JP6382232B2 - 脳全体の傍血管経路を老廃物のクリアランス機能について評価するための方法、およびそれに基づいて神経変性障害を治療するための方法 - Google Patents
脳全体の傍血管経路を老廃物のクリアランス機能について評価するための方法、およびそれに基づいて神経変性障害を治療するための方法 Download PDFInfo
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Description
[0001]本出願は、同時係属中の2013年2月21日出願の米国仮特許出願第61/767,546号、表題:Methods For Evaluating Brain−Wide Paravascular Pathway For Waste Clearance Function and Methods For Treating Neurodegenerative Disorders Based Thereon;2013年8月5日出願の仮特許出願第61/862,321号、表題:Methods For Evaluating Brain−Wide Paravascular Pathway For Waste Clearance Function and Methods For Treating Neurodegenerative Disorders Based Thereon;および2014年2月20日出願の仮特許出願第61/942,447号、表題:Methods For Evaluating Brain−Wide Paravascular Pathway For Waste Clearance Function and Methods For Treating Neurodegenerative Disorders Based Thereonの優先権および利益を主張するものであり、これらそれぞれの全体が本明細書に援用される。
[0002]開示する発明は、国立衛生研究所と第NS078304号、第NS078167号、および第NS073373号の契約をして、政府の支援を受けて行った。政府は、本発明に関して権利を有する。
1.技術分野
[0003]本発明は、哺乳動物の脳内のグリオ−血管経路の機能を測定するための方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の脳内の脳脊髄液−間質液(CSF−ISF)の交換を測定するための方法に関する。本発明はさらに、グリオ−血管経路の機能を促進または妨害することによって、哺乳動物の脳の疾患または障害を治療するための方法に関する。本発明はまた、哺乳動物の脳内の脳脊髄液の分泌および流れを促進または増大させるための方法に関する。
2.発明の背景
3.発明の概要
中枢神経系の画像化を行うステップ;および
中枢神経系中の脳脊髄液−間質液(以下、「CSF−ISF」)の交換を測定するステップ、
を含み、それによって、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定する方法を提供する。
[0011]別の実施形態では、この方法は、中枢神経系の画像化を行うステップの前に画像化剤を投与するステップをさらに含む。
[0013]この方法の別の実施形態では、画像化剤をくも膜下腔内に投与するステップが、画像化剤を腰椎または大槽髄腔内注入で投与するステップを含む。
[0019]この方法の別の実施形態では、治療剤が、治療に使用するために投与する化学療法剤、機能性ナノ粒子、または毒性組成物である。
[0027]この方法の別の実施形態では、神経変性疾患が、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、または混合型認知症である。
[0029]哺乳動物の中枢神経系に発症した神経変性疾患を治療する方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを、治療し、改善し、阻止し、減少させ、または低減させる方法を提供する。
[0032]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である。
[0034]この方法の別の実施形態では、神経変性疾患が、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症(CTE)、またはHIV関連認知症である。
[0039]抗ヒスタミン剤(例えば市販薬):
[0040]ALLEGRA(登録商標)(フェキソフェナジン)
[0041]BENADRYL(登録商標)(ジフェンヒドラミン)
[0042]CLARITIN(登録商標)またはTAVIST(登録商標)(ロラタジン)
[0043]CHLOR−TRIMETON(登録商標)(マレイン酸クロルフェニラミン)
[0044]DIMETANE(登録商標)(ブロムフェニラミン、フェニルプロパノールアミン)
[0045]ZYRTEC(登録商標)(セチリジン)
[0046]非処方箋睡眠補助剤:
[0047]Unisom Nighttime Sleep−Aid
[0048]Dormin
[0049]Nytol
[0050]Simply Sleep
[0051]Sominex
[0052]Extra Strength Tylenol PM
[0053]塩酸ジフェンヒドラミン
[0054]Excedrin P.M.
[0055]ベンゾジアゼピン系:
[0056]PROSUM(登録商標)(エスタゾラム)
[0057]DALMANE(登録商標)(フルラゼパム)
[0058]DORAL(登録商標)(クアゼパム)
[0059]RESTORIL(登録商標)(テマゼパム)
[0060]HALCION(登録商標)(トリアゾラム)
[0061]VALIUM(登録商標)(ジアゼパム)
[0062]非ベンゾジアゼピン系:
[0063]イミダゾピリジン:AMBIEN(登録商標)、AMBIEN(登録商標)CR、INTERMEZZO(登録商標)(ゾルピデム)(優れている)
[0064]SONATA(登録商標)(ピラゾロピリミジン)(優れている)
[0065]メラトニン受容体刺激剤:
[0066]ROZEREM(登録商標)(ラメルテオン)
[0067]NOTEC(登録商標)(抱水クロラール)
[0068]PRECEDEX(登録商標)(塩酸デクスメデトミジン)
[0069]LUNESTA(登録商標)(エスゾピクロン)
[0070]バルビツレート:
[0071]NEMBUTAL(登録商標)(フェノバルビタール)
[0072]MEBARAL(登録商標)(メフォバルビタール)
[0073]Amytal Sodium(アモバルビタールナトリウム)
[0074]BUTISOL(登録商標)(ブタバルビタールナトリウム)
[0075]SECONAL(登録商標)Sodium Pulvules(セコバルビタールナトリウム)
[0076]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、AQP4の脱偏在(depolarization)またはAQP4の偏在(polarization)の喪失を阻止する薬剤である。
[0078]別の実施形態では、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む。ポンピングは、当該技術分野で公知のいずれかのデバイスまたは方法により、例えば、機械的ポンプ、注入ポンプ等を使用することによって行うことができる。
[0081]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
[0083]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
[0087]別の実施形態では、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤が、JNJ−17299425またはJNJ−17306861である。
[0092]別の実施形態では、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤が、JNJ−17299425またはJNJ−17306861である。
[0094]この方法の別の実施形態では、脳の老廃産物が、可溶性アミロイドβ(Aβ)、タウ、またはαシヌクレインである。
[0099]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
[00103]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
[00106]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、本明細書に開示する、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック系の機能を測定するための方法に従って測定するステップをさらに含む。
[00109]この方法の別の実施形態では、哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である。
4.図面の簡単な説明
[00117]本発明を、添付図面を参照しながら本明細書に記載するが、図面中、類似した参照数字は、いくつかの図にわたり、類似した要素を表す。いくつかの事例では、本発明の様々な態様は、本発明を理解しやすくするために誇張、拡大、分離、または省略された状態で示される場合もあると理解されたい。
[00185]5.1.脳内のグリオ−血管経路(グリンファティック系)の機能を測定するための方法
[00186]哺乳動物の脳および/もしくは脊髄(またはまとめて、中枢神経系もしくは「CNS」)中のグリオ−血管経路(本明細書ではまた、「グリンファティック系」とも呼ぶ)の機能を測定するための方法を提供する。一実施形態では、この方法は、
中枢神経系の画像化を行うステップと、
中枢神経系中のCSF−ISFの交換を測定するステップと
を含み、それによって、哺乳動物の中枢神経系中のグリンファティック機能を測定する。
[00192]その他の実施形態では、画像化剤(または造影剤)を、実質内または脳室内のいずれかに注入する薬物と共に同時投与することができる。同時投与のそのような方法は、当該技術分野で周知である。
[00213]画像強度を、以下の式:img標準化=imgオリジナル/ファントム×1000を使用して、ボクセル強度を参照ファントムの平均強度で割り;それに続き、最大半量の等方性ガウス平滑化において、0.1mmの全幅で割ることによって、時系列を通して標準化することができる。
[00220]哺乳動物の脳および/もしくは脊髄(またはCNS)中に発症した神経変性疾患を治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含む方法を提供する。
[00232]哺乳動物の脳の間質および/または脊髄の間質からの老廃産物(例えば、脳、脊髄またはCNSの老廃産物)のクリアランスを促進するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップを含み、それによって、脳の間質および/または脊髄の間質からの老廃産物のクリアランスを促進する方法を提供する。薬剤は、例えば、利尿剤であり得る。
[00236]別の実施形態では、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤が、JNJ−17299425またはJNJ−17306861である。
[00243]哺乳動物の中枢神経系中の老廃産物の蓄積を緩慢にする、遅延させる、または阻止するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、中枢神経系からの老廃産物のクリアランスを増加させる方法を含む。
[00245]特定の実施形態では、アドレナリン作動性受容体アンタゴニストが、治療剤である。アドレナリン作動性受容体アンタゴニストは、当該技術分野で周知である。また、脳室−腹腔シャントの外科的埋込みも治療剤と併用して、グリンファティック系のクリアランスを増加させるまたは促進することができる。
[00249]別の実施形態では、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤が、JNJ−17299425またはJNJ−17306861である。
[00256]哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるまたは妨害するための方法を提供する。そのような方法を、治療用の薬物または化合物のクリアランスに、例えば、脳腫瘍の治療に使用することができる。
[00259]別の実施形態では、この方法は、脳内のグリンファティック系の機能を、セクション5.1および下記の例、例えば、実施例1〜3に開示する方法に従って測定するステップをさらに含む。
[00263]5.6.方法の治療における使用
[00264]実質の液体の流れのパターンを決定するための、本明細書に開示する方法を、治療におけるいくつかのアプローチに利用することができる。第1に、脳内のバルク流の効率を改善して、可溶性Aβ、タウまたはαシヌクレイン等の脳の老廃産物のクリアランスを改善させ、こうすることにより、それらの分解または全身循環中への再取込みのいずれかを潜在的に加速させることができる。
6.実施例
[00269]脳は、リンパ循環を欠くので、細胞外タンパク質を代替のメカニズムによりクリアランスしなければならない。脳脊髄液(CSF)は脳の細胞外溶質のためのシンクとして機能するが、脳の間質からの溶質が、実質からCSFにどのように移動するのかは不明である。本実施例により、くも膜下CSFの相当な部分が脳の間質内空間を通って循環することが示されている。本実施例は、小さな蛍光トレーサーのin vivoにおける二光子画像法に基づいて、CSFが貫通動脈を囲む傍血管空間に沿って実質に入ること、および脳の間質液が傍静脈排液経路に沿ってクリアランスされることを示している。アストロサイト中の水チャネルのアクアポリン−4(AQP4)を欠く動物では、このシステムを介するCSFの流入が緩慢になり、間質内溶質のクリアランスが約70%低減することが示され、このことは、これらの解剖学的な流入経路と流出経路の間の液体のバルク流がアストロサイトの水の輸送により支援されることを示唆する。アルツハイマー病を引き起こすと考えられているペプチドであるアミロイドβに蛍光タグを付けたものがこの経路に沿って輸送されたこと、およびAqp4遺伝子の欠失が可溶性アミロイドβのクリアランスを抑制したことから、この経路によりアミロイドβが中枢神経系から除去されることが示唆される。また、静脈に沿う流れを介するクリアランスは、神経変性状態に関与するタンパク質の細胞外レベルを調節することもでき、その機能障害は、可溶性タンパク質の誤った蓄積に寄与する。
