado, los polinucleótidos de la invención son monocatenarios (codificante o antisentido) o bicatenarios y pueden ser moléculas de ADN (genómico, cADN o sintético) o ARN. Las moléculas de ARN incluyen moléculas de HnARN, que contienen intrones y corresponden a una molécula de ADN en forma exacta y moléculas de ARNm que no contienen intrones. Pueden estar presentes, aunque no necesariamente, secuencias codificantes o no codificantes, dentro¡ de un polinucleótido de la presente invención y un polinucleótido, aunque no necesariamente, puede estar unido a otras moléculas y/o materiales de soporté. Los polinucleótidos de la presente invención se usan, por ejemplo, en ensayos de hibridación para detectar la presencia de un anticuerpo específico para CMV en una muestra biológica, y en la producción recombinánté de polipéptidos de la presente invención. 1 Por lo tanto, según otro aspecto de la presente invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que incluyen algunas o todas las secuencias de polinucleótidos enunciadas en el Ejemplo 1, complementos de una secuencia de polinucleótidos enunciada en el Ejemplo 1 y variantes degeneradas de una secuencia de polinucleótidos enunciada en el Ejemplo 1. En ciertas modalidades preferidas, las secuencias polinucleotídicas enunciadas aquí codifican polipéptidos capaces de unirse a una célula infectada por CMV de manera preferencial en comparación con una célula de control no infectada, incluido un polipéptido que tenga una secuencia enunciada en el Ejemplo 1 o en la Figura 1. Por otra parte, la presente invención contempla todos los polinucleótidos que codifican cualquier polipéptido de la presente invención. En otras modalidades relacionadas, la presente invención provee variantes de polinucleótido que tienen considerable identidad con las secuencias enunciadas en el Ejemplo 1 (o una porción de las mismas que codifica una región variable o un dominio funcional) , por ejemplo, las t que incluyen al menos 70% de identidad de secuencia, de preferencia, al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% o más identidad de secuencia en comparación don una secuencia polinucleotídica de esta invención (o fragmentos de la misma que codifica una región variable o dominio funcional de un polipéptido de la presente invención) , según se determina por medio de los métodos descritos en la presente (por ejemplo, análisis BLAST con parámetros estándar) . El experto en la técnica reconocerá que estos valores se pueden ajustar en forma correcta para determinar la identidad correspondiente de proteínas codificadas por dos secuencias nucleotídicas tomando en cuenta la degeneración del codón, la similitud de aminoácidos, el posicionamiento del marco de lectura, y lo similar . Por lo general, las variantes polinucleotídicas contienen una o más sustituciones, adiciones, deleciones y/o inserciones, de preferencia, de tal manera que las propiedades de unión inmunogénica del polipéptido codificado por el polinucleotido variante no disminuyan de manera considerable con relación a un polipéptido codificado por una secuencia polinucleotídica específicamente enunciada en la presente. En modalidades adicionales, la presente invención proporciona fragmentos de polinucleótidos que incluyen varias longitudes de tramos contiguos de secuencia idéntica o complementaria a una o más de las secuencias expuestas aquí. Por ejemplo, esta invención proporciona polinucleótidos que incluyen al menos 10, 15, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 300, 400, 500 Ó 1000 O más nucleótidos contiguos de una o más de las secuencias expuestas aquí, así como todas las longitudes intermedias que hay entre ellas. Será fácil de comprender que en este contexto el término "longitudes intermedias" se refiere a cualquier longitud entre los valores citados, cómo 16,: 17, 18, 19, etc.; 21, 22, 23, etc.; 30, 31, 32, etc.; 50, 51, 52, 53, etc.; 100, 101, 102, 103, etc.; 150, 151, 152, 153, etc.; incluidos todos los enteros de 200 a 500; 500 a 1000, y lo similar. En otra modalidad de la invención, se proporcionan composiciones de polinucleótidos que son capaces de hibridarse, en condiciones de rigor (stringency) de altas a moderadas, a una secuencia de polinucleótidos proporcionada en la presente o a un fragmento de la misma o a una secuencia complementaria de la misma. Las técnicas de hibridación son muy conocidas en la técnica de biológica molecular. Para fines de ilustración, las condiciones de restricción moderadas y adecuadas para evaluar la hibridación de un polinucleótido de esta invención con otros polinucleótidos, incluyen el prelavado en una solución de 5 X SSC, 0.5%· SDS, 1.0 m de EDTA (pH 8.0); hibridación a 50°C-60°C, 5 X SSC, durante la noche; seguido de doble lavado a 65 °C durante 20 minutos con 2X, 0.5X y 0.2X SSC que contiene SDS 0.1%. El experto en la técnica comprenderá que el rigor de la hibridación se puede manipular con facilidad, por ejemplo, alterando el contenido de sal de las soluciones de hibridación y/o la temperatura a la cual se realiza la hibridación. Por ejemplo, en otra modalidad, las condiciones de hibridación bastante rigurosas y adecuadas incluyen las que ya se describieron excepto porque aumenta la temperatura de hibridación, por ejemplo, a 60-65°C o 65-70°C. En modalidades preferidas, el polipéptido codificado por la variante o fragmento polinucleotídico tiene la misma especificidad de unión (es decir, se une de manera específica o preferencial al CMV) que el polipéptido codificado por el polinucleótido nativo. En ciertas modalidades preferidas, los polinucleótidos descritos en lo anterior, por ejemplo, variantes de polinucleótido, fragmentos y secuencias de hibridación, codifican polipéptidos que tienen un grado de actividad de unión de al menos aproximadamente 50%, de preferencia, al menos aproximadamente 70% y con más preferencia, al menos aproximadamente 90% respecto a la de una secuencia polipeptídica enunciada aquí de manera específica. Los polinucleótidos de la presente invención o los fragmentos de los mismos, independientemente de la longitud de la secuencia codificante en sí, se combinan con otras secuencias de ADN, como promotores, señales de poliadenilación, sitios de enzimas de restricción adicionales, sitios de clonación múltiple, otros segmentos codificantes, y lo similar, de manera que su longitud global varía en forma considerable. Se emplea un fragmento de ácido nucleico casi de cualquier longitud y de preferencia, la longitud total se limita por la facilidad de preparación y uso en el protocolo de ADN recombinante que se pretende. Por ejemplo, segmentos de polinucleótidos ilustrativos con longitudes totales aproximadas de 10000, 5000, 3000, 2000, 1000, 500, 200, 100, 50 pares de bases de longitud, y lo similar (incluidas todas las longitudes intermedias) , son útiles en muchas implementaciones de esta invención. Las personas con experiencia ordinaria en la técnica apreciarán que como resultado de la degeneración del código genético, hay muchas secuencias nucleotídicas que codifican un polipéptido según se describe en la presente. Algunos de estos polinucleótidos tienen mínima homología respecto a la secuencia nucleotídica de cualquier gen nativo. Sin embargo, los polinucleótidos que codifican un polipéptido de la presente invención pero que varían debido a diferencias en el uso de codón, están específicamente previstos en la presente invención. Por otra parte, los alelos de los genes que incluyen, las secuencias polinucleotídicas proporcionadas aquí, quedan dentro del alcance de la presente invención. Los alelos son genes endógenos que se alteran como resultado de una o más mutaciones, como deleciones, adiciones y/o sustituciones de nucleótidos. El ARNm y la proteína resultantes, aunque no necesariamente, pueden tener una estructura o función alterada. Los alelos se identifican mediante el uso de técnicas estándar (como hibridación, amplificación y/o comparación de secuencias en base de datos) . En ciertas modalidades de la presente invención, los inventores prevén la rautagénesis de las secuencias polinucleotídicas expuestas para alterar una o ; más propiedades del polipéptido codificado, como su especificidad de unión o fuerza de unión. Las técnicas de mutagénesis son muy conocidas en el campo técnico y se usan mucho para crear variantes de polipéptidos y polinucleótidos . Un enfoque de la mutagénesis, por ejemplo, la mutagénesis específica del sitio, se emplea para la preparación de variantes y/o derivados de los polipéptidos aquí escritos. Según este enfoque, las modificaciones específicas en una secuencia polipeptídica se hacen a través de mutagénesis de los polinucleótidos subyacentes que la codifican. Estas técnicas permiten un enfoque sencillo para preparar y evaluar variantes de secuencia, por ejemplo, incorporando una o más de las consideraciones anteriores, introduciendo uno o más cambios de la secuencia de nucleótidos en el polinucleótido . La mutagénesis específica del sitio permite la producción de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos específicas que incluyen la secuencia nucleotídica de la mutación deseada, así como un número suficiente de nucleótidos adyacentes, para proporcionar una secuencia cebadora de tamaño suficiente y complejidad de secuencia para formar un híbrido estable en ambos lados del empalme de la deleción que atraviesa. Las mutaciones se emplean en una secuencia polinucleotídica seleccionada para mejorar, alterar, disminuir, modificar o de otro modo cambiar las propiedades del polinucleótido en sí y/o alterar las propiedades, actividad, composición, estabilidad o secuencia primaria del polipéptido codificado . En otras modalidades de la presente invención, las secuencias de polinucleótidos de aquí se usan como sondas o cebadores para la hibridación de ácido nucleico, por ejemplo, como cebadores PCR. La habilidad que estas sondas de ácido nucleico tienen para hibridarse de manera específica a una secuencia de interés permitirá su uso para detectar la presencia de secuencias complementarias: en una muestra dada. Sin embargo, también se prevén otros usos, como lo es el uso de la información de la secuencia en la preparación de cebadores de especies mutantes o cebadores para usarse en la preparación de otras construcciones genéticas. Así, se considera que los segmentos de ácido nucleico que incluyan una región de la secuencia > con al menos aproximadamente 15 nucleótidos de longitud de secuencia contigua, que tengan la misma secuencia o que sea complementaria a una secuencia contigua de 15 nucleótidos de longitud que se expone aquí, son particularmente útiles. Las secuencias contiguas largas, idénticas o complementarias, por ejemplo, aquellas de aproximadamente 20, 30, 40, 50, 100, 200, 500, 1000 (incluidas todas! las longitudes intermedias) e incluso hasta las secuencias de longitud completa, ten se usan en ciertas modalidades. Las moléculas de polinucleótidos que tienen regiones de secuencia que incluyen tramos de nucleótidos contiguos de 10-14, 15-20, 30, 50 o incluso 100-200 nucleótidos o así (incluidas también las longitudes intermedias) , idénticas o complementarias a una secuencia polinucleotídica expuesta en la presente, se prevén especialmente como sondas de hibridación para usarse, por ejemplo, en transferencia Southern y Northern y/o cebadores para usarse, por ejemplo, en reacción en cadena .de polimerasa (PCR) . El tamaño total del fragmento así como el tamaño del o los tramos complementarios, dependerá en última instancia del uso o aplicación que se pretenda para el segmento de ácido nucleico particular. Los fragmentos más pequeños se usan en modalidades de hibridación, en donde la longitud de la región complementaria contigua puede variar, por ejemplo, entre aproximadamente 15 y 100 nucleótidos, pero se pueden usar tramos de complementariedad contiguos más grandes, según la longitud de las secuencias complementarias que se van a detectar. El uso de una sonda de hibridación de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos de longitud permite la formación de una molécula bicatenaria que es estable y selectiva. En general, se prefieren las moléculas que tienen secuencias complementarias contiguas respecto a tramos mayores de 12 bases, aunque con el fin de incrementar la estabilidad y selectividad del híbrido y mejorar así la calidad y grado de moléculas híbridas específicas obtenidas. Se prefieren las moléculas de ácido nucleico que tienen tramos complementarios a genes, de 15 a 25 nucleótidos contiguos o incluso más grandes. Las sondas de hibridación se seleccionan a partir de cualquier porción de cualquiera de las secuencias expuestas aquí . Todo lo que se requiere es revisar1 las secuencias enunciadas en la presente o cualquier porción continua de las secuencias, de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos de longitud hasta la longitud total de la secuencia, que se quiera utilizar como sonda o cebador. La elección de las secuencias sonda y cebador pueden controlarse por varios factores. Por ejemplo, puede que se quiera emplear cebadores desde o hacia las terminales de la secuencia total.

Los polinucleótidos de la presente invención o sus fragmentos o variantes, se preparan con facilidad, por ejemplo, sintetizando directamente el fragmento por medios químicos, en la forma común que se practica mediante el uso de un sintetizador de oligonucleótidos automatizado. También, se pueden obtener fragmentos por aplicación de la tecnología de reproducción de ácido nucleico, como la tecnología PCR® de la Patente de los Estados Unidos Nútn. 4,683,202, por introducción de secuencias selectas en vectores recombinantes para producción recombinante y por otras técnicas de ADN recombinante, por lo general, conocidas para el experto en la técnica de la biológica molecular .

Vectores, células hospederas y métodos recombinantes La invención proporciona vectores y células hospederas que incluyen un ácido nucleico de la presente invención, así como técnicas recombinantes para producción de un polipéptido de la presente invención. Los vectorés de la invención incluyen aquellos que tienen capacidad de replicación en cualquier tipo de célula u organismo, incluidos, por ejemplo, plásmidos, fagos, cósmidps y minicromosomas . En varias modalidades, los vectores que incluyen un polinucleótido de la presente invención son vectores adecuados para la propagación o replicación del polinucleótido o son vectores adecuados para expresar un polipéptido de la presente invención. Estos vectores son conocidos en la técnica y se encuentran disponibles en el comercio . Los polinucleótidos de la presente invención se sintetizan, todos o en partes que luego se combinan y se insertan en un vector mediante el uso de las técnicas de rutina de la biología celular y molecular, que incluyen por ejemplo, subclonación del polinucleótido en un vector linealizado utilizando sitios de restricción y enzimas de restricción convenientes. Los polinucleótidos de la presente invención se pueden amplificar por reacción en cadena de polimerasa con cebadores oligonucleótidos complementarios a cada hebra del polinucleótido. Estos cebadores también pueden incluir sitios de escisión de la enzima de restricción para facilitar la subclonación en un vector. Los componentes del vector replicable, por lo general, incluyen entre otros, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia señal, un origen de replicación y uno o más marcadores o genes seleccionables . Con el fin de expresar un polipéptido de la presente invención, las secuencias nucleotídicas que codifican el polipéptido o los equivalentes funcionales, se insertan en el vector de expresión apropiado, es decir, un vector que contiene los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada. Se usan los métodos al alcance de los expertos en la técnica para construir vectores de expresión que contienen secuencias que codifican un polipéptido de interés y elementos de control de traducción y transcripción adecuados. Estos métodos incluyen técnicas de ADN recombinante in vi tro, técnicas de síntesis y recombinación genética in vivo. Estas técnicas se describen, por ejemplo, en Sambrook, J. et aL (2001) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N.Y. y Ausubel, F.M. et al. (1989) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N.Y. Una variedad de vectores de expresión y/o sistemas hospederos se utilizan para contener y expresar secuencias polinucleotídicas . Estos incluyen, entre otros, microorganismos como bacterias transformadas - con bacteriófagos recombinantes , plásmidos o vectores de expresión de ADN cósmido; levaduras transformadas con vectores de expresión de levaduras sistemas celulares de insectos infectados con vectores de expresión virales (por ejemplo, báculovirus) ; sistemas celulares vegetales transformados con vectores de expresión virales (por ejemplo, virus mosaico de coliflor, CaMV, virus mosaico de tabaco, TMV) o con vectores de expresión bacterianos (por ejemplo, plásmidos Ti o pBR322) ; o sistemas celulares animales . En una modalidad, las regiones variables de un gen que expresa un anticuerpo monoclonal de interés se amplifican a partir de una célula de hibridoma utilizando cebadores nucleotídicos . Estos cebadores pueden ser sintetizados por un técnico con experiencia ordinaria o pueden adquirirse en el comercio (véase, por ejemplo, Stratagene (La Jolla, California) ) , que comercializa cebadores para amplificar regiones variables humanas y de ratón. Los cebadores se usan para amplificar regiones de variables de cadena ligera o pesada, que luego se insertan en vectores como ImmunoZAP® H o ImmunoZAP® L (Stratagene) , respectivamente. Luego, estos vectores se introducen en E. coli, levaduras o sistemas de mamíferos, para expresión.

