CN105228652A - 评价全脑血管旁路径的废弃物清除功能的方法以及基于这种方法治疗神经退化性病症的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供测量哺乳动物脑中的胶质血管路径(“胶质淋巴系统”)功能的方法，所述方法包括对脑进行成像和测量脑中的脑脊髓液-间质液(cerebrospinal？fluid-interstitial？fluid；CSF-ISF)交换。所述方法能用于追踪CSF与ISF隔室之间的交换。任选地在鞘内投与成像剂。成像剂可以是负或正(顺磁)造影剂并且可以对脑进行动态或造影剂强化型磁共振成像(magnetic？resonance？imaging；MRI)。成像剂可以是正电子发射型放射性核素示踪剂并且可以进行正电子发射断层摄影术(positron？emission？tomography；PET)。还提供治疗哺乳动物脑疾病或病症的方法，其中所述方法增强或降低胶质淋巴清除功能。

Description

评价全脑血管旁路径的废弃物清除功能的方法以及基于这种方法治疗神经退化性病症的方法
相关申请的交叉参照
本申请主张同在申请中的美国临时专利申请第61/767,546号(名称为评价全脑血管旁路径的废弃物清除功能的方法和基于这种方法治疗神经退化性病症的方法(MethodsForEvaluatingBrain-WideParavascularPathwayForWasteClearanceFunctionandMethodsForTreatingNeurodegenerativeDisordersBasedThereon)，2013年2月21日提申)、临时专利申请第61/862,321号(名称为评价全脑血管旁路径的废弃物清除功能的方法和基于这种方法治疗神经退化性病症的方法，2013年8月5日提申)和临时专利申请第61/942,447号(名称为评价全脑血管旁路径的废弃物清除功能的方法和基于这种方法治疗神经退化性病症的方法，2014年2月20日提申)的优先权和权益，这些专利申请中的每一个均以全文引用的方式并入本文中。
关于联邦赞助研究或研发的声明
所公开的本发明是在政府支持下依据美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)授予的合同号NS078304、NS078167和NS073373完成。政府拥有本发明的权利。
技术领域
本发明涉及测量哺乳动物脑中的胶质血管路径功能的方法。本发明还涉及测量哺乳动物脑中的脑脊髓液-间质液(CSF-ISF)交换的方法。本发明进一步涉及通过促进或阻碍胶质血管路径功能来治疗哺乳动物脑疾病或病症的方法。本发明还涉及促进或增强哺乳动物脑中的脑脊髓液分泌和流动的方法。
背景技术
淋巴脉管系统代表着与血液脉管系统平行的第二循环系统，其说明间质液(ISF)的清除，其中间质液的组成性蛋白质和其它溶质不能跨越毛细血管后微静脉被吸收。在大部分脉管化组织中，淋巴系统对于流体静力维持和内环境稳定性维持来说均具有关键作用。然而，脑不具有组织学上可鉴别的淋巴脉管并且因此缺乏供间质性溶质和间质液清除、存在于其它周边组织中的离散路径。这是出人意料的，原因在于神经元和神经胶质的高代谢速率以及对其细胞外环境变化的极度敏感性表明ISF和溶质需要快速清除。
中枢神经系统(centralnervoussystem；CNS)中的脑脊髓液(CSF)已被认为起着从脑清除溶质的作用。脉络膜丛中形成的CSF沿着颅脑神经鞘或经由鼻淋巴管，经由硬脑膜窦的蛛网膜绒毛，经由脑室和蛛网膜下的空间流到其再吸收入血流中的最终部位。间质性溶质已被认为通过ISF的对流性总体流动清除到CSF中，ISF弥漫性地流遍脑组织，而非流遍解剖学上或功能上的离散结构。
哺乳动物中枢神经系统(包括脑和脊髓)中的功能异常毒性蛋白质聚积与人类的多种神经退化性疾病相关，包括阿尔茨海默病(Alzheimer'sdisease；AD)、帕金森病(Parkinson'sdisease；PD)、亨廷顿病(Huntington'sdisease；HD)和肌肉萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis；ALS)。然而，导致老龄化哺乳动物脑中毒素聚积的机制尚未完全获知。在阿尔茨海默病(AD)的情况下，两种标志是老年斑(老年斑是淀粉状蛋白β(在本文中也被称作淀粉状蛋白-β、淀粉状蛋白beta或Aβ)毒素的细胞外沉积物)和细胞内神经原纤维缠结(过度磷酸化的τ)。“淀粉状蛋白级联”假设表明，AD的认知力下降和独特病原性特征与这些毒素的异常聚积有关(赛尔考D.J.(Selkoe,D.J.)，“清除脑的淀粉状蛋白蜘蛛网(ClearingtheBrain'sAmyloidCobwebs)”，神经元(Neuron)32，第2期(2001)：177-80；哈迪J.(Hardy,J.)，“阿尔茨海默病研究一百年(AHundredYearsofAlzheimer'sDiseaseResearch)”，神经元(Neuron)52，第1期(2006)：3-13)。
美国专利第6,689,085号(罗本斯特恩(Rubenstein)等人，2004年2月10日)公开了一种治疗阿尔茨海默型成年发作痴呆症的方法和装备。根据所述方法，通过将患者脑脊髓液(CSF)传输到患者身体的另一部分来脱除患者脑脊髓液(CSF)的一部分。美国专利第6,689,085号还公开了用于脱除CSF的分流器。
章节2中或本申请的任何其它章节中引用或标识的任何参考文献不应视为承认这个参考文献可作为本发明的在先技术加以利用。
发明内容
本发明提供一种测量哺乳动物脑和/或脊髓(统称为“中枢神经系统”或“CNS”)中的胶质血管路径(下文中称“胶质淋巴系统”)功能的方法，包含以下步骤：
对中枢神经系统进行成像；和
测量中枢神经系统中的脑脊髓液-间质液(下文中称“CSF-ISF”)交换，由此测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含在对中枢神经系统进行成像的步骤之前投与成像剂的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，成像剂是在鞘内投与。
在所述方法的另一个实施例中，鞘内投与成像剂的步骤包含腰椎或脑池内鞘内注射投与成像剂的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，成像剂是负或正(顺磁)MRI造影剂，并且对中枢神经系统进行成像的步骤包含对中枢神经系统进行动态或造影剂强化磁共振成像(MRI)的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，投与至少两种不同磁性的造影剂或MRI造影剂，不同磁性的造影剂就它们对T1(顺磁)或T2(负造影剂)的影响来说是匹配的，从而可以比较它们在脑组织中的动力学特征。
在所述方法的另一个实施例中，成像剂是正电子发射放射性核素示踪剂，并且对脑和脊髓进行成像的步骤包含对中枢神经系统进行正电子发射断层摄影术(PET)扫描的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含测量可溶性淀粉状蛋白β(在本文中也被称作淀粉状蛋白beta或Aβ)、τ、纳米粒子(例如功能化或治疗性纳米粒子)、化学治疗剂、治疗上投与的毒性产品、小干扰RNA(siRNA)、α突触核蛋白、小分子药物、病毒载体、抗体类治疗剂、脂质体或治疗性RNA构筑体的清除率。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含测量治疗剂的清除率。
在所述方法的另一个实施例中，治疗剂是化学治疗剂、功能化纳米粒子或为了治疗性用途而投与的毒性组合物。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含分析顺磁或负造影剂在脑中的内流动力学、实质分布和/或清除率。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含测量脑垂体隐窝、松果体腺体隐窝、小脑和/或嗅球处的CSF-ISF交换。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤包含分别测量T1缩短或T2变化的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含计算内流动力学参数的步骤，其中内流动力学参数反映CSF-ISF交换的速率。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含根据静态造影剂强化MRI或PET图像计算动力学参数的单一步骤，其中动力学参数反映CSF-ISF交换的速率。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含计算哺乳动物出现神经退化性疾病的风险的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，神经退化性疾病是帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病(Alzheimer’sdiseasewithLewybodies)、路易体性痴呆症，或混合型痴呆症。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物遭受创伤性脑损伤，所述方法进一步包含计算出现慢性创伤性脑病变(chronictraumaticencephalopathy；CTE)的风险的步骤。
提供一种治疗哺乳动物中枢神经系统的神经退化性疾病发作的方法，包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此治疗、改善、预防、减少或降低反应性神经胶质增生。
在一个实施例中，增强胶质淋巴系统清除作用的步骤包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物；或泵送流体通过哺乳动物的中枢神经系统间质的步骤，由此减少、降低、延缓发作、或防止淀粉状蛋白β(Aβ)、τ和/或α突触核蛋白在哺乳动物脑间质中聚积。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
在所述方法的一个实施例中，反应性神经胶质增生减少或妨碍了间质性废弃物的清除。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在所述方法的另一个实施例中，神经退化性疾病是帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症、慢性创伤性脑病变(CTE)或HIV相关性痴呆症。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的步骤包含向哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂(例如Stat-3抑制剂或所属领域中已知作为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子)的步骤。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦(tolvaptan)、考尼伐坦(conivaptan)或VPA-985；心房利钠肽(atrialnatriureticpeptide；ANP)的拮抗剂，例如安南汀(anantin)；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦(losartan)；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦(valsartan)。
在另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂，包括(但不限于)：
抗组胺剂(例如非处方药)：
(非索非那定(Fexofenadine))
(苯海拉明(Diphenhydramine))
或(氯雷他定(loratadine))
(氯芬尼拉明马来酸盐(chlorpheniraminemaleate))
(溴苯那敏(Brompheniramine)、苯丙醇胺(Phenylpropanolamine))
(西替利嗪(Cetirizine))
非处方睡眠助剂：
优利松(Unisom)夜间睡眠助剂
休眠素(Dormin)
力托(Nytol)
简单睡眠(SimplySleep)
索明埃克(Sominex)
超强度扑热息痛PM(ExtraStrengthTylenolPM)
苯海拉明盐酸盐
伊克赛锭P.M.(ExcedrinP.M.)
苯并二氮呯(Benzodiazepines)：
(艾司唑仑(estazolam))
(弗拉西泮(flurazepam))
(夸西泮(quazepam))
(替马西泮(temazepam))
(三唑仑(triazolam))
(安定(diazepam))
非苯并二氮呯：
咪唑并吡啶：CR、(唑吡坦(zolpidem))(其自身类别)
(吡唑并嘧啶)(其自身类别)
褪黑素受体刺激剂：
(雷美替胺(ramelteon))
(水合氯醛)
(右美托咪啶盐酸盐(dexmedetomidinehydrochloride))
(右佐匹克隆(eszopiclone))
巴比妥酸盐(Barbiturates)：
(苯巴比妥(phenobarbital))
(甲苯巴比妥(mephobarbital))
安密妥钠(AmytalSodium)(异戊巴比妥钠(amobarbitalsodium))
(布塔巴比妥钠(butabarbitalsodium))
普弗勒钠(SodiumPulvules)(司可巴比妥钠(secobarbitalsodium))
在另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的药剂是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
在另一个实施例中，防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
在另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
提供一种治疗哺乳动物中枢神经系统的反应性神经胶质增生的方法，包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此治疗、改善、预防、减少或降低反应性神经胶质增生。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在方法的另一个实施例中，反应性神经胶质增生使水通道蛋白4(aquaporin4；AQP4)依赖性总体流动减少。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的步骤包含向哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂(例如Stat-3抑制剂或所属领域中已知作为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子)的步骤。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦、考尼伐坦或VPA-985；心房利钠肽(ANP)的拮抗剂，例如安南汀；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦。
在另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的药剂是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
在另一个实施例中，防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
在所述方法的另一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
提供一种促进从哺乳动物脑间质和/或脊髓间质(或CNS间质)中清除废弃物产物的方法，包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤。在所述方法的一个实施例中，方法包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂(例如Stat-3抑制剂或所属领域中已知作为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子)投与哺乳动物的步骤。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦、考尼伐坦或VPA-985；心房利钠肽(ANP)的拮抗剂，例如安南汀；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦。
在另一个实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
在另一个实施例中，防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在所述方法的另一个实施例中，脑废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ或α突触核蛋白。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
提供一种治疗哺乳动物中枢神经系统的方法，包含增强胶质淋巴清除作用的步骤。在一个实施例中，增强胶质淋巴清除作用的步骤包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物；或泵送流体通过哺乳动物中枢神经系统间质的步骤。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
所述方法用于减缓、延迟、降低、减少或防止废弃物产物在哺乳动物中枢神经系统中的聚积。在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在所述方法的另一个实施例中，脑废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ或α突触核蛋白。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
提供一种治疗哺乳动物中枢神经系统(脑和/或脊髓)的方法，包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤，由此减少、延迟或防止淀粉状蛋白β(Aβ)、τ和/或α突触核蛋白聚积，例如在哺乳动物CNS间质中聚积，包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物脑已遭受脑损伤。在一个实施例中，脑损伤是创伤性脑损伤。在另一个实施例中，脑损伤是弥漫性缺血性损伤。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在所述方法的另一个实施例中，需要治疗的患者或个体是老龄或老年的。在一个实施例中，老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
在所述方法的另一个实施例中，治疗剂是肾上腺素激导性受体拮抗剂。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
提供一种减少或阻碍从哺乳动物CNS(脑和/或脊髓)间质中清除治疗剂或调节剂的方法，包含减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
在所述方法的另一个实施例中，需要治疗的患者或个体是老龄或老年的。在一个实施例中，老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
在所述方法的另一个实施例中，减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤包含将减少或阻碍胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤。
在所述方法的另一个实施例中，药剂是布美他尼、针对AQP4的小干扰RNA(siRNA)、AVP(血管加压素)的促效剂、心房利钠肽(ANP)的促效剂、血管紧张素II的促效剂、AT2R受体促效剂，或AT1受体促效剂。
在所述方法的另一个实施例中，减少(或阻碍)胶质淋巴清除作用的步骤包含阻断通过哺乳动物中枢神经系统间质的流体流动或对其设置障碍的步骤。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据本文所公开的测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
还提供一种装备用于恢复和/或增强所减少的脑脊髓液(CSF)分泌和/或减少的流动，脑脊髓液(CSF)分泌减少和/或流动减少与哺乳动物脑中的脑脊髓液(CSF)/间质液(ISF)交换相关。在一个优选实施例中，哺乳动物是人类。所述装备包含机械泵系统(例如输注泵)，由此促进脑中的更快速CSF清除。在一个实施例中，装备还包含人造(“模拟”)CSF和抽吸或注入人造CSF到脑中的泵系统。
在所述装备的另一个实施例中，装备恢复和/或增强所减少的脑脊髓液(CSF)分泌和/或所减少的流动，脑脊髓液(CSF)分泌减少和/或流动减少与神经退化性疾病(包括(但不限于)帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症和混合型痴呆症)相关或与创伤性脑损伤或缺血性脑损伤相关。
附图说明
本文参照附图描述本发明，其中在若干幅视图中，相似的元件符号表示相似的元件。应理解，在一些情况下，本发明的各个方面可以放大、扩大、分解或不完全绘示，以便促进对本发明的理解。
还应理解，在一些情况下，数据的颜色编码(包括聚类分析数据的编码，已根据所属领域中众所周知的方法进行)在附图中已转换成灰度。
图1A到O：蛛网膜下CSF在脑实质中的分布。颜色编码已转换成灰度。(A)将荧光示踪剂输注到侧脑室(lateralventricle；LV)或小脑延髓池(cisternamagna)之后，评价脑室和蛛网膜下CSF向脑实质的移动。(B到G)脑室内输注30分钟之后，评价小分子量示踪剂(A594；分子大小：759道尔顿；红色)、中等分子量示踪剂(TR-d3；分子大小：3kD；蓝色)和大分子量示踪剂(FITC-d2000；分子大小：2000kD；绿色)向脑实质的移动。3V：第三脑室；4V：第四脑室。(D和G)在远离脑室周围空间的组织中不存在示踪剂。插图：在相同视野中用4',6-二甲脒基-2-苯基吲哚(DAPI)标记。(H到J)脑池内注射之后，让小分子量示踪剂渗透30分钟。箭头：低程度的血管旁聚积。(K到M)脑池内注射的TR-d3(深蓝色)和FITC-d2000(绿色)的分布。汇合(浅蓝色)表示TR-d3和FITC-d2000的共定位。(N)脑池内荧光示踪剂的分布，以总脑量的百分比量化(图块面积积分)。A594在脑组织中所占比例最大。TR-d3展现中等分布，而FITC-d2000受到高度限制(n＝3，*P<0.05)。(O)脑池内注射[3H]甘露醇(分子大小：182道尔顿)或[3H]聚葡萄糖-10(分子大小：10kD)之后，放射性示踪剂在脑内的聚积。相较于[3H]甘露醇，[3H]聚葡萄糖-10在脑中的聚积显著更慢(每个时间点n＝6，*P<0.0001)。比例尺：100mm。
图2A到L：对动脉旁CSF内流到小鼠皮层中进行的活体内双光子成像。颜色编码已转换成灰度。通过封闭的颅脑窗，利用双光子成像来对脑池内注射到蛛网膜下CSF中的示踪剂向大脑皮层中的内流进行活体内评估。(A)成像装置示意图。以1分钟时间区间，对皮层表面下方0mm与240mm之间进行成像。(B)大脑脉管系统使用动脉内CB-d10可视化，并且动脉(A)和静脉(V)在形态上加以鉴别。CSF示踪剂在脑池内注射之后立即沿着大脑表面动脉而非静脉的外部移动。红色圆圈：微动脉；蓝色圆圈：微静脉。(C到E)随着时间的过去，示踪剂沿着贯穿性微动脉而非微静脉快速移动到脑内。小分子量示踪剂(TR-d3，深蓝色)容易移动到间质内，而大分子量示踪剂(FITC-d2000，绿色)局限于血管旁空间。汇合(浅蓝色)表示TR-d3和FITC-d2000的共定位。(F到H)沿着皮层表面动脉，大分子量示踪剂(FITC-d2000)存在于直接围绕动脉血管平滑肌细胞(vascularsmoothmusclecells；VSM)的血管旁空间(paravascularspace；PVS)中。血流(bloodstream；BS)利用静脉内注射的TR-d70界定。基底膜(basementmembrane；BM)中的低含量标记表示沿着基底膜移动的CSF示踪剂的比例小。(I和J)脑池内注射的大分子量示踪剂(FITC-d2000)沿着围绕贯穿性微动脉(TR-d70)的血管旁空间进入脑中。(K和L)转基因小鼠中的神经胶质肌原纤维酸性蛋白质(GFAP)阳性星形胶质细胞表达GFAP-GFP(绿色荧光蛋白)报告基因。含有TR-d2000的血管旁空间以血管周围星形胶质细胞终足(白色)为界。比例尺：100mm[(B)到(E)]，20mm[(F)到(I)]，和5mm[(J)到(L)]。
图3A到H：CSF沿着血管旁路径从脑间质进入和清除。颜色编码已转换成灰度。为了评价蛛网膜下CSF内流到脑实质中的路径，将荧光示踪剂脑池内注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双重报告基因小鼠中，以便直接区分动脉和静脉。(A和B)脑池内注射的OA-647沿着贯穿性微动脉(Tie2-GFP+/NG2-DsRed+脉管，空心箭头)，而非沿着上升静脉(Tie2-GFP+/NG2-DsRed-脉管，实心箭头)进入(绿色箭头描绘示踪剂进入)大脑皮层中。(C)CSF示踪剂沿着血管旁空间(PVS)和血管内皮与平滑肌细胞层之间的基底膜(BM)移动。示踪剂沿着毛细血管的移动是沿着基底薄层薄层进行。(D)在基底神经节和丘脑中观察到大量示踪剂，其沿着腹侧大穿动脉进入。(E)围绕豆纹动脉的示踪剂分布详图。图展示出沿着白线的强度投影。绿色：示踪剂；灰色：内皮GFP；红色：血管平滑肌。(F到H)在较长时间点(>1小时，相较于示踪剂内流0到30分钟)，OA-647(分子大小：45kD)进入间质性空间并且主要沿着毛细血管(F)和实质微静脉(G)聚积。沿着中内部大脑静脉和外腹侧后嗅区静脉(H)的聚积程度最大。(G)到(H)中的橙色箭头描绘所观察到的间质性示踪剂清除路线。比例尺：100mm[(A)和(D)]，50mm(H)，20mm[(B)、(F)和(G)]，和4mm[(C)和(E)]。
图4A到I。血管旁水通道蛋白4(AQP4)促进CSF流动通过脑间质。颜色编码已转换成灰度。(A)AQP4(紫色)特异性表达于脑星形胶质细胞(白色)中，其中到血管周围终足的位置被高度极化(箭头)。(B和C)呈AQP4阳性的血管周围星形胶质细胞终足迅即包围动脉旁CSF内流路径。图描绘(B)和(C)的荧光强度投影，用白色矩形指示。示踪剂(绿色)定位于血管旁空间(PVS)内，血管平滑肌(红色)与星形胶质细胞终足(紫色)之间。(D)示踪剂沿着毛细血管基底薄层(绿色)的移动是以血管周围AQP4阳性终足(紫色)为界。(E和F)活体内评价AQP4介导的流体流动对蛛网膜下CSF移动到脑实质内和通过脑实质的作用。量化示踪剂标记时，相较于野生型(WT)对照动物，在无Aqp4的小鼠中，脑池内注射的示踪剂在注射之后30分钟向脑中的移动显著减少(每个时间点n＝4到5，*P<0.05)。(G)活体内评价小分子量(TR-d3)(深蓝色)和大分子量(FITC-d2000)(绿色)脑池内示踪剂向皮层中的内流。大脑脉管系统利用动脉内CB-d10可视化(插图)。汇合(浅蓝色)表示TR-d3和FITC-d2000的共定位。(H)相对于野生型对照动物，在无Aqp4的动物中，大分子量示踪剂(绿色)沿着动脉旁空间的移动[如根据绿色圆形所关注区域(regionofinterests；ROI)中的平均荧光强度所测量]未发生显著变化。(I)相较于野生型对照动物，在无Aqp4的动物中，小分子量示踪剂向围绕贯穿性微动脉的间质中的移动(如根据蓝色圆环ROI中的平均荧光强度所测量)消除(每组n＝6，*P<0.01)，表明Aqp4基因缺失影响脑池内注射的示踪剂移动通过皮层实质。AU：任意单位。比例尺：100mm(G)、40mm(A)、20mm(D)和10mm[(B)和(C)]。
图5A到B：胶质淋巴系统承载着间质性溶质和间质液从脑中清除。(A)为了评价对间质性溶质的清除作用，测量纹状体内[3H]甘露醇从脑中的消除(欲知详情，参见图14A)。在注射之后的最初2小时期间，相较于野生型对照小鼠，在无Aqp4的小鼠脑中，纹状体内[3H]甘露醇的清除显著减少(*P<0.01，每个时间点n＝4)。(B)胶质淋巴路径的示意性描绘。在这种全脑路径中，CSF沿着动脉旁途径进入脑中，同时ISF沿着静脉旁途径从脑中清除。AQP4依赖性星形胶质细胞水流动促进这些内流途径与清除途径之间的对流性ISF总体流动并且驱使间质性溶质和间质液从脑实质中清除。溶质和流体可以从此处分散到蛛网膜下CSF中，跨越毛细血管后脉管系统进入血流中，或循着引流静脉的壁到达颈淋巴管。
图6A到E：间质性Aβ沿着血管旁路径清除。为了评价间质性可溶性淀粉状蛋白Aβ是否沿着与其它示踪剂相同的路径清除，将荧光或放射性标记的淀粉状蛋白β1-40注射到小鼠纹状体中。(A)125I-淀粉状蛋白β1-40注射之后15分钟、30分钟或1小时，测量全脑辐射，如图14A到B中所详述。在t＝60分钟时，在野生型动物中，I-淀粉状蛋白β1-40清除的速度比[3H]甘露醇或[3H]聚葡萄糖-10更快。无Aqp4的小鼠中的I-淀粉状蛋白β1-40清除显著减少(*P<0.05，每个时间点n＝4到6)。(B到D)HyLyte-555-淀粉状蛋白β1-40注射到Tie2-GFP小鼠中之后一小时，示踪剂沿着毛细血管(D，箭头)和大引流静脉(B和C)聚积。(C)中的图像描绘不具有内皮GFP荧光信号的(B)。(E)为了评价CSF内的可溶性Aβ是否可再循环通过脑实质，脑池内注射125I-淀粉状蛋白β1-40，并且注射之后15分钟、30分钟和45分钟，评价放射性示踪剂向脑中的内流(如图8)。125I-淀粉状蛋白β1-40以类似于[3H]聚葡萄糖-10的方式进入脑，且相较于野生型对照小鼠，在无Aqp4的小鼠中，125I-淀粉状蛋白β1-40内流显著减少(*P<0.05，每个时间点n＝4到6)。比例尺：50mm。
图7：对荧光CSF示踪剂在脑实质内分布的量化。脑池内注射A594、TR-d3和FITC-d2000注射剂之后，将动物灌注固定并且用振荡切片机切100μm切片。用4倍落射荧光显微镜对切片成像并且产生合成图像。为了评价示踪剂覆盖范围，分离颜色通道，减去图像背景，计算均一阈值面积和阈值面积并且以总切片面积的百分比表示。
图8：测量进入脑实质中的蛛网膜下CSF。示意图描绘对进入脑实质中的蛛网膜下CSF的测量。脑池内注射3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I-Aβ1-40。为了量化放射性示踪剂在脑实质内的聚积，放射性示踪剂注射之后15分钟、30分钟或45分钟收集脑。将脑溶解于Soluene中，接着通过液体闪烁计数法测量总脑放射性。根据所测量的总脑放射性(RBrain)和所注射的总放射性(RInject)来计算成比例的脑放射性(R'Brain)。收集期间，从脑中去除硬脑膜。因此，脑匀浆不包括保留于蛛网膜下CSF隔室中的放射性示踪剂。
图9A到D：对小分子量和大分子量示踪剂的动脉旁内流进行的活体内成像。颜色编码已转换成灰度。通过活体内双光子激光扫描显微镜，在麻醉小鼠中，在封闭颅脑窗内，对不同分子量的两种聚葡萄糖(TR-d3和FITC-d2000)沿着动脉旁路径的移动和向皮层间质中的移动进行成像。(A)大脑脉管系统使用动脉内级联蓝-聚葡萄糖-10(CascadeBlue-dextran-10；CB-d10)可视化并且在形态上鉴别贯穿性微动脉(A)和静脉(V)(分别为红色和蓝色圆圈)。(B-D)通过测量以贯穿性脉管为中心的环形ROI内的平均荧光强度来评价小分子量和大分子量示踪剂沿着动脉旁和静脉旁路径的移动。通过测量以贯穿性脉管为中心的圆环形ROI(红色和蓝色虚线环形)中的平均荧光强度来界定示踪剂向周围间质中的移动。(C)小分子量示踪剂容易从动脉旁空间(红色实线)移动到动脉旁(红色虚线)和静脉旁(蓝色虚线)间质内。曲线之间缺乏统计学显著性差异(P＝0.056，每组n＝6)表示这种示踪剂从动脉旁空间向外的移动相对来说不受限制。(D)大分子量示踪剂容易沿着贯穿性微动脉(红色实线)，而非沿着贯穿性微静脉(蓝色实线；*P<0.01，每组n＝6)移动到皮层中。在围绕贯穿性微动脉和静脉(分别为红色虚线和蓝色虚线)的组织中所测量的示踪剂强度和静脉旁空间中所观察到的示踪剂强度处于同样低的水平。因此，大分子量示踪剂主要局限于动脉旁空间并且不容易进入脑间质中。比例尺：100μm。
图10A到E：CSF不沿着静脉旁路径进入脑实质中。为了评价蛛网膜下CSF示踪剂的动脉旁相对于静脉旁内流，将OA-647脑池内注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双重报告基因小鼠中。(A)在这些小鼠中，所有血管的内皮经GFP标记，而血管平滑肌细胞和周细胞经DsRed标记。因此根据不同的周向性DsRed标记的存在容易区分动脉和微动脉(空心箭头)，而静脉(实心箭头)缺乏这种标记。当NG2-DsRed小鼠脑切片经内皮标记CD-31标记(右)时，发现NG2-DsRed标记的动脉特异性。(B)在大脑皮层中，脑池内示踪剂沿着DsRed+贯穿性微动脉，而非沿着DsRed-静脉进入脑。时常发现远端静脉标记，但典型地经由中间毛细血管床而来源于微动脉旁内流路径。(C-E)沿着腹侧脑表面的大脉管展现相同图案。围绕大穿动脉(空心箭头，D)的血管旁空间让CSF示踪剂大流量移动到实质中，而示踪剂不会沿着基底引流静脉(实心箭头，E)实质上渗透到实质内。比例尺：100μm(B、C)、50μm(A)、20μm(D-E)。