[00271]リンパ管構造は、血管構造に平行な第2の循環に相当し、後毛細管小静脈を介しては吸収されないその構成要素のタンパク質およびその他の溶質を有する間質液(ISF)のクリアランスを担う(1、2)。血管を有する組織の大部分では、リンパ系は、静水圧およびホメオスタシスの両方の維持にとって決定的に重要である。しかし、脳は、組織学的に特定可能なリンパ管を有さず、したがって、その他の末梢組織中には存在する、間質内溶質および液体のクリアランスのための別個の経路を欠く(3〜5)。これは、驚くべきことであり、その理由は、神経細胞およびグリアの大きな代謝速度およびそれらの細胞外環境中の変化に対する高い感受性は、ISFおよび溶質の迅速なクリアランスの必要性を示唆するからである。
[00274]動物
[00275]全ての実験が、University of Rochester Medical CenterのUniversity Committee on Animal Resourcesにより承認された。別段の記載がない限り、8〜12週齢雄C57BL/6マウス(Charles River)を実験に使用した。
[00281]全ての実験で、ケタミン(0.12mg/g、腹腔内)とキシラジン(0.01mg/g、腹腔内)との組合せを用いて、動物に麻酔を施した。
[00283]全ての図で、データを、平均±SEMとして提示する。全ての統計を、ソフトウエアPrism(GraphPad)を用いて行った。<0.05のP値を、有意とみなした。各データセットの統計処理を、下記に記載する。
[00285]全ての蛍光CSFトレーサーを、0.5%の濃度の人工CSF中で構成した。これには、ALEXA−594ヒドラジド(A594)、FITC−デキストラン2000(FITC−d2000)、テキサスレッド−デキストラン3(TR−d3)、テキサスレッド−デキストラン2000(TR−d2000)、卵白アルブミンコンジュゲートALEXA−647(OA−647)(全て、インビトロジェン製)が含まれる。HiLyte555コンジュゲートアミロイドβ1−40(Anaspec)を、0.1%の濃度の人工CSF中で構成した。放射標識3H−マンニトール(15〜30Ci/ミリモル、パーキン・エルマー)を、人工CSF中に0.1μCi/μlで溶解させた。放射標識3H−デキストラン10(100〜500mCi/g、American Radiolabeled Chemicals)を、人工CSF中に0.01μCi/μlで溶解させた。放射標識125I−アミロイドβ1−40(2200Ci/ミリモル、パーキン・エルマー)を、0.005μCi/μl(2.3ナノモル/L)の人工CSF中に溶解させた。
[00287]麻酔を施したマウスを、定位固定枠中に固定し、33GA鋼鉄針を、小さな穿頭孔から右側脳室中に定位的に挿入した(十字縫合に対して、0.95mm外側、2.35mm腹側、および0.22mm尾側)。第2の30GA針を、大槽に挿入した。脳室−大槽の閉塞灌流を、連結型シリンジポンプ(Micro4、WPI)を用いて、人工CSF中に溶解させたトレーサーを外側脳室中に注入し、大槽からCSFを200nl/分の等しい速度で引き出すことによって行った。
[00290]麻酔を施したマウスを、定位固定枠中に固定し、30GA針を、大槽に挿入した。大槽内への注入のために、10μlのCSFトレーサーを、シリンジポンプ(Harvard Apparatus)を用いて2μl/分の速度で5分にわたり注入した。
[00294]トレーサーの脳内への浸透を、落射蛍光顕微鏡法によりex vivoにおいて評価した。切片全体の多重チャネルモンタージュを、StereoInvestigatorソフトウエア(Microbrightfield)のVirtual Sliceモジュールを用いて獲得した。これには、別個のDAPI、緑色および赤色の放出チャネルが含まれた。照射レベルを、無注入対照切片に基づいて決定し、次いで、研究全体を通して一定に維持した。
[00298]in vivoにおける画像化のために、麻酔を施した動物に、挿管し、小型の動物用人口呼吸器(CWE)を使用して、約100回の呼吸/分および0.3〜0.4mlの1回換気量で室内空気による人工呼吸を行った。体温を、温度制御型加温パッドを用いて37℃に保った。開頭手術(直径3mm)を、十字縫合に対して1mm外側および0.5mm後側の皮質上で行った。硬膜を、処置せず残し、開頭部を、CSFで覆い、カバースリップを用いて密封した。平均動脈圧をモニタし、動脈血ガスの値を測定するために、大腿動脈をカニューレ処置した。生理的範囲(pO2=80〜150mmHg、pH7.25〜7.5)内の血液ガスを有するマウスのみを、本研究に含めた。血管構造を可視化するために、0.1mlのBBB不透過性カスケードブルー−デキストラン10(MW:10kD)またはテキサスレッド−デキストラン70(MW:70kD;いずれも、生理食塩水中の1%、インビトロジェン)を、画像化の直前に動脈内注入した。
[00301]間質液および溶質の脳からのクリアランスの経路および速度を評価するために、蛍光標識トレーサーおよび放射標識トレーサーを、脳の実質中へ定位的に注入した。麻酔を施した動物を、定位固定枠中に固定し、33GA針を、小さな穿頭孔から脳内へ、以下の座標において挿入した:皮質内注入(十字縫合に対して、0.22mm尾側、2.0mm外側、1.75mm腹側)、線条体内注入(十字縫合に対して、0.22mm尾側、2.5mm外側、3.5mm腹側)、視床内注入(十字縫合に対して、1.82mm尾側、1.25mm外側、3.75mm腹側)。針の挿入の後、30分を経過させて、針の跡が膨んで閉じるのを待った。1.0μlの(人工CSF中に溶解させた)トレーサーを、17nl/分の速度で注入した。
[00305]浮遊免疫蛍光法を、100μmのPFA固定ビブラトーム切片上で行った。切片を、3%のロバ正常血清(Jackson Immunoresearch)を用いて室温で1時間ブロックし、一次抗体と共に4°Cで一晩インキュベートし、2次抗体と共に室温で2時間インキュベートした。一次抗体は、ラット抗CD31(内皮マーカー;1:200、Abcam)、マウス抗GFAP(アストロサイトマーカー;1:500、ミリポア)、およびウサギ抗AQP4(1:500、ミリポア)を含んだ。2次抗体は、Cy2コンジュゲートロバ抗ラット、Cy5コンジュゲートロバ抗マウス、およびCy3コンジュゲートロバ抗ウサギ(Jackson Immunoresearch)を含んだ。
[00307]野生型マウスおよびAqp4欠損マウスにFITC−d40を注入し、5分後、0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中の4%ホルムアルデヒドおよび0.1%グルタルアルデヒドを用いる経心臓灌流により固定した。脳を、一晩後固定し、ビブラトームにより100μmの冠状切片に切断した。記載に従って、浮遊切片を、HRPコンジュゲート抗フルオレセイン抗体(Abcam、カタログ番号:AB6656、5μg/ml)と共に(4°Cで)24時間インキュベートし、次いで、ジアミノベンジジン(DAB)−ペルオキシダーゼ処理を行って、フルオレセイントレーサーを可視化した(56)。光学顕微鏡法により、切片の画像を獲得した後、頭頂葉皮質の領域を、解体し、Durcupan中に包埋した(56)。超薄切片(約90nm)を、Reichertウルトラミクロトーム上で切断した。最後に、切片を、対比染色し、FEI Tecnai 12透過型電子顕微鏡中で調べた。デジタル画像を、26000倍の公称倍率で記録した。
[00309]野生型マウス(n=3)およびAqp4欠損マウス(n=4)を、0.1Mリン酸緩衝液中の2.5%グルタルアルデヒドおよび1%ホルムアルデヒドを用いる経心臓灌流により固定した(pH7.4、9ml/分で25分間)。脳を、一晩後固定してから、300〜500μmの冠状切片を解体し、Durcupan中に包埋した(55)。超薄切片を、上記の記載に従って切断し、対比染色し、調べた。貫通血管のデジタル画像を、4200倍の公称倍率で記録した。Virchow−Robin空間の最大幅を、貫通血管の周囲で、軟膜表面からの80μmの最小深さにおいて測定した(範囲:野生型マウスおよびAqp4欠損マウスのそれぞれについて、166〜415μmおよび83〜366μm)。
[00311]脳室CSFは、わずかに脳の実質に入る
[00312]最初に、CSFが脳室コンパートメントから脳に入るかどうかを、異なる分子量の蛍光トレーサーを、麻酔を施したマウスの外側脳室中に注入することによって評価した(図1A)。30分間の連続注入の後、トレーサーの脳の実質中への移動を、ex vivoにおいて、固定したビブラトーム切片の蛍光画像法により評価した[Alexa Fluor594ヒドラジド(A594):分子サイズ、759ダルトン;テキサスレッド−デキストラン−3(TR−d3):分子サイズ、3kD;フルオレセインイソチオシアネート−デキストラン−2000(FITC−d2000):分子サイズ、2000kD]。少量のA594およびTR−d3が、側脳室および第三脳室の脳室上皮を横断した(図1B、C、EおよびF)。しかし、トレーサーは、脳室周囲直近の領域から遠く離れた部位では観察されなかった(図1DおよびG)。
[00314]次に、くも膜下コンパートメントからのCSFが脳の実質に入るかどうかを、蛍光標識トレーサーおよび放射標識トレーサーの両方を大槽に注入することによって評価した(図1A)。注入の30分後、蛍光トレーサーの分布は、トレーサーを脳室中に注入した後に観察されたパターンとは根本的に異なった(図1BおよびEと比較した図1HおよびK)。傍血管空間に沿って脳に入った分子量の大きいFITC−d2000(分子サイズ、2000kD)は、そこに限局し、周囲の間質内空間には入らなかった(図1KおよびL)。TR−d3(分子サイズ、3kD)は、傍血管空間中に集中したが、また、傍血管空間(図1KおよびL)からも軟膜表面(図1M)からも間質に入った。TR−d3は、主に血管に沿う形で局在化するFITC−d2000よりも広範に分布した。分子量のより小さいA594(分子サイズ、759ダルトン)は、脳の間質全体を通して迅速に移動し、ごく少量が傍血管空間内に集中した(図1HおよびJ)。A594およびTR−d3の両方は、軟膜表面から脳内へ緩慢かつ一様に移動した(図1H、KおよびM)。次いで、異なる分子量のトレーサーの実質における分布を、画像解析により定量化した(図7)。A594は、注入してから30分以内に事実上脳の全体積に浸透し、一方、分子量のより大きいトレーサーの浸透は、より限局的であることが証明された(図1N)。
[00317]次に、二光子レーザー走査顕微鏡法を使用して、脳の実質中へのくも膜下CSFの流入の経路および動態をリアルタイムで可視化した。麻酔を施したマウス中の頭蓋の閉窓を通して画像化する(図2A)ことによって、大槽内に注入した蛍光デキストランの大脳皮質中への移動を可視化した。大脳の血管構造を、血液脳関門(BBB)不透過性蛍光デキストラン(CB−d10)を用いて(静脈内から)標識し、貫通動脈および貫通静脈を、形態学的に同定した(図2B)。
[00321]in vivoにおける画像化により、くも膜下CSFが動脈に沿って皮質中に流入することが示された。しかし、二光子画像法では、脳のより深部の構造を通るトレーサーの流動を画像化することができないので、次に、ex vivoにおけるアプローチを使用して、脳全体を通して血管に沿うCSFの流入およびクリアランスをマッピングした。中等度の分子量のトレーサーである卵白アルブミンコンジュゲートAlexa Fluor 647(OA−647;分子サイズ、45kD)の分布を、Tie2−GFP:NG2−DsRed2重トランスジェニックレポーターマウスの固定したビブラトーム切片中で解析し、このマウス中では、動脈と静脈とを容易に識別することができた(図10A)。大槽内への注入の直後に、トレーサーは、内向きに貫通動脈および細動脈に沿って迅速に移動して、脳全体を通して末端の毛細血管床に達し(図3A)、最も大きな流入が、基底核および視床の大腹側貫通動脈に沿って生じた(図3Dおよび図10C〜E)。トレーサーは、早期の時点(注入後、<10分)では、静脈の周囲に観察されなかった。その後の時点(>1時間)では、大槽内注入したトレーサーは、毛細血管および実質の細静脈に沿って蓄積した(図3FおよびG)。トレーサーは脳から、主として2つの傍静脈経路、すなわち、内側内大脳静脈および外側−腹側の尾側鼻静脈に沿って出た(図3H)。皮質、線条体または視床中に直接注入した実質内のトレーサーは、同じ共通の解剖学的経路に沿ってクリアランスされ、内大脳静脈に向かって後側−内側にまたは外部の莢膜に沿って後側−外側−腹側に移動し、その後、実質から尾側鼻静脈に沿って出た(図11A〜E)。これらの結果から、脳の実質を通って移動するISFおよびCSFは、同じ傍静脈排液経路に沿ってクリアランスされることが示された。
[00325]このデータは、アストログリア水流は、くも膜下CSFの脳間質内への移動およびこれを経由する移動を促進することを実証している。この経実質CSFの流動に対する1つの考え得る機能として、脳間質からの液および溶質のクリアランスが挙げられる。
[00339]この事例では、脳網羅的経路は、マウスの液輸送について識別され、これには、くも膜下CSFの脳間質への傍動脈流入、その後の大口径流出静脈に沿ったISFのクリアランスが含まれる。これらの流入経路と流出経路との間に生じる間質性のバルク流は、アストロサイトを経由する水の移動に依存し、またこの系を経由する継続的な液の移動は、おそらく可溶性Aβ1−40を含む間質内溶質の脳からのクリアランスに対する重要な寄与因子である。このバルク流のグリア水流に対する依存性、およびその間質内溶質クリアランスにおけるリンパ機能の従属性に照らし、この系は「グリンファティック」経路と命名された(図5Bおよび図15A〜B)。