Con estos métodos se pueden producir grandes cantidades de una proteína de cadena simple que contenga una fusión de los dominios VH y VL (véase Bird et al., Science 242:423-426 (1988) ) . Los "elementos de control" o "secuencias reguladoras" presentes en un vector de expresión son aquellas regiones no traducidas del vector, por ejemplo, activadores, promotores, regiones 5' y 3' sin traducir, que interactúan con las proteínas celulares del hospedero para llevar la transcripción y la traducción. Estos elementos pueden variar en su intensidad y especificidad. Dependiendo del sistema de vectores y el hospedero utilizados, se usa cualquier número de elementos adecuados de transcripción y traducción, incluidos los promotores inducibles y constitutivos. Ejemplos de promotores adecuados para usarse con hospederos procariotas incluyen el promotor phoa, la ß-lactamasa y los sistemas promotores de lactosa, el promotor de fosfatasa alcalina, un sistema promotor de triptófaho (trp) y promotores híbridos como el promotor tac. Sin embargo, también son adecuados otros promotores bacterianos conocidos. Los promotores que se utilizan en sistemas bacterianos, por lo regular, también contienén uña secuencia Shine-Dalgarno operablemente unida al ADN, que codifica para el polipéptido. Se pueden usar los promotores inducibles como el promotor lacZ híbrido del fagémido pBLUESCRIPT (Stratagene, La Jolla, Calif.) o el plásmido pSPORTl (Gibco BRL, Gaithersburg, D) y lo similar. : Se conocen varias secuencias promotoras para eucariotas y cualquiera puede usarse según la presente invención. Prácticamente todos los genes eucariotas tienen una región enriquecida en AT ubicada aproximadamente de 25 a 30 bases en la dirección 51 a partir del sitio en el que se inicia la transcripción. Otra secuencia que se encuentra de 70 a 80 bases en la dirección 5' a partir del inicio de la transcripción de muchos genes es una región CNCAAT en donde N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de genes eucariotas está una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola poli A al extremo 3' de la secuencia codificante. Todas estas secuencias se insertan en la forma adecuada en vectores de expresión eucariotas. En sistemas celulares de mamíferos, se prefieren, por lo general, los promotores de los genes de mamíferos o de virus de mamíferos. La expresión del polipéptido a partir de vectores en células hospederas de mamíferos se puede controlar, por ejemplo, por promotores obtenidos a partir de genomas de virus como el virus polioma, virus de viruela aviar, el adenovirus (por ejemplo, Adenovirus 2) , virus de papiloma bovino, virus del sarcoma aviar, citomegalovirus (CMV) , un retrovirus, virus de hepatitis B y con la máxima preferencia virus de simio 40 (SV40) , a partir de promotores de mamíferos heterologos, por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina y a partir de promotores de choque térmico, siempre que estos promotores sean compatibles con los sistemas celulares hospederos. Si fuera necesario generar una línea ceíuiar que contenga copias múltiples de la secuencia que codifica para un polipéptido, se pueden usar en forma conveniente vectores que tengan como base SV40 o EBV con un marcador seleccionable apropiado. Un ejemplo de un vector de expresión adecuado es pcDNA3.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA) , que incluye un promotor de CMV. Se dispone de varios sistemas de expresión víricos para la expresión de polipéptidos en mamíferos. Por ejemplo, en casos en los que se usa un adenovirus como vector de expresión, las secuencias que codifican para un polipéptido de interés están ligadas en un complejo de transcripción/traducción de adenovirus que consta del promotor tardío y la secuencia líder tripartita. A través de la inserción en una región no esencial El o E3 del genoma viral se obtiene un virus viable con capacidad para expresar el polipéptido en las células hospederas infectadas (Logan, J. y Shenk, T. (1984) Proc . Nati. Acad. Sci. 81:3655-3659). Por otra parte, se utilizan los activadores de transcripción, como el activador del virus del sarcoma de Rous (RSV - Rous sarcoma virus),, para aumentar la expresión en células hospederas de mamíferos. En sistemas bacterianos, se selecciona cualquiera de varios vectores de expresión dependiendo del uso al que se destine el polipéptido expresado. Por ejemplo, cuando se requieren grandes cantidades, se usan los vectores que producen un alto nivel de expresión de las proteínas de fusión que se purifican con facilidad. Estos vectores incluyen, entre otros, los vectores de expresión y de clonación monofuncionales de E. coli como pET (Stratagehe) , en el que la secuencia que codifica para el polipéptidó de interés está ligada en el vector en marco de lectura con secuencias para la terminal amino Met y los siguientes 7 residuos de ß-galactosidasa, de manera que se produce, uña proteína híbrida vectores pIN (Van Heeke, G. y S.M. Schuster (1989) J. Biol . Chem. 264:5503-5509); y lo similar. Los vectores pGEX (Promega, Madison, WI) también se usan para expresar polipéptidos foráneos como proteínas de fusión con glutatión S-transferasa (GST) . En general, estas proteínas de fusión son solubles y se pueden purificar con facilidad a partir de las células lisadas por absorción en microesferas de glutatión-agarosa y después por elución en presencia de glutatión libre. Las proteínas obtenidas en estos sistemas están diseñadas para incluir heparina, trombina o sitios de escisión de proteasa factor Xa para que el polipéptidó de interés se pueda liberar de la entidad GST a voluntad. En la levadura, Saccharomyces cerevisiae, se usan varios vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles como el factor alfa, la alcohol oxidasa y PGH. Ejemplos de otras secuencias promotoras adecuadas para usarse con levaduras hospederas incluyen los promotores para 3 - fosfoglicerato cinasa u otras enzimas glucolíticás , como enolasa, gliceraldehído- 3 - fosfato deshidrogenaba, hexocinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructocinasa, glucosa-6-fosfatoisomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato cinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucocinasa. Para consultar revisiones, véase, Ausubel et al. (cita anterior) y Grant et al. (1987) Methods Enzymol. 153:516-544. Otros promotores para levaduras que son promotores inducibles con la ventaja adicional de la transcripción controlada por las condiciones de proliferación, incluyen las regiones promotoras para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromp C, fofatasa acida, enzimas degradantes asociadas con el metabolismo de nitrógeno, metalotioneína, gliceraldehído-3 -fosf todeshidrogenasa y las enzimas responsables de la utilización de maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para utilizarse en la expresión en levaduras también se describen en el documento EP 73,657. Los activadores de levaduras también se usan ventajosamente con los promotores para levaduras . En casos en los que se usan vectores de expresión vegetales, la expresión de secuencias que codifican para polipéptidos está manipulada por cualquiera de varios promotores. Por ejemplo, los promotores virales como los promotores 35S y 19S de CaMV se usan solos o en combinación con la secuencia líder omega de TMV (Takamatsu, N. (1987) EMBO J. 6:307-311. Como alternativa, se pueden usar los promotores vegetales como la pequeña subunidad de RUBISCO o promotores de choque térmico (Coruzzi, G. et al. ; (1984) EMBO J. 3:1671-1680; Broglie, R. et al. (1984) Science 224:838-843; y Winter, J. et al. (1991) Results Probl . Cell Differ. 17:85-105). Estos constructos se introducen en células vegetales por transformación directa de ADN o transfección mediada por patógenos. Estas técnicas se describen en varias revisiones de disponibilidad general (véase, por ejemplo, Hobbs, S. o Murry, L.E. en McGraw Hill Yearbook of Science and Technology (1992) McGraw Hill, New York, N.Y.; págs. 191-196). También se usa un sistema de insecto para expresar el polipéptido de interés. Por ejemplo, en uno de estos sistemas, se usa el virus de la polihedrosis nuclear (AcNPV) Autographa californica como un vector para expresar genes foráneos en células de Spodoptera frugiperda o en larvas de Trichoplusia. Las secuencias que codifican el polipéptido se pueden clonar en una región no esencial del virus, como el gen polihedrina y someterse al control del promotor de polihedrina. La inserción exitosa de la secuencia codificante del polipéptido hace inactivo al gen de polihedrina y produce virus recombinante carente de proteína de envoltura. Los virus recombinantes se pueden usar entonces para infectar, por ejemplo, células de S. frugiperda o larvas de Trichoplusia en las cuales es posible expresar el polipéptido de interés (Engelhard, E.K. et al. (1994) Proc. Nati. Acad. Sci. 91:3224-3227) . También se pueden usar señales de iniciación específicas para lograr una traducción más eficiente de las secuencias que codifican para el polipéptido de interés. Estas señales incluyen el codón de iniciación ATG y secuencias adyacentes. En casos en los que las secuencias que codifican para el polipéptido, su codón de iniciación y las secuencias en dirección 5 ' , se insertan en el vector de expresión apropiado, es posible que no se necesiten señales adicionales de control de transcripción o traducción. Sin embargo, en casos en los que se inserta sólo la secuencia codificante o una porción de la misma, se provén señales de control de traducción exógenas que incluyen el codón de iniciación ATG. Por otra parte, el codón de iniciación está en la pauta de lectura correcta para garantizar la correcta traducción del polinucleótido insertado. Los elementos de traducción y codones de iniciación exógenos pueden ser de varios orígenes, tanto naturales como sintéticos. La transcripción de un ADN que codifica para un polipéptido de la invención se incrementa con frecuencia mediante la inserción de una secuencia activador^ en el vector. Se conocen muchas secuencias activadores , que incluyen, por ejemplo, aquellas identificadas en genes que codifican para globina, elastasa, albúmina, - fetoproteína e insulina. Sin embargo, por lo regular, se usa un activador proveniente de un virus de célula eucariota. Los ejemplos incluyen el activador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270) , el activador del promotor temprano de citomegalovirus , el activador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y activadores de adenovirus . Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) sobre elementos activadores para la activación de promotores eucariotas . El activador puede dividirse en el vector en la posición 5 ' o 3 ' de la secuencia codificante del polipéptido, pero de preferencia, se ubica en el sitio 5' a partir del promotor. Los vectores de expresión usados en las células hospedera eucariotas (levaduras, hongos, insectos, plantas, animales, seres humanos o células nucleadas de otros organismos multicelulares) , por lo regular, también contienen secuencias necesarias para la terminación de la transcripción y para estabilizar el ARNm. Estas secuencias normalmente están disponibles a partir de las regiones ;no traducidas 5' y en ocasiones 3' de los ADN o ADNc viral o eucariota. Estas regiones contienen segmentos nucleotídicos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica para un anticuerpo anti-PSCA. Un útil componente de terminación de transcripción es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO 94/11026 y el vector de expresión que se describe en el mismo. Las células hospederas adecuadas para clonar , o expresar el ADN en los vectores de la presente, son las células procariotas, levaduras, células eucariotas vegetales o superiores descritas en lo anterior. E emplos de procariotas que son adecuadas para este fin, incluyen eubacterias, como microorganismos grampositivos o gramnegativos , por ejemplo, Enterobacteriaceae como Escherichia, por ejemplo, E. coli , Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia, por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella, asi como Bacilli como B. subtilis y B. lichenifor is (por ejemplo, B. licheniformis 41P dado a conocer en el documento DD 266,710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomypes . Un hospedero de clonación de E. coli preferido es E. coli 294 (ATCC 31,446), aunque otras cepas como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31,537) y E. coli W3110 (ATCC 27,325) son adecuadas. Estos ejemplos son ilustrativos más que limitativos . La levadura Saccharomyces cerevisiae o levadura de panificación común, es la que más se usa entre los microorganismos hospederos eucariotas inferiores. Sin embargo, varios microorganismos de otros géneros, especies y cepas se encuentran comúnmente disponibles y son útiles en la presente, como Schizosaccharomyces pombe; hospederos Kluyveromyces como, por ejemplo, K lactis, K. fragilis (ATCC 12,424), K. bulgaricus (ATCC 16,045), J. wickeramii (ATCC 24,178), K. waltii (ATCC 56,500), K. drosophilaru (ATCC 36,906), K. thermotolerans y K. marxianus; yarrowia (EP 402,226); Pichia pastoris (EP 183,070); Pichia ethanolica, Candida; Trichoderma reesia (EP 244,234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwanniomyces occidentalis; y hongos filamentosos como, por ejemplo, Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y hospederos Aspergillus como A. nidulans y A. niger. En ciertas modalidades, se elige una cepa de célula hospedera por su capacidad para modular la expresión de las secuencias insertadas o procesar la proteína expresada en la forma deseada. Estas modificaciones del polipéptido incluyen, entre otras, acetilación, carboxilación, glucosilación, fosforilación, lipidación y acilación. El procesamiento posterior a la traducción que escinde una forma "prepro" de la proteína, también se puede usar para facilitar la correcta inserción, plegamiento y/o función. Se pueden elegir diferentes células hospederas como CHO, COS, HeLa, MDCK, HEK293 y WI38, que - tienen maquinaria celular específicas y mecanismos característicos para estas actividades posteriores a la traducción, : para garantizar la modificación y procesamiento correctos de la proteína foránea. También se conocen en la técnica y se encuentran disponibles métodos y reactivos adaptados específicamente para la expresión de anticuerpos o fragmentos de los mismos, que incluyen los que se describen, por ejemplo, en las Patentes de los Estados Unidos Núms . 4,816,567 y 6,331,415. En varias modalidades, las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo o de fragmentos del mismo, se expresan a partir de los mismos o de distintos vectores de expresión. En una modalidad, las dos cadenas se expresan en la misma célula, facilitando por ello la formación de un anticuerpo funcional o un fragmento del mismo. Anticuerpos de longitud completa, fragmentos de anticuerpo y proteínas de fusión del anticuerpo, se pueden producir en bacterias, en particular, si no se requieren glucosilación y función efectora Fe, por ejemplo, cuando el anticuerpo terapéutico se conjuga a un agente citotóxico (por ejemplo, una toxina) y el inmunoco jugado 1 en sí muestra eficacia en la destrucción de células infectadas. Para la expresión de fragmentos de anticuerpo y polipéptidos en bacterias, véase por ejemplo, las Patentes de los Estados Unidos Núms. 5,648,237, 5,789,199 y 5,840,523, que describen la región de iniciación jde traducción (TIR) y secuencias señal para optimizar la expresión y secreción. Después de la expresión, el anticuerpo se aisla de la masa celular de E. coli en una fracción soluble y se purifica a través de, por ejemplo, una columna de proteina A o G dependiendo del isotipo. ILa purificación final se lleva a cabo mediante un proceso similar al que se usa para purificar anticuerpos expresados, por ejemplo, en células CHO. Las células hospederas adecuadas para : la expresión de polipéptidos glucosilados y anticuerpos se derivan de organismos multicelulares. Ejemplos de células de invertebrados incluyen vegetales como por ejemplo, células de lemna e insectos. Se han identificado numerosas cepas báculovirales y variantes y las correspondientes células hospederas de insectos opcionales de hospederos como Spodoptera frugiperda (oruga) , ñedes aegypti (mosquito) , Aedes albopicius (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosquito de la fruta) y Bombyx mori. Se encuentra disponible al público una variedad de cepas virales para transíección, por ejemplo, la variante L-l de Autographa californica NPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV y tales virus se pueden usar como el virus de aquí según la presente invención, sobre todo para transfección de células de Spodoptera frugiperda. Cultivos celulares vegetales de algodón, maíz, papa, soya, petunia, tpmate y tabaco, también se usan como hospedero.