图11A到E：脑池内和实质内注射的示踪剂共用相同的静脉旁引流路径。OA-647实质内注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双重报告基因小鼠中。(A-B)皮层内注射的示踪剂围绕着微脉管聚积，并且从注射部位沿着毛细血管旁和静脉旁(箭头)路径向外最快速地移动。(C-D)纹状体内示踪剂类似地围绕毛细血管和微静脉聚积。注射到灰质中的示踪剂从白质束(星号，D)中排除。(E)虽然也观察到沿着皮层上升静脉和微静脉的较小清除，但实质内示踪剂主要沿着内部大脑静脉和后嗅区静脉从脑中清除。比例尺：50μm(B、D-E)、20μm(A、C)。
图12A到E：在野生型和无Aqp4的小鼠中，示踪剂的血管旁聚积和维乔－罗宾空间(Virchow-Robinspace)的视觉显示。(A-B)脑池内注射的FITC-d40通过DAB免疫组织化学可视化。注射之后的5分钟，反应产物显而易见沿着野生型动物(A)的贯穿性皮层脉管(插图中的箭头)。在无Aqp4的动物(B)中，脉管周围的标记强度弱得多。插图高倍放大展示顶叶皮层中的标记。(C-D)电子显微照片展示围绕贯穿性皮层微动脉的邻近血管旁空间(维乔-罗宾空间，VRS)中存在电子密集型DAB反应产物。相较于野生型动物(C)，无Aqp4的动物(D)中的VRS呈现超微结构完整性。(E)未注射的无Aqp4动物中的VRS显现于皮层表面下方约1000μm。插图展示围绕贯穿性脉管的VRS的宽度(对于野生型动物来说，n＝10，对于无Aqp4动物来说，n＝11；数值是平均值±SEM)。Endo：内皮细胞；VSM：血管平滑肌细胞。比例尺：500μm(A和B中的插图)、1μm(C-E)。
图13A到D：AQP4在动脉周围星形胶质细胞中相对于在静脉周围星形胶质细胞中的表达差异。(A-B)NG2-DsRed小鼠皮层中的AQP4的免疫荧光标记。穿动脉容易通过血管平滑肌的密集性周界DsRed标记(A，空心箭头)区分，而上升静脉展现不规则的DsRed标记(B，实心箭头)。(C)血管周围终足中的AQP4免疫反应性的量化，相对于背景AQP4强度归一化。动脉周围终足对AQP4的表达显著少于毛细血管周围或静脉周围终足(*P<0.01，ANOVA；n＝24根动脉、19根静脉和43根毛细血管，来自3只动物)。(D)测量脉管壁(不包括终足)20μm内的AQP4免疫反应性时，动脉周围AQP4强度相较于毛细血管周围水平的水平显著减小(*P<0.05，t检验)。这在很大程度上受穿动脉的一种亚群(整体群组的约40％)驱动，这种亚群展现脉管周围多达50μm明显缺乏AQP4免疫反应性标记(见于A中)。
图14A到B：对间质性溶质从脑中清除的测量。(A)描绘对间质性溶质从脑实质中的清除进行测量的示意图。将3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I-淀粉状蛋白β1-40注射到纹状体中。为了量化放射性示踪剂从实质中的清除，在放射性示踪剂注射之后的t＝1小时或2小时时收集脑。溶解脑，接着通过液体闪烁计数测量总脑放射性。根据所测量的总脑放射性(RBrain)和所注射的总放射性(RInject)来计算残留的的脑放射性(R'Brain)。收集脑时，去除硬脑膜。因此，RBrain测量值不包括存在于蛛网膜下空间内的放射性示踪剂。(B)Aqp4基因缺失对实质内注射的3H聚葡萄糖-10从脑中的清除的影响。在野生型动物中，3H-甘露醇与3H-聚葡萄糖-10均按相同速率从脑中清除。这符合总体流动[与扩散(9)相比]介导的传输不依赖于分子量(4)的观察结果。类似于3H-甘露醇(图5B)，Aqp4基因缺失对3H-聚葡萄糖-10的流出有影响，明显降低了其从脑实质中清除的速率(*P<0.01，每个时间点n＝4)。
图15A到B：血管旁和间质性总体流动路径的示意图。(A)示意性描绘所提出的动脉周围星形胶质细胞终足AQP4促进动脉旁内流路径与间质性隔室之间的水总体流动的作用。由于AQP4表达较高，因此水自由越过血管周围终足。小溶质，包括荧光示踪剂TR-d3(MW3kD)，循着所产生的渗透梯度，通过重叠的终足过程之间的细胞间间隙进入间质内。大溶质，包括FITC-d2000(MW2000kD)，不能通过这个间隙并且滞留于血管旁空间中。在无Aqp4的小鼠中，血管旁空间与间质之间的水流动减少，与之同时，溶质移动到间质内。插图描绘TR-d3、FITC-d2000[dH，水化直径(9)]和终足间间隙(17)的三维尺寸。(B)详细示意图描绘所提出的星形胶质细胞AQP4维持对流性ISF总体流动和间质性溶质清除的作用。动脉旁AQP4和静脉旁AQP4允许水在动脉旁内流路径与静脉旁清除路径之间自由移动。这种对流性水流动沿着其路径扫除间质性溶质和示踪剂(例如3H-甘露醇和3H-聚葡萄糖-10)。在无Aqp4的小鼠中，血管旁空间与间质之间的水流动减少，导致间质性溶质清除失败。插图描绘3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10和终足间间隙的三维尺寸。
图16：对归一化信号强度(平均值±SD)相对于在FLASHMRI程序中以1:19稀释比率获得的翻转角作图，翻转角定义为在37℃获得的顺磁造影剂(21mM二亚乙基三胺五乙酸盐(GD-DTPA)与0.17mMGadoSpinTM)与0.9％NaCl之间的体积比。归一化通过将强度除以其跨越翻转角的最大值来达成。
图17：对纵向弛豫时间(T1)相对于稀释比作图，稀释比定义为在37℃获得的0.9％NaCl与顺磁造影剂之间的体积比(对数标度)。
图18A到J：顺磁造影剂的血管旁内流。(A)投与造影剂之前，大鼠脑中的主要解剖学结构的3D视觉显示。颜色编码已转换成灰度。解剖学结构包括脑垂体(浅蓝色)、海马体(绿色)、上丘脑(橙色)、下丘脑(深蓝色)和松果体腺体(黄色)。目视看到嗅动脉(OA)、大脑前奇动脉(azACA)、胼胝体周围奇动脉(AzPA)、中间内部额动脉(IFA)和后外侧脉络膜动脉复合体。(B)二维T1加权MRI，其中显示颜色编码的解剖学结构。(C-E)时间序列证明小分子量顺磁造影剂Gd-DTPA(MW938D)的内流较早。鞘内输注的Gd-DTPA在小脑延髓池中出现时的时间定义为‘0’分钟(C)并且内流过程的最早部分证明存在于后续时帧(D、E)中；并且展示Gd-DTPA沿着血管旁路径进入脑。(F-H)大分子量顺磁造影剂GadoSpinTM(MW200kD)较早内流的动态时间序列还展示传输到脑内是通过血管旁路径。应注意，即使两种顺磁造影剂的分子量不同，但它们显然按相似速率通过血管旁导管；证明CSF总体流动决定了这个过程。(I、J)顺磁造影剂沿着内部颈(IC)动脉、后连通(Pcom)动脉和外侧眶额动脉的血管旁传输特别明显地在威利环(CircleofWillis)层面上得到证明。
图19：从Gd-DTPA投与基底脑池和移动通过‘胶质淋巴’路径的动态显示(电影)获得的静态图像。颜色编码已转换成灰度。Gd-DTPA顺磁造影剂在电影中由绿色/蓝色表示并且每个时帧表示4.1/分钟。大鼠脑的主要解剖学结构以3D显示，包括小脑(棕色)、松果体腺体(黄色)、上丘脑(橙色)、下丘脑(红色)、脑垂体腺体(白色)和大基底动脉(红色)(电影中的颜色编码在这个静态图像中未展示)。观察到Gd-DTPA从基底脑池沿着与大脉管相关的血管旁路径移动，接着进入脑实质中并且也从脑中离开并且经由筛形板进入鼻腔中。Gd-DTPA的移动被捕获约4小时。造影剂仍未清除并且在4小时周期结束时明显存在于松果体隐窝、嗅球和基底脑池。
图20：从GadoSpinTM投与基底脑池和移动通过‘胶质淋巴’路径的动态显示(电影)获得的静态图像。颜色编码已转换成灰度。GadoSpinTM顺磁造影剂在电影中由绿色/蓝色表示并且每个时帧表示4.1/分钟。大鼠脑的主要解剖学结构以3D显示，包括小脑(棕色)、松果体腺体(黄色)、上丘脑(橙色)、下丘脑(红色)、脑垂体腺体(白色)和大基底动脉(红色)(电影中的颜色编码在这个静态图像中未展示)。类似于Gd-DTPA，GadoSpinTM也沿着血管旁导管进入胶质淋巴路径的最邻近部分中。然而，与更容易进入脑间质性空间的较小造影剂分子Gd-DTPA(MW938Da)相比，较大的GadoSpinTM分子(MW200,000Da)优先留在血管旁隔室中。
图21A到F：Gd-DTPA和GadoSpinTM沿着胶质淋巴路径传输。颜色编码已转换成灰度。示出了Gd-DTPA(蓝色实心圆圈)和GadoSpinTM(红色实心圆圈)在脑垂体隐窝(A)、松果体隐窝(B)、小脑(C)、嗅球(D)、水管(E)和脑桥核(F)中的平均时间-活性曲线(time-activitycurves；TAC)。每个所关注区域的位置展示于矢状面脑图标中，矢状面脑图标显示于每个曲线的右上角。显然，对于Gd-DTPA和GadoSpinTM(A、B)来说，造影剂在脑垂体隐窝和松果体隐窝中的吸收量在很大程度上相似。这证明了在胶质淋巴路径的邻近部分内，顺磁造影剂传输在很大程度上不依赖于分子大小。还明确的是，Gd-DTPA的组织吸收量显著高于在小脑(C)、水管(E)和脑桥核(F)中所观察到的GadoSpinTM吸收量。这证明了造影剂从蛛网膜下/邻近血管旁路径移动到脑间质并且通过脑间质实际上依赖于分子大小。数据以平均值±SEM呈现。
图22A到J：Gd-DTPA和GadoSpinTM在大鼠脑中的基于聚类的空间分布。(A)投与GadoSpinTM之前的处于水管(Aq)层面的T1加权矢状面中线切片，其显示有解剖学标志：AzACA＝大脑前奇动脉；BC＝基底脑池；BA＝基底动脉；Cb＝小脑；GA＝盖伦静脉(veinofGalen)；IFA＝中间内部额动脉；Ob＝嗅球；OA＝嗅动脉；Pin＝松果体腺体；Pit＝脑垂体腺体。(B)GadoSpinTM大鼠的聚类分析。聚类分析数据的颜色编码是以灰度展示。血管旁聚类在相应MRI上覆叠，表明红色和橙色聚类与紧邻大动脉的基底脑池、松果体隐窝以及脑垂体隐窝和组织的空间位置匹配。(C)同一GadoSpinTM大鼠的蓝色和绿色聚类的分布表明这些聚类更多位于实质。(D)所有聚类同时显示且在MRI上覆叠；血管旁导管中的红色和橙色聚类归类为‘区域1’，绿色聚类归类为‘区域2’并且蓝色聚类归类为‘区域3’。(E)投与Gd-DTPA之前的大鼠的处于水管(Aq)层面的T1加权MRI，其显示有解剖学标志。(F)显示来自Gd-DTPA大鼠的血管旁区域1聚类。(G)Gd-DTPA大鼠中的绿色和蓝色聚类分布。(H)所显示的全部四个聚类；红色、绿色和蓝色聚类分别归类为区域1、区域2和区域3。除每个聚类的体元总数之外，还显示四个聚类中的每一个在GadoSpinTM大鼠(I)和Gd-DTPA大鼠(J)中的时间-活性曲线(TAC)。
图23A到I：血管旁CSF-ISF交换的基于荧光的成像。鞘内注射小分子量荧光示踪剂(德克萨斯红-聚葡萄糖3(TexasRed-dextran3)，TR-d3；MW3kD)和大分子量荧光示踪剂(FITC-d500；MW500kD)且通过常规的和激光扫描共聚焦荧光显微镜进行活体内成像。(A、F、H)展示在注射之后30分钟(A)、60分钟(F)和180分钟(H)血管旁(箭头)CSF示踪剂内流到脑中的全切片合成图像。(B)注射后30分钟，经血管内皮标记异凝集素B4(isolectinB4；IB4)标记的冠状面切片计数。(C-D)高功率共聚焦成像展示CSF示踪剂沿着穿动脉(箭头)，而非沿着引流静脉(E)进入脑。大分子量FITC-d500仍局限于血管旁空间，而小分子量TR-d3容易移动到周围间质并且通过周围间质。(F)注射之后60分钟，小分子量TR-d3弥漫性地定位于整个脑间质中，而大分子量FITC-d500明显沿着末端毛细血管床(G)。插图描绘显示毛细血管经FITC-d500标记的程度的图像堆栈的z投影。(H)在注射后180分钟时，实质中的示踪剂含量相较于注射后30分钟及60分钟来说减少，而鞘内示踪剂沿着静脉旁清除路径(I)持续存在。
图24：通过造影剂强化型MRI评估大鼠中的CSF-ISF交换的全脑胶质淋巴路径。颜色编码已转换成灰度。通过造影剂强化型MRI评估大鼠中的CSF-ISF交换的全脑胶质淋巴路径。造影剂注射到小脑延髓池的蛛网膜下空间之后，循着特定的血管旁路径(黄色箭头)进入脑实质并且与间质性隔室(橙色箭头和视域)交换。获取动态图像系列可鉴别松果体(针)和脑垂体(凹点)隐窝处的主要CSF内流节点并且可获得偏向整个全脑中的胶质淋巴CSF-ISF交换的程度和速率的简单动力学参数。Cb：小脑；Ob：嗅球；BA：基底动脉；OA：嗅动脉。
图25A到H：评价小鼠和大鼠中的脑池内CSF示踪剂内流和清除。颜色编码已转换成灰度。脑池内注射与德克萨斯红结合的聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD；注射后t＝30分钟)之后的小鼠(A、C)和大鼠(B、D)脑的代表性前(A-B)和后(C-D)冠状面切片展示种类之间相似的示踪剂分布。(E-H)评价不同脑区域中的组织荧光：前脑(E-F)和后脑(G-H)的皮层(蓝色)、白质(灰色)、海马体(洋红色)以及皮层下结构(红色)。(F、H)量化每个区域内的平均荧光强度(*P<0.05，皮层相对于皮层下结构；##P<0.01，相对于皮层；双因素方差分析(2-wayNOVA)；每个时间点n＝3-4)。
图26A到F：分子量对腰椎鞘内注射之后示踪剂内流到脑的影响。(A-B)冠状面脑切片展示大分子量FITC结合聚葡萄糖(FITC-d500，MW500kD)和小分子量德克萨斯红结合聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD)在腰椎鞘内共注射之后120分钟的渗透情况。FITC-d500在很大程度上局限于血管旁空间(B，箭头)，而TR-d3容易从血管旁空间(A，箭头)或从表面(箭头)移动通过脑实质。(C-F)腰椎鞘内注射之后，荧光示踪剂向前脑(C-D)和后脑(E-F)内流的量化，前脑和后脑在解剖学上细分为皮层、白质、皮层下结构和海马体。(*P<0.05，*P<0.01皮层相对于皮层下结构；##P<0.01皮层相对于白质；皮层相对于海马体；双因素方差分析；每个时间点n＝3-4)。
图27A到L：CSF示踪剂在脑池内和腰椎鞘内注射之后的定位。(A-F)FITC结合聚葡萄糖(FITC-d500，MW500kD)和德克萨斯红结合聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD)在脑池内注射之后30分钟的定位。大分子量FITC-d500仍限制于围绕穿动脉(A-B)并且延伸到末端毛细血管床(C-F，箭头)层面的血管旁空间(箭头)。小分子量TR-d3快速移动到脑间质中并且被神经元亚群(箭头)吸收。(G-L)示踪剂在腰椎鞘内注射之后120分钟，大分子量FITC-d500在血管周围空间(箭头)中聚积，但未如脑池内注射之后所观察到的那样均一地聚积。小分子量TR-d3容易在整个脑实质中移动。GFAP：神经胶质肌原纤维酸性蛋白质(星形胶质细胞标记)；IB4：异凝集素B4(血管内皮标记)。
图28：Aβ40和菊糖从脑的清除随着CSF输注速率而增加。
图29A到B：Aβ40(A)和菊糖(B)从脑的清除随着CSF输注持续时间而增加。
图30A到B：在CSF输注之后的30分钟(A)和60分钟(B)，Aβ40和菊糖从脑额叶皮层的清除。
图31A到C：实验装置。A.具有梯度插件的9.4T微MRI管组件的简图。B.调谐并且匹配到400Mhz的RF鞍状线圈。C.大鼠在进入磁体中心的PET/MRI装置中期间仰卧。监视下方所示的痕迹。
图32A到F：对于评估全脑胶质淋巴传输来说，鞘内18FDG优于DTPA。(A)在PET-MRI动态成像期间接受鞘内Gd-DTPA-18FDG的大鼠的脑图像。T加权MRI上所示的Gd-DTPA分布突显了基底脑池、小脑和脑桥中的高信号强度。(B)作为对脑桥、小脑和皮层中的Gd-DTPA的反应，信号随着时间发生变化的时间活性曲线(TAC)。(C)A中所示的大鼠的相应18FDG分布图；表明18FDG活性在整个脑中的广泛分布，这在相应TAC(D)中有所反映。(E)接受鞘内18F和相应TAC(F)的大鼠，表明随着时间的过去，18F吸收局限于脑桥，而在皮层和小脑中的吸收极其有限。三种鞘内分子的TAC的差异表明18FDG的胶质淋巴传输比Gd-DTPA和18F快。在曲线B、D和F中，脑桥＝上图，小脑＝中间图，皮层＝下图。
图33A到F：在老龄化脑中，胶质淋巴血管旁CSF内流有障碍。(A)通过活体内双光子显微镜评价麻醉小鼠皮层中的血管旁CSF内流。大脑脉管系统用动脉内德克萨斯红聚葡萄糖(70kD，TR-d70)界定并且皮层动脉(箭头)和静脉(箭头)根据形态界定。脑池内注射10μl荧光CSF示踪剂(FITC结合聚葡萄糖，40kD；FITC-d40)，同时经由封闭的颅脑窗准备来使血管旁示踪剂内流可视化。(B)对血管旁CSF内流到皮层表面下方的皮层100μm进行的量化展示，相较于幼龄(2-3月龄)脑，血管旁CSF向老龄化(12个月)皮层中的内流显著减缓(*P<0.05，12个月相对于2-3个月，双因素重复测量方差分析；每组n＝4)。(C-D)CSF示踪剂当其首先沿着大脑表面动脉(C1-C6)进入皮层、接着当其移动到周围间质中时沿着贯穿性微动脉(此处是在皮层表面(D1-D6)下方100μm处成像)的代表性连续成像。(E-F)CSF示踪剂进入老龄小鼠(12个月)皮层的代表性连续成像展示，CSF示踪剂首先沿着大脑表面脉管系统(E1-E6)的血管旁空间的移动以及其向皮层间质(F1-F6)中的移动减缓。
图34A到E：老龄化脑中的全脑胶质淋巴路径功能出现障碍。通过活体内荧光成像来评价麻醉小鼠脑中的胶质淋巴路径功能。(A)将两种不同荧光CSF示踪剂(德克萨斯红结合聚葡萄糖，MW3kD，TR-d3；卵白蛋白结合ALEXA647，MW45kD，OA-647)共注射到小脑延髓池中。30分钟后，将动物灌注固定，在振荡切片机上将脑切片，并且通过双通道常规荧光显微镜对冠状面切片成像。(B)CSF示踪剂内流的量化揭露胶质淋巴路径功能的年龄相关障碍，因为相较于幼龄(2-3个月)小鼠脑，低分子量TR-d3和高分子量OA-647在老年(18个月)小鼠脑中的内流均显著减弱(*P<0.05，***P<0.001相对于2-3个月；方差分析；每组n＝5-8)。CSF示踪剂向中龄(10-12个月)脑中的内流在幼龄脑与老龄脑之间是中等的。(C-E)代表性图像展示在2-3个月(C)、10-12个月(D)和18个月(E)脑之间，荧光CSF示踪剂内流的差异展示随着年龄增长，特别是距离软膜表面越远，示踪剂内流出现明显障碍。
图35A到J：胶质淋巴路径功能的区域特异性年龄相关障碍。通过CSF示踪剂内流的活体内全切片荧光成像来评价麻醉小鼠脑中的胶质淋巴路径功能。将小分子量示踪剂(德克萨斯红结合聚葡萄糖，MW3kD，TR-d3)和大分子量示踪剂(卵白蛋白结合ALEXA647，MW45kD，OA-647)注射到小脑延髓池中，并且30分钟后将动物灌注固定。评价经核染剂DAPI对比染色的矢状面(A、C)和冠状面(B、D)切片中的荧光CSF示踪剂内流。对CSF示踪剂跨越全脑的内流的评估揭露，除老龄脑中的各区域之间对年龄相关胶质淋巴路径失效的敏感性不同之外，幼龄脑内的各区域之间存在CSF内流的差异。(E-J)前脑(E)和后脑(H)均分成所关注的总体区域并且根据区域来评价OA-647内流。一般来说，相较于幼龄(2-3个月)皮层，老龄(18个月)皮层中的胶质淋巴路径功能发生最显著的减弱，其中相较于前部皮层(F)，后部皮层(I)中观察到更大的衰减(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相对于2-3个月，方差分析；每组n＝4)。相比之下，胶质淋巴CSF向皮层下区域中的内流相对小于在皮层中所观察到的内流，同时这些皮层下区域内的年龄相关障碍类似地发生静默(G、J)。
图36A-B：间质性淀粉状蛋白β在老龄脑中的清除受到阻碍。通过放射性示踪剂清除分析来评价间质性溶质从老龄化脑中的清除。(A)将痕量的放射性标记125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖共注射到幼龄(2-3个月)、中龄(10-12个月)和老龄(18个月)麻醉小鼠的尾状核中。1小时后，将动物处死，收集脑，并且通过γ粒子计数和液体闪烁计数来量化脑组织内的残余放射性。(B)在老龄脑中，相较于幼龄脑中的清除，125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖的清除均显著减缓(***P<0.001相对于幼龄，方差分析；每组n＝8)。在幼龄与老龄脑之间，125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖从中龄脑中的清除是中等的。
图37A到E：老龄化脑中的大脑动脉脉动减少。通过活体内双光子显微镜评价麻醉小鼠中的大脑血管脉动。(A-B)大脑脉管系统通过动脉内注射荧光德克萨斯红结合聚葡萄糖(70kD)来可视化。大脑表面动脉和静脉(A)以及穿动脉和上升静脉(B)根据形态来鉴别。(B)中的插图展示实验中所成像的XYZ体积的正交XZ和YZ投影。(C-D)大脑表面动脉和静脉、穿动脉和上升静脉通过高频行扫描来鉴别和成像。所得X-t(时间)图加以阈值化以改进对比度，从而可测量每次心搏循环所引起的脉管直径变化。对血管直径在3秒间隔期间的变化关于平均脉管直径进行积分，以定义称为血管‘脉动性’的参数。(E)相较于幼龄(2-3个月)脑(每组n＝2-4)，老龄(18个月)脑的穿动脉中所测量的脉动性降低。在大脑血管树的其它元素中未观察到明显的差异。
图38A到D：老龄化不改变皮层细胞外体积分率，但的确改变曲折度。通过活体内四甲基氨电生理学评价清醒和麻醉皮层活体内的扩散参数(细胞外体积分率α；曲折度λ)(也参见谢(Xie)等人，科学(Science)2013)。(A-B)老龄脑(18个月)和幼龄脑(2-3个月)之间未观察到细胞外体积分率差异(A)；而在老龄化脑中，睡眠脑相对于清醒脑中的细胞外空间的明显扩大保持不变(B)(***P<0.001，清醒相对于睡眠，双因素方差分析，每组n＝9-20)。(C-D)虽然未注意到老龄皮层相对于幼龄皮层存在清醒或睡眠曲折度的整体差异(C)，但在老龄化脑中观察到睡眠-清醒关系在曲折度数值上的变化(D)。在幼龄脑中，清醒状态与睡眠状态之间的曲折度数值并无不同。相比之下，在老龄化脑中，睡眠开始伴随着细胞外曲折度的显著提高(***P<0.001清醒相对于睡眠，双因素方差分析，每组n＝9-20)。
图39A到F：老龄化脑中所变化的血管周围AQP4表达。通过免疫荧光双重标记、随后通过激光扫描共聚焦显微镜来评价皮层AQP4和GFAP表达的变化。(A-B)代表性图像展示，在幼龄脑(2-3个月)中，AQP4表达几乎完全局限于血管周围星形胶质细胞终足(箭头)。在老龄化皮层(18个月)中，AQP4定位转移而包括不严格位于血管周围的细微星形胶质细胞过程(箭头)。(C)终足域中AQP4表达的量化展示，在老龄化脑中，在大脑大脉管周围观察到血管周围AQP4表达稍微降低，但大脑毛细血管周围则不然(*P<0.05，18个月相对于2-3个月，t检验；每组n＝4)。(D)相比之下，老龄化脑中的AQP4定位显著转移。在幼龄脑中，AQP4极化极其显著，在血管周围终足中仅保留低水平的AQP4表达。在老龄化脑中，总体AQP4表达稍微增加，而直接围绕大脑大脉管的区域展现剧烈增加的AQP4。因此，在老龄化脑中，大脑大脉管周围的AQP4失去其严格的血管周围极化，而微血管极化在很大程度上保持完整。(E)未观察到反应性星形胶质化的标记GFAP具有这种特异性。在老龄化脑中，大脑大脉管周围与大脑微脉管周围的血管周围GFAP表达均显著升高(***P<0.001，18个月相对于2-3个月，t检验；每组n＝4)。(F)类似地，当根据空间评价GFAP表达时，在整个皮层中全面地观察到GFAP表达增加，并且未观察到大脉管与微脉管之间存在GFAP表达的差异。
图40A到C：AQP4表达和极化的区域性差异。通过免疫荧光双重标记、激光扫描共聚焦显微镜和先前定义的图像分析方法(王(Wang)等人，神经科学杂志(JNeurosci)2012；任(Ren)等人，脑血流和代谢杂志(JCerebBloodFlowMetab)2013)，评价AQP4表达(A)、AQP4极化(B)和GFAP表达(C)在前脑切片和后脑切片内的整个所关注定义区域中的变化。(A)颜色强度图描绘2-3个月和18个月脑的区域性平均AQP4免疫荧光强度。量化每个区域中的AQP4表达时，未注意到幼龄脑与老龄脑之间存在AQP4表达的显著变化。(B)AQP4“去极化”定义为其中AQP4免疫荧光等于或大于血管周围AQP4免疫反应性的组织区域(较详细描述提供于任等人，脑血流和代谢杂志2013中)。因此，较高数值反映血管周围AQP4极化的丧失，或AQP4“去极化”。如颜色强度图中所示，AQP4极化的明显丧失出现于老龄化脑中。极化显著丧失在整个皮层和皮层下结构中是明显的(*P<0.05，**P<0.01相对于2-3个月；双因素方差分析；每组n＝4)。(C)根据GFAP阳性星形胶质细胞过程的区域覆盖率来评价GFAP表达。颜色强度图展示老龄化脑中的GFAP覆盖率增加。这些变化在皮层中最显著，但在皮层下结构中也观察到(*P<0.05，**P<0.01相对于2-3个月；双因素方差分析；每组n＝4)。
图41A到J：AQP4极化是皮层胶质淋巴路径功能的主要决定因素。评价不同前脑和后脑区域中的反应性星形胶质化(GFAP表达)、AQP4表达、AQP4极化和胶质淋巴路径功能(脑池内注射的CSF示踪剂的内流)之间的相互关系。向动物脑池内注射卵白蛋白结合ALEXA-647(OA-647，MW45kD)。30分钟后，将动物固定，并且将脑切片。前脑和后脑切片通过AQP4和GFAP的免疫荧光双重标记法加以标记。评价整个前脑和后脑的不同所关注区域中的OA-647内流(A)、AQP4表达(B)、AQP4去极化(C)和GFAP表达(D)。(A-D)颜色强度图描绘2-3月龄与18月龄之间的胶质淋巴OA-647内流、AQP4表达、AQP4去极化和GFAP表达的相对增加(红色数值)相对于减少(蓝色数值)。在上述图40A到C中，数据图形表示以柱形呈现。(E-I)评价每个区域中的AQP4表达、AQP4去极化和GFAP表达之间的关系，评价汇集2-3月和18月的数值，接着对成对的OA-647/AQP4表达、OA-647/AQP4去极化和OA-647/GFAP表达数值进行线性回归分析。最强相关性用趋势线描绘于每个图中，并且提供相应r2和P值(对于非零斜率)。(E)在皮层中，AQP4极化的变化与胶质淋巴路径功能最强烈相关，其中AQP4极化的丧失强烈对应于胶质淋巴CSF示踪剂内流的减弱。(F)在海马体内，胶质淋巴路径功能、AQP4表达、AQP4极化或GFAP表达之间的较强相关性不明显。(G-J)在纹状体、外侧隔核、丘脑和下丘脑内，AQP4表达(未极化)与胶质淋巴路径功能最强烈相关。有趣的是，这是正相关的，在这些区域内，增加的AQP4表达与增加的胶质淋巴CSF内流相关。这些数据表明，血管周围AQP4极化是大脑皮层中的血管旁CSF内流的主要决定因素，而在皮层下组织中，总体AQP4表达可以是胶质淋巴路径功能的更重要决定因素。
图42A到F：创伤性脑损伤(TBI)导致AQP4血管周围星形胶质细胞终足的极化定位丧失。(A)描绘小鼠中度TBI模型的示意图。用异氟烷使小鼠短暂麻醉，用细绳通过其门牙悬挂，并且通过气动控制的皮层撞击装置传递经校准的颞叶撞击。动物落在下伏垫上并且从麻醉中快速醒来。(B-F)TBI之后28天，通过免疫荧光双重标记和激光扫描共聚焦显微镜来评价AQP4定位和GFAP表达。如全切片合成图像(B-C)中所示，持久反应性星形胶质化在TBI之后的第28天仍存在于同侧颞叶皮层中。在高倍物镜下评价AQP4定位时，TBI之后，AQP4极化无明显变化是显而易见的(将对照皮层(D)与对侧皮层比较时)，原因是AQP4定位主要局限于血管周围的星形胶质细胞终足(箭头)。在同侧皮层(F)中，GFAP阳性反应性星形胶质细胞展现AQP4极化的深度丧失，其中AQP4表达均匀分布于细微过程与那些周围大脑脉管(箭头)之间。这些结果表明TBI导致血管周围AQP4极化的长期丧失。
图43A到J：TBI之后，胶质淋巴对间质性溶质的清除长期减弱。(A)通过在TBI之后的第1、3、7和28天脑池内注射CSF示踪剂(卵白蛋白结合ALEXA-555)来评价血管旁CSF-ISF交换。(B-F)活体内全切片荧光成像展示，TBI之后第7天，注射后30分钟所评价的血管旁CSF内流显著减少。有趣的是，虽然是单侧创伤性损伤，但在两侧均观察到胶质淋巴内流减少。对示踪剂向皮层(G)内流的量化展示，TBI对CSF内流的影响在损伤后第7天达到最高，然而胶质淋巴功能的显著减弱在损伤之后的第28天仍存在(*P<0.05，**P<0.01相对于对照；#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析，每组n＝5-12个动物)。虽然观察到皮层两侧出现CSF内流减弱，但同侧皮层中的减弱程度最大。(H)损伤后第7天评价TBI对间质性溶质从皮层中清除的影响。放射性标记的3H-甘露醇(MW182Da)(I)和14C-菊糖(MW约5kDa)(J)输注到对侧额叶皮层中之后60分钟，测量其清除率。在野生型小鼠中，TBI显著减缓3H-甘露醇与14C-菊糖的清除(#P<0.05，###P<0.001相对于模拟组；双因素方差分析，每组n＝6个动物)。对Aqp4-/-小鼠进行的清除研究表明，Aqp4基因缺失使TBI之后的溶质清除减弱加剧(*P<0.05，***P<0.001相对于野生型；双因素方差分析，每组n＝6个动物)。这些数据表明，胶质淋巴路径功能，包括间质性溶质清除，在TBI之后发生深度并且长期的减弱。
图44A到E：间质性τ沿着血管旁路径从脑中清除。(A)将重组人类单体τ(hTau)注射到NG2-DsRed转基因小鼠的皮层中，其大脑血管平滑肌和周细胞表达DsRed荧光蛋白质。(B-E)注射后30分钟，通过免疫荧光，随后通过激光扫描共聚焦显微镜来评价间质性hTau通过脑的移动。hTau从注射部位(B)弥漫性地移动，沿着毛细血管基底薄层(C)聚积。荧光强度投影描绘hTau在这些空间中相对于在周围间质性隔室中的聚积。(D-E)注射后30分钟，hTau快速移动通过脑间质到达第3脑室顶部围绕大口径内部大脑静脉的血管旁空间。这些数据表明可溶性间质性τ沿着全脑胶质淋巴系统的血管旁路径从脑中清除。
图45A到C：AQP4免疫反应性在Aqp4-/-小鼠中是不存在的。为了确保本研究中所用抗AQP4一级抗体的特异性，损伤之后第7天，我们对所灌注的Aqp4-/-小鼠的对照脑和经TBI处理的脑进行免疫标记。虽然GFAP表达在对照(A)、对侧TBI(B)和同侧TBI(C)皮层中是容易检测的，但AQP4免疫反应性却检测不到。
图46A到C：Aqp4基因缺失不改变TBI病灶体积。TBI之后第28天，评价所收集的脑中的Aqp4基因缺失对创伤性病灶体积的影响。(A-B)对脑连续切片并且通过苏木素伊红染色(H&Estaining)评价脑结构。红色箭头表示创伤性撞击部位和最大皮层损伤区域。测量每个切片中的同侧和对侧皮层区域，接着对连续切片进行积分以推导皮层体积。皮层体积以相对于对侧体积(C)的比率表示。在野生型与Aqp4-/-小鼠之间，未观察到同侧病灶体积出现显著性差异。
图47A到F：Aqp4基因缺失在TBI之后加剧τ蛋白质病变的发展。评价Aqp4基因缺失使胶质淋巴路径功能减弱对TBI之后τ蛋白质病变发展的影响。(A)损伤后第28天收集野生型和Aqp4-/-脑并且探测磷酸化τ(P-τ)抗原决定基的存在。呈现的代表性印迹展示小鼠基因型(野生型相对于Aqp4-/-)、损伤状态(模拟组相对于TBI)和半球(对侧(C)相对于同侧(I))对通过靶向不同τ磷酸化抗原决定基的各种P-τ单株抗体标记的影响。还测量总τ(Pan-τ)并且所有P-τ含量相对于每个生物样品内的P-τ含量归一化。(B-F)在所有抗原决定基中，TBI倾向于增加P-τ标记，特别是在同侧。类似地，相较于TBI之后的野生型小鼠，TBI之后的Aqp4-/-小鼠中的标记倾向于更强。具体来说，相较于野生型动物，所寄存的识别pThr231和pSer396P-τ抗原决定基的抗体使Aqp4-/-小鼠中的P-τ标记显著增加(相对于Aqp4-/-模拟组，相对于野生型TBI；*P<0.05相对于野生型模拟组；#P<0.05相对于对侧结构；单因素方差分析；每组n＝4个动物)。这些数据表明当胶质淋巴路径功能的减弱超过在单独TBI情况下所见时，促进长期的τ聚集。
图48A到F：在TBI之后，胶质淋巴路径功能的减弱促进τ聚集。(A)评价Aqp4基因缺失使胶质淋巴路径功能减弱对TBI之后τ蛋白质病变发展的影响。使野生型和Aqp4-/-小鼠经受TBI并且损伤后第28天，通过免疫荧光和西方印迹(呈现于图47A到图47F中)评价磷酸化τ(P-τ)的聚积。(B-D)用AT8P-τ抗体(特异性针对pSer202/pThr205抗原决定基)和神经元标记NeuN进行的双重标记展示，在野生型皮层中，未观察到P-τ免疫反应性。在Aqp4-/-皮层中，观察到明显的P-τ标记，均位于神经元胞体(箭头)和周围神经突(箭头)中。(E-F)对P-τ染色的量化揭露，在TBI之后的第28天，Aqp4-/-小鼠的同侧皮层内存在明显的P-τ免疫反应性，而下伏纹状体中的P-τ免疫反应性较小。这些数据表明，TBI之后的胶质淋巴路径功能的减弱促进τ聚集和P-τ沉积发生于神经元内和神经外。
图49A到L：减弱的胶质淋巴路径功能维持TBI之后的神经炎症。评价Aqp4基因缺失对TBI之后的神经炎症持久性的影响。(A-F)使野生型和Aqp4-/-小鼠经受TBI并且损伤后第28天，通过免疫荧光来评价反应性星形胶质化(GFAP表达)和小胶质细胞增生(Iba1表达)。GFAP免疫反应性和Iba1免疫反应性明显升高仅在TBI之后的Aqp4-/-小鼠的同侧皮层中观察到。(G-H)GFAP标记的量化表明Aqp4-/-小鼠而非野生型小鼠的皮层和下伏纹状体中的反应性星形胶质化显著增加(*P<0.05，**P<0.01相对于野生型；#P<0.05，##P<0.01相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4个动物)。(I)在海马体中未观察到GFAP免疫反应性的差异。(J-K)Iba1标记的量化展示小胶质活化在Aqp4-/-小鼠的同侧皮层和纹状体中持久存在，但在损伤后28天内的野生型小鼠中消退(#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4个动物)。(L)在野生型和Aqp4-/-小鼠的海马体的CA3区域中观察到Iba1标记增加(#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4个动物)