[00343]これらのデータから示唆されることとして、AQP4−依存性アストログリア水流は、脳内の傍動脈CSF流入を、傍静脈ISFクリアランスと結びつけることが挙げられる。AQP4は、細胞外傷性浮腫の進行期間中における脳組織内への水の取り込み、ならびに血管原性浮腫後の水のクリアランスと関係している(30、31)。これらの観察所見から示唆されることとして、血管周囲のAQP4は、くも膜下CSFの傍動脈腔から脳の間質への流入、ならびに後続する対流性のバルク流を経由するISFのクリアランスを促進することが挙げられる(3、4)。バルク流CSFが移動する場合、それは大槽内注射したTR−d3およびFITC−d2000のin vivo二光子画像化法を用いて、直接、傍動脈経路に沿って認められた。これらの薬剤のいずれも、柔膜動脈の壁に沿って急速に移動し、周辺のくも膜下コンパートメント内のCSFと混合せずに、Virchow−Robin腔に進入した(図2B)。Wellerにより実施された軟膜血管の超微細構造解析と一致して(12)、これは、これらの血管が貫通する表面動脈の周りの傍血管腔、およびVirchow−Robin腔は、バルク流によりCSFが脳実質に急速に進入する、物理的にも機能的にも異なるサブコンパートメントを備えることを示す。このCSF流は、動脈の脈拍により駆動される可能性がある(13〜15):傍動脈腔内へのCSF流入の方向性は、おそらく傍動脈経路と傍静脈経路との間の異なるパルス圧力を反映する。
[00348]Aqp4−nullマウスにおいてこの経路が途絶すると、溶質クリアランスに不具合が生じたという所見は、神経毒性沈着物の誤った蓄積が疾患の発症に寄与する神経変性疾患にとって、臨床的意義を有する。Ballらは、実質内注射したAβは、傍血管経路に沿ってクリアランスされることを報告したが(40)、一方、可溶性Aβ傍血管クリアランスの不具合の原因として、アルツハイマー病における細胞外Aβ凝集物形成および疾患進行が示唆された(41)。本事例では、脳実質内に注射した蛍光剤でタグ化された可溶性Aβ1−40は、その他の蛍光トレーサーと同じ傍血管経路に沿ってクリアランスされ、また放射能標識されたAβ1−40の間質からのクリアランスは、Aqp4−nullマウスにおいて実質的に低下した。アルツハイマー病と反応性グリオーシスとが関連し、また老化した脳ではグリオーシスの増加が認められることから、これは重要である(42〜44)。神経病理学的条件下で反応性アストロサイト内のAQP4発現および局在に変化が生ずると(45)、間質性のバルク流異常、およびこれに起因するAβ等の神経毒性溶質のクリアランス不具合の原因となり得る。
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[00354]実施例1にて上記したグリンファティック系は、脳からの溶質および老廃物の効率的なクリアランスを促進する、脳脊髄液(CSF)と間質液(ISF)との交換のための脳網羅的傍血管経路である。CSFは、傍動脈チャンネルに沿って脳に進入してISFと交換し、次に傍静脈経路に沿って脳からクリアランスされる。可溶性アミロイドβのクリアランスは、グリンファティック経路機能に依存するので、このクリアランス系の不具合は、アミロイドプラークの沈着およびアルツハイマー病の進行の原因となり得る。この事例は、グリンファティック経路機能は、臨床的に重要な画像化技法を用いて測定可能であることを実証している。髄腔内に常磁性造影剤を投与した後、ダイナミック造影MRIを、ラット脳全体にわたりCSF−ISF交換を視覚化するのに用いた。グリンファティック経路機能の特性について、傍動脈CSF流入、および分子サイズ依存性のCSF−ISF交換の可視化を含め特徴付けた。全脳画像化法は、脳下垂体陥凹および松果腺陥凹における2つの重要な流入ノードの識別を可能にしたが、一方、ダイナミックMRI画像化法は、グリンファティックCSF−ISF交換および脳からの溶質クリアランスを特徴付けるためのキネティックパラメータの定義を可能にした。MRIアプローチは、この事例において、生きているヒトの脳を対象としてアルツハイマー病への罹患のしやすさ、およびその進行を評価する方法で利用可能であることを実証した。
[00356]古典的なモデルでは、脳脊髄液(CSF)は、脳室の脈絡叢により活発に分泌され、バルク流または拍動流により脳室系を通じて移動し、ルシュカ孔およびマジャンディ孔を通じて第4脳室からくも膜下腔内に流出する。くも膜下腔から、CSFは、硬膜静脈洞のくも膜顆粒経由で、または脳神経シースに沿って頭蓋腔外を通過することにより血流に再吸収され、頚部リンパ管を通じて除去されると考えられる(1、2)。このCSFカラムに沿った液の移動は、磁気共鳴画像化法(MRI)により一般的に測定される。位相造営磁気共鳴画像化法(MRI)は、CSF流の動力学の可視化を可能にし、また交通性と非交通性の水頭症、正常圧水頭症、およびくも膜嚢腫の評価で臨床的に用いられる(3)。造影磁気共鳴脳槽造影法も、自発的頭蓋内圧低下症またはCSF鼻漏を治療する際にCSFの漏出を識別するのに利用可能である(4、5)。
[00360]外科的調製
[00361]メスのSprague−Dawleyラット(Taconics、体重:220〜280g)を用いた。麻酔するため、導入チャンバーを用いて動物を酸素中3%のイソフルランで催眠し、次に40mg/kgフェノバルビタール(Nembutal(登録商標)ナトリウム溶液、OVATION、Pharmaceuticals、Inc.、Deerfield、IL、米国)を腹腔内注射した。動物は、全実験期間を通じて自発呼吸に任せた。外科手技期間中の適切な酸素供給(O2飽和度>97%)、呼吸(1分間当たり、50〜65回の呼吸数)、および正常体温(36.5℃〜37.5℃)を確保するために、非侵襲的モニタ(パルスオキシメトリー、呼吸数および直腸温度プローブ、SA Instruments、Inc.、Stony Brook、NY)を配置した。液の投与および補足麻酔用として、24−ゲージカテーテルを尾部静脈に挿入した。動物を定位固定フレーム(Kopf Instruments、フレーム#9)に配置し、そして頭部を50度曲げた。短時間の外科手技では、O2:空気が1:1の混合気中で送達されたイソフルラン(0.8〜1.2%)で麻酔を補足した。
[00364]手術後、ラットを仰向けに裏返し、頭部固定デバイスおよび補助酸素送達用の鼻マスクが取り付けられた特別注文のアクリル製クレードルに配置した。動物の頭部を、3.0cmの特別注文の無線周波数(rf)レシーバーコイルの最上部に配置した。動物がMRI画像検査を受けている間バイタルサインを継続的にモニタリングするために、非侵襲式、MRI適合モニタ(パルスオキシメトリー、呼吸数、および直腸温度プローブ、SA Instruments、Inc.、Stony Brook、NY)を再配置した。画像検査では、コンピュータ支援型エアヒーティングシステム(SA Instruments、Inc.、Stony Brook、NY)を用いて画像検査期間中、体温を36.5〜37.5℃内に厳密に維持した。髄腔内カテーテルを、1ccシリンジと微量注入ポンプ(Baxter Model AS50 infusion Pump、Baxter Healthcare Corporation、Illinois、米国)に取り付けられ、0.9%NaClで稀釈した常磁性MR造影剤が充填された長尺PE20ラインと連結した。尾部静脈カテーテルを、メンテナンスハイドレーション(0.9%NaCl、4cc/kg/hr)用として用い、また補足麻酔(Nembutal(登録商標)、5〜10mg/kg静注)を、呼吸数のガイドに従い2時間毎に実施した。
[00368]一般的なMRI画像処理手順は、頭部動き補正、強度標準化、スムージング、およびベースラインシグナルのボクセル毎の%変換から構成された。SPM8(fil.ion.ucl.ac.uk/spmのワールドワイドウェブ)をこれに用いた。第1に、取得したT1−重み付けMRI画像をDICOMファイルとしてエクスポートし、3次元NIfti画像フォーマットに変換した。第2に、頭部の移動により引き起こされたスキャン間の位置ずれを、各スキャンを時間平均化(平均)画像に剛体アライメントすることにより補正した。第3に、下記の表現:img_normalized=img_original/phantomom*1000を用いて、ボクセル強度を参照ファントムの平均強度で除算し;これに続き0.1mm半値全幅での等方性ガウス平滑化により、画像強度を時系列で標準化した。最後に、下記の表現:(P(I,j,k)=(I(I,j,k)−base(I,j,k))/base(I,j,k)*100)を用いて、全時系列画像をベースライン平均画像で減算および除算して、ボクセル強度が、平均ベースライン画像に対するパーセンテージ変化を表すことを確実にした。
[00371]類似したキネティクスに基づいて、MRI画像内のボクセルをグループ化するために、ノンパラメトリックセグメンテーションを、k−平均法クラスターアルゴリズム(PMOD Version 3.307、PMOD Technologies,Ltd、Zurich、スイス)を用いて、4次元T1−重み付けMRIそれぞれに由来する水管レベルにおいて、4つの矢状断面スライスについて実施した。脳のみを含む関心体積マスクをクラスター分析用に作成した。使用するクラスターの数(K)を、大血管、例えば脳底動脈(脳下垂体陥凹を含む)や嗅動脈複合体等に隣接するボクセルを区分することができるKにより決定した。これを、動物毎、インタラクティブに実施した。各分析を、50%パーセンタイル閾値(すなわち、シグナル変化が最も大きいものの50%に相当するピクセルのみ)を用いて実施した(2乗したTAC値の合計を用いた)。傍血管流入導管の最も理想的な可視化を実現したクラスターの数は、4クラスターであった。大血管と比較してクラスターの位置を検証するために、4つのクラスターを、対応する造影および解剖学的MRIにより目視的に検査し、同時登録した。クラスター毎のボクセル数およびTACを、更に処理するために抽出した。
[00373]より高い分解能で髄腔内トレーサーのラット脳内への移動を評価するために、固定化した脳スライスにおいて、フルオレセインイソチオシアネート結合デキストラン(MW500kD、FITC−d500)、およびテキサスレッド結合デキストラン(MW3kD、TR−d3)のex vivo蛍光画像化法を実施した。Gd−DTPA(MW約1kD)およびGadoSpin(商標)(MW200kD)の分子量に概ね対応するように、FITC−d500およびTR−dT3を選択した。髄腔内注射を、上記で詳記したように実施した。人工的なCSFに溶解した0.1%のFITC−d500とTR−dT3からなる混合物を注射した。注射後30分、60分、および180分経過して、動物を4%パラホルムアルデヒドで経心臓的に灌流し、脳を取り出し、そして4℃で一晩事後固定化した。100μmの矢状断面ビブラトーム切片を切り出し、DAPI(インビトロジェン)を含むProlong Antifade Gold試薬でマウントした。冠状切片のサブセットを、ビオチン化されたGriffonia(Brandeiraea)SimplicifoliaレクチンIイソレクチンB4(IB4、血管内皮マーカー;1:100、Vector Laboratories)により、4℃で一晩、更にカウンター標識した。2次検出を、Cy5結合ストレプトアビジン(1:250、Jackson Immunoresearch)を用いて実施した。モーター駆動式ステージとMicrolucidaソフトウエア(Microbrightfield)を備えた、対物レンズの倍率が10倍の従来型の落射蛍光顕微鏡(オリンパス)を用いて、3−チャンネル全スライスモンタージュを作成した。高倍率画像化法を、レーザースキャニング共焦点顕微鏡(オリンパス)により、40倍の対物レンズ倍率で実施した。
[00375]すべてのデータを、平均値±SDとして提示する。統計分析を、SASバージョン9.2(SAS Institute Inc、米国)およびXLSTATバージョン2011(Addinsoft、NY、米国)を用いて実施し、p値<0.05のとき、有意に異なるものと説明される。Gd−DTPAラットとGadoSpin(商標)ラットとの間において、局所的組織の取り込みに認められる差異(解剖学的対象部位の平均「曲線下面積(AUC)」(mAUC)と脳下垂体陥凹の平均mAUCとの間の平均の比により表される)を、両側t−検定を用いて独立した群について比較した。K−平均法クラスター分析から、下記のパラメータを導出した:1)3つの解剖学的ゾーンそれぞれにおけるボクセル総合計数、2)各ゾーンの時間−重み付けクラスター数(#ボクセル*AUC)、および3)ゾーン1’の時間−重み付けクラスター数に対する、ゾーン2’および3’の総時間−重み付けクラスター数の比。Gd−DTPAラットとGadoSpin(商標)ラットとの間におけるクラスター分析に由来するこれらのパラメータそれぞれの平均値について、その差異を、両側t−検定を用いて独立した群について比較した。
[00377]異なる濃度の2つの造影剤(すなわち、Gd−DTPAおよびGd−Chelate GadoSpin(商標)P)からなるファントムを調製し、そのT1を、37℃において計算した。GadoSpin(商標)Pを製造業者の指示に従い調製した。また、凍結乾燥品を再構成するために、1ccの滅菌0.9%NaClを33mgのGadoSpin(商標)Pを含有する各バイアルに注入し、0.165mMの溶液を得た。Magnevist(登録商標)注射物は、1−デオキシ−1(メチルアミノ)D−グルシトールジハイドロジェン[N,N−ビス[2−[ビス(カルボキシメチル)アミノ]エチル]グリシナト(5−)]ガドリナイト(2−)(2:1)の0.5Mの溶液であるが、この溶液0.01mlを、0.9%滅菌NaCl0.23mlで稀釈し、20.8mM Gd−DTPA溶液を得た。未希釈、再構成後のGadoSpin(商標)Pおよび20.8mM Gd−DTPAが、異なる濃度のファントムを作成したときの最初の溶液に該当した。したがって、Gd−TPAファントムは、1:10、1:20、1:40、1:80、1:160,1:320、1:640、および1:1280の容積比が得られるように、20.8mMのGd−DTPAを0.9%滅菌NaClで連続的に希釈して調製した。同様に、再構成後のGadoSpin(商標)P溶液から、Gd−DTPAの場合と同一の容積比(1:9〜1:1279)を用いてファントムを調製した。各ファントム(所与の希釈物0.5ml)を、動物試験の場合と同一のMRパラメータを用いて37℃でスキャンした:2DシングルスライスFLASHシーケンス、(TR=15msec、TE=3.8ms、NA=5)、および26フリップ角(2°〜80°)。T1を、以下のように表される標準スポイルドグラジエントエコーシーケンス(FLASH)により計算した:
[00379]本試験に含まれるすべてのラットは、6時間の画像化実験期間中、生理学的に安定な状態に留まり、呼吸数は50〜60回/分、O2−飽和度は約98〜100%、心拍数は約300〜370拍動/分、および体温は36.5〜37.5℃の範囲であった。いくつかの主要な解剖学的構造、例えば嗅球、海馬、松果腺、上丘、下丘、脳下垂体、および小脳等を識別することができたが、灰白質の造影は、常磁性造影剤投与前に得られた3次元FLASH T1−重み付けシーケンスに限定された(図18A〜B)。後外側脈絡膜動脈複合体に加えて、より大型の動脈、例えば嗅動脈、不対の前大脳動脈、不対の脳梁周囲動脈、中間内側前頭動脈等は、正中線近傍矢状断面において容易に可視化された(図18AおよびB)。