La propagación de polipéptidos de anticuerpo y fragmentos del mismo en células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) se ha convertido en un procedimiento de rutina. Ejemplos de líneas celulares hospederas de mamíferos son la línea celular CVl de riñon de mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; línea de riñon embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para proliferación en cultivo de suspensión, Graham et al. J. Gen. Virol. 36:59 (1977)); células de riñon de cría de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células ováricas de hámster chino/ -DHFR (CHO, Urlaub et al. Proc. Nati. Acad. Sci. USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratón (TM4 , Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980)); células de riñon de mono (CVl ATCC CCL 70) ; células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2) ; células de riñon de perro (MDCK, ATCC CCL 34) ; células hepáticas de rata búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células de pulmón humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2 , HB 8065); tumor mamario de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51) ; células TR1 (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 ; y una línea de hematoma humano (Hep G2) . Las células hospederas se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos en lo anterior para la producción del polipéptido y se cultivan en medio nutriente convencional modificado según corresponda para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican para las secuencias deseadas. Para la producción de alto rendimiento, a largo plazo, de proteínas recombinantes , se prefiere, en general, la expresión estable. Por ejemplo, las líneas celulares que expresan establemente un polinucleótido de interés se pueden transformar con vectores de expresión que pueden contener orígenes virales de replicación y/o elementos de expresión exógenos y genes marcadores seleccionables en el mismo vector o en distintos vectores. Después de la introducción del vector, las células se pueden dejar crecer durante 1 a 2 días en un medio enriquecido antes de cambiar a un medio selectivo. El propósito del marcador seleccionable es conferir resistencia a la selección y su presencia permite la proliferación y recuperación de células que expresan con éxito las secuencias introducidas. Los clones resistentes de las células establemente transformadas pueden proliferar utilizando técnicas de cultivo de tejidos apropiadas al tipo de célula. Cualquiera de varios sistemas de selección se puede usar para recuperar líneas celulares transformadas . Estos incluyen, entre otros, los genes de timidina, cinása del virus de herpes simples (Wigler, M. et al. (1977) Cell 11:223-32) y adenina fosforribosiltransferasa (Lowy, I. et ai. (1990) Cell 22:817-23, que se emplean en células tk ' o aprt ' , respectivamente. También, se usa la resistencia a antimetabolitos , antibióticos o herbicidas, como baseí de la selección; por ejemplo, dhfr que confiere resistencia al metotrexato (Wigler, M. et al. (1980) Proc. Nati. Acad. Sci. 77:3567-70); npt que confiere resta a los aminoglucósidos , neomicina y G-418 (Colbere-Garapin, F. et al. (1981) J. Mol. Biol. 150:1-14); y ais o pat, que confieren resistencia a clorosulfurón y fosfinotricina acetiltransferasa, respectivamente (Murry, citado en lo anterior) . Se han descrito otros genes seleccionables , por ejemplo, el trpB que permite a las células utilizar indol en lugar de triptófano o el hisD que permite a las células utilizar histinol en lugar de histidina (Hartman, S.C. y R.C. Mulligan (1988) Proc. Nati. Acad. Sci. 85:8047-51);. El uso de marcadores visibles ha ganado popularidad con marcadores como las antocianinas , la beta-glucuronidasa y su sustrato GUS y la luciferasa y su sustrato luciferina, que se usan mucho no sólo para identificar transformantes sino también para cuantificar la cantidad de expresión de proteína estable o transitoria atribuible a un sistema vectorial específico (Rhodes, C.A. et al. (1995) Methóds Mol. Biol. 55:121-131). Aunque la presencia o ausencia de la expresión del gen marcador sugiere que el gen de interés también está presente, es posible que se necesite confirmar su presencia y expresión. Por ejemplo, si la secuencia que codifica para un polipéptido se inserta dentro de una secuencia génica marcador, las secuencias que contienen células recombinantes se pueden identificar por la ausencia de la función del gen marcador. Como alternativa, un gen marcador se puede colocar en tándem con una secuencia que codifica para un polipéptido bajo el control de un solo promotor. La expresión del gen marcador como respuesta a la inducción o selección, por lo regular, indica también la expresión del gen en tándem. Como alternativa, las células hospederas que contienen y expresan una secuencia polinucleotídica deseada se identifican por diversos procedimientos conocidos para los expertos en la técnica. Los procedimientos incluyen, entre otros, hibridaciones ADN-ADN o ADN-AR y técnicas de bioanálisis o inmunoanálisis de proteínas que incluyen, por ejemplo, tecnologías de membrana, solución o chip para :1a detección y/o cuantificación de ácido nucleico o proteínas. En la técnica se conocen diversos protocolos para detectar y medir la expresión de productos codificados por el polinucleótido, que utilizan anticuerpos monoclonales o policlonales específicos para el producto. Los ejemplos incluyen el análisis inmunoenzimático en adsorbente (ELISA) , radioinmunoanálisis (RIA) y citometría de fluorescencia (FACS - fluorescence activated cell soirting) .

Para algunas aplicaciones puede que se prefiéra un inmunoanálisis con base monoclonal de dos sitios que utiliza anticuerpos monoclonales reactivos frente a , dos epítopes no interferentes en un polipéptido dado, pero también se puede emplear un ensayo de unión competitiva. Estos y otros ensayos se describen, entre otras publicaciones, en Hampton, R. et al. (1990; Serological Methods, a Laboratory Manual, APS Press, St Paul. Minn.) y Maddox, D.E. et al. (1983; J. Exp. Med 158:1211-1216). El experto en la técnica conoce diversos marcadores y técnicas de conjugación que se pueden aplicar en varios ensayos de ácido nucleico y aminoácidos . Los medios para producir sondas PCR o de hibridación marcada para detectar secuencias relacionadas con polinucleótidos incluyen, oligomarcado, traducción de muesca, marcadores terminales o amplificación PCR utilizando un nucleótido marcado. Como alternativa, las secuencias o cualquier porción de las mismas se pueden clonar en un vector para la producción de una sonda ARNm. Estos vectores que son conocidos en la técnica, están disponibles en el mercado y se pueden utilizar para sintetizar sondas ARN in vitro por adición de una ARN polimerasa adecuada como T7, T3 o SP6 y nucleótidos marcados. Estos procedimientos se pueden llevar a cabo utilizando una variedad de estuches comerciales. Las moléculas reporteras o marcadores adecuados que se utilizan incluyen radionúclidos , enzimas, agentes fluorescentes, quimioluminiscentes o cromogénicos así como sustratos, cofactores, inhibidores, partículas magnéticas, y lo similar. El polipéptido producido por una célula recombinante es secretado o está contenido intracelularmente dependiendo de la secuencia y/o vector utilizados. Como comprenderá el experto en la técnica,, los vectores de expresión que contienen polinucleótidos de la invención se pueden diseñar para contener secuencias señal que dirigen la secreción del polipéptido codificado a través de una membrana celular eucariota o procariota. En ciertas modalidades, un polipéptido de la presente invención se produce como un polipéptido de fusión que también incluye un dominio polipeptídico que facilite la purificación de proteínas solubles. Estos dominios que facilitan la purificación incluyen, entre otros, péptidos quelantes con metales como los módulos histidina-triptófano que permiten la purificación en metales inmovilizados, los dominios de proteína A que permiten la purificación .en inmunoglobulina inmovilizada y el dominio utilizado en el sistema de purificación por afinidad con extensión FLAGS (Amgen, Seattle, WA) . Se puede utilizar la inclusión de secuencias conectoras escindibles, como las específicas para el Factor XA o enterocinasa (Invitrogen, San Diego, CA) , entre el dominio de purificación y el polipéptido codificado, para facilitar la purificación. Un vector de expresión de este tipo permite la expresión de una proteína de fusión que contiene un polipéptido de interés y un ácido nucleico que codifica 6 o más residuos de histidina que preceden a una tioredoxina o a un sitio de escisión de enterocinasa. Los residuos de histidina facilitan la purificación en IMIAC (cromatografía por afinidad iónica en metal inmovilizado) como se describe en el articuló de Porath, J. et al. (1992, Prot . Exp. Purificada. 3:263-281), mientras que el sitio de escisión de enterocinasa provee un medio para purificar el polipéptido deseado a partir de la proteína de fusión. Un análisis útil sobre los vectores útiles para producir proteínas de fusión, se presenta en el artículo de Kroll, D.J. et al. (1993; DNA Cell Biol . 12 ¡441-453) . En ciertas modalidades, un polipéptido dé la presente invención se fusiona con un polipéptido heterólogo, el cual puede ser una secuencia señal u otro polipéptido que tenga un sitio de escisión específico en la terminal N de la proteína madura o polipéptido ÷ La secuencia señal heteróloga seleccionada, de preferencia, es aquella que es reconocida y procesada (es decir, escindida por una señal de peptidasa) por la célula hospedera. Para células hospederas procariotas la secuencia señal se puede seleccionar, por ejemplo, a partir del grupo de la fosfatasa alcalina, penicilinasa, lpp o líderes enterotoxina II termoestables . Para secreción en levaduras, la secuencia señal se puede seleccionar, por ejemplo, entre la secuencia líder para invertasa de levadura, secuencia líder para factor (que incluye líderes para factor a de Saccharo yces y Kluyveromyces) o líder para fosfatasa ácida, líder para glucoamilasa de C. albicans o la señal descrita en el documento WO 90/13646. En la expresión en células de mamíferos, se dispone de las secuencias señal de mamíferos así como las secuencias líderes secretoras virales, por ejemplo, la señal de herpes simples gD. Cuando se usan técnicas recombinantés , el polipéptido o anticuerpo se puede producir por vía intracelular, en el espacio periplásmico o se segrega directamente en el medio. Si el polipéptido o anticuerpo se produce por vía intracelular, como primer paso, se eliminan las partículas de desecho ya sea células hospederas o fragmentos de lisado, por ejemplo, por centrifugación, o ultrafiltración. Cárter et al., Bio/Technology 10:163-167 (1992) describen un procedimiento para aislar anticuerpos que son segregados al espacio periplásico de E. coli. De manera resumida, la masa celular se fluidifica en presencia de acetato de sodio (pH 3.5) , EDTA y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) durante aproximadamente 30 minutos. El desecho celular se puede eliminar por centrifugación. Si el polipéptido o el anticuerpo se segregan en el medio, los sobrenadantes de los sistemas de expresión, por lo regular, se concentran primero utilizando un filtro de concentración de proteína de los que existen disponibles en el comercio, por ejemplo, una unidad de filtración Amicon o Millipore Pellicon. Un inhibidor de proteasa como PMSF se puede incluir en cualquiera de, las etapas anteriores para inhibir la proteólisis y se puede incluir antibiótico para prevenir la proliferación de contaminantes adventicios. La composición de anticuerpo o polipéptido preparada a partir de las células se puede purificar utilizando, por ejemplo, cromatografía en hidroxiapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía por afinidad, siendo ésta última la técnica de purificación que se prefiere utilizar. La aptitud de la proteína A ;como un ligando de afinidad depende de la especie e isotipo de cualquiera de los dominios Fe de inmunoglobulina que esté presente en el polipéptido o anticuerpo. La proteína A se puede usar para purificar anticuerpos o fragmentos de los mismos que tengan como base cadenas pesadas ¡ ?2 o; ?4 humanas (Lindmark et al., J. Immunol . Meth. 62:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para ?3 humana (Guss et al., ÉMBO J. 5:15671575 (1986)). La matriz a la cual se une el ligando de afinidad, con mayor frecuencia es agarosa, pero también se dispone de otra matrices. Las matrices mecánicamente estables como el vidrio de poro controlado o el poli (estireno-divinil ) benceno permiten velocidades de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con la agarosa. Si el polipéptido o él anticuerpo incluyen un dominio CH 3 , la resina Bakerbond ABX® (J. T. Baker, Phillisburg, N.J.) es útil para purificación. También se cuenta con otras técnicas para purificación de proteínas como son la fraccionaqión en columna de intercambio iónico, precipitación etanólica, cromatografía de líquidos de alta resolución (HPLC) de fase inversa, cromatografía en sílice, cromatografía en heparina SEPHAROSE® en una resina de intercambio catiónico o aniónico (como una columna de ácido poliaspártico) , cromatoenfoque, SDS-PAGE y precipitación son sulfato de amonio, dependiendo del anticuerpo o polipéptido que se 'va a recuperar. ; Después de cualquier etapa o etapas de purificación preliminar, la mezcla que incluye el polipéptido o anticuerpo de interés y los contaminantes, se puede someter a cromatografía de interacción hidrofóbica a bajo pH, utilizando un amortiguador de elución a pH entre aproximadamente 2.5 y 4.5, de preferencia, a bajas concentraciones de sal (por ejemplo, aproximadamente 0 a 0.25 M de sal) .