图50A到E：Aqp4基因缺失加剧创伤性后认知障碍。(A)评价损害胶质淋巴路径对经受TBI的野生型和Aqp4-/-小鼠的创伤性后认知缺陷的影响。损伤之前的第2天，接着在TBI之后每周对动物进行基线行为测试。(B)通过旷场试验来评估粗大运动行为。TBI并不改变野生型或Aqp4-/-小鼠在旷场试验中的表现。(C)通过旋杆试验来评价运动协调性和学习力。虽然TBI并不显著减弱野生型动物的旋杆表现，但TBI显著减弱Aqp4-/-小鼠的试验表现(*P<0.05Aqp4-/-模拟组相对于Aqp4-/-TBI；双因素重复测量方差分析，每组n＝9-14个动物)。利用新物体识别试验(D)和巴尔内斯迷宫试验(Barnesmazetest)(E)来评价认知功能。在两项试验中，TBI减弱野生型小鼠和Aqp4-/-小鼠的认知表现(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001TBI相对于模拟组；双因素重复测量方差分析，每组n＝9-14个动物)。相较于野生型动物，创伤后认知障碍在Aqp4-/-小鼠中加剧(**P<0.01野生型TBI相对于Aqp4-/-TBI；双因素重复测量方差分析；每组n＝9-14个)。
图51A到D：作为血管周围AQP4极化的决定因素的AQP4-M1变异体。(A)Aqp4基因具有两个转录起始位点，其中在每个位点起始的转录产生两种AQP4mRNA变异体：包括Aqp4基因的外显子0-4的AQP4-M1和缺乏外显子0的AQP4-M23。(B)AQP4-M23(在生理条件下，在CNS中是主要形式)允许血管周围AQP4堆积，而AQP4-M1却妨碍其；因此，增强的AQP4-M1表达使AQP4极化减弱(克雷恩(Crane)等人，生物化学杂志(JBiolChem)2009；弗曼(Furman)等人，国家科学院学报(ProcNatAcadSci)2003)。(C)TBI之后第3天，使用特异性靶向AQP4-M1转录物的外显子0的PCR引子、通过实时定量PCR(qPCR)来评价AQP4-M1在小鼠同侧皮层中的表达。相较于AQP4-M1在对照组(模拟组)皮层中的表达，TBI使AQP4-M1表达增加约两倍(*P<0.05，t检验；每组n＝5)。(D)使用靶向AQP4-M1变异体的外显子0的基于siRNA的方法，可有效降低AQP4-M1在所培养的小鼠皮层初级星形胶质细胞中的表达。设计三种siRNA双螺旋体以靶向AQP4-M1转录物的外显子0，并且用这些siRNA双螺旋体将小鼠初级星形胶质细胞转染六天。siRNA处理之后，通过qPCR评价AQP4-M1表达，其展示靶向外显子0的siRNA有效降低AQP4-M1(###P<0.001，siAQP4-M1相对于对照，单因素方差分析；n＝3)。Aqp4基因启动子的计算机模拟筛选揭露出AQP4-M1转录起始位点上游的转录因子信号转导子和转录激活子(STAT)-3存在两个结合位点。因此，我们测试小鼠皮层初级星形胶质细胞中的STAT3信号传导的抑制是否能减少AQP4-M1表达。STAT3特异性抑制剂STATTIC处理初级星形胶质细胞使AQP4-M1表达显著减少(**P<0.01STATTIC相对于对照组，单因素方差分析；n＝3)。这些数据表明TBI之后的AQP4-M1表达增加，但是通过靶向AQP4-M1转录物的siRNA或通过星形胶质细胞中的STAT3抑制可以减少AQP4-M1表达。这些结果符合如下观点：脑损伤之后的AQP4极化丧失可通过这些途径阻止。
图52A到E：弥漫性缺血损伤之后，胶质淋巴路径功能减弱。使用具有多个微小梗塞的小鼠模型(王M.等人(M.Wangetal.)，具有多个微小梗塞的小鼠模型的认知缺陷和延迟的神经元丧失(CognitiveDeficitsandDelayedNeuronalLossinaMouseModelofMultipleMicroinfarcts)，神经科学杂志，2012年12月12日，32(50):17948-17960)，通过活体内双光子成像来评价弥漫性缺血损伤的影响。(A)使动物经受弥漫性缺血损伤。3天后，经由封闭的颅脑窗、通过对脑池内注射的荧光CSF示踪剂(德克萨斯红结合聚葡萄糖，MW70kD)向大脑皮层中的内流进行成像来评价胶质淋巴路径功能。(B-D)在皮层表面下方100μm获得的代表性双光子图像展示荧光CSF示踪剂在脑池内注射之后20分钟移动到皮层实质内。(E)损伤后第3天通过连续双光子成像对皮层表面下方100μm处荧光强度的量化展示，在对照动物中，CSF示踪剂快速进入皮层，在注射20分钟内达到峰值。在同侧皮层中，CSF示踪剂内流几乎消除，同时甚至在对侧皮层中，CSF示踪剂内流明显减弱。这些数据表明，导致血管周围AQP4极化丧失(王(Wang)等人，神经科学杂志2012)的弥漫性缺血损伤，也显著减弱胶质淋巴路径功能。
图53A到B：使用具有多个微小梗塞的小鼠模型，通过全切片荧光成像来评价弥漫性缺血损伤的影响。(A)在对照脑中，CSF示踪剂沿着血管旁空间快速移动到脑实质内。(B)弥漫性缺血损伤之后，CSF向脑中的内流显著减少。就同侧来说，CSF向实质中的移动几乎消除。在对侧半球中，虽然存在血管旁CSF内流，但与周围间质性空间交换的速率和程度显著降低。详见实例6.6。
图54：用于产生血管紧张素和活性代谢物的级联。ACE是血管紧张素转化酶。NEP是脑啡肽酶(neprilysin)。ATIR和AT2R分别是血管紧张素受体1和血管紧张素受体2。
图55A到B：Aβ(A)和菊糖(B)从脑中的清除在血管紧张素II(1μM)存在下减少并且在洛沙坦(1μM；AT1R抑制剂)存在下增加。每个图中的条柱1(第一，从左到右)、每个图中的条柱2(血管紧张素II)和每个图中的条柱3(洛沙坦)。*P<0.05，相较于对照。
图56A到B：Aβ(A)和菊糖(B)在血管紧张素II(1μM，每个图中的条柱2)、注射到小脑延髓池中的洛沙坦(1μM)(每个图中的条柱3)和腹膜内(IP)注射的洛沙坦(Img)(每个图中的第四个条柱)存在下的脑内流情况。每个图中的条柱1(第一，从左到右)(对照)。
图57：Aβ和菊糖从脑中的清除在血管加压素(1μM)存在下减少。每组条形图中的条柱1(左)(对照)。每组条形图中的条柱2(右)(血管加压素)。
图58：Aβ和菊糖从脑中的清除在心房利钠肽(atrialnatriureticpeptide；ANP)(1μM)存在下减少。每组条形图中的条柱1(左)(对照)。每组条形图中的条柱2(右)(心房利钠肽，ANP)。
图59：Aβ从脑中的清除在血管紧张素(1-7)存在下按剂量依赖性方式增加。血管紧张素(1-7)的剂量(从左到右)：1μM(条柱1)、0.1μM(条柱2)和0.01μM(条柱3)。条柱4(对照)。*P<0.05，相较于最高剂量。
图60：Aβ从脑中的清除在血管紧张素(1-7)存在下、在15分钟时按剂量依赖性方式增加(在1nM(左列)和10nM(右列)下)。*P<0.05，比较两种剂量。
图61：Aβ和菊糖从脑中的清除在A779(血管紧张素(1-7)的抑制剂，其阻断血管紧张素(1-7)的影响)存在下减少。这些数值与对照的差异不显著。
图62：剂量依赖性对Aβ和菊糖清除的影响。
图63：剂量依赖性对Aβ和菊糖内流的影响。
图64：Aβ从大脑皮层中的清除在CSF从小脑延髓池引流的情况下减少。条柱1：左(CSF引流)，条柱2：右(对照)。
图65：Aβ从脑中的清除在睡眠剥夺的情况下减少。条柱1：左(睡眠剥夺)。条柱2：右(对照)。N＝3。
具体实施方式
为了公开内容清楚起见，并且不为了限制，本发明的具体实施方式分成下文所述的分章节。
5.1.测量脑中的胶质血管路径(胶质淋巴系统)功能的方法
提供一种方法用于测量哺乳动物脑和/或脊髓(或统称为中枢神经系统或“CNS”)中的胶质血管路径(在本文中也被称作“胶质淋巴系统”)功能。在一个实施例中，所述方法包含以下步骤：
对中枢神经系统进行成像；和
测量中枢神经系统中的CSF-ISF交换，由此测量哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴功能。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物是需要治疗的患者或个体。在其它实施例中，哺乳动物可以是家养动物(例如猫、狗、猪、绵羊、牛、马和山羊)或外来哺乳动物(例如动物园哺乳动物)。
在一个实施例中，所述方法进一步包含在对中枢神经系统进行成像的步骤之前投与成像剂(在本文中也被称作示踪剂)或造影剂的步骤。
所述方法利用成像可以用于追踪CSF与ISF隔室之间的交换。成像技术优选地追踪与脑和脊髓外部的其它交换分开的这种交换过程。因此，成像剂或示踪剂优选地不存在于身体的周边(全身性)隔室中。
在一个优选实施例中，鞘内投与成像剂。在所述方法的另一个实施例中，鞘内投与成像剂的步骤包含腰椎或脑池内鞘内注射投与成像剂的步骤。鞘内投与成像剂在所属领域中是众所周知的。
在所述方法的另一个实施例中，成像(或造影)剂可以鼻内或经眼(例如经由滴眼剂施加于眼)投与。
在其它具体实例中，成像(或造影)剂可以和实质内或脑室内输注的药物共投与。这些共投药方法在所属领域中是众所周知的。
在所述方法的另一个实施例中，对中枢神经系统进行成像的步骤包含对中枢神经系统进行动态或造影剂强化磁共振成像(MRI)的步骤。成像剂可以是负或正(顺磁)造影剂。对哺乳动物的脑和脊髓(包括人类和非人类灵长类动物的脑和脊髓)进行成像的MRI方法在所属领域中是众所周知的。
在所述方法的另一个实施例中，成像剂是正电子发射放射性核素示踪剂，并且对中枢神经系统进行成像的步骤包含对脑和/或脊髓进行正电子发射断层摄影术(PET)扫描以追踪示踪剂的CSF-ISF交换的步骤。适用于对哺乳动物脑和脊髓成像的PET扫描方案在所属领域中是众所周知的。PET扫描方案可以在优化的扫描条件下追踪示踪剂移动，扫描条件可以使用所属领域中的常规方法优化。
在所述方法的一个具体实施例(其中使用PET扫描作为成像方法)中，在PET扫描期间可以调节个体或患者所用的初始床位置，以便只有注射部位看不到。这使看到示踪剂移动的能力最大化。注射之后，优选的是屏蔽注射部位以减少随机背景发射。
在所述方法的另一个实施例中，对中枢神经系统进行成像的步骤包含投与至少两种不同磁性造影剂。不同磁性造影剂可以在它们对T1(顺磁)或T2(负造影剂)的影响方面进行匹配，以便可以比较它们在中枢神经系统组织中的动力学特征。在一个具体实施例中，使用下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的方法比较或分析动力学特征。
在另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含测量或监视可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ、纳米粒子(例如功能化或治疗性纳米粒子)、化学治疗剂、治疗上投与的毒性产品、小干扰RNA(siRNA)、α突触核蛋白、小分子药物、病毒载体、抗体类治疗剂、脂质体或治疗性RNA构筑体(略举数例)的清除率。在某些实施例中，可以使用下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的分析技术。
在另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含分析顺磁或负造影剂在中枢神经系统中的内流动力学、实质分布和/或清除。在某些实施例中，可以使用下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的分析技术。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含测量脑垂体隐窝、松果体腺体隐窝、小脑和/或嗅球处的CSF-ISF交换。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤。此类数据分析可以如下文实例(实例1到实例3)中所公开的那样进行。
在所述方法的另一个实施例中，对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤包含分别测量T1缩短或T2变化的步骤。实例2公开测量T1缩短和/或T2变化的方法。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含计算内流动力学参数的步骤，其中内流动力学参数反映CSF-ISF交换的速率。
在所述方法的另一个实施例中，测量CSF-ISF交换的步骤包含根据静态造影剂强化MRI或PET图像计算动力学参数的单一步骤，其中动力学参数反映CSF-ISF交换的速率。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含计算哺乳动物出现神经退化性疾病的风险的步骤。神经退化性疾病可以是例如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症或慢性创伤性脑病变。
计算出现神经退化性疾病的风险的方法在所属领域中是众所周知的。举例来说，可以使用所属领域中已知的诊断性试验，例如关于APOE4等位基因运载状态或CSF生物标记状态(例如淀粉状蛋白β、τ、α突触核蛋白)的诊断性试验。
在所述方法的另一个实施例中，哺乳动物罹患创伤性脑损伤。在这种情况下，所述方法可以进一步包含使用所属领域中众所周知的方法计算出现慢性创伤性脑病变(chronictraumaticencephalopathy；CTE)的风险的步骤。
在所述方法的一个具体实施例(也描述于实例2中)中，使用所属领域中已知的适合手术方法将投与(例如注射)至少一种造影剂的鞘内导管插入哺乳动物患者(或个体)中。优选的是，使用腰椎鞘内插入导管和注射造影剂。在某些实施例中，可以使用其它投药途径，例如脑池内、脑室或实质内插入和注射。手术之后，患者可以定位于头部固定装置用于MRI成像。可以将MRI兼容性无创监视器(例如脉冲-血氧测定、呼吸速率和直肠温度探针)定位，以便在个体经历MRI成像的同时连续监视生命体征。在成像期间，优选的是例如使用电脑辅助式空气加热系统密切监视和维持体温。鞘内导管可以连接到用稀释于生理盐水中的两种顺磁MR造影剂填充的管线(例如PE20)并且附接到注射器和微输注泵。水化和补充性麻醉可以根据所属领域中已知的方法进行。
为了通过造影剂强化MRI使胶质淋巴路径可视化，可以使两种不同顺磁造影剂在初始浓度下的T1缩短效应匹配，使得在远离注射部位的脑组织中随着时间产生的浓度递减是类似的。优选的是使两种顺磁造影剂所诱导的T1效应匹配，因为它们注射到小脑延髓池中之后，它们将经由全脑胶质淋巴路径行进并且随着时间而逐渐稀释。
MRI成像可以使用与控制装置(例如通过Paravision5.0软件控制的控制台)连接的MRI仪器(布鲁克生物磁旋仪器公司，比勒利卡，马萨诸塞州(BrukerBioSpin,Billerica,MA))进行。表面射频线圈可以用作接收器并且容积线圈可以用作发射器。定位器解剖学搜索扫描之后，在矢状面或冠状面中获得3DT1加权FLASH序列(TR＝15msec，TE＝3.4ms，翻转角15°，NA＝1，FOV＝3.0×3.0×3.2cm，扫描时间＝4分钟5秒，采集矩阵大小为256×128×128(相对于256×256×256内插而得)，产生0.12×0.12×0.13mm的图像分辨率)。
图像强度可以使用所属领域中已知的方法相对于时间序列归一化。扫描方案可以由以下组成：例如三次基线扫描，随后经由留置导管鞘内传递两种造影剂(顺磁造影剂)，同时MRI采集继续进行。顺磁造影剂可以按适合的输注速率和适合时间鞘内传递，如使用所属领域中已知的方法测定。鞘内输注完成之后，3DMRI采集可以持续所希望的时间长度，如通过所属领域中已知的方法测定。
可以执行通用MRI图像处理程序，例如头部运动校正、强度归一化、平滑化和逐体元向基线信号％的换算。所采集的T1加权MRI图像可以作为DICOM文档形式输出并且转换成3DNIfti图像格式。
头部移动所造成的扫描到扫描图像重合失调可以通过每次扫描的刚体对齐、相对于时间平均化(平均)图像来校正。
可以通过使用以下表达式将体元强度除以参考模拟物的平均强度、相对于时间序列来将图像强度归一化：图像_归一化＝图像_原始/模拟物*1000；随后进行0.1mm半高全宽各向同性高斯平滑化(Gaussiansmoothing)。
接着可以使用以下表达式减去所有时间序列图像并且除以基线平均图像：(P(I,j,k)＝(I(I,j,k)-基线(I,j,k))/基线(I,j,k)*100)，以确保体元强度代表相对于平均基线图像的变化百分比。
对T1加权MRI在预选定的解剖学区域中随着时间测量的信号变化可以用于获得顺磁造影剂的区域性组织吸收量的时间‘活性’曲线(TACs)。T1加权平均化基线图像以及造影剂强化T1加权MRI可以用于在解剖学上引导所关注区域(ROI)的定位。根据近中线矢状面MRI，可以绘制出每个半球的四个矢状面切片上的ROI并且来自每一解剖学ROI的信号可以使用PMOD软件(PMOD3.307版，瑞士苏黎士普茂技术有限公司(PMODTechnologies,Ltd,Zurich,Switzerland)平均化。ROI可以包括例如脑垂体隐窝、松果体隐窝、嗅球、小脑、脑桥核和/或水管。每个ROI的TAC可以借助PKMod模块提取。每个ROI的TAC的曲线下面积(AUC)可以使用‘梯形法则’计算(更多详情，参见实例2)。计算出的AUC可以通过将每一个体的AUC除以特定研究所用的相应时间区间的数目来归一化，称为‘平均曲线下面积(mAUC)’，计算如下：(mAUC＝AUC/(n-1))。此外，为了使传递到群组内每一个体或患者的顺磁造影剂的量的潜在差异最小化，可以使用脑垂体隐窝(其代表造影剂的主要输入端和来源)的mAUC来使其它区域mAUC归一化。随后，可以使用双侧独立t检验来比较各组或个体之间的每一解剖学部位的平均mAUC比率。
可以进行聚类分析以基于类似动力学对MRI图像中的非参数分段到组体元进行分析，可以在水管层面、根据每一4DT1加权MRI、使用k均值聚类算法(PMOD3.307版，瑞士苏黎士普茂技术有限公司)进行。可以产生只含有脑的所关注容积罩用于聚类分析。所用聚类数(K)是由能够区分大脉管(例如基底动脉(包括脑垂体隐窝)和嗅动脉复合体)邻近体元的K确定。这是在交互式、全动物基础上进行的。每项分析使用50％百分位阈值(亦即仅50％的具有最高信号变化的像素)进行(使用TAC值平方的和)。使血管旁内流管道得到最理想可视化的聚类数是4个聚类。目测检查四个聚类并且与对应的造影剂强化和解剖学MRI共寄存以验证与大脉管相关的聚类的位置。提取每个聚类的体元和TAC数目用于进一步处理。
统计分析可以使用所属领域中已知的方法进行，例如使用统计软件包，例如SAS9.2版(美国赛仕研究所有限公司(SASInstituteInc,USA)和XLSTAT2011版(美国纽约埃鼎软件公司(Addinsoft,NY,USA))，其中p值<0.05描述为显著差异。所有数据均可以平均值±SD呈现。区域性组织吸收率(例如由所关注之解剖学区域的平均‘曲线下面积’(mAUC)与脑垂体隐窝的平均mAUC之间的平均比率所表示)的差异可以使用独立组双侧t检验来比较。
在一个实施例中，可以根据K均值聚类分析推导出以下参数：1)三个解剖学区域中的每一个的体元总数；2)每个区域的时间加权聚类数目(体元数*AUC)；以及3)区域2和区域3的总时间加权聚类数目与区域1的时间加权聚类数目的比率。这些参数中的每一个的平均值差异可以使用独立组双侧t检验、根据比较组或个体之间的聚类分析加以推导。
5.2.治疗神经退化性疾病发作的方法
提供一种治疗哺乳动物脑和/或脊髓(或CNS)的神经退化性疾病发作的方法，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤。
在所述方法的一个实施例中，反应性神经胶质增生减少，由此延迟或预防神经退化性疾病的发作。反应性神经胶质增生减少或妨碍间质性废弃物清除。反应性神经胶质增生在所属领域中已知与神经退化性疾病(例如阿尔茨海默病)相关。在老龄哺乳动物脑中也观察到增强的神经胶质增生。反应性神经胶质增生还与某些自体免疫发炎性病症相关，尤其是多发性硬化症。其在罹患肌肉萎缩性侧索硬化(amyotrophiclateralsclerosis；ALS)的个体的CNS中也观察到。在某些实施例中，增强胶质淋巴系统从CNS中清除废产物可以用于延迟、预防、减少或减轻反应性神经胶质增生和其神经退化性后果。
反应性神经胶质增生减少Aqp4依赖性总体流动并且降低细胞外空间的体积，阻碍ISF溶质(包括废弃物产物)从脑和脊髓中清除。
神经退化性疾病可以是例如帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症或慢性创伤性脑病变。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在其它实施例中，哺乳动物可以是家养动物(例如猫、狗、猪、绵羊、牛、马和山羊)或外来哺乳动物(例如动物园哺乳动物)。哺乳动物可以是需要治疗的患者或个体。
在一个实施例中，所述方法进一步包含根据章节5.1和下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的方法测量中枢神经系统中的胶质淋巴系统功能。
在所述方法的另一个实施例中，减少、延迟或预防反应性神经胶质增生。在另一个实施例中，在一个实施例中，所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴系统清除作用(在本文中也被称作“胶质淋巴清除作用”)的治疗剂的步骤。
如上文所论述，增强胶质淋巴清除作用可以减轻反应性神经胶质增生、延迟反应性神经胶质增生发作，或预防反应性神经胶质增生。因此，还提供一种方法用于治疗哺乳动物中枢神经系统中的反应性神经胶质增生，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此减少、预防、减轻反应性神经胶质增生或延迟其发作。
在一个实施例中，所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂的步骤。在一个具体实施例中，药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦、考尼伐坦或VPA-985；心房利钠肽(ANP)的拮抗剂，例如安南汀；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦。
在另一个实施例中，所述方法包含泵送流体通过哺乳动物中枢神经系统间质以增强或促进胶质淋巴清除作用的步骤。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
5.3.促进从脑间质中清除脑废弃物产物的方法
提供一种用于促进废弃物产物(例如脑、脊髓或CNS废弃物产物)从哺乳动物脑间质和/或脊髓间质中清除的方法，所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂的步骤，借此促进从脑间质和/或脊髓间质中清除废弃物产物。药剂可以是例如利尿剂。
在所述方法的一个实施例中，方法包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂(例如Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子)投与哺乳动物的步骤。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦、考尼伐坦或VPA-985；心房利钠肽(ANP)的拮抗剂，例如安南汀；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦。
在另一个实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
在另一个实施例中，防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在其它实施例中，哺乳动物可以是家养动物(例如猫、狗、猪、绵羊、牛、马和山羊)或外来哺乳动物(例如动物园哺乳动物)。哺乳动物可以是例如需要治疗的患者或个体。
在一个实施例中，所述方法进一步包含根据章节5.1和下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能。
在所述方法的另一个实施例中，脑、脊髓或CNS废弃物产物是淀粉状蛋白β(Aβ)(例如可溶性Aβ)、τ或α突触核蛋白。所述方法还适用于促进所属领域中已知的几乎任何脑废弃物产物的清除。在一个实施例中，所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂的步骤。
还提供一种装备用于恢复和/或增强所减少的脑脊髓液(CSF)分泌和/或减少的流动，脑脊髓液(CSF)分泌减少和/或流动减少与哺乳动物脑中的脑脊髓液(CSF)/间质液(ISF)交换相关。在一个优选实施例中，哺乳动物是人类。所述装备包含机械泵系统(例如输注泵)，由此促进脑中的更快速CSF清除。在一个实施例中，装备还包含人造(“模拟”)CSF和抽吸或注入人造CSF到脑中的泵系统。参见章节6.4(实例4)。
在所述装备的另一个实施例中，装备恢复和/或增强所减少的脑脊髓液(CSF)分泌和/或所减少的流动，脑脊髓液(CSF)分泌减少和/或流动减少与神经退化性疾病(包括(但不限于)帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症和混合型痴呆症)相关或与创伤性脑损伤或缺血性(例如弥漫性缺血)脑损伤相关。
5.4.减缓、延迟或预防脑废弃物产物聚积的方法
提供一种用于减缓、延迟或预防哺乳动物中枢神经系统中的废弃物产物聚积的方法，所述方法包含增强胶质淋巴清除作用的步骤，由此增强废弃物产物从中枢神经系统中的清除。
在一个实施例中，所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的治疗剂的步骤。
在一个具体实施例中，肾上腺素能受体拮抗剂是治疗剂。肾上腺素能受体拮抗剂在所属领域中是众所周知的。还可以结合治疗剂使用手术植入脑室-腹腔分流器以增强或促进胶质淋巴清除作用。
在所述方法的一个实施例中，方法包含将增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂(例如Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子)投与哺乳动物的步骤。
在其它实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是AVP(血管加压素)拮抗剂，例如托伐普坦、考尼伐坦或VPA-985；心房利钠肽(ANP)的拮抗剂，例如安南汀；血管紧张素II的拮抗剂，例如洛沙坦；AT2R受体拮抗剂，例如PD123319；或AT1受体拮抗剂，例如维沙坦。
在另一个实施例中，增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂是防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
在另一个实施例中，防止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
在另一个实施例中，所述方法包含泵送流体通过哺乳动物中枢神经系统间质以增强或促进胶质淋巴清除作用的步骤。泵送可以通过所属领域中已知的任何装置或方法完成，例如通过使用机械泵、输注泵等。
在所述方法的一个实施例中，哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。在其它实施例中，哺乳动物可以是家养动物(例如猫、狗、猪、绵羊、牛、马和山羊)或外来哺乳动物(例如动物园哺乳动物)。哺乳动物可以是例如需要治疗的患者或个体。
在一个实施例中，所述方法进一步包含根据章节5.1和下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能。
在所述方法的另一个实施例中，脑废弃物产物是淀粉状蛋白β(Aβ)(例如可溶性Aβ)、τ或α突触核蛋白。所述方法还适用于减缓、延迟或预防所属领域中已知的几乎任何脑废弃物产物的聚积。
在一个具体实施例中，提供一种方法用于减少、减轻、延迟发作或预防淀粉状蛋白β(Aβ)、τ和/或α突触核蛋白在哺乳动物脑间质中的聚积。所述方法包含向哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的步骤。
5.5.减少或阻碍从哺乳动物脑间质中清除治疗剂或调节剂的方法
提供一种减少或阻碍从哺乳动物脑间质中清除治疗剂或调节剂的方法。这种方法可以用于治疗性药物或化合物的清除，例如在治疗脑肿瘤时。
治疗剂或调节剂可以是所属领域中已知的任何药剂，例如治疗性或功能化纳米粒子、化学治疗剂、抗肿瘤剂、免疫调节剂、抗体类治疗剂、病毒载体、脂质体或RNA类治疗性构筑体。
在一个实施例中，所述方法包含减少(或阻碍)胶质淋巴清除作用的步骤。
在另一个实施例中，所述方法进一步包含根据章节5.1和下文实例(例如实例1到实例3)中所公开的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能。
在所述方法的另一个实施例中，减少(或阻碍)胶质淋巴清除作用的步骤包含将减少或阻碍胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤。在某些实施例中，药剂可以是布美他尼、针对AQP4的小干扰RNA(siRNA)、AVP(血管加压素)的促效剂、心房利钠肽(ANP)的促效剂、血管紧张素II的促效剂、AT2R受体促效剂，或AT1受体促效剂。
在所述方法的另一个实施例中，减少(或阻碍)胶质淋巴清除作用的步骤包含阻断通过哺乳动物中枢神经系统间质的流体流动或对其设置障碍的步骤。
5.6.方法的治疗性用途
本文所公开的用于测定实质液流动模式的方法可以用于多种治疗性途径。首先，提高脑中的总体流动效率能够增强脑废弃物产物(例如可溶性Aβ、τ或α突触核蛋白)的清除，潜在地加快它们的降解或它们在全身性循环中的再吸收。
反之，阻碍溶质清除可以减缓治疗剂(例如抗肿瘤剂和免疫调节剂)从脑中移除，例如用于治疗脑癌症或肿瘤。
总体流动还可以促进对脑实质的免疫监视而无损于CNS免疫特权。蛛网膜下CSF中的淋巴细胞与抗原呈递细胞均可以检测通过静脉旁总体流出传递到CSF的间质性抗原。血管旁途径还可以充当迁移细胞和其导向分子的路径，因此代表着监视肿瘤细胞迁移的潜在道路。另外，血管旁途径可以是细胞迁移管道并且针对这种迁移加以监视。
以下实例是为了说明，而非为了限制而提供。
6.实例
6.1.实例1：血管旁路径促进CSF流动通过脑实质和间隙溶质(包括淀粉状蛋白β)清除
因为脑缺乏淋巴循环，所以其必须通过替代机制清除细胞外蛋白质。脑脊髓液(CSF)充当脑细胞外溶质的接收器，但不清楚来自脑间质的溶质如何从实质移动到CSF。本实例表明大部分蛛网膜下CSF通过脑间质性空间循环。基于小荧光示踪剂的活体内双光子成像，本实例表明CSF沿着围绕穿动脉的血管旁空间进入实质并且脑间质液沿着静脉旁引流路径被清除。星形胶质细胞中缺乏水通道蛋白-4(AQP4)的动物展现CSF通过这种系统的内流减缓和间质性溶质清除的约70％降低，表明这些解剖学内流途径与流出途径之间的流体总体流动受到星形胶质细胞性水传输的支持。荧光标记的淀粉状蛋白β(一种被认为在阿尔茨海默病中具病原性的肽)沿着这种路线传输，并且Aqp4基因缺失遏制了可溶性淀粉状蛋白β的清除，表明这种路径使淀粉状蛋白β从中枢神经系统中移除。通过静脉旁流动发生的清除作用还可以调节牵涉神经退化性病状的蛋白质的细胞外含量，这种清除作用的减弱导致可溶性蛋白质的错误聚积。
概述
淋巴脉管系统代表着与血液脉管系统平行的第二循环系统，其说明间质液(ISF)的清除，其中间质液的组成性蛋白质和其它溶质不能跨越毛细血管后微静脉被吸收(1、2)。在大部分脉管化组织中，淋巴系统对于流体静力维持和内环境稳定性维持来说均具有关键作用。然而，脑不具有组织学上可鉴别的淋巴脉管并且因此缺乏供间质性溶质和流体清除、存在于其它周边组织中的离散路径(3-5)。这是出人意料的，原因在于神经元和神经胶质的高代谢速率以及对其细胞外环境变化的极度敏感性表明ISF和溶质需要快速清除。
中枢神经系统(CNS)中的脑脊髓液(CSF)已被认为起着从脑清除溶质的作用(6)。脉络膜丛中形成的CSF沿着颅脑神经鞘或经由鼻淋巴管，借助于硬脑膜窦的蛛网膜绒毛，经由脑室和蛛网膜下的空间流到其再吸收入血流中的最终部位(3、7、8)。间质性溶质已被认为通过ISF的对流性总体流动清除到CSF中，ISF弥漫性地流遍脑组织，而非流遍解剖学上或功能上的离散结构(3、4、9)。在此，已使用活体内双光子成像和其它技术研究蛛网膜下CSF向脑间质中和通过脑间质的流动。
材料和方法
动物
所有实验均得到罗切斯特大学医学中心的动物资源大学委员会(UniversityCommitteeonAnimalResourcesoftheUniversityofRochesterMedicalCenter)的批准。除非另外指出，否则实验中使用8到12周龄雄性C57BL/6小鼠(查尔斯河实验室(CharlesRiver))。
为了使血管周围星形胶质细胞终足可视化，使用FVB/N-Tg(GFAPGFP)14Mes/J(GFAP-GFP，JAX)小鼠。这些小鼠在星形胶质细胞特异性GFAP启动子的控制下过度表达绿色荧光蛋白。
通过内源性荧光、利用NG2-DsRed和Tie2-GFP:NG2-DsRed鉴别动脉/微动脉相对于静脉/微静脉：动脉和微动脉表达内皮GFP和血管平滑肌DsRed，并且静脉和微静脉表达内皮GFP，但缺乏血管平滑肌DsRed。
为了定义CSF示踪剂内流和流出的血管旁路线，产生转基因双重报告基因小鼠。将Tg(TIE2GFP)287Sato/J(Tie2-GFP，JAX)与NG2DsRedBAC(54)(NG2-DsRed，JAX)杂交。Tie2-GFP小鼠在内皮特异性Tie2启动子下过度表达绿色荧光蛋白，而NG2-DsRed小鼠在NG2启动子的控制下表达红色荧光蛋白DsRed。虽然首先产生NG2-DsRed小鼠以研究NG2阳性神经胶质细胞，但成年动物的脑周细胞和血管平滑肌细胞也表达DsRed。在Tie2-GFP:NG2-DsRed动物中，所有血管经GFP标记(在内皮细胞层中)。毛细血管(图3F)、静脉(图3H)和微静脉(图3G)表达低含量的斑点DsRed(在周细胞和分散的血管平滑肌细胞中)，而动脉(图3D-E)和微动脉(图3A-C)展现DsRed标记的密集型圆周图案。这使得动脉和微动脉容易和静脉和微静脉容易区分(图3A、图10A-E)而无需额外的组织化学标记。
如所述(53)产生Aqp4-/-(无Aqp4)小鼠。这些动物是根据C57BL/6背景回交的总体Aqp4基因剔除动物。
麻醉
在所有实验中，用氯胺酮(ketamine)(0.12mg/g，腹膜内)和甲苯噻嗪(xylazine)(0.01mg/g，腹膜内)的组合将动物麻醉。
统计学
在所有图中，数据均以平均值±SEM呈现。所有统计分析均使用软件Prism(格拉夫帕德公司(GraphPad))进行。<0.05的P值视为显著。每个数据组的统计学处理如下所述。
CSF示踪剂