[00381]実施例1は、マウスでは、CSFはくも膜下腔から傍動脈チャンネルに沿ってVirchow−Robin腔経由で脳に急速に進入し、間質液コンパートメントと交換することを実証している。脳実質へのかかる広範な「逆行性」のCSFの流動は、CSF分泌および再吸収に関する古典的なモデルに対峙する(1、2)。この事例では、第1の目標は、異なる常磁性造影剤を髄腔内に送達した後に、CSFの脳への傍血管流入が造影MRIにより観察可能であるか調べることであった。
[00386]実施例1では、低小分子量および高分子量トレーサーのいずれも、近接する傍動脈流入経路に沿って移動可能であるが、傍動脈腔から周辺の脳間質内へのアクセスは分子サイズに基づき限定されることが実証された。特に、より低分子量のトレーサー、例えばTR−d3(MW3kD)またはALEXA647結合オボアルブミン(MW45kD)等は速やかに間質内に通過したが、一方、より高分子量のトレーサー、例えばFITC結合2000kDデキストラン(FITC−d2000、MW2000kD)等は、傍血管腔に限定して残留した。大脳の微小循環を完全に鞘に収める重複性のアストロサイトエンドフィート(8)は、より高分子量の物質が間質からアクセスするのを制限するように働くと推察された。これらの所見に基づき、脳の間質により良好にアクセスする結果として、より大きなGadoSpin(商標)(MW200kD)分子と比較して、Gd−DTPA(MW938Da)は、より大きな総脳組織容積においてシグナル変化(T1の短縮)を誘発するはずであると予測された。この仮説を、異なる定量的画像処理法を用いて試験した。
[00393]
[00397]ラットに造影剤を髄腔内注射したときに、シグナル変化(T1短縮)を示す脳実質容積は、マウスを対象として蛍光に基づく画像化法によって検出される蛍光CSFトレーサーの脳実質内への貫通よりも著しく限定された(実施例1)。この差異は、脳実質全体に分散したときに、T1−重み付けMRIが低濃度の造影剤により誘発されたシグナル変化を検出する感度が相対的に劣る(蛍光に基づく画像化法と比較して)ことに加え、髄腔内に送達される造影剤の総量の差異に由来した。これを試験するため、蛍光デキストラン(FITC−d500およびTR−d3;それぞれMW500kDおよび3kD)を、MRI試験で用いられるプロトコールと同一のプロトコールにより同時注射し、そしてex vivo蛍光顕微鏡検査法により、トレーサーの脳への貫通経路と範囲を評価した。
[00402]実施例1より、グリンファティック経路は可溶性アミロイドβの脳間質からのクリアランスに対する重要な寄与因子であることが実証され、このクリアランスの不具合は、アミロイドプラークの沈着およびADの進行に寄与することが提唱された。これらの所見に照らし、ヒト脳全体を通じてグリンファティック経路機能を測定するこの系の抑制がADの発症および進行に寄与するのかを評価する予後臨床検査法の開発には大きな価値が存在する。この実施例は、グリンファティック経路機能は、脳網羅的CSF−ISF交換を視覚化するための臨床的に重要な画像化技法である造影MRIを用いて測定可能であることを実証している。同技法は、髄腔内投与後、造影剤はバルク流により傍動脈経路を通じて急速に移動して、脳下垂体陥凹、嗅球、および松果体陥凹の主要な流入ノードに到達することを実証する。更に、脳実質の異なる領域におけるシグナル変化(T1短縮)について行ったパラメトリックおよびノンパラメトリックデータ分析から、造影剤の間質内へ移動のおよびこれを通じた移動は、常磁性造影剤分子の分子量に大きく依存することが明確に実証される。脳全体にわたるCSF−ISF交換の速度を反映するグリンファティック系機能を特徴付けるために、ダイナミック時系列造影MRI画像から、キネティックパラメータを策定および規定した。
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6. Example 1
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[00413]この実施例では、腰部髄腔内造影剤送達は、ヒトを対象としてグリンファティック経路機能を評価するために、ダイナミック核イメージング法と併用して利用可能である、臨床的に有用なアプローチであることを示す。
[00415]アルツハイマー病(AD)等の神経変性疾患は、ニューロンの機能障害および喪失の原因と考えられている内因性のペプチドおよびタンパク質の凝集と関連する。上記実施例1および2で実証されるように、グリンファティック系は、アミロイドβを含む間質内溶質の脳からのクリアランスに対する重要な寄与因子である。このような所見から示唆されることとして、グリンファティック経路機能変化を測定することが、神経変性疾患への罹患のしやすさまたはその進行を評価するための重要な兆候となり得ることが挙げられる。しかし、ヒトを対象としたグリンファティック経路機能を評価する臨床的に許容されるアプローチはまだ未開発である。
[00419]アルツハイマー病(AD)等の致命的な神経変性疾患は、ニューロンの進行性喪失、感覚および運動障害、および重度の認知機能低下により特徴付けられる。可溶性アミロイドβ(Aβ)ペプチドの細胞外沈着および高リン酸化タウの神経原線維濃縮体内蓄積は、ADの病態生理学に関係すると考えられているが(HardyおよびSelkoe、2002年、Small and Duff、2008年、Maccioniら、2010年)、一方、ハンチントン舞踏病および筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含むその他の神経変性疾患では、類似のミスフォールドタンパク質が凝集する(Bruijnら、1998年、Scherzingerら、1999年、RossおよびPoirier、2004年)。ADの場合、アミロイド沈着は、可溶性Aβの脳からのクリアランスに生じた加齢性の不具合に起因すると広く考えられている(DeaneおよびZlokovic、2007年)。神経を画像化するアプローチは、アミロイドプラークの沈着およびプラーク負荷を検出するために今日幅広く利用可能であるものの(Nordbergら、2010年)、Aβクリアランス効率を直接測定できるようにするアプローチはまだ存在しない。Aβクリアランス効率の変化を検出できれば、ADおよびその他の神経変性疾患への罹患のしやすさおよびその進行の評価における大いなる進歩となろう。
[00424]外科的な調製
[00425]メスのSprague−Dawleyラット(200〜230g;Charles River Labs、米国)をすべての実験で用いた。飼料および水を適宜与えつつ、ラットを標準検査室条件下で飼育した。すべての実験は、Rochester大学の動物資源に関する大学委員会による承認を受け、また国立衛生研究所のガイドラインに基づき実施した。ラットをイソフルラン(3%)で最初催眠し、次にペントバルビタールナトリウム(50mg/kg i.p.)で麻酔した。補足的なペントバルビタールナトリウムを必要に応じて投与した。大槽内注射の場合、麻酔したラットを定位固定フレームに固定し、大後頭孔を外科的に露出させ、そして30GA針を大槽内に挿入した。腰部注射の場合、腰部脊柱を露出させ、L2−3椎弓切除を実施し、そして30GA針をくも膜下腔に挿入した。
[00427]本試験では、2つの異なる蛍光トレーサーを用いた:高分子量の固定可能型フルオレセインイソチオシアネート(FITC)結合デキストラン(500kD、FITC−d500;インビトロジェン)、および低分子量の固定可能型テキサスレッド結合デキストラン(3k、TR−d3;インビトロジェン)。トレーサーを0.25%の濃度に人工CSF内で構成した。大槽内および腰部注射の場合、30分間注射群についてトレーサーを1.6μl/分の速度で注入し、一方、注射時間が60分以上の場合、総容量が70μlになった時点で注射を止めた。注射開始後t=30分、60分、または120分の時点で、ラットをヘパリン添加した氷冷PBSで、その後4%パラホルムアルデヒド(PFA)で経心的に灌流した。脳を取り出し、4%PFA中、4℃で一晩事後固定化し、そして50μmの冠状切片をビブラトーム(Leica)上で切り出し、そしてDAPIを含むPROLONG Anti−Fade Gold(インビトロジェン)でマウントした。
[00429]浮動性免疫蛍光標識を、分離した一連の50μmスライスについて実施した。大槽内注射の場合、各動物、60分時点に由来するスライス8片を用いた。腰部注射の場合、各動物、120分時点に由来するスライス8片を用いた。各注射経路を経由するCSFトレーサー流入のピークに対応したので、これらの時点を選択した。スライスを、3%の通常のロバ血清(Jackson Immunoresearch)中にて、室温で1.5時間ブロックし、マウス抗−グリア線維酸性タンパク質(GFAP、アストロサイトマーカー;1:1000、ミリポア)中で、またはビオチン化されたGriffonia(Brandeiraea)SimplicifoliaレクチンIイソレクチンB4(Ib4、血管内皮マーカー;1:100、Vector Laboratories)中にて、一晩、4℃でインキュベートした。2次検出を、マウス−抗GFAPについて、Cy5結合ロバ抗マウス2次抗体(1:500、Jackson Immunoresearch)を用いて、およびIb4についてCy5結合ストレプトアビジン(1:250、Jackson Immunoresearch)を用いて実施した。スライスを、2次抗体溶液中にて、室温で2時間インキュベートした。洗浄後、すべてのスライスを、DAPIを含むPROLONG Antifade Gold(インビトロジェン)でマウントした。
[00431]トレーサーの脳内への移動を、従来型の蛍光顕微鏡検査により測定した。全スライス3−チャンネルモンタージュを、1動物当たりスライス8片について、4倍の倍率で、Microlucida software(Microbrightfield)のVirtual Sliceモジュールを用いて、モーター駆動式ステージを備えたアップライト型蛍光顕微鏡(オリンパス)上で作成した。これには、分離式のDAPI、緑色(FITC用)および赤色(テキサスレッド用)発光チャンネルが含まれた。ゲインおよび露出設定を未注射の対照スライスに基づき決定し、画像化セッション全体を通じて一定に維持した。実施例1に記載するように、スライス内のスライス蛍光(蛍光トレーサーの蓄積)を、ImageJソフトウェア(NIH)を用いて定量化した。解剖学的脳対象領域(ROI)を、皮質、白質(脳梁、内包および外包を含む)、皮質下構造(線条体、視床、視床下部)、および海馬について、DAPI発光チャンネルに基づき設定した。各チャンネルのバックグラウンド蛍光を、一様に差し引き、領域毎に平均ピクセル強度を測定した。脳実質全体にわたる高分子量および低分子量CSFトレーサー分布を、レーザースキャニング共焦点顕微鏡(オリンパス)により高倍率で評価した。免疫蛍光標識スライスを対物レンズ倍率40倍で画像化した。
[00433]すべての数値を平均値±SEMとして表した。個々の時点における差異を評価するために、ボンフェローニの事後検定を用いて2元配置分散分析(ANOVA)により、各時点においておよび注射経路について強度を比較した(Graphpad Prism software)。「P」値<0.05は有意とみなした。
[00435]実施例1のマウス試験では、二光子in vivo画像化法を、「グリンファティック」系と呼ばれる、CSFの脳実質ISFとの交換を可能にする脳網羅的傍血管経路の存在を実証するのに用いた。これらの傍血管経路に沿ったCSF−ISF交換は、アストログリアのアクアポリン−4水チャンネルに支援を受け、またこの経路を通じた液の移動は、可溶性Aβを含む間質内溶質の脳からのクリアランスを促進した。本試験の目的は、グリンファティック経路機能が蛍光CSFトレーサーを腰部髄腔内注射した後でも同様に評価可能であるのかを評価することであった。マウスを対象に実施された実施例1とは対照的に、本試験では、成体のSprague−Dawleyラットを対象にグリンファティック流の特徴付けを行った。ラットを対象としてグリンファティックの流動に特徴付けを行うこの選択により、ヒト治療法の前臨床モデルとして当該技術分野で認められている齧歯類モデルについてグリンファティック機能の理解が深まる一方、腰部髄腔内注射の実施をより容易にするモデルへの移行も実現する。大槽内CSFトレーサー注射を、これまでに用いた注射経路(実施例1)と直接比較できるように並行して実施した。大槽内トレーサー注射による、マウスおよびラットを対象としたCSF−ISF交換の画像化。
[00440]図26A〜Fは、腰部髄腔内注射後の分子量が脳内へのトレーサー流入に及ぼす効果を示す。図26A〜Bは、腰部髄腔内同時注射後120分を経過した時点で、高分子量のFITC結合デキストラン(FITC−d500、MW500kD)、および低分子量のテキサスレッド結合デキストラン(TR−d3、MW3kD)の貫通を示す冠状脳スライスを表す。FITC−d500は、主として傍血管腔に限定されるが(図26B、矢印)、一方、TR−d3は、傍血管腔(図26A、矢印)または軟膜表面(矢印頭部)から脳実質を通じて速やかに移動する。図26C〜Fは、皮質、白質、皮質下構造、および海馬に解剖学的に細分化された、腰部髄腔内注射後の前方(図26C〜D)および後方(図26E〜F)脳内への蛍光トレーサーの流入量の定量を示す(皮質対皮質下構造*P<0.05、*P<0.01;皮質対白質##P<0.01;皮質対海馬†P<0.05、††P<0.01;2元配置ANOVA;各時点n=3〜4)。
[00443]CSFは、バルク流プロセスを通じて脳室およびくも膜下コンパートメント経由で移動する(Cserr、1971年、Abbott、2004年、Praetorius、2007年)。バルク流下では、溶媒の移動は、受動的拡散による溶質の移動よりも一般的に速いので、バルク流依存性の移動は、分子量とは概ね独立している(Cserr、1971年)。髄腔内腰部トレーサーの脳実質への流入速度が、分子サイズに依存するのかを評価するために、高分子量の蛍光FITC−d500(MW500kD)、および低分子量のTR−d3(MW3kD)を同時注射した。この試験から得られた代表的な画像を図26A〜Bに示す。FITC−d500およびTR−d3の脳実質内への移動を、前方および後方皮質、白質、皮質下構造、および海馬内で定量化すると、低分子量および高分子量のトレーサーのタイムコースまたは流入量のいずれについても、それらの間で有意差は認められなかった(図26C〜F)。この所見は、蛍光トレーサーは腰部注射部位から脳くも膜下腔および傍血管腔に、単純な拡散によるのではなく、バルク流経由で移動することと一致する(Cserr、1971年)。