Composiciones farmacéuticas La presente invención también incluye formulaciones farmacéuticas que incluyen un polipéptido, anticuerpo o modulador de la presente invención, a un grado de pureza conveniente, y un vehículo excipiente o estabilizante farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). En ciertas modalidades, las formulaciones farmacéuticas se preparan para aumentar la estabilidad del polipéptido o anticuerpo durante el almacenamiento, por ejemplo,. en la forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos excipientes o estabilizante farmacéuticamente aceptables son atóxicos para los receptores a las dosis y concentraciones empleadas e incluyen, por ejemplo, amortiguadores como acetato, Tris, fosfato, citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen ácido ascórbico y metionina; conservadores (como cloruro de octadecildimetilbencilamonio, cloruro de hexametonio, cloruro de benzalconio, cloruro de bencetonio; fenol, alcohol butílico o bencílico; alquil parabenos como metil o propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol , 3-pentanol y m-cresol) ; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos aproximadamente) ; proteínas como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas ; polímeros hidrofílieos como polivinilpirrolidona aminoácidos como glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina o lisina; monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos que incluyen glucosa, mañosa o dextrinas; agentes quelantes como EDTA; tonificantes como trehalosa y cloruro de sodio; azúcares como sacarosa, manitol, trehalosa o sorbitol; surfactantes como polisorbato; contraiones que forman sal como sodio; complejos metálicos (por ejemplo, complejos proteicos de Zn) ; y/o surfactantes no iónicos como .TWÉE ®, PLURONICS® o polietilenglicol (PEG) . En ciertas modalidades, la formulación terapéutica incluye, de preferencia, el polipéptido o anticuerpo a una concentración entre 5 y 200 mg/ml, de preferencia, entre 10 y 100 mg/ml. Las formulaciones de aquí también pueden contener uno o más agentes terapéuticos adicionales adecuados para el tratamiento de la indicación particular, por ejemplo, la infección que se va a tratar o para prevenir efectos secundarios indeseables. De preferencia, el ( agente terapéutico adicional tiene una actividad complementaria al polipéptido o anticuerpo de la presente invención y ninguno de los dos tiene sobre el otro un efecto negativo. Por ejemplo, además del polipéptido o anticuerpo de la presente invención, sería deseable incluir en la formulación, por ejemplo, un anticuerpo adicional, un antiviral, un agente antiinfeccioso y/o un cardioprotector . Estas moléculas se presentan en la formulación en cantidades adecuadas que son eficaces para el fin que se pretende. Los ingredientes activos, por ejemplo, polipéptidos y anticuerpos de la presente invención y otros agentes terapéuticos también pueden estar incorporados en microcápsulas que se preparan, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, microcápsulas de hidroximetilcelulosa o gelatina y microcápsulas de polimetilmetacrilato, respectivamente, en sistemas coloidales de suministro de medicamentos (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanopartículas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Estas técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences 16th Edition, Osol, A. Ed. (1980) . Se pueden elaborar preparaciones de liberación sostenida. Ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen el anticuerpo, estas matrices están en forma de artículos con determinada conformación, por ejemplo, películas o microcápsulas. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hidroxietil-metacrilato) o poli (alcohol vinílico) ) , polilacturos (Patente de los Estados Unidos Núm. 3,773,919), copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, etileno-acetato de vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico como LUPRON DEPOT® (microesferas inyectables constituidas por copolímero de ácido láctico-ácido glicólico y acetato de leuprolida) y poli-ácido D- ( - ) -3 -hidroxibutírico . Las formulaciones que se utilicen para la administración in vivo son, de preferencia, estériles. Esto se logra fácilmente por filtración a través de membranas filtrante estériles.

Usos en diagnóstico Los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención se unen a células o tejidos infectados por CMV de manera específica o preferencial en comparación con las células y tejidos de control normales. De este modo, los anticuerpos de la presente invención se pueden usar para detectar células o tejidos infectados, eh un paciente, una muestra biológica o una población celular, mediante el uso de una diversidad de métodos de diagnóstico y pronóstico, que incluyen los que aquí se describen. La. habilidad de un anticuerpo anti-CMV para detectar células infectadas dependerá, por supuesto, de su especificidad de unión, la cual se puede determinar con facilidad al evaluar su capacidad para unirse a células o tejidos infectados obtenidos de diferentes pacientes y/o de pacientes infectados con diferentes cepas de CMV. Los métodos de diagnóstico incluyen, por lo general, poner en contacto una muestra biológica obtenida de un paciente, por ejemplo, sangre, suero, saliva,' orina, esputo, exudado celular o una biopsia de tejido, con un anticuerpo específico para CMV y determinar si el anticuerpo se une de manera preferencial a la muestra en comparación con una muestra de control o un valor límite predeterminado, indicando así la presencia de células infectadas. En modalidades particulares, el anticuerpo específico contra CMV se une dos veces, tres veces o cinco veces más a una célula infectada en comparación con la correspondiente muestra de control de célula o tejido normal. Se puede determinar un valor límite predeterminado, por ejemplo, haciendo un promedio de anticuerpo específico contra CMV que se une a varias muestras de control diferentes en las mismas condiciones que se utilizaron para realizar el ensayo de diagnóstico de la muestra biológica que se evalúa. El anticuerpo unido se puede detectar mediante procedimientos descritos en la presente y conocidos en la técnica. En ciertas modalidades, los métodos de diagnóstico de la presente invención se llevan a la práctica utilizando anticuerpos específicos contra CMV que están conjugados a un marcador detectable, por ejemplo, un fluoróforo, para facilitar la detección del anticuerpo que se ha unido. Sin embargo, también se pueden aplicar a través de métodos de detección secundaria del anticuerpo específico para CMV. Estos incluyen, por ejemplo, RIA, ELISA, precipitación, aglutinación, fijación de complemento e inmunofluorescencia . En ciertos procedimientos, los anticuerpos específicos contra CMV están marcados. El marcador puede detectarse directamente, como los radiomarcadofes y fluorocromos o pueden ser entidades, como las enzimas, que es preciso hacer reaccionar o derivatizar para detectarse. Ejemplos de marcadores isotópicos son "Te, 14C, 131I, l25I, 3H, 32P y 35S . Los materiales fluorescentes que se pueden usar incluyen, por ejemplo, fluoresceína y sus derivados, rodamina y derivados, auramina, dansilo, umbeliferona, luciferia, 2 , 3-dihidroftalazindionas, peroxidasa de rábano, fosfatasa alcalina, lisozima y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa . Un marcador enzimático se puede detectar por cualquiera de las técnicas que se utilizan en la actualidad colorimétricas , espectrofotométricas , fluorofotométricas o gasométricas . Muchas de las enzimas que se pueden úsar en estos procedimientos son ya conocidas. Ejemplos dé éstas son peroxidasa, fosfatasa alcalina, ß-glucuronidasa, ß-D-glucosidasa, ß-D-galactosidasa, ureasa, glucosaoxidasa más peroxidasa, galactosa oxidasa más peroxidasa y fosfatasa ácid . Los anticuerpos se pueden etiquetar con estos marcadores según métodos ya conocidos. Por ejemplo> se pueden usar agentes de acoplamiento como aldehidos, carbodiimidas , dimaleimida, imidatos, succin midas , benzadina bid-diazotizada y lo similar, para etiquetar los anticuerpos con los marcadores fluorescentes, quimioluminiscentes y enzimáticos descritos en lo anterior. Una enzima comúnmente se combina con un anticuerpo utilizando moléculas puente como carbodiimidas, peryodato, diisocianatos , glutaraldehído y lo similar. Varias técnicas de marcado se describen en Morrison, Methods in Enzymology i 32b, 103 (1974), Syvanen et al., J. Biol . Chem. 284, 3762 (1973) y Bolton y Hunter, Biochem. J. 133, 529 (1973) . Los anticuerpos específicos contra CMV: de la presente invención tienen la capacidad de diferenciar entre pacientes con y sin infección CMV y determinar si un paciente tiene una infección por medio de los ensayos representativos presentados aquí. Según un método, una muestra biológica se obtiene a partir de un paciente del cual se sospecha o se sabe que tiene infección por CMV. En modalidades preferidas, la muestra biológica incluye células del paciente. La muestra se pone en contacto con un anticuerpo específico para CMV, por ejemplo, durante un tiempo y en condiciones suficientes para dejar qué el anticuerpo específico contra CMV se una a células infectadas presentes en la muestra. La cantidad de anticuerpo específico para CMV que se ha unido se determina y se compara contra un valor determinado en una muestra de tejido normal. Un aumento en la cantidad de anticuerpo unido a la muestra del paciente en comparación con la muestra de control es indicativo de la presencia de élulas infectadas en la muestra del paciente. En un método relacionado, una muestra biológica obtenida de un paciente se pone en contacto ¡con un anticuerpo específico contra CMV durante un tiempo y en condiciones suficientes para dejar que el anticuerpo se una a las células infectadas. Luego, se detecta el anticuerpo que se ha unido y la presencia de anticuerpo unido indica que la muestra contiene células infectadas. Esta modalidad es sobre todo útil cuando el anticuerpo específico para CMV no se une a células normales en un grado detectable. En ciertas modalidades, los anticuerpos que se unen a células infectadas, de preferencia, generarán Una señal que indique la presencia de una infección en al menos aproximadamente 20% de pacientes con la infección a detectar, con más preferencia, al menos aproximadamente 30% de pacientes. Como alternativa o de manera adicional, el anticuerpo generará una señal negativa que indique la ausencia de la infección en al menos aproximadamente 90% de individuos sin la infección a detectar. Cada anticuerpo deberá satisfacer estos criterios; sin embargo, las personas con experiencia ordinaria en la técnica reconocerán que los anticuerpos de la presente invención se pueden usar en combinación para mejorar la sensibilidad. La presente invención también incluye estuches útiles para realizar ensayos de diagnóstico y pronóstico mediante el uso de los anticuerpos de la presente invención. Estos estuches incluirán un recipiente adecuado que incluya uno o más anticuerpos específicos para CMV de la presente invención, marcados o no. Por otra parte, si el anticuerpo se suministra en una forma marcada propia para un ensayo de unión indirecto, el estuche puede inclüir también reactivos útiles para realizar el ensayo indirecto correspondiente. Por ejemplo, el estuche puede incluir uno o más recipientes adecuados que incluyan sustratos de enzimas o agentes de derivatización, dependiendo: de la naturaleza del marcador. También se pueden incluir muestras de control y/o instrucciones.

Usos terapéuticos Los anticuerpos específicos para CMV y fragmentos de los mismos, de la presente invención, se unen a células infectadas de manera específica o preferencial en comparación con células y tejidos de control no infectados. De este modo, estos anticuerpos específicos para CMV se pueden usar para dirigirlos de manera selectiva a células o tejidos infectados en un paciente, una muestra biológica o una población celular. En virtud de las propiedades de unión específica, con relación a la infección, dé estos anticuerpos, la presente invención proporciona métodos de regulación (por ejemplo, inhibición) de la proliferación de las células infectadas, métodos de exterminación de células infectadas y métodos para inducir la apoptosis de las células infectadas. Estos métodos incluyen el poner .en contacto una célula infectada con un anticuerpo específico contra CMV de la presente invención. Estos métodos se pueden aplicar in vitro, ex vivo e in vivo. Las composiciones farmacéuticas de la invención se administran a poblaciones de pacientes seleccionadas, que incluye, entre otras, los ancianos y los muy jóvenes, los individuos inmunodeficientes (por ejemplo, individuos con VIH/SIDA, otras enfermedades de inmunodeficiencia o un trastorno genético que tenga como consecuencia un sistema inmune deficiente o insuficiente) , receptores de trasplantes (que incluyen, de órgano completo, de tejido y en particular aquellos pacientes que reciben un trasplante o reemplazo de una población de células progenitoras hematopoyéticas o de médula ósea) , individuos que reciben terapia inmunosupresora (por ejemplo, individuos que reciben terapia f rmacológica por padecimientos como artritis, rechazo de trasplante y cáncer) y mujeres embarazadas negativas a CMV que están en riesgo de exposición o de infección con CMV (El CMV se transmite al feto de estos individuos y es causa de sordera y deficiencia cognitiva en casi 1% de los nacimientos) . En varias modalidades, los anticuerpos son terapéuticamente activos de por sí de forma inherente y/o se conjugan a un agente citotóxico o a un agente inhibidor de proliferación, por ejemplo, un radioisótopo o una toxina, que sea útil para tratar células infectadas unidas al anticuerpo. En una modalidad, la presente invención proporciona métodos para tratar o prevenir la infección en un paciente, los cuales incluyen proveer un anticuerpo específico contra CMV de la presente invención a un paciente al que se le haya diagnosticado infección CMV, esté en riesgo de desarrollarla o se sospeche de tenerla. Los métodos de la presente invención se pueden usar cómo primera línea de tratamiento, como tratamiento posterior o en el tratamiento de una infección recurrente o refractaria. El tratamiento con un anticuerpo de la invención puede ser un tratamiento que se aplica solo o puede ser un componente o fase de un esquema de terapia de combinación en el que también se usan uno o más agentes terapéuticos adicionales para tratar al paciente. Para el tratamiento in vivo de pacientes humanos y no humanos, por lo regular, se le administra al paciente una formulación farmacéutica que incluye un anticuerpo específico contra CMV de la presente invención. Cuando se usa para terapia in vivo, los anticuerpos de la presente invención se administran al paciente en cantidades terapéuticamente eficaces (es decir, cantidades que eliminan o reducen la carga viral del paciente) . Los anticuerpos se administran a un paciente humano, según los métodos conocidos, por ejemplo, administración intravenosa, por ejemplo, como bolo o por infusión continua durante un periodo de tiempo, por vías intramusculares, intraperitoneal, intracefalorraquídea, subcutánea, intraarticular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o inhalación. Los anticuerpos se pueden administrar por vía parenteral, cuando sea posible, en el sitio celular elegido como objetivo o por vía intravenosa. La administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo se prefiere ' en ciertas modalidades. Para la administración parenteral, los anticuerpos se pueden formular en forma inyectable dé dosis unitaria (solución, suspensión, emulsión) junto con un vehículo parenteral farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de estos vehículos son el agua, la solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa y albúmina sérica humana al 5%. También se pueden usar vehículos no acuosos como los aceites fijos y el oleato de etilo. Se pueden usar liposomas como portadores. El vehículo puede contener cantidades minoritarias de aditivos, por ejemplo, sustancias que aumenten la isotonicidad y la estabilidad química, por ejemplo, amortiguadores y conservadores, Los anticuerpos normalmente se formularán en estos vehículos a concentraciones aproximadas de 1 mg/ml a 10 mg/ml . La dosis y el esquema posológico dependerá de varios factores que un médico puede determinar c,on facilidad, como son la naturaleza de la infección y las características del agente citotóxico particular o del agente inhibidor de proliferación conjugado al anticuerpo (cuando se emplea) , por ejemplo, su índice terapéutico, el paciente y la historia del paciente. Por lo general, se administra al paciente una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo. En modalidades particulares, la cantidad de anticuerpo administrada estará, por lo regular, en el intervalo aproximado de 0.1 a 50 mg/kg de peso corporal del paciente. Dependiendo del tipo y gravedad de la infección, aproximadamente 0.1 mg/kg a 50 mg/kg de peso corporal (por ejemplo, aproximadamente 0.1 a 15 mg/kg/dosis) de anticuerpo, puede ser una probable pauta posológica inicial para administrarse en el paciente, por ejemplo, en una o más administraciones individuales o por infusión continua. El progreso de esta terapia se puede monitorear fácilmente por los métodos y ensayos convencionales con base en los criterios conocidos para el médico u otra persona qué enga experiencia en la técnica. En una modalidad particular, un inmunoconjugado que incluye el anticuerpo conjugado con un agente citotóxico se administra al paciente. De preferencia, el inmunoconjugado es internalizado por la célula, dando como resultado mayor eficacia terapéutica del inmunoconj ugado en cuanto al exterminio de la célula a la cual se une. En una modalidad, el agente citotóxico se dirige o interfiere con el ácido nucleico en la célula infectada. Los ejemplos de estos agentes citotóxicos se describieron en lo anterior e incluyen maitansinoides , calicheamicinas , ribonucleasas y ADN endonucleasas . Se pueden combinar otros esquemas terapéuticos con la administración de un anticuerpo específico contra C V de la presente invención. La administración combinada incluye la administración simultánea en la que se utilizan formulaciones individuales o una sola formulación farmacéutica y la administración sucesiva en cualquier orden, en donde, de preferencia, hay un periodo de tiempo mientras los dos (o todos) principios activos ejercen sus actividades biológicas. De preferencia, estas terapias combinadas dan como resultado un efecto terapéutico sinérgico . En ciertas modalidades, es deseable combinar la administración de un anticuerpo de la presente invención con otro anticuerpo dirigido contra otro antígeno asociado con el agente infeccioso. Aparte de la administración de la proteína del anticuerpo al paciente, la presente solicitud prevé la administración del anticuerpo por terapia génica. Esta administración de ácido nucleico que codifica el anticuerpo está comprendida por la expresión "administrar una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo". Veáse, por ejemplo, PCT Publicación de Solicitud de Patente W096/Ó7321 relacionada con el uso de terapia génica para generar anticuerpos intracelulares . Todas las patentes de los Estados Unidos, publicaciones de solicitudes de patentes de los Estados Unidos, solicitudes de patente de los estados Unidos, patentes extrajeras, solicitudes de patentes extranjeras y publicaciones distintas de las patentes, citadas en esta especificación y/o enlistadas en el formato de solicitud, se consideran, en su totalidad, parte de la presente, como referencia .