所有荧光CSF示踪剂在人造CSF中的组成浓度为0.5％。这包括ALEXA-594酰肼(A594)、FITC-聚葡萄糖2000(FITC-d2000)、德克萨斯红-聚葡萄糖3(TR-d3)、德克萨斯红-聚葡萄糖2000(TR-d2000)、卵白蛋白结合的ALEXA-647(OA-647)(均得自英杰公司(Invitrogen))。HiLyte555结合的淀粉状蛋白β1-40(阿娜斯派公司(Anaspec))在人造CSF中的组成浓度是0.1％。将放射性标记的3H-甘露醇(15-30Ci/mmol，珀金埃尔默公司(PerkinElmer))以0.1μCi/μl溶解于人造CSF中。将放射性标记的3H-聚葡萄糖10(100-500mCi/g，美国放射性标记化学公司(AmericanRadiolabeledChemicals))以0.01μCi/μl溶解于人造CSF中。将放射性标记的125I-淀粉状蛋白β1-40(2200Ci/mmol，珀金埃尔默公司)以0.005μCi/μl(2.3nmol/L)溶解于人造CSF中。
脑室-脑池灌注
将麻醉的小鼠固定于立体定位框中并且以立体定位方式，借助于小钻孔将33GA钢针插入右外侧脑室(外侧0.95mm，腹侧2.35mm以及尾侧到前囟0.22mm)。将第二根30GA针插入小脑延髓池中。通过使用耦接的注射泵(Micro4，WPI)，按200nl/min的相等速率将溶解于人造CSF中的示踪剂灌注到外侧脑室中并且从小脑延髓池中抽出CSF来进行封闭式脑室-脑池灌注。
为了评价示踪剂在脑实质中的分布，动物用4％多聚甲醛(PFA)穿心灌注，后固定隔夜，并且在振荡切片机上切100μm切片并且使用PROLONGAnti-FadeGold和DAPI(英杰公司)安装。通过落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对从脑室隔室渗透的示踪剂进行活体内成像。
脑池内示踪剂注射
将麻醉的小鼠固定于立体定位框中并且将30GA针插入小脑延髓池中。脑池内注射时，使用注射泵(哈佛装备公司(HarvardApparatus))、按2μl/min的速率、历时5分钟注射10μlCSF示踪剂。
为了使示踪剂从小脑延髓池的蛛网膜下空间向脑实质内的移动可视化，脑池内示踪剂注射之后30分钟与6小时之间，将动物灌注固定。在振荡切片机上切100μm切片并且如上所述安装，并且通过落射荧光显微镜或激光扫描共聚焦显微镜对示踪剂移动进行活体内成像。
为了评价蛛网膜下CSF进入脑中的绝对比例(图8)，首先将放射性标记的3H-甘露醇(1.0μCi/10μl)或3H-聚葡萄糖-10(0.1μCi/10μl)脑池内注射到麻醉的动物中。15分钟、30分钟或45分钟之后，快速将动物斩首，打开颅骨，去除硬脑膜并且收集脑。将脑溶解于45℃的2mlSoluene(西格玛公司(Sigma))中过夜。加入10mlHionicFluor液体闪烁混合物(珀金埃尔默公司)并且用多用途闪烁计数器(贝克曼库尔特公司(BeckmanCoulter))测量放射性。脑放射性相对于总放射性(总放射性是用即将脑池内注射放射性示踪剂之前直接放置于闪烁瓶中的10μl等分试样检测)归一化并且以总注射放射性的％表示。通过双因素方差分析联合邦费罗尼事后检验(Bonferroni'spost-hoctest)来对脑中的3H-甘露醇和3H-聚葡萄糖聚积进行比较。通过将聚积曲线相对于单阶段关联度函数拟合、接着确定最佳拟合曲线的平稳值(39.96±5.55％，R2＝0.3597)来测定近似最大的3H-甘露醇内流。
活体内荧光成像
通过落射荧光显微镜对示踪剂向脑中的渗透进行活体内评价。使用StereoInvestigator软件(微亮菲尔德公司(Microbrightfield))的虚拟切片模块采集多通道全切片合成图像。这包括单独的DAPI、绿色和红色发射通道。基于未注射的对照切片来测定暴露水平，接着在整个研究期间维持恒定。
为了将示踪剂向固定切片中的移动量化，用ImageJ软件(NIH，图7)分析切片图像。对于每一切片来说，将颜色通道分裂并且基于DAPI通道定义全切片的所关注区域(ROI)。基于切片区域外部的ROI，将对应于每种示踪剂的颜色通道减去背景。计算平均切片荧光强度，接着在像素强度为75(来自255)的情况下将切片均一地阈值化并且阈值化面积以总切片面积的％表示。以这种方式对每只动物约10到14个切片进行成像，并且将每只动物内的各切片之间的平均荧光强度和示踪剂覆盖率平均化以产生单一生物学复制品。通过单因素方差分析联合土基氏事后检验(Tukey'spost-hoctest)来评价示踪剂大小对荧光强度或示踪剂分布的影响以确定个别示踪剂之间的差异。通过双因素方差分析联合邦费罗尼事后检验来评价Aqp4基因缺失对示踪剂向脑中内流的影响以确定个别时间点时的差异。
示踪剂向固定的振荡切片机切片内和通过固定的振荡切片机切片的移动另外通过使用FluoView(奥林巴斯公司(Olympus))软件的激光扫描共聚焦显微镜(FV500，奥林巴斯)，在高倍数下成像。使用具有UCSD插件集的ImageJ软件(NIH)处理图像。
活体内双光子激光扫描显微镜
对于活体内成像来说，将导管插入麻醉的动物并且使用小型的动物用换气扇(CWE)使其以约100次呼吸/分钟和0.3-0.4ml的潮气量与室内空气进行人工换气。使用温度可控的温热垫使体温保持在37℃。在皮层1mm外侧和前囟0.5mm后进行颅骨切开术(直径3mm)。使硬脑膜保持完整并且颅骨切开处用aCSF覆盖并用玻璃盖玻片密封。将管插入股动脉用于监视平均动脉血压和测量动脉血气值。本研究中只包括血气在生理学范围(pO2＝80-150mmHg，pH7.25-7.5)内的小鼠。为了使脉管系统可视化，即将成像之前，动脉内注射0.1mlBBB非通透性级联蓝-聚葡萄糖10(MW10kD)或德克萨斯红-聚葡萄糖70(MW70kD；均存在于生理盐水中，均为1％，英杰公司)。
使用附接到共聚焦扫描系统(Fluoview300，奥林巴斯)和立式显微镜(IX51W，奥林巴斯)的MaiTai激光(光谱物理公司(SpectraPhysics))进行如所述的活体内成像(55)。使用20倍(0.9NA)水浸式透镜，从表面到约250μm深度对皮层进行成像。激发波长对于级联蓝来说是800nm并且对于GFP、FITC和德克萨斯红来说是870nm。对于GFP、FITC和德克萨斯红来说，收集575nm到645nm的发射。首先，使用512×512像素帧，从表面到240μm深度，使用5μmz-步进距离对大脑脉管系统进行成像。脑池内注射CSF示踪剂之后，借助于双通道(FITC和德克萨斯红)512×512像素图像采集执行示踪剂向皮层内的移动。在实验期间，从表面到表面下方240μm，使用20μmz-步进距离，以1分钟时间区间对皮层进行重复扫描。使用具有UCSD插件集的ImageJ软件(NIH)执行图像分析。成像之后，基于如下形态来区分贯穿性微动脉与贯穿性微静脉：表面动脉浅表地通过表面静脉并且在浅表皮层深度展现较少分支。选择皮层表面下方的成像平面100-120μm用于分析脑池内示踪剂渗透。为了界定血管旁示踪剂移动，定义直径25个像素的环形ROI围绕三根贯穿性微动脉和上升微静脉。为界定示踪剂向血管旁脑组织内的移动，定义圆环形ROI具有150个像素的外径和50个像素的内径(因此不包括血管旁ROI)。这些圆环形ROI以贯穿性微动脉和上升微静脉为中心。在每个时间点时测量这些ROI内的平均像素强度。将每个时间点时、每只动物内的微动脉旁和静脉旁ROI分别地平均化以产生单一生物学复制品的数值。当对示踪剂沿着贯穿性微动脉或上升静脉的移动或向微动脉旁和静脉旁脑组织内的移动进行比较时，使用双因素方差分析，随后进行邦费罗尼事后检验。使用相同检验来评价Aqp4基因缺失对示踪剂沿着血管旁空间或向血管旁脑组织内的移动的影响。
实质内示踪剂注射
为了评价间质液和溶质从脑中清除的路径和速率，以立体定位方式将荧光和放射性标记示踪剂注射到脑实质中。将麻醉的动物固定于立体定位框中并且借助于小钻孔、按以下坐标将33GA针插入脑中：皮层内注射(尾侧0.22mm、外侧2.0mm、腹侧距离前囟1.75mm)、纹状体内注射(尾侧0.22mm、外侧2.5mm、腹侧距离前囟3.5mm)、丘脑内注射(尾侧1.82mm、外侧1.25mm、腹侧距离前囟3.75mm)。针插入之后，花30分钟让针追踪到所封闭的肿胀处。按17nl/min的速率注射1.0μl示踪剂(溶解于人造CSF中)。
评价实质内荧光示踪剂(OA-647)分布时，注射之后将将动物灌注固定1-3小时并且通过激光扫描共聚焦显微镜对振荡切片机切片进行成像。为了在纹状体内注射之后界定HiLyte-555-淀粉状蛋白β1-40从脑中清除的路径，通过激光扫描共聚焦显微镜对固定的振荡切片机切片进行成像。
评价间质性溶质从脑中清除的绝对速率时，将3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I-淀粉状蛋白β1-40注射到纹状体内(图14A-B)。15分钟、30分钟、1小时或2小时后，快速地将动物斩首并且收集脑。如上所述溶解脑，并且通过液体闪烁光谱测定法测量脑中存在的放射性。所有放射性数值相对于每次实质内注射之前直接获得的1μl注射标准物归一化。使用双因素方差分析和邦费罗尼事后检验来评价Aqp4基因缺失对3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I淀粉状蛋白β1-40从脑中清除的影响，以确定个别时间点时的差异。
免疫荧光
对100μm经PFA固定的振荡切片机切片进行自由浮动式免疫荧光。切片在室温下用3％普通驴血清(杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoresearch))阻断1小时，与一级抗体一起在4℃培育过夜并且与二级抗体一起在室温下培育2小时。一级抗体包括大鼠抗CD31(内皮标记；1:200，艾博抗公司(Abcam))、小鼠抗GFAP(星形胶质细胞标记；1:500，密理博公司(Millipore))和兔抗AQP4(1:500，密理博公司)。二级抗体包括Cy2结合的驴抗大鼠、Cy5结合的驴抗小鼠及Cy3结合的驴抗兔(杰克逊免疫研究实验室)。
包埋前的光和电子显微镜下的细胞化学
野生型和无Aqp4的小鼠用FITC-d40注射并且在5分钟之后通过用含有4％甲醛和0.1％戊二醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4)进行穿心灌注来固定。脑固定后过夜并且通过振荡切片机切成100μm冠状面切片。自由浮动切片与HRP结合抗荧光素抗体(艾博抗公司，目录号：AB6656，5μg/ml)一起培育24小时(4℃)，接着进行二胺基联苯胺(DAB)-过氧化酶程序以使荧光素示踪剂可视化，如所述(56)。将顶叶皮层的区域解剖并且包埋于Durcupan(56)中之前，采集切片的光学显微镜图像。在雷谢尔公司(Reichert)的超薄片切片机上切成超薄切片(约90nm)。最后，将切片对比染色并且用FEITecnai12透射电子显微镜检查。按26000倍的标称放大倍数记录数字图像。
电子显微镜下的形态分析
通过使用含有2.5％戊二醛和1％甲醛的0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.4，9ml/min，历时25分钟)进行穿心灌注来使野生型小鼠(n＝3)和无Aqp4的小鼠(n＝4)固定。脑固定后过夜，随后剖成300-500μm冠状面切片并且包埋于Durcupan中(55)。切成超薄切片，对比染色，并且如上文所述检查。按4200倍标称放大倍数记录贯穿性脉管的数字图像。在距离软膜表面的最小深度80μm处(对于野生型小鼠和无Aqp4的小鼠来说，范围分别是：166-415μm和83-366μm)测量围绕贯穿性脉管的维乔-罗宾空间(Virchow-Robinspace)的最大宽度。
结果
脑室CSF最低限度地进入脑实质
首先通过将不同分子量的荧光示踪剂灌注到麻醉小鼠的外侧脑室中来评价CSF是否从脑室隔室中进入脑(图1A)。连续输注30分钟之后，通过对固定的振荡切片机切片进行荧光成像来对示踪剂[AlexaFluor594酰肼(A594)，分子大小：759道尔顿；德克萨斯红-聚葡萄糖-3(TR-d3)，分子大小：3kD；异硫氰酸荧光素-聚葡萄糖-2000(FITC-d2000)，分子大小：2000kD]向脑实质内的移动进行活体内评估。少量的A594和TR-d3穿过外侧和第三脑室的室管膜(图1B、C、E和F)。然而，在远离最近脑室周围区域的部位处未观察到示踪剂(图1D和G)。
蛛网膜下CSF快速进入脑实质
然后通过将荧光标记示踪剂与放射性标记示踪剂注射到小脑延髓池中来评价CSF是否从蛛网膜下隔室进入脑实质(图1A)。注射之后三十分钟，荧光示踪剂分布根本上不同于将示踪剂注射到脑室内之后所观察到的图案(图1H和K，与图1B和E相比)。大分子量FITC-d2000(分子大小：2000kD)沿着血管旁空间进入脑，围束于此，并且不进入周围间质性空间(图1K和L)。TR-d3(分子大小：3kD)不仅在血管旁空间中浓缩，而且从血管旁空间(图1K和L)和软膜表面(图1M)进入间质。TR-d3的分布比FITC-d2000更广泛，FITC-d2000主要定位于血管周围。较低分子量A594(分子大小：759道尔顿)快速移动通过整个脑间质，并且只有少量在血管旁空间内浓缩(图1H和J)。A594与TR-d3均缓慢并且均一地从软膜表面移动到脑内(图1H、K和M)。接着通过图像分析来量化不同分子量的示踪剂的实质分布(图7)。尽管A594在注射30分钟内几乎渗透整个脑容积，但较高分子量示踪剂的渗透证明更受限制(图1N)。
脑池内放射性示踪剂注射证实了这些结果。在注射45分钟内，约40％的注射[3H]甘露醇(分子大小：182道尔顿；图8)可在脑中检测到(图1O)。较大示踪剂([3H]聚葡萄糖-10，分子大小：10kD)在脑中的聚积较缓慢(图1O)。因为水分子量为甘露醇的十分之一，所以通过[3H]甘露醇聚积(总蛛网膜下CSF的约40％)反映的CSF流量可能低估了CSF向脑实质中的真实移动。已评价蛛网膜下CSF向脑中渗透的早先研究是使用示踪剂，例如菊糖(分子大小：约5kD)、白蛋白(分子大小：66kD)和聚葡萄糖(分子大小：3kD到2000kD)(10、11)。这个实例中的结果展示较高分子量示踪剂优先从脑实质中排除，表明早先研究通过将其分析基于较大示踪剂之上而可能系统性地低估了“逆行”蛛网膜下CSF向脑中的流动。
活体内成像揭露了血管旁CSF内流
然后使用双光子激光扫描显微镜实时观察蛛网膜下CSF向脑实质中内流的路线和动力学。通过经由封闭的颅脑窗对麻醉小鼠成像(图2A)，使视脑池内注射的荧光聚葡萄糖向大脑皮层中的移动可视化。大脑脉管系统用血脑屏障(blood-brainbarrier；BBB)非通透性荧光聚葡萄糖(CB-d10)(静脉内)标记，并且根据形态鉴别穿动脉和穿静脉(图2B)。
注射之后，示踪剂沿着皮层表面动脉和贯穿性微动脉的外部(图2B和C以及图9A-D)、经由直接围绕血管平滑肌细胞(图2F-J，以及图3C和E)并且以血管周围星形胶质细胞终足(图2K和L，以及图4B-D)为界的路径快速进入脑。在脑池内注射之后超过约35分钟，在皮层表面处、皮层表面下方60mm和120mm处看到呈FITC-d40(分子大小：40kD)内流形式的这种动脉旁CSF移动。沿着表面动脉边缘、而非经由蛛网膜下CSF的快速示踪剂移动与围绕脑表面动脉的血管旁外鞘的存在一致，如威勒(Weller)所述(12)。虽然这些血管旁空间与蛛网膜下空间是连续的，但是为CSF向实质中的快速动脉旁总体流动(通过动脉脉动来驱动)提供不同的通道(13-15)。
TR-d3(分子大小：3kD)和FITC-d2000(分子大小：2000kD)尽管它们相应的分子量差异大(图9C和D)，但在注射时，均沿着贯穿性皮层动脉快速进入血管旁空间。这表明它们的传输是借助于通过血管旁空间的总体CSF流动来发生(4、16)。相比之下，在FITC-d2000与TR-d3之间，从血管旁空间向周围组织中的移动是不同的。TR-d3容易进入间质，而较大FITC-d2000局限于血管旁空间(图2C-E，以及图9B-D)。近期研究表明，星形胶质细胞终足覆盖鼠类大脑微循环中的大部分表面区域，使得通往实质的通道只由重叠终足之间的约20nm间隙提供(17)。这表明血管周围星形胶质细胞终足可以发挥筛选功能，由此解释进入间质中的血管旁溶质具有大小依赖性。虽然水和小溶质可以通过总体流动、从血管旁空间自由地进入脑间质，但是排除大分子量溶质[FITC-d2000；水化直径(dH)>32nm(9)]，而较小溶质[例如卵白蛋白和TR-d3；dH分别等于2nm到3nm和6.1nm(9)]按大小和结构依赖性方式通过终足(图2E和图9B-D)。
血管旁CSF内流和清除在整个脑中发生
活体内成像表明蛛网膜下CSF向皮层中的动脉旁内流。然而，因为双光子成像不能对通过较深脑结构的示踪剂流动进行成像，所以然后使用活体内方法反映血管旁CSF在整个脑中的内流和清除。分析中等分子量示踪剂卵白蛋白结合AlexaFluor647(OA-647；分子大小：45kD)在Tie2-GFP:NG2-DsRed双重转基因报告基因小鼠的所固定振荡切片机切片中的分布，其中容易将动脉与静脉区分开来(图10A)。示踪剂在脑池内注射之后立即沿着穿动脉和微动脉向内快速移动而到达整个脑中的末端毛细血管床(图3A)，其中最大内流沿着基底神经节和丘脑的腹侧大穿动脉发生(图3D和图10C-E)。在较早时间点(注射之后<10分钟)未在静脉周围观察到示踪剂。在较长时间点(>1小时)，脑池内注射的示踪剂沿着毛细血管和实质微静脉聚积(图3F和G)。示踪剂离开脑主要沿着两种静脉旁路线：中内部大脑静脉和外腹侧后嗅区静脉(图3H)。直接注射到皮层、纹状体或丘脑中的实质内示踪剂沿着相同的共用解剖学路径清除，后内侧向内部大脑静脉行进或后外侧腹侧沿着外部包膜行进直到其沿着后嗅区静脉从实质中离开(图11A-E)。这些结果表明，移动通过脑实质的ISF和CSF沿着相同的静脉旁引流路径清除。
星形胶质细胞性水传输支持CSF向实质中流动。星形胶质细胞性水通道蛋白-4(AQP4)的水通道定位相对于血管周围终足被高度极化(图4A)，血管周围终足以动脉旁CSF内流和静脉旁ISF清除路径为界(图4B-D)。这些星形胶质细胞性水通道为这些血管旁空间与间质之间的流体移动提供低阻力的路径，使血管旁和间质性总体流动关联并且维持对流性流(3、9)，从而驱动间质性溶质从脑实质中清除。为了对此进行研究，确定通过Aqp4基因的总体基因剔除增强实质对流体流动的阻力是否改变通过间质的CSF流量。对CSF示踪剂内流进行活体内成像时，相较于野生型对照小鼠，在无Aqp4的小鼠中，示踪剂向脑实质内的移动明显减少(图4E和F，以及图12A和B)。活体内成像证实这些结果。脑池内注射之后，FITC-d2000沿着微动脉旁内流路径的移动在无Aqp4的小鼠中未显著减缓(图4G和H)，表明动脉旁内流路径(维乔-罗宾空间)的邻近区段未因Aqp4缺失而受损。相比之下，TR-d3从血管旁空间向周围间质中的移动在无Aqp4的小鼠中发生有效消除(图4G和I)。已证实，在无Aqp4的小鼠中，围绕贯穿性皮层微动脉的血管旁空间在超微结构上垂直于皮层深度(图12C到E)，并且通过电子显微镜可在无Aqp4的小鼠以及野生型小鼠的血管旁空间内检测到脑池内注射的FITC-d40(图12C和D)。
AQP4表达差异可能导致沿着这些动脉旁CSF内流和静脉旁ISF清除路径的总体流动的极化。因此评估NG2-DsRed动物(其中静脉和动脉可以区分开来)中的AQP4免疫反应性以定义AQP4表达在动脉周围、静脉周围和毛细血管周围终足中的相对量。尽管静脉周围和毛细血管周围终足在AQP4表达方面并非不同，但动脉周围终足展现显著减弱的AQP4免疫反应性(图13A-C)。对动脉和静脉周围的非终足AQP4表达与毛细血管周围的表达进行比较时，动脉周围的表达明显减少(图13A、B和D)。这种影响在很大程度上是由于穿动脉亚群展现急剧减弱的AQP4免疫反应性(图13A和D)。
星形胶质细胞性水传输促进总体ISF溶质从实质中清除
这些数据表明，星形胶质细胞性水流动促进蛛网膜下CSF向脑间质内和通过脑间质的移动。此跨实质CSF流动的一种可能功能是流体和溶质从脑间质中清除。
这是通过检查Aqp4基因缺失对放射性标记[3H]甘露醇从脑实质中清除的影响(图14A)来测试。相较于野生型动物，在无Aqp4的小鼠中，[3H]甘露醇从脑间质中的清除降低约70％(图5A)。在野生型小鼠中，[3H]聚葡萄糖-10的清除速率(分子大小为甘露醇的55倍大)与[3H]甘露醇相同(图14B)，证明总体ISF流动(而非扩散)引起这些间质性传递的示踪剂的清除(4、9)。[3H]聚葡萄糖-10的清除在无Aqp4的小鼠中也显著降低(图14B)。本实例表明星形胶质细胞AQP4支持ISF总体流动，从而驱使间质性溶质从脑实质中清除。AQP4促进间质性淀粉状蛋白β的血管旁清除。可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)存在于健康幼龄脑的间质中，然而间质性Aβ含量与淀粉状蛋白斑负荷相关(18)。
评价AQP4依赖性ISF总体流动是否促进可溶性Aβ从脑中清除。纹状体内注射125I-淀粉状蛋白β1-40之后，化合物从脑中快速清除(图6A)。与Aβ在受体介导下跨越BBB流出(19)一致，125I-淀粉状蛋白β1-40从脑中清除的速率超过缺乏特异性流出受体的[3H]甘露醇或[3H]聚葡萄糖-10(图14A到B)。相较于野生型对照，在无Aqp4的小鼠中，125I-淀粉状蛋白β1-40清除速率降低约55％(图6A)。这表明，大部分的可溶性Aβ是通过沿着胶质血管清除系统而非局部跨越BBB的总体流动去除。为了支持这种结论，观察到荧光标记的Aβ注射到纹状体中时沿着脉管系统快速移动、沿着微脉管系统和大口径内部大脑静脉和后嗅区静脉聚积(图6B-D)。
可溶性Aβ也存在于CSF中，其可以通过跨越脉络膜丛传输(20)以及通过CSF总体转换(21)而从CSF中清除。因此需问CSF隔室内的可溶性Aβ1-40是否通过脑实质再循环。脑池内注射125I-淀粉状蛋白β1-40之后，脑中的125I-淀粉状蛋白β1-40含量按类似于[3H]聚葡萄糖-10的方式增加(图6E，与图1O相比)。在无Aqp4的小鼠中，125I-淀粉状蛋白β1-40的总体内流相较于野生型显著减少(图6E)。这些数据表明，虽然间质性可溶性Aβ沿着胶质血管路径清除，但是CSF隔室内的一部分Aβ可以沿着这种相同路线通过脑再循环。
图7展示脑实质内的荧光CSF示踪剂分布的量化。脑池内注射A594、TR-d3和FITC-d2000注射剂之后，将动物灌注固定并且用振荡切片机切100μm切片。用4倍落射荧光显微镜对切片成像并且产生合成图像。为了评价示踪剂覆盖范围，分离颜色通道，减去图像背景，计算均一阈值面积和阈值面积并且以总切片面积的百分比表示。
图8展示蛛网膜下CSF进入脑实质中的测量结果。示意图描绘蛛网膜下CSF进入脑实质中的测量结果。脑池内注射3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I-Aβ1-40。为了量化放射性示踪剂在脑实质内的聚积，放射性示踪剂注射之后15分钟、30分钟或45分钟收集脑。将脑溶解于Soluene中，接着通过液体闪烁计数法测量总脑放射性。根据所测量的总脑放射性(RBrain)和所注射的总放射性(RInject)来计算成比例的脑放射性(R'Brain)。收集期间，从脑中去除硬脑膜。因此，脑匀浆不包括保留于蛛网膜下CSF隔室中的放射性示踪剂。
图9A-D展示小分子量示踪剂和大分子量示踪剂的动脉旁内流的活体内成像。通过活体内双光子激光扫描显微镜，在麻醉小鼠中，在封闭颅脑窗内，对不同分子量的两种聚葡萄糖(TR-d3和FITC-d2000)沿着动脉旁路径的移动和向皮层间质中的移动进行成像。(A)大脑脉管系统使用动脉内级联蓝-聚葡萄糖-10(CB-d10)可视化并且根据形态鉴别贯穿性微动脉(A)和静脉(V)(分别为红色和蓝色圆圈)。(B-D)通过测量以贯穿性脉管为中心的环形ROI内的平均荧光强度来评价小分子量和大分子量示踪剂沿着动脉旁和静脉旁路径的移动。通过测量以贯穿性脉管为中心的圆环形ROI(红色和蓝色虚线圆环)中的平均荧光强度来界定示踪剂向周围间质中的移动。(C)小分子量示踪剂容易从动脉旁空间(红色实线)移动到动脉旁(红色虚线)和静脉旁(蓝色虚线)间质内。曲线之间缺乏统计学显著性差异(P＝0.056，每组n＝6)表示这种示踪剂从动脉旁空间向外的移动相对来说不受限制。(D)大分子量示踪剂容易沿着贯穿性微动脉(红色实线)，而非沿着贯穿性微静脉(蓝色实线；*P<0.01，每组n＝6)移动到皮层中。在围绕贯穿性微动脉和静脉(分别为红色虚线和蓝色虚线)的组织中所测量的示踪剂强度和静脉旁空间中所观察到的示踪剂强度处于同样低的水平。因此，大分子量示踪剂主要局限于动脉旁空间并且不容易进入脑间质中。比例尺：100μm。
图10A-E展示CSF不沿着静脉旁路径进入脑实质。为了评价蛛网膜下CSF示踪剂的动脉旁相对于静脉旁内流，将OA-647脑池内注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双重报告基因小鼠中。(A)在这些小鼠中，所有血管的内皮经GFP标记，而血管平滑肌细胞和周细胞经DsRed标记。因此根据不同的周界DsRed标记的存在容易区分动脉和微动脉(空心箭头)，而静脉(实心箭头)缺乏这种标记。当NG2-DsRed小鼠脑切片经内皮标记CD-31标记(右)时，发现NG2-DsRed标记的动脉特异性。(B)在大脑皮层中，脑池内示踪剂沿着DsRed+贯穿性微动脉，而非沿着DsRed-静脉进入脑。时常发现远端静脉标记，但典型地经由中间毛细血管床而来源于微动脉旁内流路径。(C-E)沿着腹侧脑表面的大脉管展现相同图案。围绕大穿动脉(空心箭头，D)的血管旁空间让CSF示踪剂大流量移动到实质中，而示踪剂不会沿着基底引流静脉(实心箭头，E)实质上渗透到实质内。比例尺：100μm(B、C)、50μm(A)、20μm(D-E)。
图11A-E展示脑池内注射的示踪剂和实质内注射的示踪剂共用相同的静脉旁引流路径。OA-647实质内注射到Tie2-GFP:NG2-DsRed双重报告基因小鼠中。(A-B)皮层内注射的示踪剂围绕着微脉管聚积，并且从注射部位沿着毛细血管旁和静脉旁(箭头)路径向外最快速地移动。(C-D)纹状体内示踪剂类似地围绕毛细血管和微静脉聚积。注射到灰质中的示踪剂从白质束(星号，D)中排除。(E)虽然也观察到沿着皮层上升静脉和微静脉的较小清除，但实质内示踪剂主要沿着内部大脑静脉和后嗅区静脉从脑中清除。比例尺：50μm(B、D-E)、20μm(A、C)。
图12A-E展示野生型小鼠和无Aqp4的小鼠中的示踪剂血管旁聚积和维乔-罗宾空间的视觉显示。(A-B)脑池内注射的FITC-d40通过DAB免疫组织化学可视化。注射之后的5分钟，反应产物显而易见沿着野生型动物(A)的贯穿性皮层脉管(插图中的箭头)。在无Aqp4的动物(B)中，脉管周围的标记强度弱得多。插图高倍放大展示顶叶皮层中的标记。(C-D)电子显微照片展示围绕贯穿性皮层微动脉的邻近血管旁空间(维乔-罗宾空间，VRS)中存在电子密集型DAB反应产物。相较于野生型动物(C)，无Aqp4的动物(D)中的VRS呈现超微结构完整性。(E)未注射的无Aqp4动物中的VRS显现于皮层表面下方约1000μm。插图展示围绕贯穿性脉管的VRS的宽度(对于野生型动物来说，n＝10，对于无Aqp4动物来说，n＝11；数值是平均值±SEM)。Endo：内皮细胞；VSM：血管平滑肌细胞。比例尺：500μm(A和B中的插图)、1μm(C-E)。
图13A-D展示AQP4在动脉周围星形胶质细胞相对于静脉周围星形胶质细胞中的表达差异。(A-B)NG2-DsRed小鼠皮层中的AQP4的免疫荧光标记。穿动脉容易通过血管平滑肌的密集性周界DsRed标记(A，空心箭头)区分，而上升静脉展现不规则的DsRed标记(B，实心箭头)。(C)血管周围终足中的AQP4免疫反应性的量化，相对于背景AQP4强度归一化。动脉周围终足对AQP4的表达显著少于毛细血管周围或静脉周围终足(*P<0.01，ANOVA；n＝24根动脉、19根静脉和43根毛细血管，来自3只动物)。(D)测量脉管壁(不包括终足)20μm内的AQP4免疫反应性时，动脉周围AQP4强度相较于毛细血管周围水平的水平显著减小(*P<0.05，t检验)。这在很大程度上受穿动脉的一种亚群(整体群组的约40％)驱动，这种亚群展现脉管周围多达50μm明显缺乏AQP4免疫反应性标记(见于A中)。
图14A-B展示间质性溶质从脑中清除的测量结果。(A)描绘对间质性溶质从脑实质中的清除进行测量的示意图。将3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10或125I-淀粉状蛋白β1-40注射到纹状体中。为了量化放射性示踪剂从实质中的清除，在放射性示踪剂注射之后的t＝1小时或2小时时收集脑。溶解脑，接着通过液体闪烁计数测量总脑放射性。根据所测量的总脑放射性(RBrain)和所注射的总放射性(RInject)来计算残留的的脑放射性(R'Brain)。收集脑时，去除硬脑膜。因此，RBrain测量值不包括存在于蛛网膜下空间内的放射性示踪剂。(B)Aqp4基因缺失对实质内注射的3H聚葡萄糖-10从脑中的清除的影响。在野生型动物中，3H-甘露醇与3H-聚葡萄糖-10均按相同速率从脑中清除。这符合总体流动[与扩散(9)相比]介导的传输不依赖于分子量(4)的观察结果。类似于3H-甘露醇(图14B)，Aqp4基因缺失对3H-聚葡萄糖-10的流出有影响，明显降低了其从脑实质中清除的速率(*P<0.01，每个时间点n＝4)。
图15A-B是血管旁和间质性总体流动路径的示意图。(A)示意性描绘所提出的动脉周围星形胶质细胞终足AQP4促进动脉旁内流路径与间质性隔室之间的水总体流动的作用。由于AQP4表达较高，因此水自由越过血管周围终足。小溶质，包括荧光示踪剂TR-d3(MW3kD)，循着所产生的渗透梯度，通过重叠的终足过程之间的细胞间间隙进入间质内。大溶质，包括FITC-d2000(MW2000kD)，不能通过这个间隙并且滞留于血管旁空间中。在无Aqp4的小鼠中，血管旁空间与间质之间的水流动减少，与之同时，溶质移动到间质内。插图描绘TR-d3、FITC-d2000[dH，水化直径(9)]和终足间间隙(17)的三维尺寸。(B)详细示意图描绘所提出的星形胶质细胞AQP4维持对流性ISF总体流动和间质性溶质清除的作用。动脉旁AQP4和静脉旁AQP4允许水在动脉旁内流路径与静脉旁清除路径之间自由移动。这种对流性水流动沿着其路径扫除间质性溶质和示踪剂(例如3H-甘露醇和3H-聚葡萄糖-10)。在无Aqp4的小鼠中，血管旁空间与间质之间的水流动减少，导致间质性溶质清除失败。插图描绘3H-甘露醇、3H-聚葡萄糖-10和终足间间隙的三维尺寸。
论述
在这个实例中，鉴别小鼠中的用于流体传输的全脑路径，包括蛛网膜下CSF向脑间质中的动脉旁内流，随后为ISF沿着大口径引流静脉清除。这些内流路径与流出路径之间的间质性总体流动取决于跨越星形胶质细胞的水移动，并且流体通过这种系统的连续移动是间质性溶质(可能包括可溶性Aβ1-40)从脑中清除的关键促成因素。这种系统根据其对神经胶质水流动的依赖性和淋巴功能在间质性溶质清除方面的从属作用，已被命名为“胶质淋巴”路径(图5B和图15A-B)。
CSF隔室与周边淋巴管之间的关系已明确(8)。在哺乳动物中，注射到CSF中的放射性标记白蛋白中约50％经由筛形板引流到颈淋巴管，而其余部分经由硬脑膜窦的蛛网膜粒清除到血流中(22-24)。这些已认知的引流模式首先产生如下观念：CSF通过其沿着血管旁空间与脑ISF的交换而发挥“淋巴”功能(6、25)。与我们在此报导的结果一致，对大鼠的研究表明，注射到脑间质中的示踪剂多达75％清除到蛛网膜下CSF中，占总CSF产生的约11％(26)。在这个实例中，鉴别作为主要清除路线的静脉旁路径，特别是围绕中内部大脑静脉和后嗅区静脉的那些路径，与鉴别动脉旁外鞘作为示踪剂清除路径的一些研究形成对比(26、27)。实质内注射之后的这种动脉旁标记在很大程度上是来自注射的实质内高局部压力的假象并且不反映溶质流出的天然路径。在实质内注射的情况下，靠近注射部位的动脉旁空间聚积着示踪剂。如果观察局限于这些部位，那么可能会错误地得出结论：示踪剂流出主要沿着动脉旁流出路径发生。然而，在距离注射部位最远的位置，示踪剂围绕大口径引流静脉聚积的程度是最大的(图3H和图11E)。
这些结果部分地证实仁莱尔(Rennels)等人的基本观察结果(15、28)，其中注射到猫小脑延髓池的蛛网膜下空间内的辣根过氧化酶(分子大小：40kD)沿着动脉旁路径快速移动到脑内。这些结果被赛瑟(Cserr)和同事反驳，其推断蛛网膜下CSF的血管旁内流是“缓慢的并且方向可变的”(11、29)。本发明结果，包括活体内双光子成像(图2A-L以及9A-D)、对双重转基因报告基因小鼠的活体内分析(图1A-O、图3A-H、图10A-E以及图11A-E)和定量放射性示踪剂实验(图1O)，均反对这种结论。这些有差异结果的一种可能原因是早先研究选择了较大分子量示踪剂。活体内成像(图2B-E和图9A-D)和活体内成像以及放射性示踪剂内流数据(图1O)表明示踪剂从蛛网膜下空间向脑实质中的内流依赖于分子量。在评价蛛网膜下CSF向脑实质中移动的早先研究中，典型地使用菊糖(分子大小：约5kD)、白蛋白(分子大小：66kD)和聚葡萄糖(通常为2000kD)作为CSF示踪剂(3、10、11、29)。基于这些结果，这些研究低估了蛛网膜下CSF向脑间质中内流的程度和速率。其它方法性差异似乎也起作用。普伦(Pullen)等人使用一种敞开式脑室-脑池和脑池-脑池灌注方法，其使脑池外流管向样品收集气氛敞开(29)。市村(Ichimura)等人直接将示踪剂挤压注射到观察部位处的血管旁和蛛网膜下空间中(11)。在实验(数据未显示)中，发现当硬脑膜被刺穿时(如在赛瑟和同事所用的方法(11、29)中)，血管旁示踪剂流动几乎消除，表明蛛网膜下和血管旁空间的水力完整性的维持对于维持血管旁总体流动来说是关键的。
AQP4对于血管旁路径功能的作用
这些数据表明AQP4依赖性星形胶质细胞性水流动与动脉旁CSF内流与脑内的静脉旁ISF清除相关联。AQP4已牵涉细胞毒性水肿演化期间水向脑组织中的吸收，以及血管性水肿之后的水清除(30、31)。这些观察结果表明血管周围AQP4促进蛛网膜下CSF从动脉旁空间内流到脑间质中，以及ISF随后借助于对流性总体流动进行的清除(3、4)。对脑池内注射的TR-d3和FITC-d2000使用活体内双光子成像，直接观察到沿着动脉旁路径的总体流动CSF移动。这些药剂均沿着软膜动脉壁快速移动进入维乔-罗宾空间中，而不与周围蛛网膜下隔室中的CSF混合(图2B)。与威勒(12)对软脑膜脉管进行的超微结构分析一致，这表明围绕表面动脉的血管旁空间和这些物质所渗入的维乔-罗宾空间包含物理上和功能上不同的亚隔室，CSF通过总体流动、通过亚隔室快速进入脑实质。这种CSF流动可能通过动脉脉动来驱动(13-15)：CSF向动脉旁空间内流的方向性或许反映动脉旁路径与静脉旁路径之间的不同脉动压力。