[00445]マウスを対象とした過去の試験では(実施例1)、あらゆるサイズのCSFトレーサーは、傍血管腔に沿って脳内に急速に移動したが、FITC−d2000(MW2000kD)等の高分子量のトレーサーは、傍血管腔にトラップされるようになり、脳の間質内に、およびこれを通じて自由に移動できないことが認められた。最近行われた1試験によれば、アストロサイトのエンドフィートのプロセスは、大脳の微小循環を完全に網羅する;傍血管腔とより広い脳の間質との間の唯一の経路は重複性のアストログリアエンドフィート間にある約20nmの間隙を経由する(Mathiisenら、2010年)。血管周囲のアストロサイトエンドフィートは、大型の溶質が傍血管腔から脳の間質内に移動するのを制限する篩として機能するものと推察された(実施例1)。
[00450]この前臨床試験から、3つの所見が実証される。
[00451]第1に、グリンファティック傍血管CSF−ISF交換を、ラット大槽内に蛍光CSFトレーサーを注射した後に評価したとき、脳内のトレーサー分布およびキネティクスは、マウスを対象としたこの傍血管経路の初期の特徴付けと一般的に一致する(実施例1)。
[00453]第3に、腰部髄腔内注入後、傍血管経路に沿った蛍光CSFトレーサーの移動は、バルク流に依存し、一方、蛍光トレーサーのこれら傍血管腔から周辺の脳の間質への移動およびこれを通じた移動は、トレーサーの大きさにより制限されることが判明した。
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[00458]脳脊髄液(CSF)分泌、および脳脊髄液(CSF)/間質液(ISF)交換と関連した流れが正常であれば、代謝および毒素の老廃副産物は脳から除去される。この実施例は、老化した脳における脳脊髄液(CSF)分泌の低下、および/または脳脊髄液(CSF)/間質液(ISF)交換と関連した流れの低下を復元または強化することに関連する。これを実現するために、機械式ポンピングシステムをより迅速なクリアランスを促進するのに用いた。
[00461]哺乳動物の脳内に毒性の機能障害性タンパク質が蓄積すると、それはヒトのアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多くの神経変性疾患と関連する。しかし、老化した脳内に毒素の蓄積を引き起こすメカニズムは、完全には知られていない。アルツハイマー病(AD)の場合、アミロイドβ(Aβ)毒素の細胞外沈積である老人斑、および細胞内の神経原線維濃縮体(高リン酸化型タウ)が、2つの特徴として挙げられる。「アミロイドカスケード」仮説から示唆されることとして、ADにおける認知機能低下および顕著な病原的特徴は、これら毒素の異常な蓄積と関連することが挙げられる(Selkoe、2001年;Hardy、2006年)。
[00469]脳クリアランス試験
[00470]手短に述べると、麻酔したマウス(ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg))の右側尾状核被殻または前頭皮質内にステンレススチールガイドカニューレを定位固定的に埋め込んだ。尾状核被殻の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方0.9mm、側方1.9mm、および脳表面下方2.9mmであった。前頭皮質の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方0.7mm、側方3.0mm、および脳表面下方1.3mmであった。手術後、動物を回復するまで放置した。相当の慢性プロセスが生ずる前に実験を実施したが、報告に従い、大型の分子に対するBBBの修復の時間を設けた(Deaneら、2004年)。
[00472]14C−イヌリン(0.05μCi、バルク流に対して不活性な分子)と共に、125I−標識Aβ40(10nMモノマー)を含有する模擬的なCSF(0.5μL)を、機械式注入システムを用いて5分間にわたり、脳ISF内に微量注入した。かかる注入システムは、当該技術分野において周知されている。
[00474]実験終了時に、放射能分析およびトリクロル酢酸(TCA)分析用に、当該技術分野において公知の標準法を用いて脳を取り出し、調製した。
[00476]ガンマカウンター(Wallac Vizard γカウンター、パーキン・エルマー)内で125I−放射能を測定した。14C−カウント計測の場合、サンプルを組織可溶化剤(パーキン・エルマー)0.5ml、一晩可溶化し、その後シンチレーションカクテル(Packard Ultima Gold)5mlを添加し、そして液体シンチレーション・カウンター(Packard Tri−Carb 2100TR、パーキン・エルマー)内で分析した。
[00478]クリアランスパラメータの全計算を、本明細書ですでに開示された、およびDeaneら、2004年により開示された標準法を用いて実施した。手短に述べると、微量注射後、脳内に残留する放射能の割合(%)を、脳内回収率%=100×(Nb/Ni)として求めたが、但し式中、Nbは実験終了時に脳内に残留する放射能であり、Niは脳ISFに注射した放射能であり、すなわち14C−イヌリンの場合はd.p.m.、およびトリクロル酢酸(TCA)−沈殿可能な125I−放射能の場合はc.p.m.である。イヌリンを代謝的に不活性な極性分子として用いたが、これはBBBを通過して輸送されることも、また脳により保持されることもない;そのクリアランス速度は、ISFのバルク流の指標を提供する。
[00480]125I−Aβ40および14C−イヌリンを尾状核内注射した後に、CSF注入速度が、これらの脳内回収率に及ぼす効果
[00481]125I−Aβ40(10nM)および14C−イヌリン(0.05μCi)を含有する少量(0.5μL)の模擬的なCSFを尾状核に最初微量注射し、そして速やかにCSFを大槽内に、0.1μL/分、0.5μL/分、または1.0μL/分で30分間注入した。実験終了時に、脳を取り出し、放射能を分析した。図28は、脳内に残留するAβ40およびイヌリンの濃度が、CSF注入速度に応じて漸減したことを示す。脳のAβ40およびイヌリンクリアランスはCSF注入速度に応じて増加した。
[00483]図29A〜Bは、0.1μL/分のCSF注入速度の場合、Aβ40(図29A)およびイヌリン(図29B)の尾状核内注射後、脳内に残留するそれらの濃度は、注入時間に応じて漸減したことを示す。したがってAβ40(A)およびイヌリン(B)の脳クリアランスは、CSF注入時間に応じて増加した。
[00485]図30A〜Bは、Aβ40およびイヌリンを前頭皮質内に注射し、そして0.1μL/分の速度で大槽内CSF注入した後に、30分(図30A)、および60分(図30B)経過したときの脳内に残留するAβ40およびイヌリンの濃度を示す。CSF注入は、Aβおよびイヌリンの脳からのクリアランスを高める。したがって、CSFのCSFコンパートメント内注入は、毒性物質の老化した脳からのクリアランスを改善、増加、または復元するのに利用可能である。老化した脳内およびアルツハイマー病に罹患した個体の脳内では、CSF分泌速度は低下するので、この流れおよびCSF/ISF交換を復元することは、Aβの蓄積を低減し、認知機能低下および/またはニューロン機能障害の発現を遅延、減少または防止するのに利用可能である。このアプローチは、あらゆる年齢依存性神経障害に適用される可能性を秘める。
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[00488]この実施例では、常磁性造影剤および2つの異なる18F−標識放射性同位体の髄腔内投与と併用したダイナミック一体型MRI−PET画像化法を用いて、生きている齧歯類の脳内のグリンファティック輸送をマッピングする方法について示す。特定の実施形態では、そのような方法は、グリンファティック経路を経由する老廃物の臨床アリーナ内へのクリアランスを評価するのに用いられる。
[00490]6.5.1 ダイナミック一体型MRI−PETにより画像化した齧歯類脳内グリンファティック輸送
[00491]Sprague−Dawleyラット(2〜3月齢のメス)をフェノバルビタールで麻酔し、そして腰部髄腔内カテーテルを留置した。9.4TマイクロMRI(ref)と併用したラット脳用の特注MRI−適合型PETスキャナーを用いて画像検査を実施した。9.4TマイクロMRI装置内で用いられるPETカメラは、別途詳細に記載されている(Ref)。手短に述べると、それは初期RatCap検出器(ref)の改変型であり、非磁性材料を用いて設計されている(ref)。PETリング(ID38mmおよびラット頭部に合わせて調整)は、薄い反射性フォイルを用いて組み立てられ、マッチング非磁性S8550APDアレイに連結した2.22×2.22×5mm3ルテチウムオキシオルトシリケート(LSO)結晶の4×8アレイからなる12個のディテクターブロックから構成される(ref)。PETデータを、光ファイバー経由で外部の(PCI)に基づくデータ取得ボードに転送する(ref)。PET/MRI同時画像化用として、PETリング内部に収まる特別注文のボリュームRFコイルを用いた。すべての実験で用いた9.4TマイクロMRIは、超伝導水平中空磁石(Bruker Biospin 94/20、400 MHz、Magnex scientific)であり、これをBruker Advance consoleにインターフェース接続し、Paravision5.0ソフトウエア(Bruker Bio Spin、Billerica、MA)により制御する。磁石は、能動的遮蔽型併用式RT−shimおよび200mT/mの最大勾配磁場強度を生成し得る勾配磁場システム(B−GA 12S)を備える。9.4T磁石は、磁石の中空部全長にわたり延在する特別設計のプラスチックサポート管も装備し、これはノイズ低減性の同心円状フォームライナー(この形状は、画像検査期間中に勾配磁場により生み出される振動に起因するノイズを低減する)により、勾配磁場とは隔離されている。サポート管は、PET−MRI画像化で用いられる2つのその他のプラスチック管装置を収納するのに十分な大きさを有する;1つの管は、PETリング内にRFコイルを固定するのに用いられ、また他方の管は、動物を磁石の中心に位置するPET−MRIデバイス内に正確に配置するのに用いられる(図31A〜C)。
[00495]前臨床データセクション(上記セクション6.5.1)で提示したアプローチを、以下のようにヒトに変換した。段階的なトライアルを実施する。第1ステップでは、放射性核種槽造影を受けるヒト患者に髄腔内注射した(日常的な方法を使用)111−In DTPAの脳の取り込みについて、SPET−CTを併用して試験する。第2ステップでは、ヒト患者を対象として髄腔内注射した18FDGを同様に試験する。この目的のために髄腔内18FDGを使用する長所として、下記事項が挙げられる:
[00496]グリンファティック経路を経由する取り込みおよび輸送が、DTPAと比較してかなり迅速に生ずる;これは試験を促進する。
[00499]この実施例では、脳網羅的グリンファティック経路機能が、老化した脳では障害を有することを示す。
[00504]間質内溶質の老化した脳からのクリアランスを、放射性トレーサークリアランスアッセイ法により評価した。(A)痕跡量の放射能標識125I−アミロイドβ1−40および14C−イヌリンを、若年(2〜3カ月)、中年(10〜12カ月)、および老年(18カ月)の麻酔したマウスの尾状核内に同時注射した。1時間後、動物を絶命せしめ、脳を採集し、そして脳組織内の残留放射能をガンマ粒子カウント法および液体シンチレーションカウント法により定量化した。(B)老年の脳では、125I−アミロイドβ1−40および14C−イヌリンの両方のクリアランス速度は、若年の脳におけるクリアランスと比較して有意に低下した(若年の脳に対して***P<0.001、ANOVA;1群当たりn=8)。125I−アミロイドβ1−40および14C−イヌリンの中年の脳からのクリアランスは、若年の脳と老年の脳とのクリアランスの中間であった。これらのデータから、間質内アミロイドβクリアランス機能を含むグリンファティック経路機能は、老化した脳では顕著に低下していることが実証される。
[00506]大脳血管の拍動性を、麻酔したマウスについてin vivo二光子顕微鏡検査により評価した。(A〜B)大脳の脈管構造を蛍光テキサスレッド結合デキストラン(70kD)を動脈内注射することにより可視化した。大脳の表面動脈と静脈(A)、および貫通動脈と上行静脈(B)を形態学的に識別した。(B)の挿入図は、実験用に画像化したXYZ容積の直交するXZとYZの投影図を示す。(C〜D)大脳の表面動脈と静脈、貫通動脈と上行静脈を、高周波数ラインスキャニングにより、識別および画像化した。得られたX−t(時間)プロットについて閾値を設けてコントラストを改善し、各心周期に起因する管腔径の変化を測定できるようにした。血管の「拍動性」と呼ばれるパラメータを規定するために、血管径の変化を3秒間隔で平均管腔径について積分した。(E)貫通動脈について測定された拍動性は、若年(2〜3カ月)の脳と比較して老年(18カ月)の脳では低下した(1群当たりn=2〜4)。脳血管ツリーのその他の要素には、明らかな相違は認められなかった。これらのデータから、グリンファティック経路機能の駆動力の1つである、動脈の拍動性が老化した脳では低下していることが実証される。
[00508]拡散パラメータ(細胞外容量分画、α;屈曲度、λ)を、in vivoの覚醒時皮質および麻酔時皮質について、これまでの記載に従い、in vivoテトラメチルアンモニア電気生理学により評価した(Xieら、Science 2013年、その全体が参照により本明細書に組み込まれている)。(A〜B)老年(18カ月)と若年(2〜3カ月)との脳の間で、細胞外容量分画に相違は認められなかった(A);一方、覚醒時脳と比較して睡眠時脳では、細胞外腔の顕著な拡大が、老年の脳では不変のままであった(B)(覚醒時対睡眠時***P<0.001;2元配置ANOVA;1群当たりn=9〜20)。(C〜D)若年皮質に対して老年の皮質を比較した場合、覚醒時または睡眠時の屈曲度のいずれにおいても全体的な相違は認められなかったが(C)、老化した脳では、屈曲度の数値について、睡眠時−覚醒時の関連性に変化が認められた(D)。若年の脳では、屈曲度の数値は、覚醒状態と睡眠状態との間で異ならなかった。対照的に、老年の脳では、睡眠が開始すると、これに伴い細胞外屈曲度が有意に増加した(覚醒時対睡眠時***P<0.001;2元配置ANOVA;1群当たりn=9〜20)。これらのデータから、脳細胞外空間の構成(物質的および空間的の両方において)は、老年の脳で変化しており、これが老化した脳に認められるグリンファティック経路機能障害の原因であり得ることが実証される。