EJEMPLO 1 PRODUCCIÓN DE ANTICUERPOS ESPECÍFICOS ANTI-CMV Anticuerpos monoclonales humanos específicos para CMV se produjeron por vía recombinante, en la forma que se describe a continuación. 89 muestras de plasma humano se cribaron en función de la presencia de anticuerpos CMV por medio de la prueba ELISA utilizando un polipéptido correspondiente al sitio AD2 del epítope CMV gpll6 que tiene la secuencia de aminoácidos SHRANETIYNTTLKYGDTTGTNTTK (SEQ ID NO : 31) . Dos muestras de plasma dieron positivo, lo cual indica la presencia de anticuerpos anti-CMV gpll6. Células PBMC se obtuvieron de una muestra de sangre de un donante con título elevado de IgG frente a la AD2 del epítope CMV gpll6. Células CD19+ se enriquecieron y mezclaron con una forma biotinilada del péptido AD2 CMV gpll6 y células B específicas para el antígeno se enriquecieron con microesferas recubiertas con estreptavidina . Estas células B seleccionadas para el antígeno se depositaron en microplacas a una densidad mayor de 1 célula por pocilio y se cultivaron en condiciones favorables a la proliferación y activación de células B para generar células B productoras de anticuerpo, por ejemplo, en presencia de mitógeno de células B como un lipopolisacárido (LPS) o ligando CD40. Los sobrenadantes celulares obtenidos de las células B se evaluaron luego en función de la presencia de anticuerpos unidos a la AD2 del epítope CMV gpll6, identificando así 11 pocilios que contenían células B que producían anticuerpos específicos para el antígeno. Anticuerpos recombinantes con regiones de unión al antígeno de los anticuerpos específicos para el antígeno se produjeron por subclonacion de la ADN que codifica para las regiones variables de las cadenas de anticuerpo en el vector de expresión pcDNA3.1+. Se realizaron transíecciones transitorias en células 293 FT para reconstituir y producir por vía recombinante estos anticuerpos. Los anticuerpos producidos en forma recombinante se evaluaron en función de su habilidad para unirse a la AD2 del epítope CMV gpll6 y se identificaron 7 IgG recombinantes que se unieron a este antígeno. Posteriormente se generaron dos anticuerpos ánti-CMV adicionales según estos mismos métodos. La afinidad de unión de los anticuerpos se determinó tal como se muestra en la Tabla 1.

Tabla 1. Afinidades de unión de anticuerpos anti-CMV ordenados por KD y koff Se determinaron las secuencias de los anticuerpos, incluidas las secuencias de las regiones variables de las cadenas ligeras kappa y pesadas gamma de los anticuerpos designados como 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 4P12, 5P9, 9C16. Por otra parte, se determinó la secuencia de cada uno de los polinucleótidos que codifican las secuencias del anticuerpo. Más adelante se presentan ias secuencias de polipéptido y de polinucleótido de las cadenas ligeras kappa y pesadas gamma, los péptidos señal están en negritas en la terminal N (o extremo 5') y las regiones constantes en negritas en la terminal C (o extremo 3 ' ) de las regiones variables, las cuales se presentan en texto simple. 2FIO gamma ATGGAGTTTGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTAC ATCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTCGTCCAGCCTGGTAGGGCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGC CACTGGATTCACATTTAGTAATCACGGCATACATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGCTGGCAGTTATTTCAAGCGATGGAGATGATGACCGTTACGCAGACTCCGTGAAGGG C GATTCAGCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCGTGCATCTGCAGATGAATGGCCTGAGACC TGACGACACGGCTATTTATTTCTGTGCGCGAGATGGGAGGTGTGGTGAACCTAAGTGCTACTCA GGGTTGCCTGATTACTGGGGCCGGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGC-AGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCÁGCÁA CACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGÁG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGiGAA;C GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID N0:1) Región variable de 2F10 gamma CAGGTACATCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTCGTCCAGCCTGGTAGGGCCCTGAGAGTGTCCT GTGCAGCCACTGGATTCACATTTAGTAATCACGGCATACATTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGCTGGCAGTTATTTCAAGCGATGGAGATGATGACCGTTACGCAGACTCCGTG AAGGGTCGATTCAGCGTCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACCGTGCATCTGCAGATGAATGGCC TGAGACCTGACGACACGGCTATTTATTTCTGTGCGCGAGATGGGAGGTGTGGTGAAGCTAAGTG CTACTCAGGGTTGCCTGATTACTGGGGCCGGGGGACCCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 34) 2FIO gamma EFGLSWVFLVALLRGVQCQVHLVESGGGWQPGRALRLSCAATGFTFSNHGIHWVRQAPGKGL EWLAVISSDGDDDRYADSVKGRFSVSRDNSKNTVHLQM GLRPDDTAIYFCARDGRCGEPKCYS GLPDY GRGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSS STSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTS GVHTFPAVIiQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVN^ PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTL ISRTPEVTCVVVDVSHEDPBVKFNWYVDGVEVHNAKrá EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRÉE MTl^QVSLTCLVKGFYPSDIAVE ESNGQPElWYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDksRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 2 ) Región variable de 2F10 gamma: (CDR Kabat subrayadas,! CDR Clothia en cursiva negrita) : QVHLVESGGGWQPGRALRLSCAATGFTFgi^GIHWRQAPGKGLEWLAVJggI)GDDI?-¾YADgV KGRFSVSRDN5KNTvHLQMNGLRPDDTAIYFCARI?GJ?CGgPJ:CYSgLPI?YWGRGTLVTVS (SEQ ID NO: 35) CDR Kabat de la cadena pesada 2FIO gamma: CDR 1 : SNHGIH (SEQ ID NO: 36) CDR 2: V1SSDGDDDRYADSV G (SEQ ID NO: 37) CDR 3: DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38) CDR Clothia de la cadena pesada 2F10 gamma: CDR 1 : GFTFSN (SEQ TD NO: 39) CDR 2: VISSDGDDDR (SEQ ID NO: 40) CDR 3: DGRCGEP CYSGLPDY (SEQ ID NO: 38) 2FIO kappa ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGCTACCACCGGAGAGA TTGTTTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGACAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGGTACTTAGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCCAGGGTCCC AGGCTCCTCCTCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGGAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCACTTTATTA i o ! CTGTCTTCAGCGTAACACGTGGCCTCCGCTCACTTTCGGGGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT I GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG i 1 ' G (SEQ ID NO: 3) Región variable de 2F10 kappa GAGATTGTTTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGACAGAGCGACCCTCT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGGTACTTAGCCTGGTATCAACAAAAGCCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCCTCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC 20 AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCÁCTTT ATTACTGTCTTCAGCGTAACACGTGGCCTCCGCTCACTTTCGGGGGAGGGACCAAGGTGGAGAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 41) 2FIO kappa: MEAPAQLLFLLLLWLPATTGEIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRASQSVGGYLAWYQQKPGQAP RLLLYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFALYYCLQRNTWPPLTFGGGTKVEIK RWAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS CLLiraFYPREAIVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ SKDS i · TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 4) Región variable de 2F10 kappa: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : EIVLTQSPATLSLSPGDRATLSCRAgQSVGGri-A YQQKPGQAPRLLLYgASlVRflrGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFALYYCI.O-¾JrWPPI.rFGGGTKVEI RT (SEQ ID NO: 42) CDR Kabat de la cadena ligera 2F10 kappa: CDR I : RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) CDR 2: DASNRAT (SEQ ID NO: 44) CDR 3: LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45) CDR Clothia de la cadena ligera 2F10 kappa: CDR 1 : RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) CDR 2: DASNRAT (SEQ ID NO: 44) CDR 3 : LQRNTWPPLT (SEQ ID NO: 45) 2M16 gamma ATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGCCAGCiGC AGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCATGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTTCAGC CTCTGGACTCACCTTCAGCAATTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGG¾GCTG GAGTGGGTGGCAGTTATATCAAGTGATGGAAGTAATGAGCACTACGCAGACTCCGTGAAGGGCC GATTCACTATCTCCAGAGACAATTTCAACAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCTGTCTATTACAGTGCGAGAGATGGGAGGTGTCCTGATGTTAACTGCTACTCA GGGTTGATTGACTATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACGAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGGGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGGCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAGAGT GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG I ' 1 " GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAGTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCC!AACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAGATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC i CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTGCC TGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID N0:5) Región variable de 2M16 gamma CAGGTGCAGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCATGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTTCAGCCTCTGGACTCACCTTCAGCAATTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTGCAGGCÁA GGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTTATATCAAGTGATGGAAGTAATGAGCACTACGCAGACTCCGTG AAGGGCCGATTCACTATCTCCAGAGACAATTTCAACAACATGCTGTATCTGCAAATGAACAGCC TGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACAGTGCGAGAGATGGGAGGTGTCCTGATGTTAACTG CTACTCAGGGTTGATTGACTATTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 46) 2M16 gamma MBLGLCWVFLVALLRGVQCQVQLVDSGGGMVQPGRSLRLSCSASGLTFSNYG HWVRQAPGKGL EWVAVISSDGSNEHYADSVKGRFTISRDNFNNMLYLQM SLRAEDTAVYYSARDGRCPDV CYS GLIDYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSOTK^KRVEPKSCDETHTCP C PAPELLGGPSVFLFPPKP DTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV FNWYVDGVEVHNAKTOPRE EQYNSTYR SVLWLHQDWLNGKEYKCKVSN ALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSR QQGN VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 6) Región variable de 2M16 gamma: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : QVQLVDSGGG^QPGRSLRLSCSASgLTFg-VYGMHWVRQAPGKGLE VAVJggPggjrEHYADSV KGRFTISRDNFNNMLYLQMNSLRAEDTAVYY5ARI?gJ¾CPCV-ffCySGIiJDYWGQGTLVTVS (SEQ ID NO: 47) CDR Kabat de la cadena pesada 2M16 gamma: CDR 1: SNYGMH (SEQ ID NO: 48) CDR 2: V7SSDGSNEHYADSVTKG (SEQ TD NO: 49) CDR 3: DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) CDR Clothia de la cadena pesada 2M16 gamma: CDR 1: GLTFSN (SEQ ID NO: ! 18) CDR 2: V1SSDGSNEH (SEQ ID NO: 51) CDR 3: DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) 2M16 kappa ATGGAAGCCCCAQCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTQGCTCCCAQATACCACCGGAGAAA TTGTCTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGATACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAGGTGGCCAGGCTCCC AGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCGACAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTT ATTA CTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGTCCAAGGTGGAGA CAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGT|GGAAGGT GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:7) Región variable de 2M16 kappa GAAATTGTCTTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGATACTTAGCCTGGTACCAACAGAAAGGTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAACAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCGACAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTT ATTACTGTCAGCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGTCCAAGGTGGAGAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 94) 2M16 kappa: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRYLAWYQQKGGQAP RLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTIDSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGSKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLl^FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQPSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8) Región variable de 2M16 kappa: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCJ^gQSVGJirLAWYQQKGGQAPRLLIYPAgJflflrGIPARFSG SGSGTDFTLTIDSLEPEDFAVYYCQQRSNWPPLTFGGGSKVEIKRT (SEQ ID NO: 52) CDR Kabat de la cadena ligera 2M16 kappa: CDR 1 : RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53) CDR 2: DASNRAT (SEQ ID NO: 44) CDR 3: QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54) CDR Clothia de la cadena ligera 2 16 kappa: CDR I : RASQSVGRYLA (SEQ TD NO: 53) CDR 2: DASNRAT (SEQ ID NO: 44) CDR 3: QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54) 2N9 gamma ATGGAGTTGGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGC AGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGC CTCTGGATTCACCTTCAGTAGTAATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGGTG GACTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGCAAATGATAAACAATACGCAGACTCCGTGAAGGGCC, GATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGT! TGAAGACACGGCTGTCTATTTCTGTGCGAGAGATGGGACGTGCAGTGGTGGTAACTGCTACTCA GGGTTGATTGACTATTGGGGCCGGGGAATTCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC.