血管周围星形胶质细胞终足提供大脑微脉管系统的完全覆盖，重叠过程之间仅20nm间隙提供与间质的直接连通(17)。这向血管旁隔室与间质性隔室之间的流体和溶质流动置入了高阻力屏障。在毛细血管面向终足的表面区域中占约50％的AQP4(32)构成了用于水在这些隔室之间移动的低阻力路径。可能通过动脉旁总体流动的流体静压驱动的跨神经胶质细胞性水移动可以借助于特定的星形胶质细胞溶质转运蛋白或通过终足之间的细胞间间隙来驱动溶质从血管旁空间流入间质中。Aqp4基因缺失对TR-d3在血管旁空间与周围间质之间移动的影响支持AQP4的这种作用。终足的筛选作用(当它们接近20nm之dH时限制溶质移动)可以解释分子量对示踪剂向间质中渗透的影响(图15A-B)。
当蛛网膜下CSF进入间质并且与ISF混合时，两者均与任何相关的溶质(包括可溶性Aβ)一起沿着特定的静脉旁路径(包括内部大脑静脉与后嗅区静脉)被清除。这些静脉直接引流到加伦大静脉(greatveinofGalen)和直窦(内部大脑静脉)和横窦(后嗅区脉)中(33)。如同动脉旁内流路线，AQP4定位于围绕微脉管的星形胶质细胞终足，并且这些大引流静脉为水和随附溶质流出到静脉旁隔室提供低阻力路径。这与如下观察结果一致：在无Aqp4的动物中，间质性溶质的总体流动依赖性清除降低约70％。这些静脉旁空间与硬脑膜窦之间的关系能提供低压接收器，与蛛网膜下空间内的动脉脉动组合，产生驱动血管旁CSF总体流动和ISF清除的动静脉流体静力梯度。在此环境中，围绕静脉的血管周围AQP4的表达高于动脉可以有助于维持ISF的低阻力清除路线。这受到如下观察结果的支持：相较于野生型动物，缺乏Aqp4基因的小鼠的脑实质展现扩大的细胞外空间(34)，这可以代表这些小鼠中存在向实质ISF总体流出抵消较高阻力的补偿性现象。血管周围星形胶质细胞AQP4定位错误或缺乏的小鼠，包括α-互生蛋白(35)、mdx(36)和Aqp4(37)基因剔除小鼠，展示肿胀的终足和血管周围星形胶质细胞的其它病理性变化。与血管周围终足处的骨架调节异常相关的这些变化可以解释所观察到的Aqp4基因缺失对间质性总体流动和溶质清除的影响。然而，后来的电子显微镜下研究报告无Aqp4的小鼠的BBB或血管周围星形胶质细胞终足中未发生明显的超微结构变化(38、39)，并且本发明的分析表明无Aqp4的小鼠的血管旁空间在整个皮层深度上具有结构完整性(图12A-E)。
虽然本实例表明间质性溶质是通过沿着静脉旁路径的AQP4依赖性总体流动来清除，但这些路径可能不一定是溶质从颅中清除的末端路线。根据早先研究，这种末端清除最可能出现两种路线。首先，溶质沿着脑微脉管和大引流静脉的移动提供溶质方便进入血脑屏障(BBB)到特定传输的机制。第二种可能性是沿着内部大脑静脉和后嗅区静脉引流到其相关窦的溶质借助于蛛网膜粒(22-24)清除到血流中，从而在BBB处为不与特定传输路径交互作用或具有饱和的特定传输路径的间质性溶质提供离开路线。
血管旁路径和疾病
在无Aqp4的小鼠中，这种路径的中断导致溶质清除失败的研究结果在临床上与神经退化性疾病有关，其中神经毒性沉积物的错误聚积导致疾病发展。波耳(Ball)等人已报告实质内注射的Aβ是沿着血管旁路径被清除(40)，而血管旁可溶性Aβ清除的失败已表明是阿尔茨海默病中细胞外Aβ聚集物形成和疾病进展的根本原因(41)。在本发明实例中，注射到脑实质中的荧光标记可溶性Aβ1-40沿着与其它荧光示踪剂相同的血管旁路径被清除并且放射性标记的Aβ1-40从间质中的清除在无Aqp4的小鼠中实质上减少。这是有价值的，原因在于阿尔茨海默病与反应性神经胶质增生和老龄化脑中所观察到的神经胶质增生增强有关(42-44)。反应性星形胶质细胞中的AQP4表达和定位在神经病理学条件下的改变(45)可能导致间质性总体流动错乱和所引起的神经毒性溶质(例如Aβ)的清除失败。
可溶性Aβ1-40从脑间质中的清除速度比大小相当的聚葡萄糖分子更快，表明特异性BBBAβ流出受体与总体流动依赖性清除之间可能发生交互作用(46、47)。Aβ沿着特定解剖学血管旁路径(包括深静脉系统)发生的清除提高了跨内皮Aβ流出在整个大脑脉管系统中可能不均一，但在某些专门化清除脉管中可能发生的可能性。沿着静脉旁清除路径移动的可溶性Aβ再进入脑室内(内部大脑静脉)或蛛网膜下空间(后嗅区静脉)中的CSF隔室。脑室路径提供通往脉络膜丛(一种可以促进Aβ从CSF隔室中清除的结构)的直接路线(48)。从水相中隔离到斑块中的Aβ(主要是Aβ1-42)不会被总体流动清除到跨内皮或脉络膜流出的远端部位，或不会被借助于CSF的总体清除作用清除。
这些实质液流动模式为多种治疗性途径提供路线。首先，提高AQP4依赖性总体流动效率能改进可溶性Aβ的清除，潜在地加快其降解或加快其再吸收到全身性循环中。反之，阻碍溶质清除能减缓治疗剂(例如抗肿瘤剂和免疫调节剂)从脑中的去除。AQP4依赖性总体流动还可以促进对脑实质的免疫监视而无损于CNS免疫特权。蛛网膜下CSF中的淋巴细胞与抗原呈递细胞(49)均可以检测通过静脉旁总体流出传递到CSF的间质性抗原。实际上，无Aqp4的小鼠在大脑内注射脂多糖之后展现减轻的神经炎症(50)。在无Aqp4的小鼠中，周边免疫反应的这种衰减可以是蛛网膜下CSF隔室中的抗原聚积减少的结果。这些血管旁路线还可以充当迁移细胞和其导向分子的路径，因此代表着肿瘤细胞迁移的潜在道路(51)。另外，血管旁路线可以是在分子上不同并且在功能上与成年脑实质中的细胞形成和迁移的血管周围生态位重叠的细胞迁移管道(52)。
虽然这种路径对于啮齿动物脑中的流体和溶质动态平衡具有重要作用，但是其对于人体中的间质性溶质清除也具有非常重要的作用。相较于简单扩散，总体流动的标志之一是溶质移动不依赖于分子大小(4、46)，原因在于所有溶质随着移动介质一起按相同的流体流动速率载运。相比之下，在简单扩散中，由于扩散速率依赖于分子大小，因此较大溶质从脑实质中清除到最近CSF隔室中需要较长的时间(16、46)。因此，尿素(分子大小：60道尔顿)在脑内扩散1cm需要5.4小时，然而白蛋白(分子大小：66.5kD)需要109个小时。基于这些值，赛瑟假设脑越大，间质性溶质(特别是较大分子，例如不能有效地借助扩散清除的肽和蛋白质)的有效清除对于总体流动的依赖性越大(16)。因此，在人类脑中，血管旁路径和AQP4依赖性总体流动对于脑功能的重要性比啮齿动物脑实质上更大。为了评价这种可能性，实例2中使用侵入性比本实例中所用的那些侵入性途径更弱的途径(例如磁共振灌注成像)来评估人体中的间质性溶质移动。
实例1中所引用的参考文献
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6.2.实例2：通过造影剂强化MRI捕获用于废弃物清除的MRI全脑血管旁路径
上文在实例1中所述的胶质淋巴系统是脑脊髓液(CSF)和间质液(ISF)交换的全脑血管旁路径，其促进溶质和废弃物从脑中有效清除。CSF沿着动脉旁通道进入脑与ISF交换，继而沿着静脉旁路径从脑中清除。因为可溶性淀粉状蛋白β清除取决于胶质淋巴路径功能，所以这种清除系统的失效可能会造成淀粉状蛋白斑沉积和阿尔茨海默病进展。本实例表明胶质淋巴路径功能能够使用临床上相关的成像技术测量。动态造影剂强化MRI用于在鞘内投与顺磁造影剂之后，使跨越大鼠脑的CSF-ISF交换可视化。表征胶质淋巴路径功能的特征，包括动脉旁CSF内流和分子大小依赖性CSF-ISF交换的可视化。全脑成像允许鉴别位于脑垂体和松果体腺体隐窝的两个主要内流节点，而动态MRI成像允许定义动力学参数以表征胶质淋巴CSF-ISF交换和溶质从脑中的清除。在评价活人脑中的阿尔茨海默病易患性和进展的方法中可以使用本实例中所展示的MRI途径。
概述
在经典模型中，脑脊髓液(CSF)由脑室的脉络膜丛主动地分泌，通过总体或脉动流动行进通过脑室系统，通过第四脑室外侧孔(foraminaofLuschka)和第四脑室正中孔(foramenofMagendie)、从第四脑室流入蛛网膜下空间中。CSF被认为从蛛网膜下空间、经由硬脑膜窦的蛛网膜粒再吸收到血流中，或沿着颅脑神经鞘、从颅腔通过，通过颈淋巴管排除(1、2)。沿着这种CSF柱的流体移动通常通过磁共振成像(MRI)测量。相位对比磁共振成像(MRI)可使CSF流动动力学可视化并且在临床上用于评价交通性脑积水相对于非交通性脑积水、常压脑积水和蛛网膜囊肿(3)。造影剂强化磁共振脑池造影术还可以在治疗自发性颅内低血压或CSF鼻液溢时用于鉴别CSF渗漏(4、5)。
实例1表明，与教科书中的CSF分泌和再吸收模型相反，大部分蛛网膜下CSF沿着血管旁空间再循环通过脑实质并且与间质液(ISF)交换。流体沿着这些血管旁路线和通过间质的流动受到通过星形胶质细胞水通道蛋白-4(AQP4)水通道发生的跨神经胶质水移动的支持并且促进间质性溶质(包括可溶性淀粉状蛋白β)从脑实质中的有效清除。实例1中这种路径(称为‘胶质淋巴’系统)的描述是基于活体内双光子和活体内荧光成像。脑切片活体内分析表明，这种路径代表着促进间质性溶质和废弃物有效清除的全脑解剖学系统，然而基于荧光的成像模式的局限性阻碍了三维(3D)方式直接评估全脑CSF-ISF流动动力学。
在本研究中，造影剂强化MRI是用于使活大鼠脑中的全脑蛛网膜下CSF-ISF交换可视化。初始研究(实例1)中所述路径的特征得到证实，包括蛛网膜下CSF示踪剂沿着动脉旁路线发生的总体流动依赖性内流和示踪剂向脑实质内和通过脑实质的移动。MRI的固有3D性质与各种处理模式组合使用，包括绘制随着时间跨越脑的CSF-ISF交换路径的聚类分析，以鉴别解剖学内流‘节点’和从脑实质中清除的路线。定义动力学参数以描述顺磁造影剂在整个脑容积中的内流和清除。根据这种路径在使可溶性淀粉状蛋白β从脑实质中清除方面所起的主要作用(如实例1所展示)，这种造影剂强化MRI量化途径能提供评价阿尔茨海默病(AD)易患性和疾病进展的全新策略的基础。
方法
手术准备
使用雌性史泊格多利大鼠(SpragueDawleyrats)(泰康尼克(Taconics)，体重：220-280g)。麻醉时，使用吸气室，用含有3％异氟烷的氧气诱导动物，接着使其接受腹膜内注射40mg/kg苯巴比妥(phenobarbital)(钠溶液，美国伊利诺伊州迪尔菲尔德艾默生医药公司(OVATION,Pharmaceuticals,Inc.,Deerfield,IL,USA))。允许动物在整个实验期间自主呼吸。安置无创监视器(脉博血氧测定、呼吸速率和直肠温度探针，纽约石溪SA仪器公司(SAInstruments,Inc.,StonyBrook,NY))以确保手术程序期间的充分供氧(O2饱和度大于97％)、通风(呼吸速率：每分钟50-65次呼吸)和正常体温(36.5℃-37.5℃)。将24号导管插入尾静脉中用于投与流体和强化麻醉。将动物定位于立体定位框(考弗仪器公司(KopfInstruments)，9号框)中并且将头弯曲到50度。在短暂的手术程序中，通过用1:1O2:空气混合物传递的异氟烷(0.8-1.2％)强化麻醉。
借助于中线背侧颈切口曝露环枕膜并且获得小切口以曝露下伏硬脑膜。借助于使用23号针所行的小型硬膜切开术，将填充有标准生理盐水的聚乙烯导管(6cm长，0.28mmID×0.61mmOD，(所罗门科学公司，普利茅斯密亭，宾夕法尼亚州)(SolomonScientific,PlymouthMeeting,PA))推入鞘内空间1mm并且固定并用超级胶密封。闭合围绕导管的皮肤切口。
MRI成像方案
手术之后，将大鼠翻转仰卧并且定位于定制的亚克力底座(acryliccradle)上，所述底座装配有头部固定装置和鼻罩用于传递补充氧气。动物的头定位于3.0cm定制射频(rf)接收器线圈顶上。再定位MRI兼容性无创监视器(脉博-血氧测定、呼吸速率和直肠温度探针，纽约石溪SA仪器公司)用于在动物经历MRI成像的同时连续监视生命体征。在成像期间，使用计算机辅助空气加热系统(纽约石溪SA仪器公司)将成像期间的体温严格地保持在36.5-37.5℃内。鞘内导管连接到PE20长管线，所述管线填充有在0.9％NaCl中稀释的顺磁MR造影剂并且附接到1cc注射器和微输注泵(巴克斯特AS50型输注泵，美国伊利诺伊州巴克斯特医疗保健公司(BaxterHealthcareCorporation,Illinois,USA))尾静脉导管用于维持水化(0.9％NaCl，4cc/kg/hr)和强化麻醉(5-10mg/kgIV)，如根据呼吸速率所引导，每隔2小时投与。
实验中使用两种不同的顺磁造影剂：(二亚乙基三胺五乙酸盐(Gd-DTPA)，分子量(MW)938D，新泽西州韦恩拜耳医疗保健医药公司07470)和GadoSpinTMP(聚合物Gd-螯合剂，MW200kDa，加利福尼亚州奥本美天旎生物技术公司(MiltenyiBiotecInc.,Auburn,CA)。为了通过造影剂强化MRI使胶质淋巴路径可视化，可以使两种不同顺磁造影剂在初始浓度下的T1缩短效应匹配，使得在远离注射部位的脑组织中随着时间产生的浓度递减是类似的。换句话说，使两种顺磁造影剂所诱导的T1效应匹配是重要的，因为它们注射到小脑延髓池中之后，它们将经由全脑胶质淋巴路径行进并且随着时间而逐渐稀释。为此，进行模拟物实验。
所有成像方案均用9.4T/20MRI仪器执行，所述仪器连接到布鲁克高级控制台(BrukerAdvanceconsole)并且通过Paravision5.0软件(马萨诸塞州比勒利卡布鲁克生物磁旋公司(BrukerBioSpin,Billerica,MA))控制。使用定制的3cm表面射频线圈作为接收器并且使用16cm直径的体积线圈(布鲁克)作为发射器。定位器解剖学搜索扫描之后，在矢状面或冠状面中获得3DT1加权FLASH序列(TR＝15msec，TE＝3.4ms，翻转角15°，NA＝1，FOV＝3.0×3.0×3.2cm，扫描时间＝4分钟5秒，采集矩阵大小为256×128×128(相对于256×256×256内插而得)，产生0.12×0.12×0.13mm的图像分辨率)。在所有实验中，置于动物头部附近的60mM(1:8体积比，在0.9％NaCl中稀释)Gd-DTPA模拟物用于成像强度在时间序列上的归一化。扫描方案由以下组成：三次基线扫描，随后借助于留置导管传递鞘内顺磁造影剂(0.17mMGadoSpinTM和21mMGd-DTPA)，同时MRI采集继续进行。按1.6μl/min的输注速率(总输注时间：50分钟)鞘内传递总共80μl顺磁造影剂。鞘内输注完成之后，3DMRI采集继续进行3.9小时。实验结束时，用过度剂量的戊巴比妥(Nembutal)使动物安乐死。
数据处理
通用MRI图像处理程序由以下组成：头部运动校正、强度归一化、平滑化和逐体元转换为基线信号的％。所述程序使用SPM8(万维网：fil.ion.ucl.ac.uk/spm)。首先，所采集的T1加权MRI图像可以作为DICOM文档形式输出并且转换成3DNIfti图像格式。其次，头部移动所造成的扫描到扫描图像重合失调可以通过每次扫描的刚体对齐、相对于时间平均化(平均)图像来校正。第三，可以通过使用以下表达式将体元强度除以参考模拟物的平均强度、相对于时间序列来将图像强度归一化：图像_归一化＝图像_原始/模拟物*1000；随后进行0.1mm半高全宽各向同性高斯平滑化。最后，可以使用以下表达式减去所有时间序列图像并且除以基线平均图像：(P(I,j,k)＝(I(I,j,k)-基线(I,j,k))/基线(I,j,k)*100)，以确保体元强度代表相对于平均基线图像的变化百分比。
对T1加权MRI在预选定的解剖学区域中随着时间测量的信号变化用于获得顺磁造影剂的区域性组织吸收量的时间“活性”曲线(TAC)。T1加权平均化基线图像以及造影剂强化T1加权MRI是用于在解剖学上引导所关注区域(ROI)的定位。根据近中线矢状面MRI，绘制每个半球的四个矢状面切片的ROI并且使用PMOD软件(PMOD3.307版，瑞士苏黎士普茂技术有限公司)将每个解剖学ROI的信号平均化。ROI包括脑垂体隐窝、松果体隐窝、嗅球、小脑、脑桥核和水管。每个ROI的TAC可以借助于PKMod模块提取。使用“梯形法则(trapezoidalrule)”计算每个ROI的曲线下面积(AUC)。计算出的AUC可以通过将每个动物的AUC除以特定研究所用的相应时间区间的数目来归一化，称为“平均曲线下面积(mAUC)”，计算如下：(mAUC＝AUC/(n-1))。此外，为了使传递到群组内每个动物的顺磁造影剂的量的潜在差异最小化，使用脑垂体隐窝(其代表造影剂的主要输入端和来源)的mAUC来使其它区域mAUC归一化。随后，使用双侧独立t检验，针对每个解剖学部位来比较两组之间的平均mAUC比率。
聚类分析
使用k均值聚类算法(PMOD3.307版，瑞士苏黎士普茂技术有限公司),根据每个4DT1加权MRI，在水管层面，基于类似动力学对四个矢状面切片的MRI图像中的体元执行非参数分段到分组。产生只含有脑的所关注容积罩用于聚类分析。所用聚类数(K)是由能够区分大脉管(例如基底动脉(包括脑垂体隐窝)和嗅动脉复合体)邻近体元的K确定。这是在交互式、全动物基础上进行的。每项分析使用50％百分位阈值(亦即仅50％的具有最高信号变化的像素)进行(使用TAC值平方的和)。使血管旁内流导管道得到最理想可视化的聚类数是4个聚类。目测检查四个聚类并且与对应的造影剂强化和解剖学MRI共寄存以验证与大脉管相关的聚类的位置。提取每个聚类的体元和TAC数目用于进一步处理。
荧光鞘内示踪剂成像
为了评价鞘内示踪剂向大鼠脑中的移动，对所固定脑切片中的异硫氰酸荧光素结合聚葡萄糖(MW500kD，FITC-d500)和德克萨斯红结合聚葡萄糖(MW3kD，TR-d3)进行较高分辨率的活体内荧光成像。选择与Gd-DTPA(MW约1kD)和GadoSpinTM(MW200kD)的分子量大致对应的FITC-d500和TR-d3。如上文详述进行鞘内注射。注射0.1％FITC-d500和TR-d3溶解于人造CSF中的混合物。注射后30分钟、60分钟和180分钟，动物穿心灌注4％多聚甲醛并且移出脑并在4℃进行后固定过夜。切100μm矢状面振荡切片机切片并且用ProlongAntifadeGold试剂和DAPI(英杰公司)安装。冠状面切片亚群另外在4℃用生物素化加纳籽(biotinylatedGriffonia)(斑得蕊(Brandeiraea))单叶绿绒蒿(Simplicifolia)凝集素I异凝集素B4(IB4，血管内皮标记；1:100，载体实验室(VectorLaboratories))对比标记过夜。使用Cy5结合的抗生蛋白链菌素(1:250，杰克逊免疫研究实验室(JacksonImmunoresearch))进行二次检测。使用10X物镜倍数、配有电动精密滑台和Microlucida软件(微亮菲尔德公司)的常规落射荧光显微镜(奥林巴斯)产生三通道全切片合成图像。通过激光扫描共聚焦显微镜(奥林巴斯)，在40X物镜倍数下进行高倍成像。
统计学概述
所有数据均以平均值±SD呈现。使用SAS9.2版(美国赛仕研究所公司)和XLSTAT2011版(美国纽约埃鼎软件公司)执行统计学分析，其中p值<0.05描述为显著差异。使用独立组双侧t检验，对Gd-DTPA与GadoSpinTM大鼠之间的区域性组织吸收差异(如解剖学所关注区域的平均‘曲线下面积’(mAUC)与脑垂体隐窝的平均mAUC之间的平均比率所表示)进行比较。根据K均值聚类分析推导出以下参数：1)三个解剖学区域中的每一个的体元总数；2)每个区域的时间加权聚类数目(体元数*AUC)；以及3)区域2和区域3的总时间加权聚类数目与区域1的时间加权聚类数目的比率。使用独立组双侧t检验，对Gd-DTPA与GadoSpinTM大鼠之间根据聚类分析所推导的这些参数中的每一个的平均值的差异进行比较。
模拟物MRI实验
制备两种造影剂(亦即Gd-DTPA和Gd-螯合剂GadoSpinTMp)的不同浓度的模拟物并且计算其在37℃的T1s。根据厂家说明书制备GadoSpinTMP；并且为了复原冻干物，将1cc无菌0.9％NaCl注射到含有33mgGadoSpinTMP的每个小瓶中，产生0.165mM溶液。注射剂是1-脱氧-1(甲基胺基)D-葡糖醇二氢[N,N-双[2-[双(羧甲基)氨基]乙基]甘氨酸基(5-)]硅铍钇矿(2-)(2:1)；并且用0.23ml0.9％无菌NaCl稀释0.01ml这种溶液，产生20.8mMGd-DTPA溶液。未经稀释复原的GadoSpinTMP和20.8mMGd-DTPA代表着初始溶液，不同浓度的模拟物是由初始溶液制得。因此，通过用无菌0.9％NaCl连续稀释20.8mMGd-DTPA来制备Gd-DTPA模拟物，获得1:10、1:20、1:40、1:80、1:160、1:320、1:640和1:1280体积比。类似地，使用与Gd-DTPA相同的体积比(1:9到1:1279)，由经复原的GadoSpinTMP溶液制备模拟物。使用与动物研究相同的MR参数：2D单切片FLASH序列(TR＝15msec，TE＝3.8ms，NA＝5)和26个翻转角(2°到80°)，在37℃扫描每种模拟物(0.5ml指定稀释液)。通过标准扰相梯度回波序列(FLASH)计算T1，表达式如下：
S ( &theta; , T E ) = S 0 ( 1 - e - T R / T 1 ) s i n &theta; ( 1 - e - T R / T 1 cos &theta; ) e - T E / T 2 *
其中S0、TR、TE、T1、T1、θ分别表示质子密度、重复时间、回波时间、横向弛豫时间、纵向弛豫时间和翻转角。拟合程序中使用内嵌于MATLAB7.1中的Nelder-Mead单工算法。图16(1:20体积比)描绘在两种造影剂的翻转角范围内的所检测信号变化。在图17中，T1s计算值相对于0.1(1:10比率)和0.01(1:100比率)范围内的顺磁造影剂浓度作图。如从图17可以看出，两种不同造影剂的T1's在递减浓度的广泛区间内是可比的。基于这些实验，假定0.165mMGadoSpinTM和20.8mMGd-DTPA在实验开始(鞘内输注开始)时产生几乎相等的T1效应。
结果
研究中所包括的所有大鼠在6小时成像实验期间保持生理上的稳定，其中呼吸速率在50-60次呼吸/分钟范围内、O2饱和度约98-100％、心率约300-370次跳动/分钟和体温36.5-37.5℃。虽然在投与顺磁造影剂之前获得的3DFLASHT1加权序列中，灰质-白质造影剂有限，但是可以鉴别若干主要解剖学结构，例如嗅球、海马体、松果体腺体、上丘脑、下丘脑、脑垂体腺体和小脑(图18A-B)。除后外侧脉络膜动脉复合体之外，较大动脉(例如嗅动脉、前侧大脑奇动脉、胼胝体周围奇动脉、中间内部额动脉)在近中线矢状平面中容易可视化(图18A和B)。
顺磁造影剂的血管旁内流
实例1表明，在小鼠中，CSF从蛛网膜下空间沿着与间质液隔室交换的动脉旁通道、经由维乔-罗宾空间快速进入脑。CSF向脑实质中的这种广泛‘逆行’流动与CSF分泌和再吸收的经典模型相反(1、2)。在这个实例中，第一目标是确定，在鞘内传递不同顺磁造影剂之后，是否可以通过造影剂强化MRI观察到CSF向脑中的血管旁内流。
图18A-J展示小分子量Gd-DTPA(图18C-E)和大分子量GadoSpinTM(图18F-H)在两个代表性大鼠中、在早期输注期期间的内流。T1加权MRI的动态时间序列明确揭露，时间依赖性解剖学血管旁内流路线包括1)顺磁造影剂到达小脑延髓池(图18C和F)并且沿着基底动脉传输(图18D和G)；2)造影剂出现于脑垂体隐窝(图18D和G)；3)沿着嗅动脉复合体继续传输并且进入嗅球(图18E和H)；以及4)经由后侧脉络膜动脉复合体(图18A)传输到松果体隐窝。
捕获Gd-DTPA和GadoSpinTM通过胶质淋巴系统传输的动态时间序列的电影明确表明小分子和较大分子在全脑分布上的差异(数据未显示；图19和20中显示电影的静态图像)。举例来说，GadoSpinTM诱导的信号变化出现并且沿着动脉旁/血管旁管道优先保持并且实质吸收稀少，而小分子量Gd-DTPA造影剂扩散进入脑实质则容易得多(数据未显示)。还明显的是，虽然两种顺磁造影剂的分子量不同，但是根据造影剂在小脑延髓池中出现的时间(在图18C和F中定义为‘0’分钟)，经由血管旁管道通过在很大程度上是类似的。松果体隐窝中出现的顺磁造影剂的数量存在一些可变性；并且在注射有Gd-DTPA的2只动物中，未观察到松果体隐窝中存在信号变化。然而，沿着胶质淋巴路径内流的血管旁性质在威利环层面上最清楚，其中高强度信号概述后连通动脉的出口(图18I)；以及沿着外侧眶额动脉(图18J)。
基于动态时间序列，明显的是，虽然Gd-DTPA和GadoSpinTM的分子量相差超过2个数量级，但是它们似乎以很相似的速率通过血管旁管道(图18C-H)。造影剂移动通过松果体隐窝时似乎停滞，典型地残留于这个脑池中，即使在超过2小时的冲刷之后(数据未显示)。血管旁造影剂移动无明显不同的观察结果(基于药剂分子量)与总体流动介导的流体传输一致，这已知为不依赖于分子大小(7)。使用造影剂强化MRI的这些数据证实实例1中的第一基本研究结果：CSF从蛛网膜下空间向脑实质中的总体流动主要沿着动脉旁路径发生。
分子大小对全脑Gd-DTPA和GadoSpinTM传输的影响
实例1中表明虽然小分子量示踪剂与大分子量示踪剂均能够沿着邻近动脉旁内流路径移动，但是从动脉旁空间进入周围脑间质受到限制(基于分子大小)。具体来说，较小分子量示踪剂(例如TR-d3(MW3kD)或ALEXA647结合卵白蛋白(MW45kD))容易传入间质中，而较大分子量示踪剂(例如FITC结合的2000kD聚葡萄糖(FITC-d2000，MW2000kD))仍局限于血管旁空间。猜测是，完全插入大脑微循环(8)中的重叠星形胶质细胞终足具有限制较大分子量物质从间质中出入的作用。基于这些研究结果，经预测，由于容易进入脑间质，因此相较于较大GadoSpinTM(MW200kD)分子，预期Gd-DTPA(MW938Da)在较大总脑组织容积中诱导信号变化(T1缩短)。使用不同的定量图像处理策略来测试这种假设。
首先在靠近血管旁内流大管道的主要解剖学部位测量顺磁造影剂的总‘时间暴露量’，其中造影剂吸收随着时间而明显可视化。具体来说，ROI细分成最邻近的胶质淋巴内流管道(即，脑垂体隐窝和松果体隐窝)和‘实质’ROI，例如脑桥核、小脑、嗅球和水管。为了比较这些子区域内的相对动力学，计算Gd-DTPA和GadoSpinTM的平均TAC并标绘于图21A-F中。在脑垂体隐窝内，Gd-DTPA和GadoSpinTM所诱导的信号强度变化的平均时程在整个研究期期间，在很大程度上相同(图21A)。对于松果体隐窝观察到类似的研究结果(图21B)这证明在胶质淋巴路径的邻近部分(定义为蛛网膜下空间和邻近血管旁通道)内，造影剂出入和流动在很大程度上不依赖于分子大小。相比之下，小脑(图21C)、水管(图21E)和脑桥核(图21F)内的Gd-DTPA和GadoSpinTM的平均TAC表明内流速率、达到峰值的时间和流出速率存在明显的药剂内部差异。在每种情况下，大分子量GadoSpinTM向这些区域中的明显内流大大滞后于Gd-DTPA。举例来说，在输注Gd-DTPA的大鼠中，小脑中的平均吸收量在注射后约90分钟时达到峰值，而在输注GadoSpinTM的大鼠中，小脑组织平均吸收量在注射后约120分钟时达到明显平线区。
还计算Gd-DTPA和GadoSpinTM在这些区域中的每一个内的的平均AUC值(mAUC)，平均AUC值反映传输和吸收速率。在脑垂体隐窝处，针对Gd-DTPA和GadoSpinTM所推导出的mAUC值分别是743±266％信号变化/时间区间和685±217％信号变化/时间区间(p值＝0.45)。当通过脑垂体隐窝的顺磁造影剂总量在每个组内的大鼠之间不同时，为了在比较组内和组间的顺磁造影剂的组织吸收量时使可变性最小化，所有区域性mAUC相对于脑垂体隐窝(代表胶质淋巴路径的最邻近部分和造影剂传递的主要‘来源’)的mAUC归一化。表1展示区域性mAUC比率分析的结果并且表明相较于GadoSpinTM，Gd-DTPA在小脑、水管和脑桥核中的组织吸收量显著高于GadoSpinTM。
表1：注射Gd-DTPA的大鼠与注射GadoSpinTM的大鼠之间的总组织吸收量的差异
区域 Gd-DTPA(N＝8)mAUC Gado-Spin(N＝6)mAUC P值
松果体隐窝# 1.01±0.35 1.13±0.53 0.629
小脑 0.28±0.11 0.11±0.08 0.007*
嗅球 0.24±0.11 0.16±0.06 0.113
水管 0.34±0.23 0.06±0.04 0.012*
脑桥核 0.17±0.09 0.03±0.02 0.002*
#Gd-DTPA组中的2只大鼠的松果体隐窝中无造影剂。数据表示解剖学所关注之区域的平均mAUC与脑垂体隐窝的平均mAUC之间的比率。结果以平均值±SD呈现；*P<0.05。
作为分析Gd-DTPA相较于GadoSpinTM的脑组织摄入和分布模式的第二非参数方法，对来自每只动物的导管程度的一系列4个正中矢状面切片进行聚类分析。这一分析的结果显示于图22A到J中。使用四个聚类(K＝4)进行血管周围导管的最佳观测。不同聚类与不同解剖学区域有关，包括与血管旁区域直接相关的组织(区1)，紧邻区1的组织(区2)和紧邻区2的最远端标记的体元(区3)。集群和相应区的分布模式显示于图22A到J中。在GadoSpinTM大鼠中，血管旁区1包括红色和橙色集群(图22B)并且绿色和蓝色集群分别包含区2和区3，并且表示较短实质胶质淋巴路径，例如嗅球和靠近垂体凹槽和松果体凹槽的组织(图22C，D)。来自GadoSpinTM大鼠的四个集群的TAC显示最近端血管旁导管(红色和橙色集群)，当与绿色和蓝色集群相比时其由最高信号改变(相对于基线值>300％信号改变)表示；并且另外，其表示最小隔室(图22I)。
在Gd-DTPA大鼠中，聚类分析类似地产生分布于三个主要解剖学区中的集群，然而，与GadoSpinTM相比时其包括全部脑组织。如图22A-J所示，在Gd-DTPA大鼠中，对GadoSpinTM观察到红色集群位于血管旁导管中(比较图22B和F)；并且绿色集群与较深组织区域(例如嗅球和小脑)有关(图22G)。然而，与GadoSpinTM形成对比，Gd-DTPA大鼠的蓝色集群体元包括小脑和脑桥核的大部分(图22G到H)，表明大分子量GadoSpinTM接近脑部胞间隙不如小分子量Gd-DTPA容易。来自Gd-DTPA大鼠的四种不同集群的TAC显示于图22J中。血管旁红色集群到达峰值的时间为约90分钟，这与GadoSpinTM大鼠的血管旁红色集群观察到的类似。换句话说，Gd-DTPA和GadoSpinTM的血管旁传输共用类似动力学。
表2中呈现Gd-DTPA和GadoSpinTM大鼠的聚类分析的量化结果。
表2：4个正中矢状面切片的聚类分析
表2阐述分析中包括的四个正中矢状面脑部切片产生的每一个集群的平均体元总数、三个不同集群/区TAC的AUC×每一个集群/区的体元数目结果。从表2可以看出，Gd-DTPA和GadoSpinTM大鼠的分派到区1的体元数目(血管旁区域)在类似范围内。然而，在Gd-DTPA大鼠中，区3的平均体元总数(图22D中的蓝色体元)显著高于GadoSpinTM观察到的平均体元总数(图22H中的蓝色体元；p值<0.05)。
为了进一步比较两个组内各集群之间的关系，计算区2的总时间-经加权集群数比第一区的比率(区2#体元*AUC/区1#体元*AUC)和区3的总时间-经加权集群数比第一区的比率(区3#体元*AUC/区1#体元*AUC)。这些比率表示研究期间穿过血管旁区域(区1)的造影剂(Gd-DTPA和GadoSpinTM)和穿过实质体元(区2和3)的造影剂之间的关系。其表示量化使用哪一种造影剂可以相对容易的从近端胶质淋巴内流路径(红色和/或橙色集群)传输到较深脑间质(绿色和蓝色集群)的方式。如表2中可以看出，Gd-DTPA大鼠中获得的平均区3#体元*AUC/区1#体元*AUC比率显著高于GadoSpinTM大鼠中获得的比率(Gd-DTPA：0.89±0.56相比于GadoSpinTM：0.25±0.22；p＝0.027，t-检验)。因此，这一非参数聚类分析明确确认尽管小分子量Gd-DTPA和大分子量GadoSpinTM享有大部分等效的近端胶质淋巴路径(包括蛛网膜下和初始血管旁隔室)，但大分子量GadoSpinTM到脑部胞间隙的进入量与Gd-DTPA相比显著降低。
胶质淋巴路径功能的基于荧光的成像
大鼠中鞘内注射造影剂时展示信号改变(T1缩短)的脑实质体积比小鼠中通过基于荧光的成像检测到的进入脑实质的荧光CSF示踪剂的渗透量显著更有限(实例1)。起源于鞘内传递的造影剂总量的差异的这一偏差与T1-经加权MRI的相对不灵敏性(相较于基于荧光的成像)组合来检测当分散于整个脑实质时低浓度造影剂诱导的信号改变。为了测试这一改变，荧光聚葡萄糖(FITC-d500和TR-d3；分别MW500kD和3kD)通过用于MRI研究的相同方案共同注射，并且通过活体内荧光显微法评估示踪剂渗透到脑部的途径和程度。
当通过常规落射荧光显微法以低功率(4×)成像时，总体荧光示踪剂分布与MRI成像研究的发现结果高度一致。示踪剂输注后30到60分钟，整个脑部的软膜表面下的密集荧光标记明显(图23A，F)。沿腹侧脑表面和沿松果体隐窝界限的示踪剂强度最大，因为其延伸到脑部并且与海马沟连接。在这些位置，渗透到组织中的CSF示踪剂大部分取决于分子尺寸，因为小分子量TR-d3容易从蛛网膜下空间进入实质，而大分子量FTIC-d500不会穿透越过软膜表面(图23A，F)。
注射后30分钟，进入脑部的血管旁CSF内流很明显(图23A-B)。如表1中所观察，血管旁内流几乎完全沿穿动脉周围的空间(图23C-D)而非沿静脉(图23E)发生。这包括除了起源于腹侧脑表面的大口径动脉之外，较小的穿透皮层动脉。与Gd-DTPA和GadoSpinTM之间观察到的分布差异相符，脑部的TR-d3和FITC-d500分布显著不同。注射后30分钟，剩余的FITC-d500局限于血管旁空间并且不进入周围实质。相比之下，TR-d3从血管旁空间容易地扩散进入周围实质并且被附近神经元吸收(图23C-D)。
实质内由Gd-DTPA诱导的信号改变在注射后60-80分钟达到峰值(图21C-D)，接着随着造影剂从脑实质清除而下降。注射后30到60分钟，全脑TR-d3荧光看似随着示踪剂从近端软膜表面和血管旁路径扩散以在整个实质中广泛分布而提高(图23A，F)。剩余的FITC-d500局限于血管旁空间，延伸到整个脑部的毛细管床中(图23G)。注射后180分钟时，脑部荧光强度从30和60分钟的值下降(图23H)，然而示踪剂存留在松果体凹槽附近的周围静脉旁路径中(图23I)。
论述
实例1显示胶质淋巴路径为可溶性淀粉状蛋白β从脑间质清除的关键促成因素，并且提出这一清除失效可能促成淀粉状蛋白斑块沉积和AD进展。鉴于这些发现，用于测量整个人类脑部的胶质淋巴路径功能和评估这一系统的抑制是否有助于AD产生和进展的临床预后测试的研发有巨大价值。本实例证实可使用临床上相关的成像技术、造影剂强化MRI测量胶质淋巴路径功能来观察全脑CSF-ISF交换。这证实在鞘内投予后，造影剂通过总体流动快速移动通过动脉旁路径到达垂体凹槽、嗅球和松果体凹槽处的主要内流节点。另外，不同脑实质区域内信号改变(T1缩短)的参数和非参数数据分析清楚地证实移动进入和通过间质的造影剂高度取决于顺磁性造影剂分子的分子量。从动态系列的造影剂强化MRI影像产生动力学参数并且限定为表征反映整个脑部的CSF-ISF交换速率的胶质淋巴系统功能。