[00510]皮質内AQP4およびGFAPの発現の変化を、免疫蛍光2重標識法とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により評価した。(A〜B)代表的な画像から、若年の脳(2〜3カ月)では、AQP4の発現は、血管周囲のアストロサイトエンドフィートにほぼ排他的に限定されることを示す(矢印)。老化した皮質(18カ月)では、AQP4の局在が変化して、厳密には血管周囲に該当しない、微細なアストロサイトプロセス(矢印頭部)を含むようになる。(C)エンドフィートドメインにおけるAQP4発現量を定量化すると、老年の脳では、血管周囲のAQP4発現について、大型の大脳血管周辺で若干の減少が認められたが、大脳の毛細血管周辺では認められないことを示す(18カ月対2〜3カ月*P<0.05、t−検定;1群当たりn=4)。(D)対照的に、AQP4の局在は、老年の脳では劇的に変化する。若年の脳では、AQP4の偏在は非常に顕著であり、低レベルのAQP4発現が、血管周囲のエンドフィートにおいてのみ保持される。老年の脳では、グローバルなAQP4発現がわずかに増加するが、一方、大型の大脳血管の直近周辺部位において、AQP4の大幅な増加が認められる。したがって、老年の脳では、大型の大脳血管周辺のAQP4について、その厳密な血管周囲の偏在が失われる一方、微小血管における偏在は、概ね不変のままである。(E)かかる特異性は、反応性のアストログリオーシスのマーカーであるGFAPでは認められない。老年の脳では、血管周囲におけるGFAPの発現は、大型の大脳血管周辺および大脳の微小血管周辺のいずれにおいても有意に増加した(18カ月対2〜3カ月***P<0.001;t−検定;1群当たりn=4)。(F)同様に、GFAPの発現を空間的に評価すると、GFAP発現量の増加が皮質全体を通じて認められ、また大血管と微小血管との間において、GFAP発現量の相違は認められない。
[00512]AQP4発現量(A)、AQP4の偏在(B)、およびGFAPの発現量(C)の変化を、免疫蛍光2重標識法、レーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法、およびこれまでに定義された画像分析アプローチ(Wangら、J Neurosci、2012年;Renら、J Cereb Blood Flow Metab、2013年)により、前方および後方の脳スライス内の規定された対象領域全体にわたり評価した。(A)カラー強度マップは、2〜3カ月および18カ月の脳について局所的な平均AQP4免疫蛍光強度を表す。各部位についてAQP4発現量を定量化すると、若年の脳と老年の脳との間でAQP4発現量に有意な変化は認められない。(B)AQP4の「脱偏在」は、血管周囲で認められるAQP4免疫反応性以上のAQP4免疫蛍光を有する組織部位として定義する(より詳細な説明は、Renら、J Cereb Blood Flow Metab、2013年に記載)。したがって、より高い数値は、血管周囲におけるAQP4の偏在喪失、またはAQP4の「脱偏在」を反映する。カラー強度マップに示す通り、老年の脳でAQP4の偏在につき、顕著な喪失が生じた。偏在の有意な喪失は、皮質および皮質下構造全体を通じて明白であった(2〜3カ月に対して*P<0.05、**P<0.01;2元配置ANOVA;1群当たりn=4)。(C)GFAPの発現量を、GFAP陽性アストロサイトプロセスのエリアカバー率に基づき評価した。カラー強度マップでは、老年の脳におけるGFAPカバー率の増加を示す。このような変化は、皮質において最も顕著であったが、皮質下構造でも認められた(2〜3カ月に対して*P<0.05、**P<0.01;2元配置ANOVA;1群当たりn=4)。
[00514]反応性のアストログリオーシス(GFAPの発現)、AQP4の発現、AQP4の偏在、およびグリンファティック経路機能(大槽内注射したCSFトレーサーの流入)の間の相互関係を、前方および後方の異なる脳部位全体を通じて評価した。オボアルブミン結合ALEXA−647(OA−647、MW45kD)を、動物に大槽内注射した。30分後に動物を固定し、脳をスライスした。前方および後方の脳スライスを、AQP4およびGFAPについて免疫蛍光2重標識法により標識した。前方および後方の脳全体にわたり、異なる対象部位において、OA−647の流入(A)、AQP4の発現(B)、AQP4の脱偏在(C)、およびGFAPの発現(D)を評価した。(A〜D)カラー強度マップは、月齢2〜3カ月と月齢18カ月の間で、グリンファティックOA−647流入、AQP4の発現、AQP4の脱偏在、およびGFAPの発現について、これらの相対的増加量(赤色の数値)と減少量(青色の数値)を表す。これは、上記図40A〜Cのカラム形式で提示したデータの図形表現である。(E〜I)各部位におけるAQP4の発現、AQP4の脱偏在、およびGFAPの発現の間の関連性を、2〜3カ月および18カ月の数値をプーリングして評価し、次に対をなすOA−647/AQP4の発現、OA−647/AQP4の脱偏在、およびOA−647/GFAPの発現の数値について線形回帰分析を行った。近似曲線と共に最も強い関連性を各図に示し、また対応するr2およびP値(スロープがゼロでない場合)を提示する。(E)皮質では、AQP4の偏在の変化がグリンファティック経路機能と最も強く関連し、AQP4の脱偏在は、グリンファティックCSFトレーサー流入障害と強い対応性を有した。(F)海馬内では、グリンファティック経路機能、AQP4の発現、AQP4の偏在、またはGFAPの発現の間で強い関連性は明確には認められなかった。(G〜I)線条体、外側中隔核、視床、および視床下部内では、AQP4の発現(偏在ではない)がグリンファティック経路機能と最も強く関連した。興味深いことに、これは正の相関であり、これらの部位内のAQP4の発現量の増加は、グリンファティックCSF流入量の増加と関連した。これらのデータから、血管周囲におけるAQP4の偏在は、大脳皮質における傍血管CSF流入の重要な決定要素であるが、一方、皮質下組織では、グローバルなAQP4発現が、グリンファティック経路機能のより重要な決定要素であり得ることが実証される。
[00516](A)中等度のTBIを有するマウスモデルを示す概略図。マウスをイソフルランで短時間麻酔し、糸でその門歯により懸架し、そして較正済の側頭部打撃をニューマチック制御式皮質打撃デバイスにより加える。動物を下敷パッドに落下させ、速やかに麻酔から覚醒させる。(B〜F)TBI後28日経過して、免疫蛍光2重標識法およびレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査法により、AQP4の局在およびGFAPの発現を評価する。全スライスモンタージュに示す通り(B〜C)、反応性のアストログリオーシスが持続する部位は、TBI後28日間経過しても、同側の側頭皮質内に留まる。高倍率対物レンズ下でAQP4の局在を評価すると、対照皮質(D)をTBI後の対側皮質(E)と比較したとき、AQP4局在は主に血管周囲のアストロサイトエンドフィート(矢印)に限定したままなので、AQP4の偏在の明らかな変化は認められない。同側皮質(F)では、GFAP−陽性反応性アストロサイトが示すAQP4の偏在の喪失は顕著であり、AQP4の発現は、微細なプロセスと大脳血管周囲のプロセス(矢印)との間で均等に分布している。これらの所見は、血管周囲のAQP4の偏在について、TBIがその慢性的な喪失を引き起こすことを実証している。
[00518](A)傍血管CSF−ISF交換を、TBI後1日、3日、7日、および28日経過時点での、CSFトレーサー(オボアルブミン結合ALEXA−555)の大槽内注射により評価した。(B〜F)Ex vivo全スライス蛍光画像検査から、注射後30分において評価した傍血管CSF流入は、TBI後7日経過して劇的に減少したことを示す。興味深いことに、片側性の外傷性損傷であるにもかかわらず、グリンファティック流入の減少が両側において認められた。皮質内へのトレーサー流入の定量(G)から、TBIがCSF流入に及ぼす効果は損傷後7日目にピークに達するが、しかし有意なグリンファティック機能障害は損傷後28日間継続することを示す(対照に対して*P<0.05、**P<0.01;対側構造に対して#P<0.05;2元配置ANOVA、1群当たりn=5〜12匹の動物)。CSF流入障害は、皮質において両側に認められるが、障害は、同側皮質において最大である。(H)TBIが皮質からの間質内溶質のクリアランスに及ぼす効果を、損傷後7日目に評価した。放射能標識3H−マンニトール(MW182Da)のクリアランス(I)、および14C−イヌリン(MW約5kDa)のクリアランス(J)を、対側の前頭皮質内注入後60分経過して測定した。野生型マウスでは、TBIは、3H−マンニトールおよび14C−イヌリンの両方のクリアランスを有意に減少させる(Shamに対して#P<0.05、###P<0.001;2元配置ANOVA、1群当たりn=6匹の動物)。Aqp4−/−マウスについて実施したクリアランス試験から、TBI後の溶質クリアランス障害は、Aqp4遺伝子欠損により悪化することが示唆された(WTに対して*P<0.05、***P<0.001;2元配置ANOVA、1群当たりn=6匹の動物)。これらのデータから、間質内溶質クリアランスを含むグリンファティック経路機能は、TBI後に、顕著で慢性的な障害を有することが実証される。
[00520]A)組換えヒト単量体タウ(hタウ)を、大脳血管平滑筋および周細胞においてDsRed蛍光タンパク質を発現するNG2−DsRed遺伝子組換えマウスの皮質内に注射した。(B〜E)脳を経由する間質内hタウの移動を、注射後30分経過して、免疫蛍光検査とその後のレーザースキャニング共焦点顕微鏡検査により評価した。hタウは、注射部位から拡散的に移動し(B)、毛細血管基底板に沿って蓄積した(C)。蛍光強度投影図は、周辺間質コンパートメントに関連するこれらの空間にhタウが蓄積することを示す。(D〜E)注射後30分経過して、hタウは脳間質経由で急速に移動して、第三脳室ルーフ内の大型の内大脳静脈を取り巻く傍血管腔に到達した。これらのデータは、可溶性の間質内タウは、脳網羅的グリンファティック系の傍血管経路に沿って脳からクリアランスされることを実証している。
[00522]本試験で使用される抗−AQP4一次抗体の特異性を確保するために、発明者らは、損傷後7日目に灌流したAqp4−/−マウスに由来する対照脳およびTBI処理脳の免疫標識を実施した。GFAPの発現は、対照(A)、対側TBI(B)、および同側TBI(C)の各皮質において容易に検出可能であったが、AQP4の免疫反応性は検出不能であった。
[00524]Aqp4遺伝子欠損が外傷性病変容積に及ぼす効果を、TBI後28日目に採集された脳について評価した。(A〜B)脳を連続的にスライスし、そして脳の構造をH&E染色法により評価した。赤色矢印は、外傷性打撃部位および最大皮質損傷領域を示す。同側および対側の皮質領域を切片毎に測定し、次に皮質容積を導出するために、連続したスライスを積分した。皮質容積を、対側容積(C)に対する比として表す。野生型マウスとAqp4−/−マウスとの間で、同側病変容積に有意差は認められなかった。
[00526]Aqp4遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、TBI後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。(A)野生型マウスおよびAqp4−/−脳を損傷後28日目に採集し、そしてリン酸化タウ(P−タウ)エピトープの存在について調べた。マウス遺伝子型(野生型とAqp4−/−)、損傷状態(shamとTBI)、および半球(対側(C)と同側(I))が、異なるタウリン酸化エピトープを標的とする様々なP−タウモノクロナール抗体による標識に及ぼす効果を示す代表的なブロットを提示する。総タウも測定し(Pan−タウ)、すべてのP−タウレベルを、各生体試料内のP−タウレベルに標準化した。(B〜F)すべてのエピトープの中でも、TBIは、P−タウ標識を、特に同側の側において増加させる傾向を有した。同様に、標識は、TBI後の野生型マウスと比較して、TBI後のAqp4−/−マウスにおいてより強い傾向を有した。特に、pThr231およびpSer396P−タウエピトープを認識する抗体は、野生型動物と比較してAqp4−/−マウスにおいてP−タウ標識の有意な増加を示した(††Aqp4−/−shamに対して†P<0.05、†††P<0.001;野生型TBIに対して‡P<0.05;野生型shamに対して*P<0.05;対側構造に対して#P<0.05;1元配置ANOVA;1群当たりn=4匹の動物)。これらのデータから、グリンファティック経路機能は、TBI単独の場合に認められる以上の障害を有するとき、慢性的なタウ凝集が促進されることが実証される。
[00528](A)Aqp遺伝子欠損によるグリンファティック経路機能障害が、TBI後のタウオパシーの進行に及ぼす効果を評価した。野生型マウスおよびAqp4−/−のマウスにTBIを加え、リン酸化タウ(P−タウ)の蓄積を、損傷後28日目に免疫蛍光検査法およびウェスタンブロット(図47A〜Fに提示)により評価した。(B〜D)AT8 P−タウ抗体(pSer202/pThr205エピトープに対して特異的)およびニューロンマーカーNeuNによる2重標識から、野生型皮質では、P−タウ免疫反応性は認められないことが示された。Aqp4−/−皮質では、ニューロン体(矢印)内、および周辺神経突起(矢印頭部)内の両方で、顕著なP−タウ標識が認められた。(E〜F)P−タウ染色の定量から、TBI後28日目に、Aqp4−/−マウスの同側皮質内、および少なめではあるが基底線条体内で、P−タウ免疫反応性が顕在化したことが明らかにされた。これらのデータから、TBI後のグリンファティック経路機能障害は、タウ凝集、およびニューロン内および神経外の両方においてP−タウの沈着を促進することが実証される。