CATCGGTCTTCCCCCTGGCAC CTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGGTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGC^C^CCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCC iAGCAA, CACCAAGGTGGACAAGAGAGT GAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGtGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACAGCC; TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATbGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGjSGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID N0:9) Región variable de 2N9 gamma CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGATTCACCTTCAGTAGTAATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGACTGGGTGGCAGTTATATCATCTGATGCAAATGATAAACAATACGCAGACTGCGTG AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACATGGTGTATCTGCAAATGAAGAGCC TGAGAGTTGAAGACACGGCTGTCTATTTCTGTGCGAGAGATGGGACGTGCAGTGGTGGTÁÁCfG CTACTCAGGGTTGATTGACTATTGGGGCCGGGGAATTCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 55) 2N9 gamma MELGLRWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSNGIHWVRQAPGKGL DWAVISSDANDKQYADSVKGRFTISRDNSKNMWLQM SLRVEDTAVYFCARDGTGSGGNC S GLIDY GRGILV VSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW SGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVITO APELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVOVSHEDPEVK^ EQY STYRWSVLTVLHQD LNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRÉE TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 10) Región variable de 2N9 gamma: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFrFSSNGIHWVRQAPGKQLDWAVISgDAl^JQYAPSy KGRFTISRDNSKNMVYLQMNSLRVEDTAVYFCARPgrCSGG-VCySgLJDr GRGILVT VS (SEQ ID NO: 56) CDR Kabat de la cadena pesada 2N9 gamma: CDR 1 : SSNGIH (SEQ ID NO: 57) CDR 2: VISSDANDKQYADSVKG (SEQ ID NO: 58) CDR 3: DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) CDR Clothia de la cadena pesada 2N9 gamma: CDR 1 : GFTFSS (SEQ ID NO: 60) CDR 2: VISSDANDKQ (SEQ ID NO: 61 ) CDR 3: DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) 2N9 kappa ATGGACATGAGGGTCCCAGCTCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCG GAGAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCTTGTCTTTGTCTCCAGGTGAAAGAGGCAGCCT CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAG GCTCCCAGGCTCCTCATCTACGATGCCTCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTG GCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGT TTATTACTGTCACCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAT ATCAAACGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAAT CTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTG GAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAG GACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAG TCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGG AGAGTGT (SEQ ID NO: 11) Región variable de 2N9 kappa GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCAGCCACCTTGTCTTTGTCTCCAGGTGAAAGAGCGACCCTCT i CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAACCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTACGATGCCTCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCAGTTT ATTACTGTCACCAGCGTAGCAACTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGATAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 62) 2N9 kappa: MRVPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGGYLAWYQQKPGQÁP RLLIYDASIRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQRSNWPPLTFGGGTKVDIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS CLL1WFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSK S TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 12) Región variable de 2N9 kappa: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRAgggVGGrLAWYQQKPGQAPRLLIYDASJJlflrGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLEPEDFAVYYCHQJ?S2VWPPZ.rFGGGT VDIKRT(SEQ ID NO: 63) CDR Kabat de la cadena ligera 2N9 kappa: CDR 1 RASQSVGGYLA (SEQ TD O: 43) CDR 2 AS1RAT (SEQ ID NO: 64) CDR 3 HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) CDR Clothia de la cadena ligera 2N9 kappa: CDR 1 : RASQSVGGYLA (SEQ TD NO: 43) CDR 2: ASIRAT (SEQ ID NO: 64) CDR 3: HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) 4P12 gamma ATGGAGTTGGGGCTGAGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGC AGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTGATCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTTGC CTCTAAATTCATCTTCAGTAACCATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGGTG GAGTGGGTGGCGGTTATATCAAAAGATGGGACTAATGCACACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCC GATTTAGCATCTCCAGAGACAACTCCAAGGACACTGTCTTTCTGGAAATGCGCAGCCTGCGACC TGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCGGTGTATTGAAGAAAACTGCTACTCC GGACAGATTGACTATTGGGGCCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCGAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCAGCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACGCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGGGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAAO^AAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACGAT: CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTC1AAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCRTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTAO-CGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA ( SEQ ID NO : 13 ) Región variable de 4P12 gamma CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTGATCC!AGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGTTGCCTCTAAATTCATCTTCAGTAACCATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTGCAGGC A GGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTTATATCAAAAGATGGGACTAATGCACACTACGCAGACTCCGTG AGGGGCCGATTTAGCATCTCCAGAGACAACTCCAAGGACACTGTCTTTCTGGAAATGCGGAGCC í TGCGACCTGAAGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCGGTGTATTGAAGAAÁACTG CTACTCCGGACAGATTGACTATTGGGGCCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 66) 4P12 gamma MELGLSWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCVASKFIFSNHGIHWVRQAPGKGL EWVAVISKDGTNAHYADSVRGRFSISRDNSKDTVFLEMRSLRPEDTAVYYCAREGRCIEÉNCYS GQIDYWGQGSLVTVSSAST GPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVIiQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSl r^ PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVEVSHEDPEVKFN YVDGVEVHNAK KPRE EQYNSITRWSVLTVLHQDWLNGKEYKC VS KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTI^QVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEIWY TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 14) Región variable de 4P12 gamma: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : QVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCVASgFJFS-VHGIHWRQAPGKGL^ RGRFSISRDNSKDT^FLEMRSLRPEDTAVYYCARgGJ?CJgEyCYggOJPYWGQGSLVTVS (SEQ ID NO: 67) CDR Kabat de la cadena pesada 4P12 gamma: CDR 1 : SNHG1H (SEQ ID NO: 36) CDR 2: VIS DGTNAHYADSVRG (SEQ ID NO: 68) CDR 3: EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) CDR Clothia de la cadena pesada 4P12 gamma: CDR 1: KFIFSN (SEQ ID NO: 70) CDR 2: V1S DGT AH (SEQ ID NO: 71) CDR 3: EGRCIEENCYSGQ1DY (SEQ JD NO: 69) 4P12 kappa ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAA TTCTATTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCCTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGGTACATGGCCTGGTATCAACAGAGACCTGGCCAGGCTCCC AGGCTCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAATTTATTA CTGTCAGCAGCGTAGCAGCTGGCCCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATGTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO: 15) Región variable de 4P12 kappa GAAATTCTATTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCÓACCC CT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGGTACATGGCCTGGTATCAACAGAGACCTGGCCAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGCCTGAAGATTTTGCAATTT ATTACTGTCAGCAGCGTAGCAGCTGGCCCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 72) 4P12 kappa: EAPAQLLFLLLL LPDTTGEILLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRYMAWYQQRPGQAP RLLIYDASIRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYCQQRSS PPLTFGGGT VEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDÍ3KDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID N0:16) Región variable de 4P12 kappa: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : EILLTQSPATLSLSPGERATLSCJ¾AgQgyGJ¾Y2^WYQQRPGQAPRLLIYI?ASJRATOIPARFSG SGSGTDFTLTISSLQPEDFAIYYC=225WPPLTFGGGT VEIKRT (SEQ ID N0¡ : 73 ) CDR Kabat de la cadena ligera 4P12 kappa: CDR 1 : RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) CDR 2: DAS1RAT (SEQ ID NO: 75) CDR 3: QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) CDR Clothia de la cadena ligera 4P12 kappa: CDR 1 : RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) CDR 2: DASIRAT (SEQ ID NO: 75) CDR 3: QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) 5P9 gamma ATGGAGTTGGGGCTGCGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGC AGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTGATCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGTTGC CTCTAAATTCATCTTCAGTAACCATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAÁGGGGC G GAGTGGGTGGCGGTTATATCAAAGGATGGGACTAATGCACACTACGCAGACTCCGTGAGGGGCC GATTTAGCATCTCCAGAGACAACTCCAAGGACACTGTCTTTCTGGAAATGCGCAGCC GCGACC TGAAGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCGGTGTATTGAAGAAAAGTGCTACTCC GGACAGATTGACTATTGGGGGCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCAAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGGCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAGTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGAGATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTGCC TGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID N0:17) Región variable de 5P9 gamma CAGGTGCAGCTGGTGGAGTCGGGGGGAGGCGTGATCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGTTGCCTCTAAATTCATCTTCAGTAACCATGGCATACACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGGTGGCGGTTATATCAAAGGATGGGACTAATGCACACTACGCAGACTCCGTG AGGGGCCGATTTAGCATCTCCAGAGACAACTCCAAGGACACTGTCTTTCTGGAAATGCGCAGCC TGCGACCTGAAGACACGGCTGTCTATTACTGTGCGAGAGAGGGCCGGTGTATTGAAGAAAAGTG CTACTCCGGACAGATTGACTATTGGGGGCAGGGATCCCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 77) 5P9 gamma MELGLRWVFLVALLRGVQCQVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCVASKFIFSNHGIHWVRQAPGKGL EWVAVISKDGTNAHYADSVRGRFSISRDNS DTVFLEMRSLRPEDTAVYYCAREGRGIEEKCYS GQIDY GQGSLVTVSSASnCGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLV DYFPEPVTVSWNSGALTS GVHTFPAVXQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICl^raKPSl^KVDKRVEPKSOTktHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPIO>TLMISRTPEVTCVVVrVSHEDPEV FMWYVDGVEVH AKTO EQYNSTYR SVLTVLHQDWLNGKEYKC VS KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPE NY TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALH HYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 18) Región variable de 5P9 gamma: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : QVQLVESGGGVIQPGRSLRLSCVASyFJFSNHGIHWW RGRFSISRDNSKDTVFLEMRSLRPEDTAVYYCARggl¾CI SK r-?ggXPy GQGSL\i S (SEQ ID NO: 78) CDR Kabat de la cadena pesada 5P9 gamma CDR 1 : SNHG1H (SEQ ID NO: 36) CDR 2: VISKDGTNAHY ADSVRGR (SEQ ID NO: 79) CDR 3: EGRCTEEKCYSGQTDY (SEQ TD NO: 80) CDR Clothia de la cadena pesada 5P9 gamma : CDR 1 : FIFSN (SEQ ID NO: 70) CDR 2: V1S DGTNAH (SEQ ID NO: 71) CDR 3: EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ TD NO: 80) 5P9 kappa ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAA TTCTATTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTCTCGTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGGTACATGGCCTGGTATCAACAGAGACCTGGCCAGGGTCCC AGGCTCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGGAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGACTGAAGATTTTGCAATT ATTA CTGTCAGCAGCGTAGCAGCTGGCCCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGÁCAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:19) Región variable de 5P9 kappa GAAATTCTATTGACACAGTCTCCAGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCC CT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCAGGTACATGGCCTGGTATCAACAGAGACCTGGCCAqGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCATCAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTACAGACTGAAGATTTTGCAA^TT ATTACTGTCAGCAGCGTAGCAGCTGGCCCCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 81) 5P9 kappa: MEAPAQLLFLLLL LPDTTGEILLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGRYMA YQQRPGQAP RLLIYDASIRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLQTEDFAIYYCQQRSSWPPLTFGGGTKVEIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLL FYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYE HKVYACEVTHQGLSSP TKSFNRGEC (SEQ ID NO: 20) Región variable de 5P9 kappa: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : EILLTQSPATLSLSPGERATLSCRASgSraRK^WYQQRPGQAPRLLIYDAfl RATGIPARFSG SGSGTDFTLTISSLQTEDFAI YYCQQRSSWPP TFGGGTKVEIKRT ( SEQ ID NO: 82) CDR Kabat de la cadena ligera 5P9 kappa: CDR 1: RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) CDR 2: DAS1RAT (SEQ ID NO: 75) CDR 3: QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) CDR Clothia de la cadena ligera 5P9 kappa: CDR 1 : RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) CDR 2: DAS1RAT (SEQ ID NO: 75) CDR 3: QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) 9C16 gamma ATGGAGTTGGGGCTGTGCTGGGTTTTCCTCGTTGCTCTTTTAAGAGGTGTCCAGTGTCAGGTGC AGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTGTGCAGC CTCTGGACTCACCTTCAGTGATTATGGTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGGGCTG GAGTGGGTGGCAGTCATCTCAAAGGATGGAACTAACACACACTATGCAGACTCCGTGAGGGGCC GATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACATTTTCTATCTGCAAATGAACGGCCTGAGAGC TGAGGACACGGCTGTCTATTACAGTGGGAGAGATGGGAAGTGTCCTGATCTTAAGTGCTACTCA GGGTTGATTGACTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCGAGCGCCTCCACCÁAGGGCC CATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTG CCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGC GGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGA CCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAA CACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGC CCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCC TCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACGCTGA GGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGOGAG GAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGAGTGGCTGA ATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCAT CTCCAAAGCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAG ATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCG TGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTC CGACGGCTCCTTCTTCCTCTATAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAAC GTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCC TGTCTCCGGGTAAA (SEQ ID N0:21) Región variable de 9C16 gamma CAGGTGCAGCTGGTGGACTCTGGGGGAGGCGTGGTCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCT GTGCAGCCTCTGGACTCACCTTCAGTGATTATGGTATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAA GGGGCTGGAGTGGGTGGCAGTCATCTCAAAGGATGGAACTAACACACACTATGCAGÁCTCCGTG AGGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACTCCAAGAACATTTTCTATCTGCAAATGAACGGCC TGAGAGCTGAGGACACGGCTGTCTATTACAGTGGGAGAGATGGGAAGTGTCCTGATGTTAAGTG CTACTCAGGGTTGATTGACTACTGGGGCCAGGGGACCCTGGTCACCGTCTCG (SEQ ID NO: 83) 9C16 gamma MELGLCWVFLVALLRGVQCQVQLVDSGGGWQPGRSLRLSCAASGLTFSDYGMHWVRQAPGKGL EWVAVISKDGTNTHYADSVRGRFTISRDNS NIFYLQMNGLRAEDTAVYYSGRDGKCPDLKCYS GLIDY GQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSVmSGALTS GVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSOTKVD RVEPKSCDKTHTCPPC PAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFN^ EQYNSTYRWSVLWLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKA GQPREPQVYTLPPSREE MTKNQVSLTCLV GFYPSDIAVEWESNGQPE1WYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGN VFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO: 22) Región variable de 9C16 gamma: (CDR Kabat subrayadas, CDR Clothia en cursiva negrita) : QVQLVDSGGGWQPGRSLRLSCAASGLrFgPYG^W RGRFTISRDNSK^IFYLQMNGLRAEDTAVYYSGRgGyCPDLiCCyggLJDyWGQGTLV VS (SEQ ID NO: 84) CDR Kabat de la cadena pesada 9C16 gamma: CDR 1 : SDYGMH (SEQ ID NO: 85) CDR 2: V1SKDGTNTHYADSVRG (SEQ ID NO: 86) CDR 3: DG CPDL CYSGL1DY (SEQ ID NO: 87) CDR Clothia de la cadena pesada 9C16 gamma: CDR 1 : GLTFSD (SEQ ID NO: 88) CDR 2: V1S DGTNTH (SEQ ID NO: 89) CDR 3: DGKCPDL CYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) 9C16 kappa ATGGAAGCCCCAGCGCAGCTTCTCTTCCTCCTGCTACTCTGGCTCCCAGATACCACCGGAGAAA TTGTGTTGACACAGTCTCCGGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCCACCCTC CGTG CAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGCCAGGCTCCC AGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAAAAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGCAGTG GGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCACCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCIAÁTT ATTA CTGTCACCAGCGTAGCAGCTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGÁTATCAAA CGTACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAA CTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGT GGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAÁGGACAGC ACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTGTACG CCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTG T (SEQ ID NO:23) Región variable de 9C16 kappa GAAATTGTGTTGACACAGTCTCCGGCCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAAAGAGCGACCCTCT CCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGGCGGCTACTTAGCCTGGTACCAACAGAAGCCTGGCGAGGC TCCCAGGCTCCTCATCTATGATGCATCCAAAAGGGCCACTGGCATCCCAGCCAGGTTCAGTGGC AGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCACCATCAGCACCCTAGAGCCTGAAGATTTTGCÁATTT ATTACTGTCACCAGCGTAGCAGCTGGCCTCCGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGATAT CAAACGTACG (SEQ ID NO: 90) 9C16 kappa: MEAPAQLLFLLLLWLPDTTGEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVGGYLA YQQKPGQAP RLLIYDASKRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISTLEPEDFAIYYCHQRSSWPPLTFGGGTKVDIK RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTAS CLLNNFYPREAKVQ KVDNALQSGNSQESVTEQDSKDS TYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSF RGEC (SEQ ID NO:24) Región variable de 9C16 kappa: (CDR Kabat subrayadas, GDR Clothia en cursiva negrita) : EIVLTQSPATLSLSPGERATLSC-¾AgggVGSYLAWYQQKPGQAPRLLIY£?AgK. ArGIPARFSG 5GSGTDFTLTISTLEPEDFAIYYCHQJ¾gSWPPLrFGGGTKVDIKRT (SEQ ID NO: 91) CDR Kabat de la cadena ligera 9C16 kappa: CDR 1 : RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) CDR 2: DASKRAT (SEQ ID NO: 92) CDR 3: HQRSSWPPLT (SEQ I D NO: 93) CDR Clothia de la cadena ligera 9C16 kappa: CDR 1 : RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) CDR 2: DAS RAT (SEQ ID NO: 92) CDR 3: HQRSSWPPLT (SEQ TD NO: 93) Tabla 2: Secuencias CDR de anticuerpos anti-CMV y secuencias consenso (según se determina mediante los métodos de Kabat y Clothia para la cadena pesada, cuyas CDR son idénticas para la cadena ligera) . CDRH1 SEQ ID CDRH2 SEQ ID CDRH3 SEQ ID (Kabat ) NO! (Kabat) NO: (Kabat) NO: 2F10 SNHGIH 36 VISSDGDDDRYADSVKG 37 DGRCGEPKCYSGLPDY ' 38 2M16 SNYGMH 48 VISSDGSNEHYADSVKG 49 DGRCPDVNCYSGLIDY 50 2N9 SSNGIH 57 VISSDANDKQYADSVKG 58 DGTCSGGNCYSGLIDY 69. 4P12 SNHGIH 36 VISKDGTNAHYADSVRG 68 EGRCIEENCYSGQIDY 69 5P9 SNHGIH 36 VISKDGTNAHYADSVRGR 79 EGRCIEEKCYSGQIDY 80 9C16 SDYGMH 85 VIS DGTNTHYADSVRG 86 DGKCPDLKCYSGLIDY , 87 Consenso A SXXGXH 95 VISXDXXXXXYADSVRG 96 XCXCXXXCYSGXXDY ' ¡ 97 Consenso B . SXXGIH 98 VISXDGXNXHYADSVXG 99 DGXCSXXXCYSGLXDY 100 Consenso C SXYGMH 101 EGRCIEEXCYSGQIDY 102 Consenso D DGXCPDXXCYSGLIDY 103 CDRH1 CDRH2 CDRH3 (Clothia) (Clothia) (Clothia) 2F10 GFTFSN 39 VISSDGDDDR 40 DGRCGEPKCYSGLPDY 38 2M1S GLTFSN 118 VISSDGSNEH 51 DGRCPDVNCYSGLID 50. 2N9 GFTFSS 60 VISSDANDKQ 61 DGTCSGGNCYSGLIDY 59 4P12 KFIFSN 70 VIS DGTNAH 71 EGRCIEENCYSGQIDY 69 5P9 FIFSN 70 VISKDGTNAH 71 EGRCIEEKCYSGQIDY 80 9C16 GLTFSD 88 VISKDGTNTH 89 DGKCPDLKCYSGLIDY 87 Consenso A XXXFSX 104 VISXDXXXXX 105 XGXCXXXXCYSGXXDY 106 Consenso B GXTFSX 107 VISKDGTNXH 108 DGXCXXXXCYSGLXDY 109 Consenso C EGRCIEEXCYSGQIDY' 110 CDRL1 CDRL2 CDRL3 2F10 RASQSVGGYLA 43 DASNRAT 44 LQRNTWPPLT 45 2M16 RASQSVGRYLA 53 DASNRAT 44 QQRSNWPPLT 54 2N9 RASQSVGGYLA 43 ASI AT 64 HQRSNWPPLT ] 65 4P12 RASQSVGRYMA 74 DASIRAT 75 QQRSSWPPLT 76 5P9 RASQSVGRYMA 74 DASIRAT 75 QQRSSWPPLT ! ] 76 9C16 RASQSVGGYLA 4.3 DASKRAT 92 HQRSSWPPLT ! 93 Consenso A RASQSVGXYXA 111 XASXRAT 112 XQRXXWPPLT ' 11 Consenso B RASQSVGXYLA 114 DASXRAT 115 HQRSXWPPLT 116 Consenso C QQRSXWPPLT ] 117 EJEMPLO 2 IDENTIFICACIÓN DE REGIONES VARIABLES DEL ANTICUERPO CONSERVADAS Las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de la cadena ligera kappa y la cadena pesada gamma de los siete anticuerpos producidos según se describe en el Ejemplo 1, se alinearon para identificar regiones conservadas y residuos, tal como se muestra en las Figuras 1A y IB. Las regiones variables de los anticuerpos anti-C V generados presentaron alto grado de conservación. Por ejemplo, los anticuerpos designados como 3C21 y 4P12 fueron idénticos en la región variable de la cadena pesada y sólo tuvieron una diferencia de aminoácido en la cadena ligera kappa, que parece ser un artefacto PCR ya que la secuencia 4P12 coincide con la línea germinal. La cadena gamma 5P9 fue idéntica a la cadena gamma 3G7 y sólo tuvo una diferencia de aminoácido en CD3 respecto a las cadenas gamma 3C21 y 4P12. La cadena kappa 5P9 fue bastante coincidente (diferencia de 1 aminoácido) con la cadena kappa de 5A11, 3C21 y 4P12 (las dos últimas cadenas son idénticas entre sí excepto por un intercambio D/E) . La cadena gamma 9C16 fue la más parecida a la cadena, gamma 2M16 y la cadena kappa 9C16 fue la más parecida a la cadena kappa 2N9 (sólo dos aminoácidos de diferencia) . La cadena kappa 3G7 fue, por completo, diferente de las otras, incluida la 5P9, lo que sugiere que la unión observada se debe a la cadena pesada. Estos datos demuestran la naturaleza bastante conservada de los anticuerpos que se unen de manera específica a la AD2 del epítope CMV gpll6 e identifican regiones de anticuerpo importantes para esta especificidad.