实例1显示蛛网膜下CSF沿穿动脉周围的血管旁通道快速进入脑实质。本发明发现证明外部脑表面动脉(例如基底动脉、威利环的连通动脉和鼻动脉)构成较宽蛛网膜下空间和最终适当脑部内CSF的快速传输路径。在解剖学上，这些CSF传输路径可能对应于电子显微法研究(威勒和同事)中描述的软脑膜血管旁鞘(9-11)。小(<1kD)和大(约200kD)分子量造影剂以相当速率移动通过这些动脉旁空间，表明总体流动驾驶沿这些路径传输的CSF通量(7，12，13)。进入大鼠脑部的鞘内荧光标记的示踪剂内流的分析确认表面动脉周围的总体流动路径与较小穿动脉周围的那些连续并且提供CSF进入和通过脑间质的快速内流的直接途径。这些动脉旁总体流动路径包含便于从脑间质清除溶质和废弃物的全脑系统的主要组分。
血管旁空间与间质之间的CSF和ISF交换通过血管周星形胶质细胞终足产生，所述终足几乎延伸完全覆盖脑部微脉管(8)。因此，缺乏跨终足的特异性分子传输路径(例如离子转运蛋白或通道)的溶质必须另外穿过重叠终足过程之间的约20nm间隙以接近胞间隙。在实例1中，观察到例如TR-d3的小示踪剂(水合作用直径(dH)＝6.1nm(14))容易进入和通过间质，而大示踪剂(例如FITC-d2000(dH>32nm(14)))仍大部分局限于血管旁空间。在这一实例中，在大鼠中使用基于荧光的成像确认这些发现。另外，鞘内投予两种不同尺寸的造影剂Gd-DTPA(MW约1kD)和GadoSpinTM(MW200kD)用于通过动态造影剂强化磁共振成像证明示踪剂尺寸的类似作用。举例来说，当比较不同解剖学部位的两种造影剂的TAC时，大分子量GadoSpinTM以显著低于小分子量Gd-DTPA的速率进入脑实质(比较红色和蓝色曲线，图21A-F)。另外，独立聚类分析明确揭露尽管两种示踪剂具有到达血管旁空间的备用入口，但Gd-DTPA可进入的脑部体积显著大于GadoSpinTM可进入的脑部体积(比较蓝色区3，图22D，H)。尽管Gd-DTPA和GadoSpinTM之间的CSF-ISF交换模式中观察到的差异可能由于分子尺寸的差异，但也存在其它可能性。举例来说，例如形状、静电力、尺寸(回转半径)、构形或物理/化学相互作用等其它固有分子特性可造成使用两种造影剂分子观察到相异CSF-ISF交换模式。
在此实例中的实验方案下基于荧光的成像和基于造影剂强化MR的成像之间的一个明显偏差为鞘内注射后不能在全部脑实质中检测小分子量造影剂(Gd-DTPA)。这与小鼠中用小分子量荧光CSF示踪剂标记的广泛实质形成对比(实例1)。为了确认这些差异并不反映CSF-ISF交换中的物种差异，在鞘内注射类似尺寸的荧光CSF示踪剂之后在大鼠脑部切片中使用另外与用于MRI实验的方案相同的注射方案进行活体内荧光成像(比较FITC-d500(500kD)与GadoSpinTM(200kD)，并且比较TR-d3(MW3kD)与Gd-DTPA(MW约1kD))。这一基于荧光的成像确认小分子量CSF示踪剂渗透整个大鼠脑实质，而大分子量示踪剂局限于血管旁空间。因此，Gd-DTPA(如TR-d3)实际上迁移到整个脑实质。然而，目前鞘内输注方案下在仅仅广泛实质内实现的Gd-DTPA造影剂浓度对于诱发可检测信号改变(T1缩短)来说不够高。
不管这些局限性，MRI的固有3D性质允许观察整个全脑的全部血管旁CSF-ISF交换路径，允许我们定义在垂体隐窝、鼻动脉和松果体隐窝处进入脑部的CSF内流关键节点并且同时评定许多解剖学上不同部位处的CSF-ISF(图24)。通过动态图像采集，可以测量流入血管旁和间质空间的CSF示踪剂和从血管旁和间质空间清除的CSF示踪剂的动力学并且针对既定造影剂分子进行表征。举例来说，在Gd-DTPA注射后针对蛛网膜下垂体隐窝和松果体隐窝产生的TAC呈现类似内流特征，而从松果体隐窝的流出相较于从垂体隐窝的流出显著减缓(比较图21A和B)。类似地，针对小脑和水管产生的TAC显示类似内流动力学，而造影剂从水管的清除相较于从小脑区的清除延长(比较图21C和E)。从松果体凹槽和水管的清除拖延的一种可能解释是这些解剖学区域构成主要ISF清除部位，并且因此看起来保留造影剂(通过将其从其它区域积聚)维持较长持续时间。
动态时间连续数据的分析也允许基本比较小(Gd-DTPA)和大(GadoSpinTM)分子量造影剂之间的CSF-ISF交换。尤其重要的是应注意在垂体凹槽内，Gd-DTPA和GadoSpinTM内流和清除实际上相同(比较红色和蓝色曲线，图21A)，而在实质脑桥核中，移动进入和通过所述区域的GadoSpinTM相较于Gd-DTPA显著降低(比较红色和蓝色曲线，图21F)。使用第二方法，即聚类分析，可以在水管层面评估两种造影剂之间的CSF-ISF交换的空间分布模式。比较区3占据的原始脑部体积(对应于最末端隔室)或标准化平均区3#体元*AUC/区1#体元*AUC比率(这反映血管旁空间到脑实质的示踪剂渗透)，进入和通过脑间质的GadoSpinTM渗透相较于Gd-DTPA显著局限(表2)。因此，鞘内造影剂投予之后的动态造影剂强化MRI提供一种表征整个全脑的胶质淋巴CSF-ISF交换的动力学和空间分布的方法。
实例1证实胶质淋巴路径为间隙溶质(例如可溶性淀粉状蛋白β，一种广泛认为是AD发病机理的关键驱动因素的肽)的清除的重要促成因素(15，16)。实例1指示胶质淋巴路径功能失效可能造成淀粉状蛋白β斑块沉积和AD进展。在这一实例中论述的通过造影剂强化MRI评估大鼠中胶质淋巴路径功能工作提供用于评估人类脑部中的胶质淋巴路径功能的实验基础并且不论其是否失败都有助于人类中的AD进展。为了实现这一目的，测量胶质淋巴路径功能的安全微创成像方法是必需的。
造影剂强化MR脑池造影术目前临床上用于观察进行自发颅内低血压和CSF鼻漏治疗的患者中的CSF渗漏(4，5)并且用于本研究中的Gd-DTPA已经在临床上审批通过用于这一目的。尽管通过小脑延髓池的目前注射途径和所需的扫描时间(>2小时)在临床上不相关，但实例3证实单次鞘内腰椎注射用于评估脑部的胶质淋巴路径功能的适用性。
本发明实例证实在大鼠中，这一潜在地临床上可接受方法可用于观察和评估胶质淋巴路径功能，允许评定整个全脑的血管旁CSF-ISF交换模式的动力学和解剖学分布模式。这一方法可提供用于评估AD敏感性和疾病进展的完全新颖预后策略的基础。
实例2中所引用的参考文献
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6.实例1
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6.3.实例3：利用临床上相关的CSF示踪剂鞘内注射评估胶质淋巴路径功能
本实例证实腰椎鞘内造影传递为可与动态核成像结合用于评定人类中的胶质淋巴路径功能的临床适用方法。
概述
例如阿兹海默氏病(AD)的神经退化性疾病与内源性肽和蛋白质聚集有关，所述内源性肽和蛋白质聚集被认为是造成神经元功能不全和损失。如上文实例1和2中所证实，胶质淋巴系统为间隙溶质(包括淀粉状蛋白β)从脑部清除的关键贡献因素。这些发现表明胶质淋巴路径功能中的测量改变可能为评估神经退化性疾病敏感性或进展的重要预后。然而，尚未开发出可评估人类中的胶质淋巴路径功能的临床可接受方法。
在向枕骨大孔或腰脊柱中鞘内注射德克萨斯红结合的聚葡萄糖-3(TexasRed-conjugateddextran-3，TR-d3，MW3kD)和FITC结合的聚葡萄糖-500(FITC-d500，MW500kD)之后，在30、60、120和180分钟时进行大鼠和小鼠冠状面切片的时间定序活体内荧光显微法。接着在大鼠前脑和后脑中量化不同脑部区域(皮层、白质、皮层下结构和海马区)中的示踪剂含量以绘制示踪剂在两种注射途径之后的移动。
在脑池内和腰椎鞘内注射之后，小分子量TR-d3沿血管周路径进入脑部并且与脑实质大规模交换，与小鼠中的胶质淋巴路径的初始表征相符。剩余的较大分子量FITC-d500主要限于血管周空间。腰椎鞘内注射相较于脑池内注射显现降低和延迟的峰值荧光强度。
背景
例如阿兹海默氏病(AD)的致命神经退化性病症的特征为神经元进行性损失、感觉和运动障碍以及严重认知减退。认为可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)肽的胞外沉积和过度磷酸化τ在神经原纤维缠结中的聚积促成AD的病理生理学(哈迪和赛尔考,2002,斯莫尔(Small)和达夫(Duff),2008,马克尼(Maccioni)等人,2010)，而类似错误折叠蛋白质在其它神经退化性疾病(包括亨廷顿病和肌萎缩性侧索硬化(ALS))中聚集(布鲁因等人,1998,舍青格(Scherzinger)等人,1999,罗斯和普瓦里耶(Poirier),2004)。在AD的情形中，广泛地认为淀粉状蛋白沉积是由年龄相关的可溶性Aβ从脑部清除的失效引起(迪恩(Deane)和左柯维科(Zlokovic),2007)。尽管目前广泛使用神经成像方法检测淀粉状蛋白斑块沉积和斑块负荷演变(诺德伯格(Nordberg)等人,2010)，但不存在直接测量Aβ清除效率的方法。检测Aβ清除效率变化的能力将是评估对AD和其它神经退化性病症的易感性和所述病症的进展的显著进步。
实例1证实大部分蛛网膜下CSF沿血管旁空间通过脑实质再循环，在通过静脉旁路径清除之前与脑实质的脑部间质液(ISF)交换。CSF沿这一路径的连续循环促进从脑部清除胞外溶质，包括可溶性Aβ。基于通过星形细胞水通道蛋白-4水通道的星形胶质细胞水传输在促进CSF-ISF交换和溶质清除中的关键作用(实例1)，已将这一全脑路径称为‘胶质淋巴系统’。这些发现的一种含义在于，胶质淋巴路径功能改变可造成AD临床前阶段中Aβ清除失效，而测量临床群体中胶质淋巴路径功能的方法可能允许评估AD疾病易感性和进展。
胶质淋巴系统的初始表征采用脑池内注入的CSF示踪剂的活体内双光子显微法和活体内荧光成像来绘制所述全脑路径和量化小鼠中的溶质清除效率。因为基于荧光的成像的光学局限性和与人类脑池内注射有关的并发症，所以这些方法不适于临床应用(基恩(Keane),1973)。在临床环境中，例如正电子发射断层摄影术(PET)和磁共振成像(MRI)的动态核成像模态通常用于在自发颅内低血压(SIH)和创伤后CSF鼻漏或耳漏的诊断中监视CSF通量(伯恩斯(Burns),2008,达埃拉(Daele)等人,2011)。这些成像模态允许以示踪剂分布的高空间和时间分辨率对脑进行时间定序三维(3D)表示。在实例2的随访临床前研究中，在向小脑延髓池中鞘内注射基于钆的造影剂之后成功采用造影剂强化磁共振成像(MRI)来测量大鼠中的胶质淋巴路径功能。
与脑池内注射相比，目前使用腰椎鞘内注射放射性示踪剂与计算机X线断层摄影术/脊髓造影术和数字减影脊髓造影术来诊断与SIH、假性脑膜膨出和表面铁沉积病有关的硬脊膜漏(菲利浦等人,2002,霍克斯沃斯(Hoxworth)等人,2012)，以及损伤或肿瘤环境中的脊髓完整性(迦毗罗(Kapila),1987,亚当斯(Adams)等人,1988)。腰椎鞘内注射另外用于每日实施麻醉剂传递(波平(Popping)等人,2012)，并且将因此提供可与动态造影剂强化MRI结合用于评估人类中的胶质淋巴清除率的造影剂的理想传递途径。本发明临床前研究评估腰椎鞘内CSF示踪剂传递是否允许评估脑部的胶质淋巴路径功能。比较在大鼠脑部脑池内和腰椎鞘内注射荧光示踪剂的内流动力学和实质分布。数据表明通过两种途径注射的CSF示踪剂通过血管旁空间进入脑部并且以与实例1中小鼠中的胶质淋巴路径的上述表征相符的方式与实质交换。这显示腰椎鞘内注射为评定人类中的胶质淋巴功能的临床上切实可行的造影剂传递途径。
方法
手术准备
全部实验中都使用雌性史泊格-多利大鼠(Sprague-Dawleyrat)(200-230g；查士睿华实验室(CharlesRiverLabs),美国)。大鼠在标准实验室条件下圈养，可任意获取食物和水。全部实验都由罗切斯特大学动物资源大学委员会(UniversityCommitteeonAnimalResourcesoftheUniversityofRochester)批准并且根据美国国家卫生研究院(NationalInstitutesofHealth)的指导原则进行。大鼠用异氟醚(3％)初始诱导，接着用戊巴比妥钠(50mg/kg腹膜内)麻醉。根据需要补充戊巴比妥钠。对于脑池内注射，将麻醉的大鼠固定在立体定位框架中，以手术方式暴露枕骨大孔，并且向脑池中插入30GA针。对于腰椎注射，暴露腰椎脊柱，进行L2-3椎板切除术，并且向蛛网膜下空间插入30GA针。
示踪剂注射
在本研究中，使用两种不同荧光示踪剂：大分子量可固定异硫氰酸荧光素(FITC)结合的聚葡萄糖(500kD,FITC-d500；英杰公司)和小分子量可固定德克萨斯红结合的聚葡萄糖(3k,TR-d3；英杰)。示踪剂由浓度为0.25％的人工CSF构成。对于脑池内和腰椎注射，30分钟注射组的示踪剂以1.6μl/min的速率输注，而对于注射时间大于或等于60分钟的组，总量达到70μl时停止注射。在t＝注射开始后30、60或120分钟时，大鼠经贲门灌注冰冷肝素化PBS，随后4％三聚甲醛(PFA)。去除脑部，在4％PFA中固定后在4℃下隔夜，并且在振荡切片机(徕卡(Leica))上切割50μm冠状面切片并且与具有DAPI的PROLONGAnti-FadeGold(英杰)放在一起。
免疫萤光
对50μm切片独立组进行自由浮动免疫荧光标记。对于脑池内注射，使用来自60分钟时间点的各动物的8个切片。对于腰椎注射，使用来自120分钟时间点的各动物的8个切片。选择这些时间点是因为其与通过各别注射途径的峰值CSF示踪剂内流一致。在室温下在3％正常驴血清(杰克逊免疫研究实验室)中阻断切片1.5小时，在4℃下在小鼠抗神经胶质肌原纤维性酸性蛋白质(GFAP，星形胶质细胞标记物；1:1000，密理博(Millipore))或生物素化加纳籽(斑得蕊)单叶绿绒蒿凝集素I异凝集素B4(Ib4，血管内皮标记物；1:100，载体实验室(VectorLaboratories))培育隔夜。使用Cy5结合的驴抗小鼠二次抗体(1:500，杰克逊免疫研究)进行小鼠抗GFAP的二次检测并且使用Cy5结合的抗生蛋白链菌素(1:250，杰克逊免疫研究)进行Ib4的二次检测。在室温下在二次抗体溶液中培育切片2小时。洗涤后，全部切片与具有DAPI的PROLONGAntifadeGold(英杰)一直放置。
荧光成像
通过常规荧光显微法测量示踪剂移动到脑部中。在装配有机动平台的立式荧光显微镜(奥林巴斯)上使用麦克卢希达(Microlucida)软件(麦克布莱菲(Microbrightfield))对8个切片以4倍放大率产生全部切片3-通道蒙太奇(montages)。这包括独立DAPI绿色(针对FITC)和红色(针对德克萨斯红)发射管道。基于未注射对照切片测定增益和暴露设定并且整个成像阶段保持恒定。使用如实例1中所述的ImageJ软件(NIH)量化切片中的切片荧光(荧光示踪剂聚积)。基于DAPI发射通道产生针对皮层、白质(包括胼胝体、内囊和外囊)、皮层下结构(纹状体、丘脑、下丘脑)和海马区的解剖学脑部关注区(ROI)。均匀扣除各通道的背景荧光并且测量各区的平均像素强度。通过激光筛选共焦显微(奥林巴斯)在高功率下评估大分子量和小分子量CSF示踪剂在整个脑实质中的分布。免疫荧光标记的切片在40倍目标功率下成像。
统计分析
所有值都表示为平均值±SEM。使用邦费罗尼事后测试(Bonferroni'spost-hoctest)通过双因素方差分析(ANOVA)比较每个时间点和跨越交叉途径的强度来评估个别时间点的差异(格拉夫帕德普锐斯软件(GraphpadPrismsoftware))。‘P’值<0.05认为是显著的。
结果与讨论
在实例1中的小鼠研究中，使用2-光子体内成像证明存在允许CSF与脑实质的ISF交换的全脑血管旁途径，称为‘胶质淋巴’系统。沿这些血管旁路径的CSF-ISF交换由星形胶质细胞水通道蛋白-4水管道支持并且流体通过这一路径的移动促进间隙溶质(包括可溶性Aβ)从脑部清除。本研究的目的为评定在腰椎鞘内注射荧光CSF示踪剂之后是否可类似地评估胶质淋巴路径功能。与对小鼠进行的实例1相比，当前研究表征成年史泊格多利大鼠中的胶质淋巴流动。表征大鼠中胶质淋巴通量的这一选择将胶质淋巴功能的理解扩展到所属领域中视为人类治疗方法临床前模型的啮齿动物模型中，同时还转移到使得容易进行腰椎鞘内注射的模型中。平行进行脑池内CSF示踪剂注射以提供与事先使用的注射途径(实例1)的直接比较。通过脑池内示踪剂注射交换小鼠和大鼠中的成像CSF-ISF。
后颅窝池注射之后的鞘内CSF荧光示踪剂(TR-d3，MW3kD)移动到大鼠脑实质内。在图25A-H中，评估小鼠和大鼠中的脑池内CSF示踪剂内流和清除率。代表性前(图25A-B)和后(图25C-D)冠状面切片显示脑池内注射德克萨斯红结合的聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD；t＝注射后30分钟)之后的小鼠(图25A，C)和大鼠(图25B，D)脑部，显示物种之间类似的示踪剂分布。(图25E-H)评估不同脑部区域中的组织荧光：前(图25E-F)和后(图25G-H)脑部的皮层(蓝色)、白质(灰色)、海马区(洋红色)和皮层下结构(红色)。图25F和图25H显示每个区域内的平均荧光强度的量化(*P<0.05，皮层相对于皮层下结构；##P<0.01，相对于皮层；双因素方差分析；每个时间点n＝3-4)。
图25A-D显示来自小鼠和大鼠脑部切片的代表性影像，所述切片分别采取距前囟0点1.1和1.0mm前和1.5和0.4mm后，其在注射后30分钟固定(峰值荧光强度的时间点)。与小鼠中的先前研究(实例1)相符，观测到脑池内注射的TR-d3快速移动到大鼠脑实质中，两个都通过软膜表面和沿血管旁路径(图25B，D)并且与脑间质大规模交换。为了量化进入不同脑部区域的示踪剂移动，限定四个前(图25E-F)和后(图25G-H)关注区，包括皮层、白质、皮层下结构和海马区(图25E，G显示关注区)。分析全部活体内切片内或皮层、白质或亚皮层结构内的TR-d3荧光揭露注射后约30分钟达到峰值的脑池内注射的CSF示踪剂的内流，接着在随后时间点开始减退，因为示踪剂从脑部组织清除(图25F，H；每个时间点n＝3-4只动物)。
四个不同解剖学区域之间的示踪剂清除率分析表明皮层下结构的示踪剂清除率比皮层快(图25F，H；*P<0.05皮层相对于皮层下，双因素方差分析)。这与皮层下区域享有沿来自腹脑表面的大口径穿动脉的最大蛛网膜下CSF内流(实例1)的观测相符。此外，这些区域最接近沿内部大脑静脉剧中汲取的静脉旁清除路径。当比较前示踪剂通量相对于后示踪剂通量时，后脑中注射后30分钟的两个峰值和30-120分钟之间的清除速率相较于前脑较低(比较图25F，H)。这些观测与大鼠中的MRI发现相符，其中沿前穿动脉的胶质淋巴通量的量值比中侧动脉(例如中间大脑动脉)的后续分支更快和更大(实例2)。在前脑和后脑中，在所有时间点，白质中的TR-d3荧光强度显著低于皮层(图25F，H；##P<0.01相对于皮层，双因素方差分析)，而示踪剂从白质的清除速率看起来并不与其它脑部区域始终不同。白质荧光强度中的移位可能源于白质相较于灰质较低水平的组织自身荧光。或者，这可能反映先前研究中观测到的较低水平的CSF示踪剂渗透到皮层下白质中(实例1)。
腰椎鞘内注射后成像大鼠CSF-ISF交换
图26A-F显示分子量对腰椎鞘内注射后进入脑部的示踪剂内流的作用。图26A-B显示冠状面脑部切片，其显示大分子量FITC结合的聚葡萄糖(FITC-d500，MW500kD)和小分子量德克萨斯红结合的聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD)在腰椎鞘内共注射之后120分钟的渗透情况。FITC-d500在很大程度上局限于血管旁空间(图26B，箭头)，而TR-d3容易从血管旁空间(图26A，箭头)或从软膜表面(箭头)移动通过脑实质。图26C-F显示腰椎鞘内注射后进入前(图26C-D)和后(图26E-F)的荧光示踪剂内流的量化，其解剖学上细分成皮层、白质、皮层下结构和海马区。(*P<0.05，*P<0.01皮层相对于皮层下结构；##P<0.01皮层相对于白质；皮层相对于海马区；双因素方差分析；每个时间点n＝3-4)。
相较于脑池内注射的TR-d3(图25F，H)，通过腰椎途径传递的CSF示踪剂的内流显著延迟，在后脑中在注射后60分钟达到峰值，并且在前脑中在注射后120分钟达到峰值(比较图25F、H到图26C、E)。CSF示踪剂内流动力学中的这一延迟可能归因于两种因素。首先，与向小脑延髓池腰椎注射的部位的距离为约32mm。其次，脊髓蛛网膜下的CSF总体流动的主要方向为吻突到尾侧(恩兹曼(Enzmann)和佩尔克(Pelc),1991)，表明输注期间，CSF示踪剂必须跨越针对脑室中的CSF分泌产生的整体CSF流动的介入距离。除了荧光CSF示踪剂内流中的延迟之外，腰椎输注之后进入脑部的示踪剂内流的整体量值相较于脑池内输注显著降低。这一差异最可能为通过周边神经根沿脊柱发生的CSF再吸收的结果(艾斯巴吉(Edsbagge)等人,2004)。CSF示踪剂输注到腰椎蛛网膜下空间并且朝向脑部吻突移动，沿天然CSF清除路径沿各脊椎区段将丢失一部分，导致脑部周围的远端脑池空间的示踪剂传递降低，所述远端脑池空间形成全脑胶质淋巴系统到入口(实例1和2)。尽管内流量值和动力学中的这些差异，但腰椎和脑池内注射后的示踪剂分布遵照类似模式并且涵盖全部脑实质(比较图25B、D和图26A)。这些发现证明通过腰椎途径注射后容易观测进入和通过脑实质的荧光鞘内示踪剂内流。
大鼠腰椎鞘内示踪剂内流与分子量无关
CSF通过总体流动方法移动通过脑室和蛛网膜下隔室(赛瑟(Cserr),1971,阿博特(Abbott),2004,普雷托里乌斯(Praetorius),2007)。因为在总体流动下，溶剂的移动通常比被动扩散的溶质移动更快，总体流动依赖性移动很大程度上与分子量无关(赛瑟,1971)。为了评估进入脑实质的鞘内腰椎示踪剂内流速率是否取决于分子大小，共同注射大分子量荧光FITC-d500(MW500kD)和小分子量TR-d3(MW3kD)。这一研究的代表性影像显示于图26A-B中。当量化前和后皮层、白质、皮层下结构和海马区内进入脑实质的FITC-d500和TR-d3移动时，小分子量和大分子量示踪剂的时程或内流量值之间都未观测到显著差异(图26C-F)。这一发现与荧光示踪剂通过总体流动而非简单扩散从腰椎注射部位到脑部蛛网膜下和血管旁空间移动相符(赛瑟,1971)。
鞘内CSF示踪剂内流的血管旁路径
在小鼠中的先前研究(实例1)中，注意到尽管全部尺寸的CSF示踪剂沿血管旁空间快速移动到脑部，但例如FITC-d2000的大分子量示踪剂(MW2000kD)截留在血管旁空间中并且不能自由移动进入和通过脑间质。根据一项近期研究，星形胶质细胞终足工艺完全涵盖大脑微循环；血管旁空间与较宽脑间质之间的仅有途径为重叠星形胶质细胞终足之间的约20nm间隙(马斯森(Mathiisen)等人,2010)。推测血管周星形胶质细胞终足充当限定大溶质从血管旁空间向脑间质移动的筛(实例1)。
在本实例中，采用共焦显微评估血管旁内流路径与周围脑间质之间的小(TR-d3)和大(FITC-d500)荧光CSF示踪剂交换。分别在注射后30分钟和120分钟固定来自脑池内注射的动物和腰椎注射的动物的切片。这些时间点对应于针对各注射途径观测到的峰值内流值(图26A-F和图27A-L)。
图27A-L证明脑池内和腰椎鞘内注射后的CSF示踪剂位置。图27A-L显示FITC结合的聚葡萄糖(FITC-d500，MW500kD)和德克萨斯红结合的聚葡萄糖(TR-d3，MW3kD)在脑池内注射之后30分钟的位置。大分子量FITC-d500仍限制于围绕穿动脉(图27A-B)并且延伸到末端毛细血管床(图27C-F，箭头)层面的血管旁空间(箭头)。小分子量TR-d3快速移动到脑间质中并且被神经元亚群(箭头)吸收。图27G-L显示示踪剂在腰椎鞘内注射之后120分钟，大分子量FITC-d500在血管周空间(箭头)中聚集，但未如脑池内注射之后所观察到的那样均匀聚集。小分子量TR-d3容易在整个脑实质中移动。GFAP：神经胶质肌原纤维性酸性蛋白质(星形胶质细胞标记物)；IB4：异凝集素B4(血管内皮标记物)。
脑池内注射后，FITC-d500覆盖软膜表面并且沿血管旁路径分布到较深脑组织中，延伸到末端毛细管床层面(图27A-F)。其并未从血管旁空间明显迁移到周围间质中。当在腰椎注射后评估FITC-d500分布时，剩余的大分子量示踪剂以类似方式被限制于血管旁空间(图27G-L)，然而整体荧光强度相较于脑池内注射降低。脑池内和腰椎注射后，小分子量示踪剂容易移动到血管旁空间周围的间质中(图27A-L)。这些数据证明在大鼠中脑池内和腰椎鞘内注射之后，大分子量荧光示踪剂沿血管旁空间迁移到脑部，但仍被限制这一空间。相比之下，小分子量CSF示踪剂能够迁移到和通过脑间质。
结论
这一临床前研究证实三项发现。
首先，当在荧光CSF示踪剂注射到大鼠小脑延髓池之后评估胶质淋巴血管旁CSF-ISF交换时，脑内的示踪剂分布和动力学一般来说与小鼠中这一血管旁路径的初始表征相一致(实例1)。
其次，观测到除了脑池内途径之外，荧光CSF示踪剂通过腰椎注射后容易评估脑内的CSF-ISF交换。
第三，发现腰椎鞘内输注之后，沿血管旁路径的荧光CSF示踪剂移动取决于总体流动，而荧光示踪剂从这些血管旁空间移动进入和通过周围脑间质受限于示踪剂大小。
实例1描述全脑血管旁路径，CSF和ISF沿着其交换以促进间隙溶质(包括淀粉状蛋白β)从脑部清除。存在的这些发现表明淀粉状蛋白β通过胶质淋巴路径清除失效有助于淀粉状蛋白斑块沉积发作和AD进展。如果成立，那么临床测量患者中的胶质淋巴路径功能的能力将提供评估AD敏感性和进展的有效方法。
为了根据临床环境翻译胶质淋巴路径的初始表征，可使用用于评估胶质淋巴路径功能的临床上相关成像模态。实例2中的分析证实可在大鼠中在脑池内基于钆的造影剂注射之后使用造影剂强化MRI评估胶质淋巴系统。然而，脑池内注射很少用于临床环境，因为其医原性并发症(包括创伤组织损伤)的可能性高(基恩，1973)。相比之下，腰椎鞘内传递途径通常用于投予用于CT脊髓造影术的发射性示踪剂(亚当斯(Adams)等人,1988,霍克斯沃斯等人,2012)、脊髓麻醉剂和手术后镇痛剂(洪(Hong)和李(Lee),2005,戈林(Gehling)和曲巴(Tryba),2009)以及化学治疗剂(克尔等人,2001)。在这一实例中，已显示可通过这一临床相关路径使用示踪剂注射有效评估胶质淋巴路径功能。
实例3中所引用的参考文献
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6.4.实例4：重建或扩增脑脊髓液(CSF)分泌以清除老龄化脑部的毒素
正常脑脊髓液(CSF)分泌和与脑脊髓液(CSF)/间质液(ISF)交换有关的流动从脑部去除代谢废物副产物和毒素。这一实例涉及恢复或加强降低的脑脊髓液(CSF)分泌和/或与老龄化脑部中的脑脊髓液(CSF)/间质液(ISF)交换有关的降低的流量。为了实现这一目标，用于机械泵送系统促进较快清除。
在人类患者中，例如通过支线脑室或蛛网膜下空间进行CSF输注。阿兹海默氏病(AD)为这一方法的主要应用。目前，不存在将减缓或停止这一破坏性疾病的进展的治疗。
背景
哺乳动物脑部中的毒性功能异常蛋白质聚积与人类的许多神经退化性疾病(包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩性侧索硬化(ALS))有关。然而，导致老龄化脑部中毒素聚积的机制尚未完全获知。在阿兹海默氏病(AD)的情况中，两个标志为老年斑(其为淀粉状蛋白β(Aβ)毒素的胞外沉积物)和胞内神经原纤维缠结(过度磷酸化τ)。“淀粉状蛋白级联”假设表明认知减退和AD的不同病原学特征与这些毒素的异常聚积有关(赛尔考,2001；哈迪,2006)。
Aβ通过身体的许多细胞(包括脑部的神经细胞)从称为淀粉状蛋白β前驱蛋白(APP)的大蛋白质(通过蛋白酶β-分泌酶和γ-分泌酶裂解)产生Aβ来产生(赛尔考,2001)。在正常个体中，这些毒素以低浓度存在于脑部中，但在AD中，其积聚并且其存在为引起AD发病机理的主要事件(哈迪和赛尔考,2002)。在少数情况(<1％)中，Aβ聚积是由于其过度产生(早发AD)，而在大部分情况中，Aβ聚积是由于脑部的失效清除(迟发AD)(坦齐(Tanzi),2005；坦齐等人,2004；马文叶佳(Mawuenyega)等人,2010)。脑部中增加的Aβ含量导致形成神经毒性Aβ寡聚物和进行性突触、神经炎和神经元功能不全(马斯特和赛尔考,2012)。Aβ肽为脑实质和血管中的淀粉状蛋白β的主要构成(脑淀粉样血管病变)。从老年斑提取的Aβ主要为肽Aβ1-40(Aβ40)和Aβ1-42(Aβ42)，而血管淀粉状蛋白主要为肽Aβ1-39和Aβ40。脑脊髓液(CSF)和脑部中存在的Aβ主要可溶形式为Aβ40。可溶性Aβ在CSF和脑部间质液(ISF)中循环，可以游离肽形式存在和/或与不同结合蛋白(载体)缔合，例如载脂蛋白E(apoE)、载脂蛋白J(apoJ)、甲状腺素运载蛋白、白蛋白和α2-巨球蛋白(α2M)(迪恩等人,2009)。到目前为止，仅基于降低的脑部Aβ含量的疗法在临床试验中不成功(哈迪,2009)。
Aβ通过多种途径从脑部ISF消除，包括细胞摄入和分解、ISF总体流动和血脑屏障(BBB)介导的传输(迪恩等人,2009)。胶质淋巴系统为CSF/ISF交换的宏观全脑路径，其便于清除神经毒性代谢副产品，包括Aβ。胶质淋巴系统调控脑部ISF的对流并且类似于周边淋巴系统起作用。胶质淋巴系统包含三个主要路径：(1)通过动脉周空间的CSF，(2)脑部ISF通过脑实质的星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4)依赖性对流，和(3)通过静脉周清除的流出。然而，因为CSF沿穿动脉快速并且明确进入脑实质，所以胶质淋巴系统也可以用作全脑传递基本化合物以及移去毒性化合物的分布路径。另外，胶质淋巴系统可为清除脑部全部Aβ形式(结合和游离)的机制。
在老龄化脑部和AD中，CSF分泌降低(赛诺特等人,2003)。降低的CSF分泌与啮齿动物脑部的Aβ和τ聚积有关(丘(Chiu)等人,2012；西尔弗贝里等人,2010)。在轻度到严重AD患者中，CSF通过分流器连续排出不具有益处(西尔弗贝里等人,2008)。
这一实例证明通过胶质淋巴系统恢复或加强CSF流量和CSF/ISF交换并且使用机械泵或输注系统提高、加强或恢复毒性物质从脑部的去除，并且因此可防止老龄化脑部中的神经元功能损失。这一系统还可以恢复基本物质到脑部的传递。因为胶质淋巴系统为基本全脑系统，所以其已应用于与毒性物质在脑部聚积有关的许多疾病。
在这一实例中，人工CSF使用机械输注系统以低速率(0.1μL/min)输注到小脑延髓池中并且在其注射到脑部之后和CSF输注之前，测量外源性125I-Aβ和14C-菊糖在不同时间点(15、30和60分钟)的回收率。因为Aβ呈现与AD有关的肽而使用125I-Aβ并且因为菊糖为惰性分子和分子总体流动的标记物而使用14C-菊糖。
在第二实验系列中，CSF输注速率变化(0.1μL/min、0.5μL/min和1.0μL/min)并且125I-Aβ和14C-菊糖的回收率在注射到脑部之后30分钟测定。为了显示胶质淋巴系统为全脑方法，125I-Aβ和14C-菊糖注射到两个脑部区域，尾状核和额叶皮层中。CSF分泌到小鼠中的正常速率为0.37μL/min(大潮等人,2003)。获得的数据证实通过胶质淋巴系统恢复或加强CSF流量和CSF/ISF交换恢复毒性物质从脑部去除并且表明老龄化脑部中的神经元功能损失可通过提高胶质淋巴系统的CSF流量和CSF/ISF交换而延迟、减轻、降低或预防。
方法
脑部清除研究
简单来说，不锈钢导引管定位植入到麻醉小鼠(氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg))的右侧尾壳核或额叶皮层。对于尾壳核，导管尖端的座标为前囟之前0.9mm和前囟侧1.9mm，并且在脑表面下方2.9mm。对于额叶皮层，导管尖端的座标为前囟之前0.7mm和前囟侧3.0mm，并且在脑表面下方1.3mm。手术后使动物恢复。实验在实质性慢性方法发生之前进行，但如报告允许BBB修复成大分子的时间(迪恩等人,2004)。
注射示踪剂的混合物
含有125I标记的Aβ40(10nM单体)以及14C-菊糖(0.05μCi，用于总体流动的惰性分子)的模拟CSF(0.5μL)使用机械输注系统经5分钟微输注到脑部ISF。此类输注系统为所属领域中众所周知的。
组织取样
实验结束时，去除脑部并且准备用于使用所属领域中已知的标准方法的放射性分析和三氯乙酸(TCA)分析。
放射性分析
在伽马计数器(华莱克维扎德伽马计数器(WallacVizardGammaCounter)，珀金埃尔默(PerkinElmer))中测定125I-放射性。对于14C-计数，样品溶解于0.5ml组织增溶剂(珀金埃尔默)中隔夜，随后添加5ml闪烁混合液(帕卡德UltimaGold(PackardUltimaGold))并且在液体闪烁计数器(帕卡德Tri-Carb2100TR(PackardTri-Carb2100TR),珀金埃尔默)中分析。
计算
清除参数的全部计算都是用如上文和迪恩等人,2004中披露的标准方法进行。简单来说，微注射之后脑部剩余的放射性百分比以脑部回收率％＝100×(Nb/Ni)来计算，其中Nb为实验结束时脑部剩余的放射性并且Ni为注射到脑部ISF的放射性，即14C-菊糖的d.p.m.和三氯乙酸(TCA)可沉淀的125I-放射性的c.p.m.。菊糖用作既不传输通过BBB也不被脑部保留的代谢惰性极性分子；其清除速率提供ISF总体流动的量度。
结果
CSF输注到尾状核中之后CSF输注速率对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
首先将小体积(0.5μL)的含有125I-Aβ40(10nM)和14C-菊糖的模拟CSF(0.05μCi)微注射到尾状核中，并且立即以0.1、0.5或1.0μL/min将CSF输注到小脑延髓池中持续30分钟。实验结束时去除脑部并且分析放射性。图28显示脑部剩余的Aβ40含量和菊糖含量随着CSF输注速率进行性降低。Aβ40和菊糖的脑部清除随着CSF输注速率增加。
CSF输注到尾状核中之后CSF输注对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
图29A-B显示在0.1μL/min的CSF输注速率下，在注射到尾状核之后脑部剩余的Aβ40含量(图29A)和菊糖含量(图29B)随着输注持续时间逐渐降低。因此，Aβ40(A)和菊糖(B)的脑部清除随着CSF输注持续时间增加。
CSF输注到额叶皮层中之后CSF输注持续时间对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