[00530]Aqp4遺伝子欠損が、TBI後の神経炎症の遷延性に及ぼす効果を評価した。(A〜F)野生型マウスおよびAqp4−/−マウスにTBIを加え、反応性のアストログリオーシス(GFAPの発現)およびマイクログリオーシス(Iba1の発現)を、損傷後28日目に免疫蛍光検査法により評価した。TBI後、もっぱらAqp4−/−マウスの同側皮質に、GFAP−およびIba1−免疫反応性の顕著な上昇を認めた。(G〜H)GFAP標識の定量から、Aqp4−/−の皮質および基底線条体では、反応性のアストログリオーシスが有意に増加するが、野生型マウスではそうではないことが実証された(野生型に対して*P<0.05、**P<0.01;対側構造に対して#P<0.05、##P<0.01;2元配置ANOVA;1群当たりn=4匹の動物)。(I)海馬では、GFAP免疫反応性に差異は認められなかった。(J〜K)Iba1標識の定量から、ミクログリアの活性化がAqp4−/−マウスの同側皮質および線条体で遷延するが、野生型マウスでは、損傷後28日以内に消散することが示された(対側構造に対して#P<0.05;2元配置ANOVA;1群当たりn=4匹の動物)。(L)野生型マウスおよびAqp4−/−マウスの両方で、Iba1標識の増加が海馬のCA3領域に認められた(対側構造に対して#P<0.05;2元配置ANOVA;1群当たりn=4匹の動物)。
[00532](A)グリンファティック経路障害が外傷後の認知障害におよぼす効果を、TBIを受けた野生型マウスおよびAqp4−/−マウスについて評価した。動物は損傷2日前に、そしてTBI後は毎週ベースライン行動試験を受けた。(B)オープンフィールド試験により大運動行動を評価した。TBIは、野生型マウスまたはAqp4−/−マウスのいずれにおいても、オープンフィールド試験成績を変化させなかった。(C)運動調整および学習をロータロッド試験により評価した。TBIは、野生型動物では、ロータロッド成績を有意に損ねることはなかったが、Aqp4−/−マウスでは、TBIは試験成績を有意に損ねた(Aqp4−/−sham対Aqp4−/−TBI*P<0.05;2元配置反復測定ANOVA、1群当たりn=9〜14の動物)。認知機能を、新規物体認識試験(D)およびバーンズ迷路試験(E)により評価した。両試験では、TBIは、野生型マウスおよびAqp4−/−マウスの両方について認識成績を損ねた(TBI対sham*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001;2元配置反復測定ANOVA、1群当たりn=9〜14匹の動物)。外傷後認知障害は、野生型動物と比較してAqp4−/−マウスで悪化した(野生型TBI対Aqp4−/−TBI**P<0.01;2元配置反復測定ANOVA;1群当たりn=9〜14)。
[00534](A)Aqp4遺伝子は、2つの転写開始部位を有し、各部位において転写が開始すると、2つのAQP4 mRNA変異体:Aqp4遺伝子のエクソン0〜4を含むAQP4−M1、およびエクソン0を欠くAQP4−M23が生じる。(B)AQP4−M23(生理的条件下、CNSにおいて支配的な形態)は、血管周囲AQP4の充填を可能にする一方、AQP4−M1はこれを阻止する;したがってAQP4−M1発現が増加すると、AQP4の偏在は阻害される(Craneら、J Biol Chem、2009年;Furmanら、Proc Nat Acad Sci、2003年)。(C)AQP4−M1の発現を、マウス同側皮質について、TBI後3日目に、AQP4−M1転写物のエクソン0を特異的に標的とするPCRプライマーを用いて、リアルタイム定量的PCR(qPCR)により評価した。対照(sham)皮質におけるAQP4−M1発現量と比較して、AQP4−M1発現量は、TBIにより約2倍増加した(*P<0.05、t−検定;1群当たりn=5)。(D)AQP4−M1変異体のエクソン0を標的とするsiRNAに基づくアプローチを用いれば、AQP4−M1の発現は、培養された初代マウス皮質アストロサイトにおいて効果的にノックダウンすることが可能であった。3つのsiRNA2本鎖を、AQP4−M1転写物のエクソン0を標的とするように設計し、初代マウスアストロサイトにこれらのsiRNA2本鎖を6日間トランスフェクトした。siRNA処理後、AQP4−M1発現をqPCRにより評価し、エクソン0を標的とするsiRNAアプローチによりAQP4−M1の効果的なノックダウンが明らかとなった(siAQP4−M1対対照###P<0.001;1元配置ANOVA;n=3)。Aqp4遺伝子プロモーターのin silicoスクリーニングでは、AQP4−M1転写開始部位の上流にある転写(STAT)−3の転写因子シグナルトランスジューサーおよびアクチベーターについて、2つの結合部位が明らかになった。したがって、発明者らは、初代マウス皮質アストロサイトにおけるSTAT3シグナル伝達の阻害が、AQP4−M1発現量を低減し得るのかを試験した。STAT3−特異的阻害剤STATTICにより、初代アストロサイトを処理すると、AQP4−M1発現量は有意に低下した(STATTIC対対照**P<0.01;1元配置ANOVA;n=3)。これらのデータから、AQP4−M1発現量は、TBI後に増加したが、AQP4−M1発現量は、AQP4−M1転写物をsiRNAの標的対象とすることにより、またはアストロサイト内でSTAT3を阻害するにより抑えられることが実証される。これらの所見は、脳損傷(例えば外傷性脳損傷または虚血性脳損傷等)後のAQP4の偏在喪失は、これらのアプローチを通じて防止し得る、という概念と一致する。
[00536]複数の微小梗塞を有するマウスモデル(M.Wangら、Cognitive Deficits and Delayed Neuronal loss in a Mouse Model of Multiple Microinfarcts、J.Neuroscience、2012年12月12日、第32巻(50):17948〜17960頁)を用いて、拡散虚血性損傷の影響をin vivo二光子画像化法により評価した。(A)動物に拡散虚血性損傷を加えた。3日後に、グリンファティック経路機能を、大槽内注射した蛍光CSFトレーサー(テキサスレッド結合デキストラン、MW70kD)の、閉鎖頭蓋窓を経由した大脳皮質内流入を画像化することにより評価した。(B〜D)皮質表面下100μmにて取得した代表的な二光子画像は、蛍光CSFトレーサーが大槽内注射後20分で皮質実質内に移動することを示す。(E)損傷後3日目に、シリアル二光子画像化法により皮質表面下100μmにて蛍光強度を定量し、これにより、対照動物では、CSFトレーサーは皮質に急速に進入し、注射から20分以内にピークに達することを示す。同側皮質では、CSFトレーサーの流入は事実上消滅したが、一方、対側皮質でさえも、CSFトレーサーの流入は、有意に障害を受ける。これらのデータから、血管周囲のAQP4の偏在の喪失を引き起こす拡散虚血性損傷(Wangら、J Neurosci、2012年)によっても、グリンファティック経路機能は劇的に損なわれることが実証される。
[00538]最近記載された(Wangら、J Neurosci、2012年)複数の微小梗塞を有するマウスモデルを用いて、拡散虚血性損傷の影響を、全スライス蛍光画像化法により評価した。動物に拡散虚血性損傷を加えた。3日後、グリンファティック経路機能を、CSFトレーサー(オボアルブミン結合ALEXA−647、OA−647、MW45kD)の大槽内注射により評価した。トレーサー注射後30分経過して、動物を固定し、脳をスライスし、そしてCSFトレーサー流入を従来型の蛍光顕微鏡検査法により評価した。(A)対照脳では、CSFトレーサーは傍血管腔に沿って脳実質内に急速に移動する。(B)拡散虚血性損傷後、CSFの脳内への流入は、劇的に低下した。同側においてには、CSFの実質内への移動は事実上消滅する。対側半球では、傍血管CSF流入が存在するものの、周辺の間質空間と交換する際のその速度および程度は劇的に低下する。
[00540]本明細書に開示するように、老化した脳において、脳間質液(ISF)の対流性の流れおよび脳脊髄液(CSF)/ISFの交換を制御する脳の正常なメカニズムを調節することにより、毒性物質または老廃物質の脳からのクリアランスを増加させると、代謝の老廃副産物およびアルツハイマー病(AD)等の神経変性疾患と関連した毒素が除去される。
[00544]脳内に毒性の機能障害性タンパク質が蓄積すると、それはアルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病、および筋萎縮性側索硬化症(ALS)を含む多くの神経変性疾患と関連する。しかし、老化した脳内に毒素の蓄積を引き起こすメカニズムは、完全には知られていない。アルツハイマー病(AD)の場合、アミロイドβ毒素(Aβ)の細胞外沈積である老人斑、および細胞内の神経原線維濃縮体(高リン酸化型タウ)が、2つの特徴として挙げられる。「アミロイドカスケード」仮説から示唆されることとして、ADにおける認知機能低下および顕著な病原的特徴は、これら毒素の異常な蓄積と関連することが挙げられる(Selkoe、2001年;Hardy、2006年)。
[00548]周辺では、血漿容積および塩組成(塩化ナトリウム)および血圧が、ホルモン(アルドステロンおよびバソプレシン)、レニン−アンジオテンシン系(RAS)、および交感神経系を含む相互作用系により維持される。これらのメカニズムは、十分に立証されている(Dinhら、2001年;Zucker、2002年;Persson、2003年;Burnier、2003年;Arnoldら、2013年;Ohshimaら、2013年)。血漿容積が低下すると、腎臓からのレニン放出を引き起こし、次にタンパク質分解作用により血漿中の前駆体アンジオテンシノーゲン(肝臓で生成)からアンジオテンシンI(デカペプチド)への開裂が生じる。アンジオテンシンIは、アンジオテンシン変換酵素(ACE)により、アンジオテンシンIIに更にプロセシングされる。更に、カスケードは、アンジオテンシンIおよびアンジオテンシンIIの系列と、対照的な生物学的作用を有するアンジオテンシン(1−7)を含むその他の活性な代謝物に分岐する(図54)。アンジオテンシン変換酵素2は、アンジオテンシンIからアンジオテンシン(1−9)への、およびアンジオテンシンIIからアンジオテンシン(1−7)への変換を触媒する。その他の酵素、例えばカテプシンおよびネプリリシン等も、RASの活性な代謝物からなるカスケードにおいて役割を演ずる可能性がある。アンジオテンシンIIは、2つのクラスの薬理学的Gタンパク質共役受容体である、アンジオテンシン1受容体(AT1R)およびアンジオテンシン2受容体(AT2R)に作用するが、一方アンジオテンシン(1−7)は、最近識別されたmas受容体に作用する。アンジオテンシンIIは、アルドステロンの副腎皮質からの分泌を刺激するが、アルドステロンはナトリウムを、主に腎臓による排泄を低減することにより、血漿内に保持する。アンジオテンシンIIも血管収縮を引き起こす(潅流圧を維持する)。同時に、バソプレシンは脳下垂体後葉から分泌され、腎臓による水の排泄を低減することにより、水の保持を促進する。全体として、これらのメカニズムは、血圧、血漿(細胞外容積)容積、および血漿塩濃度を維持する。血漿容積が増加すると逆のことが生ずる。アンジオテンシンIIとは対照的に、アンジオテンシン(1−7)は、Masと呼ばれる受容体に作用することにより血管拡張を引き起こす(Santosら、2003年)。
[00551]脳内RASは、周辺のRASとは独立していると考えられている(Mogiら、2012年;Ohshimaら、2013年)。脳は、これらの立証済みのメカニズムを統合して血圧、血漿容積、および塩組成を制御する際に主要な役割を演ずる。更に、BBBにより、脳はそれ自体の液環境を、おそらく血漿容積および塩組成の制御と同様の方式で制御し得る(ISF/ECFの容積および組成)。更に、RASは塩と水のバランスと関係しない、神経保護、学習、および炎症等のその他の役割を有する。アンジオテンシン2受容体およびMas受容体が活性化すると、血管拡張、神経保護、認知、抗増殖効果、および降圧効果をもたらす(Sudilovskyら、1987年;Wangら、2007年)。老化およびADでは、脳内RASは増強されると考えられている(Wrightら、2010年;Savaskanら、2001年)。アンジオテンシン変換酵素濃度は、ADの尾状核および皮質で上昇し(Arreguiら、1982年)、ADリスクに影響を及ぼす可能性がある(Hemmingら、2005年;Hajjarら、2012年;Saavedraら、2012年;AbdAllaら、2013年)。
[00555]RASは基本的な脳網羅的系であるので、Aβを含む脳内毒性物質の蓄積と関連した多くの疾患に応用できる。この仮説を、アンジオテンシンII、アンジオテンシン(1−7)、アンジオテンシンI受容体の遮断薬(ロサルタン、バルサルタン)、およびアンジオテンシン(1−7)受容体(A779)の遮断薬を用いて、125I−Aβ1−40(Aβと呼ぶ)および対流性のISF流によってのみクリアランスされる分子である14C−イヌリン(イヌリンと呼ぶ)のクリアランスについて試験した(Xieら、2013年)。外因性の125I−Aβおよび14C−イヌリンのクリアランスに対するRASの役割を、その前頭皮質内注射後、30分の時点において調べた(Xieら、2013年)。これら分子の脳への流入に対するRASの役割を、これら分子をくも膜下腔(大槽)内に注射することにより調べ、そして30分後に脳内濃度を測定した。Aβは、ADと関連したペプチドに、またイヌリンは不活性分子およびISF内の分子の対流性の流れのマーカーに該当した。データは仮説を裏付ける。
[00557]脳クリアランス試験:手短に述べると、麻酔したマウス(ケタミン(100mg/kg)およびキシラジン(10mg/kg))の右側尾状核被殻または前頭皮質内にステンレススチールガイドカニューレを定位固定的に埋め込んだ。前頭皮質の場合、カニューレ先端の座標は、ブレグマに対して前方0.7mm、側方3.0mm、および脳表面下方1.3mmであった。手術後、動物を回復するまで放置した。相当の慢性プロセスが生ずる前に実験を実施したが、但し報告に従い、大型の分子に対するBBBの修復の時間を設けた(Deaneら、2004年)。放射能標識された分子を注射する前の10分間、薬物を事前注射した。
[00560]放射能分析:γカウンター(Wallac Vizard γカウンター、パーキン・エルマー)内で125I−放射能を測定した。14C−カウント計測の場合、サンプルを組織可溶化剤(パーキン・エルマー)0.5ml、一晩可溶化し、その後シンチレーションカクテル(Packard Ultima Gold)5mlを添加し、そして液体シンチレーション・カウンター(ベックマン・コールターカウンター)内で分析した。
[00563]A.薬理学的介入