EJEMPLO 3 UNIÓN A CMV DE ANTICUERPOS RECOMBINANTES Los anticuerpos recombinantes 2F10, 2M16, 2N9, 3C21, 3G7, 4P12 y 5J12 se produjeron en cantidades de mg por transfección transitoria a gran escala en células 293 PEAK y se evaluaron mediante ELISA respecto a su capacidad para unirse a un virus CMV inactivado con UV depositado en una placa. La capacidad de unión de los anticuerpos se evaluó en ausencia y presencia del péptido AD2 del epítope CMV gpll6 competitivo y también se comparó con la unión de un anticuerpo de control, ITC88 que también se une al péptido AD2 del epítope CMV gpll6 (Ohlin et al. 1993, J Virol 67:703-710. Como reactivo de detección se utilizó un anticuerpo secundario anti humano conjugado con HRP.; Como se muestra en las Figuras 2 a 8, cad uno de los anticuerpos 2F10, 2M16, 2N9, 3C21 y 4P12 se unen a CMV y entraron en competencia con el péptido AD2 del epítope CMV gpll6. Estos datos demuestran que los anticuerpos recombinantes humanos generados contra el epítope CMV gpll6 tienen capacidad también para unirse de manera específica con el virus CMV.

EJEMPLO 4 NEUTRALIZACIÓN DE CMV POR ANTICUERPOS RECOMBINANTES , Los anticuerpos recombinantes 2F10, 2M16 , 2N9 , 3C21, 3G7 y 4P12 se evaluaron respecto a su capacidad para inhibir el virus hCMV mezclando hCMV con cada uno de los anticuerpos y luego la mezcla se utilizó para infectar células. La proporción de células infectadas a células totales se gráfico como función de la concentración de anticuerpo. Los núcleos de las células totales se contaron mediante tinción con YOYO-1 y los núcleos infectados, con hCMV se determinaron por permeabilización de las células y determinación de la unión del antígeno precoz inmediato CMV con el anticuerpo monoclonal designado como l-K-10 (ígG2a de ratón Meridian Life Science, Cincinnati, OH) que a <su vez se detectó como anticuerpo anti-IgG ratón acoplado a AlexaFluor (AF) 647 (H&L) ( Invitrogen; Carlsbad, CA) . También se usó el anticuerpo control ITC88 en cada experimento . Como se muestra en las Figuras 9 a 14 , cada uno de los anticuerpos 2F10, 2M16, 2N9, 3C21 y 4P12 inhibió hCMV a un nivel comparable al anticuerpo control ITC88. Estos datos demuestran que los anticuerpos recombinantés humanos generados contra el epítope AD2 CMV gpll6 son capaces de neutralizar el virus CMV.

EJEMPLO 5 POTENCIA Y ESPECTRO DE NEUTRALIZACIÓN DE ANTICUERPOS HCMV: DISEÑO' EXPERIMENTAL Y MÉTODOS GENERALES El CMV puede entrar a una amplia gama de tipos de células human s. Recientemente se ha reportado que las interacciones de receptor del hospedero con la glucoproteína del CMV varían con diferentes tipos de células. Sin embargo, un aspecto central con relación a la capacidad del CMV para entrar a todos los tipos de células es la interacción del complejo de glucoproteína gB (compuesto de proteínas gp58 y gpll6) con los receptores de la célula huésped. Se generaron series de anticuerpos anti-HCMV por medio de un procedimiento que incluye la extracción de sangre de varios voluntarios humanos sanos, seguida de la recolección de células B y la estimulación, tal como se describe en el Ejemplo 1. Las IgG segregadas se evaluaron en función de su reactividad frente al epítope AD2 ; dentro de la terminal amino del gB. Las cadenas pesadas y ligeras se clonaron fuera de las células B que expresan la unión de AD2 a IgG. Se determinaron las afinidades de unión para cada anticuerpo. Todos los anticuerpos evaluados neutralizaron intensamente la entrada de CMV sin importar la cepa del virus o el tipo de infección celular. Esto contrasta con la infección CMV en cobayos, en donde tal como se esperaba, ninguno de los anticuerpos neutralizantes tuvieron efecto. La especificidad de los anticuerpos anti-HCMV para HCMV gB contra GPCMV gB se debe a secuencias divergentes dentro de estas proteínas que afectan la eficacia de la unión del anticuerpo (Tabla 3) . Los datos que se presentan más adelante respaldan los análisis adicionales del grupo actual de anticuerpos neutralizantes de CMV y la elección como objetivos de otros complejos glucoproteína CMV.

Materiales y métodos Anticuerpos Los anticuerpos 2N9, 5P9, 2F10, 4P12, 2M16 e ITC88 se obtuvieron con el método ya descrito. ¾1 anticuerpo gH(l) es un anticuerpo de referencia neutralizante anti-glucoproteína H. Cytotect® s CMV terapéutico disponible comercialmente fabricado por Chong Lap (H.K.) CO. LTD.

Virus La cepa VR1814 de HCMV se obtuvo de secreciones cervicales de una mujer embarazada. Los tres aislados de HCMV clínicos 8818, 8819 y 8824 se aislaron de esputo, lavado alveolar bronquial y tejido pulmonar, respectivamente, de pacientes infectados y se propagárqn en la línea celular endotelial ARPE- 19. La cepa CMV de, cobayo V545/82 se obtuvo de Mark Schleiss y contenía el gen reportero GFP (McGregor A. y Schleiss M.R. (2001) Molecular Genetics and Metabolism 72 (1) : 15-26) .

Líneas celulares Las líneas celulares usadas en estos ensayos son: línea celular epitelial humana ARPE-19 (células epiteliales pigmentadas retínales, ATCC # de catálogo CRL-2302) , línea celular de fibroblastos humanos NN-NHDF (fibroblastos dérmicos humanos normales neonatales, Lonza # de catálogo CC-2509) , línea celular endotelial humana HUVEC (células endoteliales de vena umbilical humana, Lonza # de catálogo CC-2517) y línea celular de fibroblastos derivados de cobayo JH4 (fibroblasto pulmonar de cobayo, ATCC # de catálogo CCL-158) .

Ensayo de entrada Las células ARPE-19, NN-NHDF, HUVEC y JH4 se sembraron en placas de 96 pocilios a una concentración de 8 x 103 células por pocilio en un volumen de 100 µ? de medio de proliferación. Las células ARPE- 19 se cultivaron en medio DMEM/F-12 completo, las células N -NHDF se cultivaron en DMEM completo, las células HUVEC se cultivaron en medio EGM-2 y las células JH4 en medio F-12K. Las células se incubaron durante la noche a 37°C y C02 5%. Al siguiente día, las células se infectaron primero eliminando el medio de cultivo y lavando cada pocilio tres veces con 100 µ?, por pocilio, de medio libre de suero. Las células ARPE-19 se lavaron con medio SF-DMEM/F-12 , las células NN-NHDF con medio SF-DMEM, las células HUVEC con medio EBM-2 y las células JH4 con medio SF-F-12K. Los anticuerpos, ¡se diluyeron en serie, en el medio libre de suero, para cada línea celular respectiva (véase lo anterior) y se mezclaron con suficiente virus para infectar 50% de las células en placa de 96 pocilios y se incubaron a 37°C y 5% de C02 durante 1 hora. Se infectaron pocilios por adición de la mezcla virus/anticuerpo en volúmenes de 50 µ? por pocilio por triplicado. Las placas ARPE y HUVEC se incubaron a 37 °C y C02 5% durante 3 horas y las placas NN-NHDF y JH4 se incubaron a 37 °C y C02 5% durante 1 hora. El medio con anticuerpo/virus se eliminó a las células se lavaron tres veces con 100 µ? del medio completo correspondiente (véase lo anterior) por pocilio. El lavado final no se eliminó.

Las placas se incubaron a 37 °C y C02 5% durante la noche.

Tinción IE de VR1814 y aislados clínicos HCMV El medio se eliminó y las células se fijaron con 100 µ?/pocillo de paraformaldehído al 4% durante 20 minutos a temperatura ambiente (TA) . Luego, se eliminó el paraformaldehído y las células se lavaron tres veces con 100 µ?/pocillo de PBS . En cada pocilio se adicionaron 50 µ? de anticuerpo de ratón IE anti-CMV diluido a 1:2000 en PBS-GC que contenía Tritón X-100 0.1% y se incubaron a TA durante 1 hora. El anticuerpo IE se eliminó y los pocilios se lavaron tres veces con 100 µ?/pocillo de PBS. En cada pocilio se adicionaron 50 µ? de anticuerpo secundario y 41 , 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) en el mismo paso mezclando anticuerpo Alexa Fluor 594 cabra anti-ratón a 1:2000 en PBS-GC y DAPI 1:5000 en PBS-GC. Las placas se incubaron en la oscuridad a TA durante 1 hora. El anticuerpo secundario se eliminó y los pocilios se lavaron tres veces con 100 µ?/pocillo de PBS. El tercer lavado no se eliminó. Las placas se leyeron en el equipo Cellomics ArrayScanMRVTI de plataforma completa.