图30A-B显示注射到额叶皮层之后30分钟(图30A)和60分钟(图30B)并且在到小脑延髓池0.1μL/min的CSF输注速率下，脑部剩余的Aβ40含量和菊糖含量。CSF输注提高Aβ和菊糖的脑部清除率。因此，CSF输注到CSF隔室可用于改善、提高或恢复毒性物质从老龄化脑部的清除率。因为老龄化脑部和患有阿兹海默氏病的个体脑部中CSF分泌速率降低，恢复这一流量和CSF/ISF交换可用于减少Aβ聚积和延迟认知减退和/或神经元功能不全发作，减轻或预防认知减退和/或神经元功能不全。这一方法可潜在地应用于任何年龄相关性神经病症。
实例4中所引用的参考文献
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6.5实例5：使用正电子发射断层摄影术(PET)与鞘内2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(18FDG)组合的评估全脑血管旁路径用于废物清除功能的方法
这一实例证实使用动态整合MRI-PET成像与鞘内投予顺磁性造影剂和两种不同18F标记的放射性同位素的组合描绘活啮齿动物脑部的胶质淋巴传输的方法。在某些实施例中，这些方法用于评估临床领域中通过胶质淋巴路径的废物清除。
这一实例还描述可用于在人类中实施这一技术的临床方案。
6.5.1通过动态整合MRI-PET成像的啮齿动物脑部的胶质淋巴传输
史泊格多利大鼠(2-3个月龄雌性)用苯巴比妥麻醉并且放置腰椎鞘内导管。使用针对大鼠脑部的定制MRI相容PET扫描仪与9.4TmicroMRI(ref)的组合进行成像。9.4TmicroMRI仪器内部使用的PET相机已在别处详细地描述(Refs)。简单来说，这是初始RatCap检测器(参考)的改进并且用非磁性材料(参考)设计。PET环(ID38mm并且适应大鼠头部)由12个检测器区块组成，所述区块由以下各项组成：2.22×2.22×5mm3氧正硅酸镥(LSO)晶体的4×8阵列，所述晶体装配有薄反射箔并且耦接到匹配非磁性S8550APD阵列(参考)。PET数据通过光纤转移到基于外部(PCI)的数据获取板(参考)。为了同时PET/MRI成像，使用配适PET环内部的定制体积RF线圈。全部实验中使用的9.4TmicroMRI为超导水平孔磁体(布鲁克拜厄斯宾94/20(BrukerBiospin94/20),400MHz,马金科科学(Magnexscientific))，其与布鲁克高级控制台介接并且由Paravision5.0软件(布鲁克拜厄斯宾(BrukerBioSpin),比勒利卡(Billerica),马萨诸塞州(MA))控制。磁体配备有主动屏蔽组合的RT-匀场和梯度系统(B-GA12S)，其可产生的最大梯度强度为200mT/m。9.4T磁体还装备有延伸穿过磁体的整个孔的专门设计的塑料支撑管，其与具有减少噪音的同心泡沫衬垫的梯度组分离(这一配置减少成像期间梯度产生的振动噪音)。支撑管足够大以容纳两个用于PET-MRI成像的其它塑料管组件；一个管用于确保RF线圈在PET环内部并且另一个用于在PET-MRI装置内精确定位动物，所述装置位于磁体中心(图31A-C)。
在鞘内输注Gd-DTPA和18F标记的同位素的混合物(总量：60μl)期间和之后，大鼠以仰卧位置成像。同步获取动态MRI和PET影像；包括3DT1-加权FLASH序列(TR＝15ms,TE＝3.8ms,NA＝1,FOV＝3.0×3.0×3.2cm,扫描时间＝4.1min,图像解析度0.12×0.12×0.13mm)和单列表格模式的PET获取，空间分辨率1.2mm。测试与Gd-DTPA(人工CSF中的20.8mM)混合的两种不同18F标记的同位素：i)0.5mCi[18F]氟和ii)0.5mCi2-脱氧-2-(18F)氟-D-葡萄糖(18FDG)。如先前所述重构MRI数据(参考)。PET数据使用迭代最大似然期望最大化(MLEM)方法重构并且包括针对衰退和使用期限的最终校正。执行PET-MRI图像融合并且标准化，并且登记到分段大鼠脑部图谱模板(PMOD)。
图32A-F中所示的实验结果证明鞘内18FDG如图32D所示快速移动通过全脑胶质淋巴路径，显示主要脑部区域的18FDG时间-活性曲线几乎相同。相比之下，DTPA和18F移动通过具有一些‘约束’的胶质淋巴路径。这些数据提供鞘内投予18FDG可提供胶质淋巴路径功能的快速量化和短暂评估的原理证明。鞘内投予的18FDG的这些特征使其对于临床应用理想。
6.5.2评定人类脑部中的胶质淋巴传输的临床方案
临床前数章节(上文章节6.5.1)中提出的方法如下转移到人类。进行逐步试验。在第一步中，使用组合SPET-CT研究进行放射性核脑池造影术的人类患者中的脑部摄入鞘内注射的111-InDTPA(使用常规方法)。在第二步中，类似地研究人类患者中鞘内注射的18FDG。针对这一目的使用鞘内18FDG的优势为：
通过胶质淋巴路径摄入和传输相较于DTPA产生快得多；并且这加快所述测试。
如果18FDG为人类患者中的脑池造影术效力，那么其又可以在多个临床环境中以诊断方式用于例如评估正常压力脑积水(NPH)、脑脊髓液(CSF)渗漏和评估处于AD风险中的患者的胶质淋巴废物清除。
6.6实例6：老龄化脑部中的全脑胶质淋巴路径功能减弱
这一实例证实老龄化脑部中的全脑胶质淋巴路径功能减弱。
图33A-F.老龄化脑部中胶质淋巴血管旁CSF内流减弱。(A)通过体内双光子显微镜评估麻醉小鼠皮层中的血管旁CSF内流。脑血管系统用动脉内德克萨斯红聚葡萄糖(70kD，TR-d70)界定并且皮层动脉(箭头)和静脉(箭头)根据形态界定。脑池内注射10μl荧光CSF示踪剂(FITC结合的聚葡萄糖，40kD；FITC-d40)，同时通过封闭的颅脑窗准备来使血管旁示踪剂内流可视化。(B)对血管旁CSF内流到皮层表面下方的皮层100μm进行的量化展示，相较于年轻(2-3月龄)脑，血管旁CSF向老化(12个月)皮层中的内流显著减缓(*P<0.05，12个月相对于2-3个月，双因素重复测量方差分析；每组n＝4)。(C-D)CSF示踪剂当其首先沿着脑表面动脉(C1-C6)进入皮层、接着当其移动到周围间质中时沿着贯穿性微动脉(此处是在皮层表面(D1-D6)下方100μm处成像)的代表性连续成像。(E-F)CSF示踪剂进入老龄小鼠(12个月)皮层的代表性连续成像展示，CSF示踪剂首先沿着脑表面血管系统(E1-E6)的血管旁空间的移动以及其向皮层间质(F1-F6)中的移动减缓。这些数据证明老龄化小鼠皮层中的胶质淋巴路径功能显著降低。
图34A-E.老龄化脑部中的全脑胶质淋巴路径功能减弱。通过活体内荧光成像来评估麻醉小鼠脑部中的胶质淋巴路径功能。(A)将两种不同荧光CSF示踪剂(德克萨斯红结合的聚葡萄糖，MW3kD，TR-d3；卵白蛋白结合的ALEXA647，MW45kD，OA-647)共同注射到小脑延髓池中。30分钟后，将动物灌注固定，在振荡切片机上将脑切片，并且通过双通道常规荧光显微镜对冠状面切片成像。(B)CSF示踪剂内流的量化揭露胶质淋巴路径功能的年龄相关障碍，因为相较于幼龄(2-3个月)小鼠脑部，低分子量TR-d3和高分子量OA-647在老年(18个月)小鼠脑部中的内流均显著减弱(*P<0.05，***P<0.001相对于2-3个月；方差分析；每组n＝5-8)。CSF示踪剂向中龄(10-12个月)脑部中的内流是幼龄脑部与老龄脑部之间的中间值。(C-E)代表性影像显示在2-3个月(C)、10-12个月(D)和18个月(E)脑部之间，荧光CSF示踪剂内流的差异显示随着年龄增长，特别是距离软膜表面越远，示踪剂内流出现明显障碍。
图35A-J.胶质淋巴路径功能的区域特异性年龄相关障碍。通过CSF示踪剂内流的活体内全切片荧光成像来评估麻醉小鼠脑部的胶质淋巴路径功能。将小分子量示踪剂(德克萨斯红结合的聚葡萄糖，MW3kD，TR-d3)和大分子量示踪剂(卵白蛋白结合的ALEXA647，MW45kD，OA-647)注射到小脑延髓池中，并且30分钟后将动物灌注固定。评估经核染剂DAPI对比染色的矢状面(A、C)和冠状面(B、D)切片中的荧光CSF示踪剂内流。对CSF示踪剂跨越全脑的内流的评估揭露，除老龄脑部的各区域之间对年龄相关胶质淋巴路径失效的敏感性不同之外，幼龄脑部内的各区域之间存在CSF内流的差异。(E-J)前脑(E)和后脑(H)都分成所关注的总体区域并且根据区域来评估OA-647内流。一般来说，相较于幼龄(2-3个月)皮层，老龄(18个月)皮层中的胶质淋巴路径功能发生最显著的减弱，其中相较于前部皮层(F)，后部皮层(I)中观察到更大的衰减(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001相对于2-3个月，方差分析；每组n＝4)。相比之下，胶质淋巴CSF向皮层下区域中的内流相对小于在皮层中所观察到的内流，同时这些皮层下区域内的年龄相关障碍类似地发生静默(G、J)。
图36A-B.老龄脑部的间质淀粉状蛋白β清除障碍。
通过放射性示踪剂清除分析来评估间质性溶质从老龄化脑部的清除。(A)将痕量放射性标记的125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖共注射到幼龄(2-3个月)、中龄(10-12个月)和老龄(18个月)麻醉小鼠的尾状核中。1小时后，将动物处死，收集脑部，并且通过γ粒子计数和液体闪烁计数来量化脑部组织内的残余放射性。(B)在老龄脑部中，相较于幼龄脑部中的清除，125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖的清除都显著减缓(***P<0.001相对于幼龄，方差分析；每组n＝8)。125I-淀粉状蛋白β1-40和14C-菊糖从中龄脑部的清除是幼龄与老龄脑部之间的中间值。这些数据证明老龄化脑部的胶质淋巴路径功能显著降低，包括间质淀粉状蛋白β清除功能。
图37A-E.老龄化脑部中的大脑动脉脉动降低。
通过体内双光子显微法评估麻醉小鼠中的脑血管脉动。(A-B)脑血管系统通过动脉内注射荧光德克萨斯红结合的聚葡萄糖(70kD)来可视化。脑表面动脉和静脉(A)以及穿动脉和上升静脉(B)根据形态来鉴别。(B)中的插图显示实验中所成像的XYZ体积的正交XZ和YZ投影。(C-D)脑表面动脉和静脉、穿动脉和上升静脉通过高频行扫描来鉴别和成像。所得X-t(时间)曲线加以阈值化以改进对比度，从而可测量每次心搏循环所引起的血管直径变化。对血管直径在3秒间隔期间的变化关于平均血管直径进行积分，以定义称为血管‘脉动性’的参数。(E)相较于幼龄(2-3个月)脑部(每组n＝2-4)，老龄(18个月)脑部的穿动脉中所测量的脉动性降低。在脑血管树的其它元素中未观察到明显的差异。这些数据证明老龄化脑部中的胶质淋巴路径功能的一个驱动力(动脉脉动)降低。
图38A-D.老龄化不会改变皮层胞外体积分率但会改变扭曲度。
如先前所描述在唤醒和麻醉皮层中通过体内四甲基氨电生理学评估扩散参数(胞外体积分率，α；扭曲度，λ)(谢(Xie)等人,科学2013，以全文引用的方式并入本文中)。(A-B)老龄脑部(18个月)和幼龄脑部(2-3个月)之间未观察到胞外体积分率差异(A)；而在老龄化脑部中，睡眠脑部相对于清醒脑部的胞外空间的明显扩大保持不变(B)(***P<0.001，清醒相对于睡眠，双因素方差分析，每组n＝9-20)。(C-D)虽然未指出老龄皮层相对于幼龄皮层中的清醒或睡眠扭曲度的整体差异(C)，但在老龄化脑部中观察到睡眠-清醒关系在扭曲度数值上的变化(D)。在幼龄脑部中，清醒状态与睡眠状态之间的扭曲度数值并无不同。相比之下，在老龄化脑部中，睡眠开始伴随着细胞外扭曲度的显著提高(***P<0.001清醒相对于睡眠，双因素方差分析，每组n＝9-20)。这些数据证明老龄化脑部的脑部胞外空间的组成(材料和空间)改变，此可成为老龄化脑部中观测的胶质淋巴路径功能障碍的基础。
图39A-F.老龄化脑部中改变的血管周AQP4表达。
通过免疫荧光双重标记，随后通过激光扫描共聚焦显微镜来评估皮层AQP4和GFAP表达的变化。(A-B)代表性影像显示，在幼龄脑部(2-3个月)中，AQP4表达几乎完全局限于血管周围星形胶质细胞终足(箭头)。在老龄化皮层(18个月)中，AQP4定位偏移而包括不严格位于血管周围的细微星形胶质细胞过程(箭头)。(C)终足域中AQP4表达的量化显示，在老龄化脑部，在脑大血管周围观察到血管周围AQP4表达稍微降低，但脑毛细血管周围则不然(*P<0.05，18个月相对于2-3个月，t检验；每组n＝4)。(D)相比之下，老龄化脑部中的AQP4定位显著偏移。在幼龄脑中，AQP4极化极其显著，在血管周围终足中仅保留低水平的AQP4表达。在老龄化脑部，总体AQP4表达稍微增加，而直接围绕脑大血管的区域展现剧烈增加的AQP4。因此，在老龄化脑部，脑大血管周围的AQP4失去其严格的血管周围极化，而微血管极化在很大程度上保持完整。(E)未观察到反应性星形胶质化的标记GFAP具有这种特异性。在老龄化脑部，脑大血管周围与脑微血管周围的血管周围GFAP表达都显著升高(***P<0.001，18个月相对于2-3个月，t检验；每组n＝4)。(F)类似地，当根据空间评价GFAP表达时，在整个皮层中全面地观察到GFAP表达增加，并且未观察到大血管与微血管之间存在GFAP表达的差异。
图40A-C.AQP4表达和极化的区域性差异。
通过免疫荧光双重标记、激光扫描共聚焦显微镜和先前定义的图像分析方法(王等人，神经科学杂志2012(Wangetal.JNeurosci2012)；任等人，脑血流和代谢杂志2013(Renetal.JCerebBloodFlowMetab2013))，评估AQP4表达(A)、AQP4极化(B)和GFAP表达(C)在前脑切片和后脑切片内的整个所关注定义区域中的变化。(A)颜色强度图描绘2-3个月和18个月脑部的区域性平均AQP4免疫荧光强度。量化每个区域中的AQP4表达时，未注意到幼龄脑部与老龄脑部之间存在AQP4表达的显著变化。(B)AQP4“去极化”定义为其中AQP4免疫荧光等于或大于血管周围AQP4免疫反应性的组织区域(较详细描述提供于任等人，脑血流和代谢杂志2013中)。因此，较高数值反映血管周围AQP4极化的丧失，或AQP4“去极化”。如颜色强度图中所示，AQP4极化的明显丧失出现于老龄化脑部中。极化显著丧失在整个皮层和皮层下结构中是明显的(*P<0.05，**P<0.01相对于2-3个月；双因素方差分析；每组n＝4)。(C)根据GFAP阳性星形胶质细胞过程的区域覆盖率来评估GFAP表达。颜色强度图展示老龄化脑部中的GFAP覆盖率增加。这些变化在皮层中最显著，但在皮层下结构中也观察到(*P<0.05，**P<0.01相对于2-3个月；双因素方差分析；每组n＝4)。
图41A-J.AQP4极化为皮层胶质淋巴路径功能的关键决定因素。
评估不同前脑和后脑区域中的反应性星形胶质化(GFAP表达)、AQP4表达、AQP4极化和胶质淋巴路径功能(脑池内注射的CSF示踪剂的内流)之间的相互关系。向动物脑池内注射卵白蛋白结合的ALEXA-647(OA-647，MW45kD)。30分钟后，将动物固定，并且将脑切片。前脑和后脑切片通过AQP4和GFAP的免疫荧光双重标记法加以标记。评估整个前脑和后脑的不同所关注区域中的OA-647内流(A)、AQP4表达(B)、AQP4去极化(C)和GFAP表达(D)。(A-D)颜色强度图描绘2-3月龄与18月龄之间的胶质淋巴OA-647内流、AQP4表达、AQP4去极化和GFAP表达的相对增加(红色数值)相对于减少(蓝色数值)。在上述图40A-C中，数据图形表示以柱形呈现。(E-I)评估每个区域中的AQP4表达、AQP4去极化和GFAP表达之间的关系，评估汇集2-3月和18月的数值，接着对成对的OA-647/AQP4表达、OA-647/AQP4去极化和OA-647/GFAP表达数值进行线性回归分析。最强结合用趋势线描绘于每个图中，并且提供相应r2和P值(对于非零斜率)。(E)在皮层中，AQP4极化的变化与胶质淋巴路径功能最强烈相关，其中AQP4极化的丧失强烈对应于胶质淋巴CSF示踪剂内流的减弱。(F)在海马体内，胶质淋巴路径功能、AQP4表达、AQP4极化或GFAP表达之间强相关性不明显。(G-J)在纹状体、外侧隔核、丘脑和下丘脑内，AQP4表达(未极化)与胶质淋巴路径功能最强烈相关。有趣的是，这是正相关的，在这些区域内，增加的AQP4表达与增加的胶质淋巴CSF内流相关。这些数据表明，血管周围AQP4极化是大脑皮层中的血管旁CSF内流的主要决定因素，而在皮层下组织中，总体AQP4表达可以是胶质淋巴路径功能的更重要决定因素。
图42A-F.创伤性脑损伤(TBI)导致AQP4血管周围星形胶质细胞终足的极化定位丧失。
(A)描绘小鼠中等TBI模型的示意图。用异氟烷使小鼠短暂麻醉，用细绳通过其门牙悬挂，并且通过气动控制的皮层撞击装置传递经校准的瞬时撞击。动物落在下伏垫上并且从麻醉中快速苏醒。(B-F)TBI之后28天，通过免疫荧光双重标记和激光扫描共聚焦显微镜来评估AQP4定位和GFAP表达。如全切片合成图像(B-C)中所示，TBI之后，持久反应性星形胶质化在同侧颞叶皮层中保持28天。在高倍物镜下评估AQP4定位时，TBI之后，AQP4极化无明显变化是显而易见的(将对照皮层(D)与对侧皮层比较时)，原因是AQP4定位主要局限于血管周围的星形胶质细胞终足(箭头)。在同侧皮层(F)中，GFAP阳性反应性星形胶质细胞展现AQP4极化的深度丧失，其中AQP4表达均匀分布于细微过程与围绕脑血管(箭头)的那些过程之间。这些结果表明TBI导致血管周围AQP4极化的长期丧失。
图43A-J.TBI之后间隙溶质的胶质淋巴清除长期削弱。
(A)通过在TBI之后的第1、3、7和28天脑池内注射CSF示踪剂(卵白蛋白结合的ALEXA-555)来评估血管旁CSF-ISF交换。(B-F)活体内全切片荧光成像显示，TBI之后第7天，注射后30分钟所评估的血管旁CSF内流显著减少。有趣的是，虽然是单侧创伤性损伤，但在两侧都观察到胶质淋巴内流减少。对示踪剂向皮层(G)内流的量化显示，TBI对CSF内流的影响在损伤后第7天达到峰值，然而胶质淋巴功能的显著减弱在损伤之后的第28天仍存在(*P<0.05，**P<0.01相对于对照；#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析，每组n＝5-12只动物)。虽然观察到皮层两侧出现CSF内流减弱，但同侧皮层中的减弱程度最大。(H)损伤后第7天评估TBI对间质性溶质从皮层中清除的影响。放射性标记的3H-甘露醇(MW182Da)(I)和14C-菊糖(MW约5kDa)(J)输注到对侧额叶皮层中之后60分钟，测量其清除率。在野生型小鼠中，TBI显著减缓3H-甘露醇与14C-菊糖的清除(#P<0.05，###P<0.001相对于假手术对照；双因素方差分析，每组n＝6只动物)。对Aqp4-/-小鼠进行的清除研究表明，Aqp4基因缺失使TBI之后的溶质清除减弱加剧(*P<0.05，***P<0.001相对于野生型；双因素方差分析，每组n＝6只动物)。这些数据表明，胶质淋巴路径功能，包括间质性溶质清除，在TBI之后发生彻底并且长期的减弱。
图44A-E.沿血管旁路径从脑部清除间质τ。
(A)将重组人类单体τ(hTau)注射到NG2-DsRed转基因小鼠的皮层中，其脑血管平滑肌和周细胞表达DsRed荧光蛋白质。(B-E)注射后30分钟，通过免疫荧光，随后通过激光扫描共聚焦显微镜来评估间质性hTau通过脑的移动。hTau从注射部位(B)弥漫性地移动，沿着毛细血管基底薄层(C)聚积。荧光强度投影描绘hTau在这些空间中相对于在周围间质性隔室中的聚积。(D-E)注射后30分钟，hTau快速移动通过脑间质到达第3脑室顶部围绕大口径内部大脑静脉的血管旁空间。这些数据表明可溶性间质性τ沿着全脑胶质淋巴系统的血管旁路径从脑部清除。
图45A-C.Aqp4-/-小鼠中不存在AQP4免疫反应性。
为了确保本研究中所用抗AQP4一级抗体的特异性，损伤之后第7天，我们对所灌注的Aqp4-/-小鼠的对照脑部和经TBI处理的脑部进行免疫标记。虽然GFAP表达在对照(A)、对侧TBI(B)和同侧TBI(C)皮层中是容易侦测的，但AQP4免疫反应性却侦测不到。
图46A-C.Aqp4基因缺失不会改变TBI病灶体积。
TBI之后第28天，评估所收集的脑部的Aqp4基因缺失对创伤性病灶体积的影响。(A-B)对脑部连续切片并且通过H&E染色评估脑部结构。红色箭头表示创伤性撞击部位和最大皮层损伤区域。测量每个切片中的同侧和对侧皮层区域，接着对连续切片进行积分以推导皮层体积。皮层体积以相对于对侧体积(C)的比率表示。在野生型与Aqp4-/-小鼠之间，未观察到同侧病灶体积出现显著性差异。
图47A-F.Aqp4基因缺失加剧TBI后τ蛋白病变发展。
评估Aqp4基因缺失使胶质淋巴路径功能减弱对TBI之后τ病变发展的影响。(A)损伤后第28天采集野生型和Aqp4-/-脑部并且探测磷酸化τ(P-τ)表位的存在。呈现的代表性印迹展示小鼠基因型(野生型相对于Aqp4-/-)、损伤状态(假手术组相对于TBI)和半球(对侧(C)相对于同侧(I))对通过靶向不同τ磷酸化表位的各种P-τ单株抗体标记的影响。还测量总τ(Pan-τ)并且所有P-τ含量相对于每个生物样品内的P-τ含量标准化。(B-F)在所有表位中，TBI倾向于增加P-τ标记，特别是在同侧。类似地，相较于TBI之后的野生型小鼠，TBI之后的Aqp4-/-小鼠中的标记倾向于更强。具体来说，相较于野生型动物，所寄存的识别pThr231和pSer396P-τ表位的抗体使Aqp4-/-小鼠中的P-τ标记显著增加(相对于Aqp4-/-假手术组，相对于野生型TBI；*P<0.05相对于野生型假手术组；#P<0.05相对于对侧结构；单因素方差分析；每组n＝4只动物)。这些数据表明当胶质淋巴路径功能的减弱超过在单独TBI情况下所见时，促进长期的τ聚集。
图48A-F.胶质淋巴路径功能障碍促进TBI后τ聚集。
(A)评估Aqp4基因缺失使胶质淋巴路径功能减弱对TBI之后τ蛋白病变发展的影响。使野生型和Aqp4-/-小鼠经受TBI并且损伤后第28天，通过免疫荧光和西方印迹(呈现于图47A到F中)评估磷酸化τ(P-τ)的聚积。(B-D)用AT8P-τ抗体(特异性针对pSer202/pThr205表位)和神经元标记NeuN进行的双重标记展示，在野生型皮层中，未观察到P-τ免疫反应性。在Aqp4-/-皮层中，观察到明显的P-τ标记，都位于神经元胞体(箭头)和周围神经突(箭头)中。(E-F)对P-τ染色的量化揭露，在TBI之后的第28天，Aqp4-/-小鼠的同侧皮层内存在明显的P-τ免疫反应性，而下伏纹状体中的P-τ免疫反应性较小。这些数据表明，TBI之后的胶质淋巴路径功能的减弱促进τ聚集和P-τ沉积发生于神经元内和神经外。
图49A-L.胶质淋巴路径功能减弱维持TBI后的神经炎症。
评估Aqp4基因缺失对TBI之后的神经炎症持久性的影响。(A-F)使野生型和Aqp4-/-小鼠经受TBI并且损伤后第28天，通过免疫荧光来评估反应性星形胶质化(GFAP表达)和小胶质细胞增生(Iba1表达)。仅在TBI之后的Aqp4-/-小鼠的同侧皮层中观察到GFAP免疫反应性和Iba1免疫反应性明显升高。(G-H)GFAP标记的量化表明Aqp4-/-小鼠而非野生型小鼠的皮层和下伏纹状体中的反应性星形胶质化显著增加(*P<0.05，**P<0.01相对于野生型；#P<0.05，##P<0.01相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4只动物)。(I)在海马体中未观察到GFAP免疫反应性的差异。(J-K)Iba1标记的量化展示小胶质活化在Aqp4-/-小鼠的同侧皮层和纹状体中持久存在，但在损伤后28天内的野生型小鼠中消退(#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4只动物)。(L)在野生型和Aqp4-/-小鼠的海马体的CA3区域中观察到Iba1标记增加(#P<0.05相对于对侧结构；双因素方差分析；每组n＝4只动物)。
图50A-E.Aqp4基因缺失加剧创伤后认知障碍。
(A)评估损害胶质淋巴路径对经受TBI的野生型和Aqp4-/-小鼠的创伤后认知缺陷的影响。损伤之前的第2天，接着在TBI之后每周对动物进行基线行为测试。(B)通过旷场试验来评定粗大运动行为。TBI并不改变野生型或Aqp4-/-小鼠在旷场试验中的表现。(C)通过旋杆试验来评估运动协调性和学习力。虽然TBI并不显著减弱野生型动物的旋杆表现，但TBI显著减弱Aqp4-/-小鼠的试验表现(*P<0.05Aqp4-/-模拟组相对于Aqp4-/-TBI；双因素重复测量方差分析，每组n＝9-14只动物)。利用新物体识别试验(D)和巴尔内斯迷宫试验(Barnesmazetest)(E)来评估认知功能。在两项试验中，TBI减弱野生型小鼠和Aqp4-/-小鼠的认知表现(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001TBI相对于模拟组；双因素重复测量方差分析，每组n＝9-14只动物)。相较于野生型动物，创伤后认知障碍在Aqp4-/-小鼠中加剧(**P<0.01野生型TBI相对于Aqp4-/-TBI；双因素重复测量方差分析；每组n＝9-14只)。
图51A-D.作为血管周AQP4极化的决定因素的AQP4-M1变异体。
(A)Aqp4基因具有两个转录起始位点，其中在每个位点起始的转录产生两种AQP4mRNA变异体：包括Aqp4基因的外显子0-4的AQP4-M1和缺乏外显子0的AQP4-M23。(B)AQP4-M23(在生理条件下，在CNS中是主要形式)允许血管周围AQP4堆积，而AQP4-M1却妨碍其堆积；因此，增强的AQP4-M1表达使AQP4极化减弱(克雷恩等人，生物化学杂志2009；弗曼等人，国家科学院学报2003)。(C)TBI之后第3天，使用特异性靶向AQP4-M1转录物的外显子0的PCR引子，通过实时量化PCR(qPCR)来评估AQP4-M1在小鼠同侧皮层中的表达。相较于AQP4-M1在对照组(模拟组)皮层中的表达，TBI使AQP4-M1表达增加约两倍(*P<0.05，t检验；每组n＝5)。(D)使用靶向AQP4-M1变异体的外显子0的基于siRNA的方法，可有效降低AQP4-M1在所培养的小鼠皮层初级星形胶质细胞中的表达。设计三种siRNA双螺旋体以靶向AQP4-M1转录物的外显子0，并且用这些siRNA双螺旋体将小鼠初级星形胶质细胞转染六天。siRNA处理之后，通过qPCR评估AQP4-M1表达，其展示靶向外显子0的siRNA有效阻断AQP4-M1基因表现(###P<0.001，siAQP4-M1相对于对照，单因素方差分析；n＝3)。Aqp4基因启动子的计算机模拟筛选揭露出AQP4-M1转录起始位点上游的转录因子信号转导子和转录激活子(STAT)-3存在两个结合位点。因此，我们测试小鼠皮层初级星形胶质细胞中的STAT3信号传导的抑制是否能减少AQP4-M1表达。STAT3特异性抑制剂STATTIC处理初级星形胶质细胞使AQP4-M1表达显著降低(**P<0.01STATTIC相对于对照组，单因素方差分析；n＝3)。这些数据表明TBI之后的AQP4-M1表达增加，但是通过靶向AQP4-M1转录物的siRNA或通过星形胶质细胞中的STAT3抑制可以减少AQP4-M1表达。这些发现与可以通过这些方法防止脑部损伤(例如创伤性脑损伤或缺血性脑部损伤)后损失AQP4极化的概念相符。
图52A-E.弥漫性缺血性损伤后胶质淋巴路径功能减弱。
使用具有多个微小梗塞的小鼠模型(M.王等人，具有多个微小梗塞的小鼠模型中的认知缺陷和延迟的神经元丧失，神经科学杂志，2012年12月12日，32(50):17948-17960)，通过体内双光子成像来评估弥漫性缺血性损伤的影响。(A)使动物经受弥漫性缺血性损伤。3天后，通过封闭的颅脑窗，通过脑池内注射的荧光CSF示踪剂(德克萨斯红结合的聚葡萄糖，MW70kD)向大脑皮层中的内流进行成像来评估胶质淋巴路径功能。(B-D)在皮层表面下方100μm获得的代表性双光子图像展示荧光CSF示踪剂在脑池内注射之后20分钟移动到皮层实质内。(E)损伤后第3天通过连续双光子成像对皮层表面下方100μm处荧光强度的量化显示，在对照动物中，CSF示踪剂快速进入皮层，在注射20分钟内达到峰值。在同侧皮层中，CSF示踪剂内流几乎消除，同时甚至在对侧皮层中，CSF示踪剂内流明显减弱。这些数据表明，导致血管周围AQP4极化丧失(王等人，神经科学杂志2012)的弥漫性缺血性损伤也显著减弱胶质淋巴路径功能。
图53A-B.弥漫性缺血性损伤后胶质淋巴路径功能减弱。
使用最近描述的具有多个微小梗塞的小鼠模型(王等人,神经科学杂志2012)，通过全切片荧光成像评估弥漫性缺血性损伤的作用。使动物经受弥漫性缺血性损伤。3天后，通过脑池内注射CSF示踪剂(卵白蛋白结合的ALEXA-647,OA-647,MW45kD)评估胶质淋巴路径功能。示踪剂注射30分钟后，将动物固定，将脑切片，并且通过常规荧光显微法评估CSF示踪剂内流。(A)在对照脑中，CSF示踪剂沿着血管旁空间快速移动到脑实质内。(B)弥漫性缺血性损伤之后，CSF向脑部的内流显著减少。就同侧来说，CSF向实质中的移动几乎消除。在对侧半球中，虽然存在血管旁CSF内流，但与周围间质性空间交换的速率和程度显著降低。
6.7实例7：胶质淋巴系统：老龄化脑部和阿兹海默氏病中全脑清除的目标
如本文所揭露，通过调节控制老龄化脑部中脑部间质液(ISF)对流和脑脊髓液(CSF)/ISF交换的脑部正常机制提高毒性或废弃物质的脑部清除率，去除废弃代谢副产物和与神经退化性疾病(例如阿兹海默氏病(AD))有关的毒素。
如本实例中所披露，提供一种调节脑部肾素-血管紧张素系统(RAS)以提高例如淀粉状蛋白-β的物质从脑部的清除率的方法。阿兹海默氏病为通过这种方法治疗的一个主要目标。目前，不存在将减缓或停止这一破坏性疾病的进展的治疗。
本实例还证实所属领域已知的AVP(血管加压素)的拮抗剂(例如托伐普坦(tolvaptan)、考尼伐坦(conivaptan)或VPA-985)、心房利钠肽的拮抗剂(ANP)(例如安南汀(anantin))、血管紧张素II的拮抗剂(例如氯沙坦(losartan))、AT2R受体的拮抗剂(例如PD123319)或AT1受体的拮抗剂(例如维沙坦(valsartan))可用于提高或促进胶质淋巴清除率。
背景
毒性功能异常蛋白质在脑部的聚积与许多神经退化性疾病有关，包括阿尔茨海默氏病、帕金森氏病、亨廷顿氏病和肌萎缩性侧索硬化(ALS)。然而，导致老龄化脑部中毒素聚积的机制尚未完全获知。在AD的情况中，两个标志为老年斑(其为淀粉状蛋白β(Aβ)的胞外沉积物)和胞内神经原纤维缠结(过度磷酸化τ)。“淀粉状蛋白级联”假设表明认知减退和AD的不同病原学特征与这些毒素的异常聚积有关(赛尔考,2001；哈迪,2006)。
Aβ通过身体的许多细胞(包括脑部的神经细胞)从称为淀粉状蛋白β前驱蛋白(APP)的大蛋白质(通过蛋白酶β-分泌酶和γ-分泌酶裂解)产生Aβ来产生(赛尔考,2001)。在正常个体中，这些毒素以低浓度存在于脑部中，但在AD中，其积聚并且其存在为与AD发病机理相关的主要事件(哈迪和赛尔考,2002)。在少数情况(<1％)中，Aβ聚积是由于其过度产生(早发AD)，而在大部分情况中，Aβ聚积是由于脑部的失效清除(迟发AD)(坦齐,2005；坦齐等人,2004；马文叶佳等人,2010)。脑部中增加的Aβ含量导致形成神经毒性Aβ寡聚物、进行性突触损失和神经元功能不全(马斯特和赛尔考,2012)。Aβ肽为脑实质和血管中的淀粉状蛋白β的主要构成(脑淀粉样血管病变，CAA)。从老年斑提取的Aβ主要为肽Aβ1-40(Aβ40)和Aβ1-42(Aβ42)，而血管淀粉状蛋白主要为肽Aβ1-39和Aβ40。脑脊髓液(CSF)和脑部中存在的主要可溶形式的Aβ为Aβ40。在CSF和脑部间质液(ISF)中循环的可溶性Aβ可以游离肽形式存在和/或与不同结合蛋白(载体)缔合，例如载脂蛋白E(apoE)、载脂蛋白J(apoJ)、甲状腺素运载蛋白、白蛋白和α2巨球蛋白(α2M)(迪恩等人,2009)。到目前为止，仅基于降低的脑部Aβ产量的疗法在临床试验中不成功(哈迪,2009)。
Aβ通过多种途径从脑部ISF消除，包括细胞摄入和分解、ISF对流和血脑屏障(BBB)介导的传输(迪恩等人,2009)。如本文所揭露，胶质淋巴系统为CSF/ISF交换的宏观全脑路径，其便于清除代谢副产品(包括Aβ)。胶质淋巴系统为星形胶质细胞介导的脑部ISF对流的基础并且类似于周围淋巴系统起作用。胶质淋巴系统由三种主要路径组成：(1)来自蛛网膜下空间的CSF通过动脉旁空间重新进入脑部，(2)星形胶质细胞水通道蛋白4(AQP4，星形胶质细胞中的水通道特异)驱动脑部ISF通过脑实质的对流，以及(3)通过静脉旁清除流出。然而，因为CSF沿穿动脉快速进入脑实质，所以胶质淋巴系统也可以用作全脑传递基本化合物以及移去毒性化合物的分布路径。另外，这可以是清除脑部全部Aβ形式(结合和游离)的机制。
末梢区域的流体平衡
在末梢区域，通过交互系统保持盐(氯化钠)的血浆容量和组成以及血压，包括激素(醛固酮和血管加压素)、肾素-血管紧张素系统(RAS)以及交感神经系统。这些机制良好确立(丁(Dinh)等人,2001；祖克尔(Zucker),2002；佩尔松(Persson),2003；本尼尔(Burnier),2003；阿诺德(Arnold)等人,2013；大岛(Ohshima)等人,2013)。降低的血浆容量引起肾素从肾脏释放，这又以蛋白水解方式从血浆中的前驱体血管紧张素原(肝脏中产生)裂解血管紧张素I(十肽)。血管紧张素I通过血管紧张素转化酶(ACE)进一步加工成血管紧张素II。另外，级联随着血管紧张素I和血管紧张素II进展成其它活性代谢物(包括血管紧张素(1-7))而发生分歧，使得生物作用形成对比(图54)。血管紧张素转化酶2催化血管紧张素I转化成血管紧张素(1-9)并且催化血管紧张素II转化成血管紧张素(1-7)。其它酶(例如组织蛋白酶和奈溶酶)也可以在RAS的活性代谢物级联中起作用。血管紧张素II对G蛋白偶合受体、血管紧张素1受体(AT1R)和血管紧张素2受体(AT2R)的两类药理学起作用，而血管紧张素(1-7)对最近鉴别的mas受体起作用。血管紧张素II刺激醛固酮从肾上腺皮质的分泌，其通过减少钠主要通过肾脏的排泄而将钠留在血浆中。血管紧张素II还引起血管收缩(保持灌注压)。同时，血管加压素从脑垂体后叶分泌并且通过减少水通过肾脏排泄而促进水滞留。总体来说，这些机制维持血压、血浆(胞外体积)体积和血浆盐浓度。当血浆容量增加时，发生逆转。与血管紧张素II相比，血管紧张素(1-7)通过对称为Mas的受体起作用引起血管扩张(桑托斯等人,2003)。
血管紧张素II对AT2受体起作用也引起血管扩张。因此，血管紧张素II和血管紧张素(1-7)之间的平衡调节RAS的结果。认为RAS作用的这一平衡中的一种关键酶是血管紧张素-转化酶2，因为其在血管紧张素I和血管紧张素II转化成血管紧张素(1-7)时起重要作用(加拉格尔(Gallagher)等人,2006)。
脑部肾素血管紧张素系统(RAS).