Tinción de GPCMV El medio se eliminó y las células se fijaron con 100 µ?/pocillo de paraformaldehído 4% durante 20 minutos a TA. Luego, el paraformaldehído se eliminó y las células se lavaron tres veces con 100 µ?/pocillo de PBS . En cada pocilio se adicionaron 50 µ? de DAPI 1:5000 en PBS-GC. Las placas se incubaron en la oscuridad a TA durante 10 minutos. El DAPI se eliminó y los pocilios se lavaron tres veces con 100 µ?/pocillo de PBS. El tercer lavado no se eliminó. Las placas se leyeron en el equipo Cellomics ArrayScanMRVTI de plataforma completa.

Análisis Los datos de los ensayos de neutralización se recopilaron utilizando el equipo Cellomics ArrayScanMRVTI de plataforma completa. Las placas se cerraron herméticamente con sellos para placa de adhesivo transparente y se depositaron con un brazo robotico. Las placas infectadas con aislados clínicos VR1814 y HCMV se analizaron según el protocolo Target Activation NB-TA-2CH (1000 objetos contados por pocilio) . Las placas infectadas con GPCMV se analizaron según el protocolo Molecular Translocation NB-MT-Guinea Pig CMV (1000 objetos contados por pocilio) . El % de infectividad se calculó dividiendo el número de células positivas a CMV (detectadas por IE o GFP dependiendo del virus) por pocilio entre el número de células por pocilio y multiplicando por 100. El % de infectividad relativa pára cada dilución se calculó tomando el % de infectividad de pocilios que no tenían anticuerpo (sólo virus) y dividiendo por el % de infectividad de cada dilución dé cada anticuerpo y multiplicando por 100. El % de infectividad relativa se gráfica contra la concentración de anticuerpos en µ9/p?1 y la mitad de la concentración inhibidora máxima (IC50) se determina como la concentración de anticuerpo a la cual 50% de los virus infecciosos observados en el virus de control, se neutralizan (50% de infectividad relativa) .

Resumen Los datos presentados aquí muestran que los seis anticuerpos que se dirigen a la región AD-2 de DLD en la glucoproteína B del HCMV, son capaces de neutralizar la entrada de HCMV en líneas celulares humanas de fibroblastos, epiteliales y endoteliales . Los IC50 de cada anticuerpo son consistentes entre las tres líneas celulares infectadas con VR1814 y esto demuestra su habilidad para neutralizar la entrada independientemente del tipo de célula. Estos anticuerpos también son capaces ¡de neutralizar la entrada de tres aislados clínicos de HCMV de subcultivos bajos a las -NHDF, casi sin ninguna diferencia en cuanto a la potencia de neutralización observada entre cada anticuerpo. Este efecto también se observa en las células HUVEC y ARPE-19 infectadas con el aislado clínico 8819 de HCMV. Ninguno de los anticuerpos evaluados fueron capaces de neutralizar la entrada de GPCMV en la línea celular JH4 de fibroblastos de cobayo. Sin embargo, esto no es inesperado ya que existe gran variabilidad de secuencia entre GPCMV gB y HCMV gB en la región AD-2 de esta proteína. Todos los anticuerpos anti-HCMV gB neutralizaron de manera consistente todas las cepas de virus HCMV evaluadas en las tres líneas celulares sin presentar diferencia significativa en cuanto a la potencia.

EJEMPLO 6 ANTICUERPOS PARA HCMV QUE NEUTRALIZAN CON POTENCIA LA INFECCIÓN POR VR1814 EN CÉLULAS EPITELIALES HUMANAS (ARPE- 19) , CÉLULAS ENDOTELIALES (HUVEC) Y FIBROBLASTOS ( HDF) Los anticuerpos anti-HCMV se evaluaron a diluciones de 30 a 0.003 µg/ml y pudieron neutralizar la infección por HCMV VR1814 en los tres tipos de células (Figura 15) . Los valores IC50 registrados estuvieron entre 0.35 y 1.73 g/ml y fueron comparables con el control positivo gH(l) . Hubo poca diferencia en la potencia de neutralización entre cada uno de los anticuerpos. Los seis anticuerpos mostraron neutralización consistente frente a VR1814 en todas las líneas celulares sin presentar variabilidad significativa en las IC50.

EJEMPLO 7 ANTICUERPOS PARA HCMV QUE NEUTRALIZAN CON POTENCIA LA INFECCIÓN DE FIBROBLASTOS POR LOS AISLADOS CLÍNICOS 8818, 8819 Y 8824 DE HCMV Los anticuerpos anti-HCMV se evaluaron a diluciones de 30 a 0.003 µg/ml y pudieron neutralizar la infección por los aislados clínicos 8818, 8819 y 8824 de HCMV (Figura 16) . Los valores IC50 registrados estuvieron entre 0.19 y 0.83 µg/ml y fueron comparables con el control positivo gH(l), con excepción del aislado clínico 8824 qüe mostró un cambio en la IC50 (más alta) en gH(l) . Hubo poca diferencia entre cada uno de los anticuerpos. Los seis anticuerpos mostraron neutralización consistente frente a las tres infecciones por aislados clínicos de los fibroblastos, sin presentar variabilidad significativa en las IC50.

EJEMPLO 8 ANTICUERPOS PARA HCMV QUE NEUTRALIZAN ENDOTELIALES (HÜVEC) Y EPITELIALES (ARPE- 19) POR EL AISLADO CLÍNICO 8819 DE HCMV Los aislados clínicos 8818 y 8824 no se adaptaron totalmente a las infecciones de células endoteliales y células epiteliales y por lo tanto, no se encuentran por ;lo pronto a valor suficientemente elevado para medir en forma estadística diferencias significativas en la infección de células HUVEC y ARPE-19. De este modo, sólo el 8819 estuvo en este tipo de células. Los anticuerpos anti-HCMV se evaluaron a diluciones de 30 a 0.003 µg/ml y tuvieron la capacidad de neutralizar con potencia infecciones de células epiteliales (ARPE-19) y endoteliales (HUVEC) del aislado clínico 8819 de HCMV (Figura 17) . Los valores IC50 registrados estuvieron entre 0.19 y 0.83 µg/ml y fueron comparables con el control positivo gH(l) . Hubo poca diferencia entre cada uno de los anticuerpos. Los seis anticuerpos neutralizaron en forma consistente el aislado clínico 8819 en las dos líneas celulares, sin presentar variabilidad significativa en las IC50. Las grandes desviaciones estándar observadas en algunas de las muestras de las células HUVEC se atribuyen a una baja cantidad de virus infeccioso. Aunque el 8819 tiene capacidad para infectar las HUVEC, el % de infectividad es menor 1 y esto hace más variable al % de infectividad relativa.

EJEMPLO 9 ANTICUERPOS PARA HCMV QUE NO NEUTRALIZAN LA ENTRADA DE GPCMV A LAS CÉLULAS JH4 Ninguno de los anticuerpos anti-HCMV pudieron neutralizar la cepa V545/82 de GPCMV en células JH4 (Figura 18) . Los anticuerpos anti-HCMV no tuvieron efecto observable en la entrada de GPCMV hasta 300 µg/ml, que fue la concentración más alta evaluada. La heparina fue el único compuesto capaz de inhibir la entrada de GPCMV en células JH4. El fracaso de estos anticuerpos para bloquear la entrada de GPCMV se atribuye al alto grado de variabilidad de secuencia entre las secuencias GPCMV gB y gB en los otros aislados HCMV evaluados (Tabla 3) .

Tabla 3: Alineación Ad-2 La región AD-2 está resaltada en negritas A partir de lo anterior se apreciará que aun cuando para fines de ilustración se hayan descrito aquí modalidades específicas de la invención, se pueden hacer varias modificaciones sin desviarse del espíritu y alcance de la invención. En consecuencia, la invención no se limita sino por las reivindicaciones adjuntas.

Claims

REIVINDICACIONES : 1. Un anticuerpo aislado anti-CMV o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo comprendé: I : a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos SNHGIH (SEQ ID NO: 36) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos VISSDGDDDRYADSVKG (SEQ ID NO: 37) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38); y b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de LQRNT PPLT (SEQ ID NO: 45) ; II : (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de SNYGMH (SEQ ID NO: 48) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGSNEHYADSVKG (SEQ ID NO: 49); (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO: 44); (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54) ; III: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos SSNGIH (SEQ ID NO: 57) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDANDKQYADSVKG (SEQ ID NO: 58); (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de ASIRAT (SEQ ID NO: 64) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 65) ; IV: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de SNHGIH (SEQ ID NO: 36) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAHYADSVRG (SEQ ID NO: 68) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) V: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de SNHGIH (SEQ ID NO: 36); (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAHYADSVRGR (SEQ ID NO: 79) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO: 80) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) ; VI : (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de SDYGMH (SEQ ID NO: 85) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNTHYADSVRG (SEQ ID NO: 86) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASKRAT (SEQ ID NO: 92) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 93) ; VII: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de SXXGXH (SEQ ID NO: 95) , SXXGIH (SEQ ÍED NO: 98) O SXYGMH (SEQ ID NO: 101); (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISXDXXXXXYADS RG (SEQ ID NO: 96) O
VISXDGXNXHYADSVXG (SEQ ID NO: 99) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGXCSXXXCYSGLXDY (SEQ ID NO: 100), EGRCIEEXCYSGQIDY (SEQ ID NO: 102) o DGXCPDXXCYSGLIDY (SEQ ID NO: 103) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGXYXA (SEQ ID NO: 111) o RASQSVGXYLA (SEQ ID NO: 114); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de XASXRAT (SEQ ID NO: 112) o DASXRAT (SÉQ ID NO: 115) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XQRXXWPPLT (SEQ ID NO: 113), HQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 116) o QQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 117) . 2. Un anticuerpo aislado anti-CMV o un fragmento del mismo, en donde el anticuerpo comprende: I: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de GFTFSN (SEQ ID NO: 39) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGDDDR (SEQ ID NO: 40) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCGEPKCYSGLPDY (SEQ ID NO: 38); y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos DASNRAT (SEQ ID NO: 44); (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos LQR TWPPLT (SEQ ID NO : 45) ; II : (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de GLTFSN (SEQ ID NO: 118) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDGSNEH (SEQ ID NO: 51) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGRCPDVNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 50) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYLA (SEQ ID NO: 53); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASNRAT (SEQ ID NO: 44) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSNWPPLT (SEQ ID NO: 54) ; III : (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos GFTFSS (SEQ ID NO: 60) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISSDANDKQ (SEQ ID NO: 61) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGTCSGGNCYSGLIDY (SEQ ID NO: 59) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de ASIRAT (SEQ ID NO: 64) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSN PPLT (SEQ ID NO: 65) ; IV: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de KFIFSN (SEQ ID NO: 70) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEENCYSGQIDY (SEQ ID NO: 69) ; y (fc>) una región VL que incluye (i) una región VL CDR1 que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) ; V: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de KFIFSN (SEQ ID NO: 70) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNAH (SEQ ID NO: 71) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de EGRCIEEKCYSGQIDY (SEQ ID NO: 80) ; y (b) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGRYMA (SEQ ID NO: 74); (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASIRAT (SEQ ID NO: 75) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de QQRSSWPPLT (SEQ ID NO: 76) ; VI: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de GLTFSD (SEQ ID NO: 88) ; (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISKDGTNTH (SEQ ID NO: 89) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de DGKCPDLKCYSGLIDY (SEQ ID NO: 87) ; y (fc>) una región VL que incluye (i) una región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de RASQSVGGYLA (SEQ ID NO: 43) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de DASKRAT (SEQ ID NO: 92) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de HQRSSWPPLT (SEQ ID NO : 93) ; VII: (a) una región VH que incluye (i) una región VH CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos de XXXFSX (SEQ ID NO: 104) o GXTFSX (SEQ ID NO: 107); (ii) una región VH CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de VISXDXXXXX (SEQ ID NO: 105) o VISKDGTNXH (SEQ ID NO: 108) ; (iii) una región VH CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XGXCXXXXCYSGXXDY (SEQ ID NO: 106), DGXCXXXXCYSGLXDY (SEQ ID NO: 109) o EGRCIEEXCYSGQIDY (SEQ ID NO: 110) ; y (b) una región VL que incluye (i) un región VL CDRl que incluye la secuencia de aminoácidos RASQSVGXYXA (SEQ ID NO: 111) o RASQSVGXYLA (SEQ ID NO: 114) ; (ii) una región VL CDR2 que incluye la secuencia de aminoácidos de XASXRAT (SEQ ID NO: 112) o DASXRÁT (SEQ
ID NO: 115) ; (iii) una región VL CDR3 que incluye la secuencia de aminoácidos de XQRXXWPPLT (SEQ ID NO: 113), HQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 116) O QQRSXWPPLT (SEQ ID NO: 117) . 3. Un anticuerpo anti-CMV aislado que comprende : a) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 35 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 42 o (b) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 47 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 52 o; (c) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 56 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 63 O; (d) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 67 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 73 o; (e) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 78 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 82 o; (f) una secuencia de cadena pesada que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 84 y una secuencia de cadena ligera que incluye la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 91.
4. El anticuerpo anti-CMV según las reivindicaciones 1, 2 ó 3, en donde el anticuerpo se une a un epítope de la proteína de envoltura glucoproteína b (gB) del virus CMV.
5. El anticuerpo anti-CMV según la reivindicación 4, en donde el epítope comprende el sitio 1 del determinante antigénico 2 de gB, gp 116.
6. Una composición que contiene el anticuerpo según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.
7. La composición según la reivindicación 6, que también comprende un tratamiento antiviral .
8. La composición según la reivindicación 7, en donde el tratamiento antiviral es ganciclpvir, foscarnet, cidofovir, valganciclovir y la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) .
9. La composición según la reivindicación 6, que también contiene un segundo anticuerpo anti-CMV.
10. El anticuerpo según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5, en donde el anticuerpo está operablemente unido a un agente terapéutico o a un marcador detectable.
11. Un método para el tratamiento o prevención de una infección CMV en un individuo, que comprende administrarle al individuo la composición según la reivindicación 6.
12. El método según la reivindicación 11, en donde el método también comprende administrar un tratamiento antiviral .
13. El método según la reivindicación 11,1 en donde el tratamiento antiviral es ganciclovir, foscariiet, cidofovir, valganciclovir y la inmunoglobulina intravenosa (IVIG) .
14. El método según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo se administra antes o después dé la exposición a CMV.
15. El método según la reivindicación 11, en donde el anticuerpo se administra a una dosis suficiente para neutralizar la infección CMV.
16. Un método para determinar la presencia de una infección CMV en un paciente, que comprende las siguientes etapas: (a) poner en contacto una muestra biológica obtenida del paciente con el anticuerpo según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5 ; (b) detectar una cantidad del anticuerpo que se une a la muestra biológica; (c) comparar la cantidad de anticuerpo que se une a la muestra biológica con un valor control y a partir de éste determinar la presencia del virus de influenza en el paciente.
17. Un estuche de diagnóstico que comprendé el anticuerpo según las reivindicaciones 1, 2, 3, 4 ó 5.