相信脑部RAS与末梢区域中的RAS无关(莫吉(Mogi)等人,2012；大岛等人,2013)。脑部起的主要作用是通过整合这些现有机制来控制血压、血浆容量和盐组成。另外，由于BBB，其可能用或许与调节血浆容量和盐组成类似的方式控制其自身的流体环境(ISF/ECF的体积和组成)。另外，RAS具有与盐和水平衡无关的其它作用，例如神经保护、学习和发炎。血管紧张素2受体和Mas受体的活化导致血管扩张、神经保护、认知、抗增生作用和抗高血压作用(苏迪洛夫斯基(Sudilovsky)等人，1987；王等人,2007)。在老龄化和AD中，认为脑部RAS有待强化(赖特(Wright)等人,2010；沙伐斯堪(Savaskan)等人,2001)。AD中的尾状核和皮层中的血管紧张素-转化酶的含量增加(阿雷吉(Arregui)等人,1982)，这可能影响AD的风险(赫明(Hemming)等人,2005；哈加(Hajjar)等人,2012；萨韦德拉(Saavedra)等人,2012；阿卜杜拉(AbdAlla)等人,2013)。
在脑部中，星形胶质细胞为血管紧张素原(血管紧张素I的前驱体)和用于转化成血管紧张素(1-7)的血管紧张素转化酶2的主要来源(加拉格尔等人,2006)。星形胶质细胞还具有血管紧张素1受体。因此，星形胶质细胞可在控制脑部ISF体积和盐中起重要作用。另外，最近我们已显示阻断去甲肾上腺素受体(α1、α2和β)会提高Aβ和菊糖通过胶质淋巴系统从脑部的清除(谢等人,2013)。去甲肾上腺素为活化交感神经系统和肾上腺素系统的神经传递素，其提高肾素的活性，肾素是将血管紧张素原转化成血管紧张素I的酶(迈克尔(Michael)等人,2001；坎贝尔(Campbell)等人,1979；马克法(Macova)等人,2009)。因此，增加觉醒(不眠)时脑部肾上腺素系统(蓝斑(LocusCoeruleus))的活性可提高RAS活性。这与唤醒状态期间降低的通过胶质淋巴系统的清除有关(谢等人,2013)。在睡眠状态阻断肾上腺素系统与增加的物质从脑部的清除率有关(谢等人,2013)。
因此，RAS在控制ISF物质通过胶质淋巴系统清除中可起重要作用。然而，RAS在清除ISF中存在的物质中的作用不明确。
脑部RAS保存脑部ISF流体(像在末梢区域中一样)并且阻断其作用会提高通过胶质淋巴系统的ISF清除率。
因为这是基本全脑系统，所以其将应用于与毒性物质(包括Aβ)在脑部聚积有关的许多疾病。这一假设通过使用血管紧张素II、血管紧张素(1-7)、血管紧张素I受体的阻断剂(氯沙坦、维沙坦)和血管紧张素(1-7)受体的阻断剂(A779)测试清除125I-Aβ1-40(称为Aβ)和14C-菊糖(称为菊糖)来测试，125I-Aβ1-40(称为Aβ)和14C-菊糖(称为菊糖)是只通过ISF对流清除的分子(谢等人,2013)。在注射到额叶皮层之后30分钟测定RAS对清除外源性125I-Aβ和14C-菊糖的作用(谢等人,2013)。通过向蛛网膜下空间(小脑延髓池)注射这些分子并且在30分钟后测定脑部含量来测定RAS对这些分子的内流到脑部的作用。Aβ表示与AD和菊糖有关的肽，是ISF中分子对流的惰性分子和标记物。数据确认所述假设。
方法
脑部清除研究：简单来说，不锈钢导引管定位植入到麻醉小鼠(氯胺酮(100mg/kg)和甲苯噻嗪(10mg/kg))的右侧尾壳核或额叶皮层。对于额叶皮层，导管尖端的座标为前囟之前0.7mm和前囟侧3.0mm，并且在脑表面下方1.3mm手术后使动物恢复。实验在实质性慢性方法发生之前进行，但如报告允许BBB修复成大分子的时间(迪恩等人,2004)。预先注射药物10分钟，随后注射放射性标记的分子。
注射示踪剂的混合物：将含有125I标记的Aβ40(10nM单体)以及14C-菊糖(0.05μCi，总体流动的惰性分子)模拟CSF(0.5μL)经5分钟微注射到脑部ISF中。
组织取样：在实验结束时，去除脑部并且准备好进行放射性分析和TCA分析。
放射性分析：在伽马计数器(华莱克维扎德伽马计数器，珀金埃尔默)中测定125I-放射性。对于14C-计数，样品溶解于0.5ml组织增溶剂(珀金埃尔默)中隔夜，随后添加5ml闪烁混合液(帕卡德UltimaGold)并且在液体闪烁计数器(贝克曼库尔特计数器(Beckman计数器))中分析。
计算：清除率参数的全部计算都如上文所述进行或通过常规方法进行(迪恩等人,2004；谢等人,2013)。简单来说，微注射之后脑部剩余的放射性百分比以脑部回收率％＝100×(Nb/Ni)来计算，其中Nb为实验结束时脑部剩余的放射性并且Ni为注射到脑部ISF的放射性，即14C-菊糖的d.p.m.和TCA可沉淀的125I-放射性的c.p.m.。菊糖用作既不传输通过BBB也不被脑部保留的代谢惰性极性分子；其清除速率提供ISF对流总体流动的量度。每组有3-6只小鼠，并且数据表示为平均值±SEM。如使用t检验测定，P<0.5视为统计显著的。
结果
A.药物介入
1)血管紧张素和氯沙坦注射到额叶皮层中之后，血管紧张素和氯沙坦对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
小体积(0.5μL)的含有125I-Aβ40(10nM)和14C-菊糖(0.05μCi)的模拟CSF微注射到额叶皮层中。实验结束时(30分钟)，去除脑部并且分析放射性。图55A显示使用血管紧张素II(1μM)的脑部中剩余的Aβ40的含量提高。相比之下，氯沙坦(1μM)降低Aβ的回收率，氯沙坦是血管紧张素1受体的拮抗剂。图55B显示使用血管紧张素II(1μM)的脑部中剩余的菊糖含量也增加。相比之下，氯沙坦(1μM)降低菊糖回收率。因此，血管紧张素II降低通过ISF对流的清除率。
2)血管紧张素和氯沙坦注射到脑池中之后，血管紧张素和氯沙坦对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的内流的作用
小体积(5μL)的含有125I-Aβ40(10nM)和14C-菊糖(0.05μCi)的模拟CSF以1μL/min微注射到脑池中。实验结束时(30分钟)，去除脑部并且分析放射性。图56A显示使用血管紧张素II(1μM)时Aβ40向脑部的内流降低。相比之下，注射到脑池(1μM)或腹膜内(IP；1mg)中的氯沙坦提高Aβ内流。图56B显示使用血管紧张素II(1μM)时菊糖向脑部的内流也降低。相比之下，氯沙坦提高菊糖内流。
3)血管加压素注射到额叶皮层中之后，血管加压素对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
图57显示注射到额叶皮层中的血管加压素(1μM)相较于对照降低Aβ和菊糖从脑部的清除率，血管加压素是将水留在体内的一种激素。
4)心房利钠肽(ANP)注射到额叶皮层中之后，心房利钠肽对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
图58显示心房利钠肽(ANP)(1μM)注射到额叶皮层中时会降低Aβ和菊糖的清除率，心房利钠肽是减少体内水和钠的肽。如觉醒条件中所见，ANP分泌由多种因素刺激，包括交感神经活化提高。
5)血管紧张素(1-7)(A7)注射到额叶皮层中之后，血管紧张素(1-7)(A7)对脑部125I-Aβ40和14C-菊糖的回收率的作用
血管紧张素(1-7)已显示具有神经保护性作用，并且对抗血管紧张素II的作用。我们测定预先注射到额叶皮层中的血管紧张素(1-7)对Aβ和菊糖从脑部的清除的作用。图59显示Aβ的清除率随着剂量逐渐提高。
为了提高敏感性，我们减少了时间点。使用15分钟时间点，10nm和1nM血管紧张素(1-7)浓度之间存在较大改变(图60)。
为了确认血管紧张素(1-7)的作用，我们使用阻断剂A779，其通过阻断受体来拮抗这一配位体。A779(IμM)首先注射到脑池中持续10分钟，并且接着在A779(1μM)和血管紧张素(1-7)(10nM)存在下测定Aβ和菊糖从额叶皮层的清除率。图61显示阻断剂防止血管紧张素(1-7)的作用。
6)阻断氧化氮(NO)对于胶质淋巴路径的作用。
因为氧化氮(NO)在调节许多激素、神经传递素的作用中起关键作用并且与RAS相互作用，所以我们测定胶质淋巴系统中的NO的作用。
使用诱导型氧化氮合成酶(iNOS)的选择性抑制剂L-NIL。图62显示L-NIL对Aβ和菊糖清除率具有剂量依赖性作用。1mML-NIL下的清除率提高。
使用L-NIL时，Aβ和菊糖的内流也存在剂量依赖性提高(图63)。
B.胶质淋巴系统的机械破坏
首先，对小脑延髓池插管并且使CSF持续排出。10分钟后，测定Aβ从额叶皮层的清除率持续30分钟。图64显示皮层的Aβ清除率降低，而CSF从脑池排出。因此，来自脑部的分流CSF流量可减少其通过动脉旁空间到脑部的再循环，并且减少通过实质的对流，这又降低清除率。
C.睡眠剥夺
Aβ和菊糖的清除率早睡眠条件下提高(还参看谢等人,2013，以全文引用的方式并入本文中)。为了确定睡眠剥夺是否会改变清除率，通过从6AM温和处置(开灯)持续6小时来剥夺小鼠睡眠。接着确定觉醒下的Aβ的清除率。图65显示睡眠剥夺期间Aβ的清除率降低。因此，为了提高胶质淋巴清除率，在某些实施例中，可使用临床上公认的常规方法向个体或患者投予用于治疗失眠或帮助睡眠的药剂，包括(但不限于)：
抗组胺剂(例如非处方药)：
(非索非那定)
(苯海拉明)
或(氯雷他定)
(氯芬尼拉明马来酸盐)
(溴苯那敏、苯丙醇胺)
(西替利嗪)
非处方睡眠助剂：
优利松夜间睡眠助剂
休眠素
力托
简单睡眠
索明埃克
超强度扑热息痛PM
苯海拉明盐酸盐
伊克赛锭P.M.
苯并二氮呯：
(艾司唑仑)
(弗拉西泮)
(夸西泮)
(替马西泮)
(三唑仑)
(安定)
非苯并二氮呯：
咪唑并吡啶：CR、(唑吡坦)(其自身类别)
(吡唑并嘧啶)(其自身类别)
褪黑素受体刺激剂：
(雷美替胺)
(水合氯醛)
(右美托咪啶盐酸盐)
(右佐匹克隆)
巴比妥酸盐：
(苯巴比妥)
(甲苯巴比妥)
安密妥钠(AmytalSodium)(异戊巴比妥钠)
(布塔巴比妥钠)
普弗勒钠(SodiumPulvules)(司可巴比妥钠)
实例7中所引用的参考文献
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6.8实例8：通过水通道蛋白4(AQP4)调节淀粉状蛋白β从脑部的清除
固有膜蛋白的水通道蛋白家族充当许多细胞的质膜中的水选择性通道。水通道蛋白4(AQP4)为脑部发现的主要水通道蛋白。本实例证实AQP4调节淀粉状蛋白β从脑部的清除。AQP4的活化可促进淀粉状蛋白β从脑部清除，或抑制AQP4可加重阿兹海默氏病的转殖基因小鼠模型中的淀粉状蛋白β沉积。基于本实例中揭露的结果，神经退化性疾病(包括阿兹海默氏病)可用药物JNJ-17299425或JNJ-17306861治疗、改善或预防，所述药物促进AQP4的血管周围极化。
包括阿兹海默氏病的神经退化性疾病特征为肽和蛋白质错误聚集成毒性聚集体和斑块，部分由年龄或损伤相关的胞外蛋白质或肽清除障碍引起。胞外蛋白质和肽从脑部清除取决于AQP4的血管周围定位；老龄化和受伤脑部中损失极化。维持AQP4的血管周围极化可用于维持这些溶质从胞外隔室的清除，防止或减缓神经退化的发作和进展。
目前，没有预防老龄化脑部的AQP4极化损失的现有治疗方法。实际上，处理聚集体的目前方法为防止产生其组分或使聚集体靶向破坏。前者可能有害，因为这些组分通常为正常功能必需的生理学活性化合物，而靶向聚集体可能对病理学过程中防止神经元损失来说发生的太迟。通过维持‘正常’AQP4极化和清除这些组分，在疾病发作和神经元损失之前防止聚集。
已知JNJ-17299425或JNJ-17306861(詹森药剂公司(JanssenPharmaceuticals,Inc.),泰特斯维尔(Titusville),新泽西州(NJ)08560)以及其衍生物会防止创伤性脑损伤后AQP4极化损失，而没有报告有其它药物可以维持AQP4极化。在一个实施例中，通过在神经退化性过程中尽早用NJ-17299425或JNJ-17306861治疗，可以无需改变负责其产量的细胞过程就防止蛋白质和肽聚集。
淀粉状蛋白β沿这些路径的清除取决于AQP4极化。在弥漫性缺血性损伤和轻度和中等创伤性脑损伤模型中，脑损伤之后始终失去血管周围AQP4定位。在老龄化小鼠和人类脑部中，损失血管周围AQP4极化。这伴随着间质淀粉状蛋白β清除失败。血管周围AQP4极化的损失造成间质淀粉状蛋白β和τ清除失败。维持这一极化的治疗方法可有效预防淀粉状蛋白β或τ聚集以及下游神经退化性过程发作。
进行概念验证研究以确定AQP4活化是否会加速淀粉状蛋白β从脑部清除，或抑制AQP4是否会加剧阿兹海默氏病的转殖基因小鼠模型中淀粉状蛋白β沉积。
对JNJ-17299425和JNJ-17306861进行测试以决定其是否可预防老龄化脑部或创伤性脑损伤后年轻脑部的AQP4极化损失。
JNJ-17299425可通过在创伤损伤之后将其保留在血管周围终足中来提高AQP4功能。防止AQP4在老龄化和神经退化脑部中错误定位可防止淀粉状蛋白β和τ聚集。因此，AQP4靶向化合物JNJ-17299425或JNJ-17306861可有效维持老龄化脑部中的淀粉状蛋白β和τ清除率并且防止其聚集。
本文所述的装置样品在下文编号段落中阐述：
1、一种用于测量哺乳动物中枢神经系统(脑和/或脊髓)中的胶质血管路径(下文中称“胶质淋巴系统”)功能的方法，所述方法包含以下步骤：
对中枢神经系统进行成像；和
测量中枢神经系统中的脑脊髓液-间质液(下文中称“CSF-ISF”)交换。
2、根据段落1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
3、根据段落1所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
4、根据段落1所述的方法，进一步包含在对中枢神经系统进行成像的步骤之前投与成像剂的步骤。
5、根据段落4所述的方法，其中所述成像剂是以鞘内途径投与。
6、根据段落5所述的方法，其中鞘内投与成像剂的步骤包含腰椎或脑池内鞘内注射投与成像剂的步骤。
7、根据段落4所述的方法，其中：
所述成像剂是负或正(顺磁)造影剂，并且对中枢神经系统进行成像的步骤包含对中枢神经系统进行动态或造影剂强化磁共振成像(MRI)的步骤。
8、根据段落7所述的方法，其中投与至少两种不同的MRI造影剂，所述不同的MRI造影剂就其对T1(顺磁)或T2(负造影剂)的影响来说是匹配的，从而能够比较其在脑组织中的动力学特征。
9、根据段落4所述的方法，其中：
所述成像剂是正电子发射放射性核素示踪剂，并且
对脑和脊髓进行成像的步骤包含对中枢神经系统进行正电子发射断层摄影术(PET)扫描的步骤。
10、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含测量可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ、纳米粒子(例如功能化或治疗性纳米粒子)、化学治疗剂、治疗上投与的毒性产品、小干扰RNA(siRNA)、α突触核蛋白、小分子药物、病毒载体、抗体类治疗剂、脂质体或治疗性RNA构筑体的清除率。
11、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含测量治疗剂清除率。
12、根据段落11所述的方法，其中所述治疗剂是化学治疗剂、功能化纳米粒子或为了治疗性用途而投与的毒性组合物。
13、根据段落7所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含分析顺磁或负造影剂在脑中的内流动力学、实质分布和/或清除率。
14、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含测量脑垂体隐窝、松果体腺体隐窝、小脑和/或嗅球处的CSF-ISF交换。
15、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤。
16、根据段落15所述的方法，其中对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤包含分别测量T1缩短或T2变化的步骤。
17、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含计算内流动力学参数的步骤，其中所述内流动力学参数反映CSF-ISF交换速率。
18、根据段落1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含利用静态造影剂强化MRI或PET图像计算动力学参数的单一步骤，其中所述动力学参数反映CSF-ISF交换速率。
19、根据段落1所述的方法，其进一步包含计算哺乳动物出现神经退化性疾病的风险的步骤。
20、根据段落19所述的方法，其中所述神经退化性疾病是帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症、慢性创伤性脑病变(CTE)或HIV相关性痴呆症。
21、根据段落1所述的方法，其中所述哺乳动物罹患创伤性脑损伤，所述方法进一步包含计算出现慢性创伤性脑病变(CTE)的风险的步骤。
22、一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统(脑和/或脊髓)的神经退化性疾病发作的方法，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此减少反应性神经胶质增生或延迟反应性神经胶质增生发作。
23、根据段落22所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
24、根据段落22所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
25、根据段落22所述的方法，其中所述神经退化性疾病是帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症、慢性创伤性脑病变(CTE)或HIV相关性痴呆症。
26、根据段落22所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
27、根据段落22所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的步骤包含向所述哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂的步骤。
28、根据段落27所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子。
29、根据段落27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽(ANP)的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
30、根据段落27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
31、根据段落27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
32、根据段落31所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
33、根据段落22所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。
34、一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统的反应性神经胶质增生的方法，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此减少反应性神经胶质增生或延迟反应性神经胶质增生发作。
35、根据段落34所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
36、根据段落34所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
37、根据段落34所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
38、根据段落34所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的步骤包含向所述哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂的步骤。
39、根据段落38所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子。
40、根据段落38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽(ANP)的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
41、根据段落38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
42、根据段落38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
43、根据段落42所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
44、根据段落34所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。
45、一种促进从哺乳动物中枢神经系统间质(脑间质和/或脊髓间质)中清除废弃物产物的方法，所述方法包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质。
46、根据段落45所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
47、根据段落45所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
48、根据段落45所述的方法，其中所述脑废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ，或α突触核蛋白。
49、根据段落45所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
50、一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统的方法，所述方法包含增强所述哺乳动物的中枢神经系统中的胶质淋巴清除作用的步骤，由此降低、减少、延迟发作或阻止废弃物产物在所述哺乳动物的中枢神经系统中的聚积。
51、根据段落50所述的方法，其中增强所述哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴清除作用的步骤包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质。
52、根据段落50所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
53、根据段落50所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
54、根据段落53所述的方法，其中需要治疗的所述患者或个体是老龄或老年患者或个体。
55、根据段落54所述的方法，其中所述老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
56、根据段落50所述的方法，其中所述废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白β(Aβ)、τ，或α突触核蛋白。
57、根据段落50所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
58、一种治疗哺乳动物脑的方法，所述方法包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质，由此减少、降低、延迟发作或阻止淀粉状蛋白β(Aβ)、τ和/或α突触核蛋白在所述哺乳动物的脑间质中的聚积。
59、根据段落58所述的方法，其中所述哺乳动物的脑已遭受创伤性脑损伤。
60、根据段落58所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
61、根据段落58所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
62、根据段落58所述的方法，其中需要治疗的所述患者或个体是老龄或老年患者或个体。
63、根据段落62所述的方法，其中所述老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
64、根据段落58所述的方法，其中所述治疗剂是肾上腺素能受体拮抗剂。
65、根据段落58所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白(BMP)信号传导轴分子的分子。
66、根据段落58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽(ANP)的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
67、根据段落58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
68、根据段落58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
69、根据段落68所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
70、根据段落58所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
71、一种用于减少或阻碍从哺乳动物脑间质中清除治疗剂或调节剂的方法，所述方法包含减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤。
72、根据段落71所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
73、根据段落71所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
74、根据段落71所述的方法，其中减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤包含将减少或阻碍胶质淋巴清除作用的药剂投与哺乳动物的步骤。
75、根据段落71所述的方法，其中所述药剂是布美他尼、针对AQP4的小干扰RNA(siRNA)、AVP(血管加压素)的促效剂、心房利钠肽(ANP)的促效剂、血管紧张素II的促效剂、AT2R受体促效剂，或AT1受体促效剂。
76、根据段落71所述的方法，进一步包含根据段落1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
77、根据段落71所述的方法，其中减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤包含阻断通过哺乳动物中枢神经系统间质的流体流动或对其设置障碍的步骤。
本发明的范围不受本文所述的具体实施例限制。实际上，除本文所述的那些之外，所属领域的技术人员根据前文描述将显而易知本发明的各种修改。希望这些修改属于所附权利要求书的范围内。
虽然本发明的实施例已参照某些实例和特征加以具体展示和描述，但所属领域的技术人员应理解，可以实现各种细节上的变化而这些变化不偏离本发明的精神和范围，本发明的精神和范围由能够受书面说明书和附图支持的权利要求书限定。另外，在示例性实施例参照一定数目个要素描述的情况下，应理解示例性实施例能够使用少于或大于某些数目个要素实施。
本文中引用的所有参考文献以全文引用的方式并入本文中用于所有目的，其引用的程度如同每篇个别公开案、专利或专利申请经具体地并且个别地指明以全文引用的方式并入一般，以用于所有目的。
对任何公开案的引用是针对申请日之前的其公开内容，并且不应解释为承认本发明无权先于依靠先前发明的这个公开案。

Claims (77)

1.一种用于测量哺乳动物中枢神经系统(脑和/或脊髓)中的胶质血管路径(下文中称“胶质淋巴系统”)功能的方法，所述方法包含以下步骤：
对所述中枢神经系统进行成像；和
测量所述中枢神经系统中的脑脊髓液-间质液(下文中称“CSF-ISF”)交换。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包含在对所述中枢神经系统进行成像的所述步骤之前投与成像剂的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述成像剂是以鞘内途径投与。
6.根据权利要求5所述的方法，其中鞘内投与所述成像剂的所述步骤包含腰椎或脑池内鞘内注射投与所述成像剂的步骤。
7.根据权利要求4所述的方法，其中：
所述成像剂是负或正(顺磁)造影剂，并且
对所述中枢神经系统进行成像的所述步骤包含对所述中枢神经系统进行动态或造影剂强化磁共振成像MRI的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其中投与至少两种不同的MRI造影剂，所述不同的MRI造影剂就其对T1(顺磁)或T2(负造影剂)的影响来说是匹配的，从而能够比较其在脑组织中的动力学特征。
9.根据权利要求4所述的方法，其中：
所述成像剂是正电子发射放射性核素示踪剂，并且
对脑和脊髓进行成像的所述步骤包含对所述中枢神经系统进行正电子发射断层摄影术PET扫描的步骤。
10.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含测量可溶性淀粉状蛋白βAβ、τ、纳米粒子(例如功能化或治疗性纳米粒子)、化学治疗剂、治疗上投与的毒性产品、小干扰RNA(siRNA)、α突触核蛋白、小分子药物、病毒载体、抗体类治疗剂、脂质体或治疗性RNA构筑体的清除率。
11.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含测量治疗剂清除率。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述治疗剂是化学治疗剂、功能化纳米粒子或为了治疗性用途而投与的毒性组合物。
13.根据权利要求7所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含分析所述顺磁或负造影剂在脑中的内流动力学、实质分布和/或清除率。
14.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的步骤包含测量脑垂体隐窝、松果体腺体隐窝、小脑和/或嗅球处的CSF-ISF交换。
15.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含对信号变化进行参数或非参数数据分析的步骤。
16.根据权利要求15所述的方法，其中对信号变化进行参数或非参数数据分析的所述步骤包含分别测量T1缩短或T2变化的步骤。
17.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含计算内流动力学参数的步骤，其中所述内流动力学参数反映CSF-ISF交换速率。
18.根据权利要求1所述的方法，其中测量CSF-ISF交换的所述步骤包含利用静态造影剂强化MRI或PET图像计算动力学参数的单一步骤，其中所述动力学参数反映CSF-ISF交换速率。
19.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含计算所述哺乳动物出现神经退化性疾病的风险的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述神经退化性疾病是帕金森病PD、阿尔茨海默病AD、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症、慢性创伤性脑病变CTE或HIV相关性痴呆症。
21.根据权利要求1所述的方法，其中所述哺乳动物罹患创伤性脑损伤，所述方法进一步包含计算出现慢性创伤性脑病变CTE的风险的步骤。
22.一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统(脑和/或脊髓)的神经退化性疾病发作的方法，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此减少反应性神经胶质增生或延迟反应性神经胶质增生发作。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
25.根据权利要求22所述的方法，其中所述神经退化性疾病是帕金森病PD、阿尔茨海默病AD、伴路易体阿尔茨海默病、路易体性痴呆症、混合型痴呆症、血管性痴呆症、额颞叶型痴呆症、慢性创伤性脑病变CTE或HIV相关性痴呆症。
26.根据权利要求22所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
27.根据权利要求22所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述步骤包含向所述哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂的步骤。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白BMP信号传导轴分子的分子。
29.根据权利要求27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽ANP的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
30.根据权利要求27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
31.根据权利要求27所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
32.根据权利要求31所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的所述药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
33.根据权利要求22所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。
34.一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统的反应性神经胶质增生的方法，所述方法包含增强胶质淋巴系统清除作用的步骤，借此减少反应性神经胶质增生或延迟反应性神经胶质增生发作。
35.根据权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
36.根据权利要求34所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
37.根据权利要求34所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
38.根据权利要求34所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述步骤包含向所述哺乳动物投与增强胶质淋巴清除作用的药剂的步骤。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白BMP信号传导轴分子的分子。
40.根据权利要求38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽ANP的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
41.根据权利要求38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
42.根据权利要求38所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
43.根据权利要求42所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的所述药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
44.根据权利要求34所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述步骤包含泵送流体通过中枢神经系统间质的步骤。
45.一种促进从哺乳动物中枢神经系统间质(脑间质和/或脊髓间质)中清除废弃物产物的方法，所述方法包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或
泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质。
46.根据权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
47.根据权利要求45所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
48.根据权利要求45所述的方法，其中所述脑废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白βAβ、τ，或α突触核蛋白。
49.根据权利要求45所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
50.一种用于治疗哺乳动物中枢神经系统的方法，所述方法包含增强所述哺乳动物的中枢神经系统中的胶质淋巴清除作用的步骤，由此降低、减少、延迟发作或阻止废弃物产物在所述哺乳动物的中枢神经系统中的聚积。
51.根据权利要求50所述的方法，其中增强所述哺乳动物中枢神经系统中的胶质淋巴清除作用的步骤包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或
泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质。
52.根据权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
53.根据权利要求50所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
54.根据权利要求53所述的方法，其中需要治疗的所述患者或个体是老龄或老年患者或个体。
55.根据权利要求54所述的方法，其中所述老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
56.根据权利要求50所述的方法，其中所述废弃物产物是可溶性淀粉状蛋白βAβ、τ，或α突触核蛋白。
57.根据权利要求50所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
58.一种治疗哺乳动物脑的方法，所述方法包含以下步骤：
向所述哺乳动物投与增强或促进胶质淋巴清除作用的药剂；或
泵送流体通过所述哺乳动物的中枢神经系统间质，
由此减少、降低、延迟发作或阻止淀粉状蛋白βAβ、τ和/或α突触核蛋白在所述哺乳动物的脑间质中的聚积。
59.根据权利要求58所述的方法，其中所述哺乳动物的脑已遭受创伤性脑损伤。
60.根据权利要求58所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
61.根据权利要求58所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
62.根据权利要求58所述的方法，其中需要治疗的所述患者或个体是老龄或老年患者或个体。
63.根据权利要求62所述的方法，其中所述老龄或老年患者或个体是超过50岁、60岁、70岁、80岁或90岁的人类。
64.根据权利要求58所述的方法，其中所述治疗剂是肾上腺素能受体拮抗剂。
65.根据权利要求58所述的方法，其中所述药剂是Stat-3抑制剂或所属领域中已知为骨形态生成蛋白BMP信号传导轴分子的分子。
66.根据权利要求58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是AVP(血管加压素)的拮抗剂、心房利钠肽ANP的拮抗剂、血管紧张素II的拮抗剂、AT2R受体拮抗剂或AT1受体拮抗剂。
67.根据权利要求58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是用于治疗失眠或用作睡眠助剂的药剂。
68.根据权利要求58所述的方法，其中增强胶质淋巴清除作用的所述药剂是阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的药剂。
69.根据权利要求68所述的方法，其中阻止AQP4去极化或AQP4极化丧失的所述药剂是JNJ-17299425或JNJ-17306861。
70.根据权利要求58所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
71.一种用于减少或阻碍从哺乳动物脑间质中清除治疗剂或调节剂的方法，所述方法包含减少或阻碍胶质淋巴清除作用的步骤。
72.根据权利要求71所述的方法，其中所述哺乳动物是人类或非人类灵长类动物。
73.根据权利要求71所述的方法，其中所述哺乳动物是需要治疗的患者或个体。
74.根据权利要求71所述的方法，其中减少或阻碍胶质淋巴清除作用的所述步骤包含将减少或阻碍胶质淋巴清除作用的药剂投与所述哺乳动物的步骤。
75.根据权利要求71所述的方法，其中所述药剂是布美他尼、针对AQP4的小干扰RNAsiRNA、AVP(血管加压素)的促效剂、心房利钠肽ANP的促效剂、血管紧张素II的促效剂、AT2R受体促效剂，或AT1受体促效剂。
76.根据权利要求71所述的方法，进一步包含根据权利要求1所述的方法测量脑中的胶质淋巴系统功能的步骤。
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