[00564]1) 125I−Aβ40および14C−イヌリンを前頭皮質内注射した後に、アンジオテンシンおよびロサルタンがこれらの脳内回収率に与える効果
[00565]125I−Aβ40(10nM)および14C−イヌリン(0.05μCi)を含有する少量(0.5μL)の模擬的なCSFを前頭皮質に微量注射した。実験終了時(30分)に、脳を取り出し、放射能を分析した。図55Aは、アンジオテンシンII(1μM)を含む脳内に残留するAβ40濃度は増加したことを示す。対照的に、アンジオテンシン1受容体拮抗薬であるロサルタン(1μM)は、Aβの回収を低下させた。図55Bは、アンジオテンシンII(1μM)を含む脳内に残留するイヌリン濃度も増加したことを示す。対照的に、ロサルタン(1μM)は、イヌリンの回収を低下させた。したがって、アンジオテンシンIIは、対流性のISF流を経由するクリアランスを低下させた。
[00567]125I−Aβ40(10nM)および14C−イヌリン(0.05μCi)を含有する少量(5μL)の模擬的なCSFを大槽内に1μL/分で微量注射した。実験終了時(30分)に、脳を取り出し、放射能を分析した。図56Aは、アンジオテンシンII(1μM)を含む脳では、これに流入するAβ40量は低下したことを示す。対照的に、ロサルタンを大槽内(1μM)または腹腔内(IP;1mg)に注射すると、Aβの流入量は増加した。図56Bは、アンジオテンシンII(1μM)を含む場合、イヌリン流入量も減少したことを示す。対照的に、ロサルタンはイヌリン流入量を増加させた。
[00569]図57は、身体内の水分を保持するホルモンであるバソプレシン(1μM)を前頭皮質内に注射すると、Aβおよびイヌリンの両方について、対照と比較して脳からのクリアランスが低下したことを示す。
[00571]図58は、身体の水分およびナトリウムを低減するペプチドである心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)(1μM)は、前頭皮質内に注射したとき、Aβおよびイヌリンのクリアランスを低下させたことを示す。ANP分泌は、覚醒状態において認められるような交感神経活性化の増大を含め、様々な因子により刺激を受ける。
[00573]アンジオテンシン(1−7)は、神経保護効果を有し、またアンジオテンシンIIの作用を妨害することが明らかにされている。頭皮質内に事前注射したアンジオテンシン(1−7)が、Aβおよびイヌリンの脳からのクリアランスに及ぼす効果について調べた。図59は、Aβのクリアランスは用量に応じて漸増したことを示す。
[00577]一酸化窒素(NO)は、多くのホルモン、神経伝達物質の効果を媒介する際に重要な役割を演じ、またRASと相互作用するので、グリンファティック系におけるNOの役割を調べた。
[00580]B.グリンファティック系の機械的混乱
[00581]最初に、大槽にカニューレを挿入し、CSFを連続的に流出させた。前頭皮質からAβのクリアランスを行った10分後に、30分間測定した。図64は、CSFの大槽からの流出期間中、Aβの皮質からのクリアランスは低下したことを示す。したがって、CSF流を脳から迂回させると、その傍動脈腔を経由する脳内への再循環を低下させ、また実質を通じた対流性の流れを低下させる可能性があり、これは次にクリアランスを減少させる。
[00583]Aβおよびイヌリンのクリアランスは、睡眠状態下で増加する(Xieら、2013年も参照、その全体が参照により本明細書に組み込まれている)。睡眠妨害がクリアランスに変化をもたらすか、その変化を立証するために、穏やかに取り扱いつつ、6AM(点灯)より6時間マウスから睡眠を奪った。次に、Aβのクリアランスを覚醒下で測定した。図65は、Aβのクリアランスは睡眠妨害期間中、低下したことを示す。
[00585]抗ヒスタミン薬(例えば、店頭薬):
[00586]ALLEGRA(登録商標)(フェキソフェナジン)
[00587]BENADRYL(登録商標)(ジフェンヒドラミン)
[00588]CLARITIN(登録商標)またはTAVIST(登録商標)(ロラタジン)
[00589]CHLOR−TRIMETON(登録商標)(マレイン酸クロルフェニラミン)
[00590]DIMETANE(登録商標)(ブロムフェニラミン、フェニルプロパノールアミン)
[00591]ZYRTEC(登録商標)(セチリジン)
[00592]非処方箋睡眠補助剤:
[00593]Unisom Nighttime Sleep−Aid
[00594]Dormin
[00595]Nytol
[00596]Simply Sleep
[00597]Sominex
[00598]Extra Strength Tylenol PM
[00599]塩酸ジフェンヒドラミン
[00600]Excedrin P.M.
[00601]ベンゾジアゼピン系:
[00602]PROSUM(登録商標)(エスタゾラム)
[00603]DALMANE(登録商標)(フルラゼパム)
[00604]DORAL(登録商標)(クアゼパム)
[00605]RESTORIL(登録商標)(テマゼパム)
[00606]HALCION(登録商標)(トリアゾラム)
[00607]VALIUM(登録商標)(ジアゼパム)
[00608]非ベンゾジアゼピン系:
[00609]イミダゾピリジン:AMBIEN(登録商標)、AMBIEN(登録商標)CR、INTERMEZZO(登録商標)(ゾルピデム)(優れている)
[00610]SONATA(登録商標)(ピラゾロピリミジン)(優れている)
[00611]メラトニン受容体刺激剤:
[00612]ROZEREM(登録商標)(ラメルテオン)
[00613]NOTEC(登録商標)(抱水クロラール)
[00614]PRECEDEX(登録商標)(塩酸デクスメデトミジン)
[00615]LUNESTA(登録商標)(エスゾピクロン)
[00616]バルビツレート:
[00617]NEMBUTAL(登録商標)(フェノバルビタール)
[00618]MEBARAL(登録商標)(メフォバルビタール)
[00619]Amytal Sodium(アモバルビタールナトリウム)
[00620]BUTISOL(登録商標)(ブタバルビタールナトリウム)
[00621]SECONAL(登録商標)Sodium Pulvules(セコバルビタールナトリウム)
[00622]実施例7で引用した参考文献
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[00624]内因性膜タンパク質のアクアポリンファミリーのメンバーは、多くの細胞の原形質膜において、水選択的チャンネルとして機能する。アクアポリン4(AQP4)は、脳に見出される主要なアクアポリンである。この実施例では、AQP4はアミロイドβの脳からのクリアランスを調節することを示す。いずれにせよ、AQP4の活性化はアミロイドβの脳からのクリアランスを促進し得る、またはAQP4を阻害するとアルツハイマー病の遺伝子組換えマウスモデルにおいてアミロイドβの沈着を悪化させ得る。この実施例で開示される結果に基づき、アルツハイマー病を含む神経変性疾患は、AQP4の血管周囲の偏在を促進する薬物である、JNJ−17299425またはJNJ−17306861により、治療、改善、または予防可能である。
[00631]JNJ−17299425は、外傷性損傷後に、血管周囲のエンドフィートにAQP4を保持することにより、AQP4機能を改善する可能性がある。老化した脳および神経変性の脳においてAQP4の誤った局在を防止すれば、アミロイドβおよびタウの凝集を予防し得る。したがってAQP4−標的型化合物のJNJ−17299425またはJNJ−17306861は、老化した脳においてアミロイドβおよびタウのクリアランスを維持し、それらの凝集を予防する上で有効であり得る。
[00633]1. 哺乳動物の中枢神経系(脳および/または脊髄)中のグリオ−血管経路(以下、「グリンファティック系」)の機能を測定するための方法であって:
[00634]中枢神経系の画像化を行うステップ;
[00635]中枢神経系中の脳脊髄液−間質液(以下、「CSF−ISF」)の交換を測定するステップ、
を含む前記方法。
[00637]3. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ1の方法。
[00639]5. 画像化剤をくも膜下腔内に投与する、パラグラフ4の方法。
[00641]7. パラグラフ4の方法であって、
[00642]画像化剤が、陰性または陽性(常磁性)の造影剤であり、中枢神経系の画像化を行うステップが、中枢神経系のダイナミックまたは造影磁気共鳴画像化法(MRI)を行うステップを含む、前記方法。
[00645]画像化剤が、陽電子放出放射性核種トレーサーであり、
[00646]脳および脊髄の画像化を行うステップが、中枢神経系の陽電子放出断層撮影(PET)スキャニングを行うステップを含む、前記方法。
[00649]12. 治療剤が、治療用途で投与する化学療法剤、機能性ナノ粒子、または毒性組成物である、パラグラフ11の方法。
[00657]20. 神経変性疾患が、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症(CTE)、またはHIV関連認知症である、パラグラフ19の方法。
[00659]22. 哺乳動物の中枢神経系(脳および/または脊髄)に発症した神経変性疾患を治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記方法。
[00661]24. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ22の方法。
[00664]27. グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む、パラグラフ22の方法。
[00668]31. グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ27の方法。
[00671]34. 哺乳動物の中枢神経系の反応性グリオーシスを治療するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップを含み、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記方法。
[00673]36. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ34の方法。
[00675]38. グリンファティック系のクリアランスを増加させるステップが、グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤を哺乳動物に投与するステップを含む、パラグラフ34の方法。
[00679]42. グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ38の方法。
[00682]45. 哺乳動物の中枢神経系の間質(脳の間質および/または脊髄の間質)からの老廃産物のクリアランスを促進するための方法であって:
[00683]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ;または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップ、を含む前記方法。
[00685]47. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ45の方法。
[00687]49. 脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ1の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ45の方法。
[00690]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ;または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップを含む、パラグラフ50の方法。
[00692]53. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ50の方法。
[00694]55. 高齢者または老人の患者または対象が、50歳、60歳、70歳、80歳、または90歳より高齢のヒトである、パラグラフ54の方法。
[00696]57. 脳内のグリンファティック系の機能をパラグラフ1の方法に従って測定するステップをさらに含む、パラグラフ50の方法。
[00698]グリンファティック系のクリアランスを増加させるかもしくは促進する薬剤を哺乳動物に投与するステップ;または哺乳動物の中枢神経系の間質を通じて液体をポンピングするステップ、を含み、それによって、哺乳動物の脳の間質中のアミロイドβ(Aβ)、タウ、および/またはαシヌクレインの蓄積の減少、低減、発生遅延、または阻止をもたらす、前記方法。
[00700]60. 哺乳動物が、ヒトまたは非ヒト霊長類である、パラグラフ58の方法。
[00702]62. 処置を必要とする患者または対象が、高齢者または老人である、パラグラフ58の方法。
[00704]64. 治療剤が、アドレナリン作動性受容体のアンタゴニストである、パラグラフ58の方法。
[00708]68. グリンファティック系のクリアランスを増加させる薬剤が、AQP4の脱偏在またはAQP4の偏在の喪失を阻止する薬剤である、パラグラフ58の方法。
[00711]71. 哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるかまたは妨害するための方法であって、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップを含む、前記方法。
[00713]73. 哺乳動物が、処置を必要とする患者または対象である、パラグラフ71の方法。
[00717]77. グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害するステップが、哺乳動物の中枢神経系の間質を通る液体の流れを遮断するかまたはそれに対するバリアを設けるステップを含む、パラグラフ71の方法。
Claims (8)
- 哺乳動物の中枢神経系(CNS)の反応性グリオーシスを治療するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはL−NILであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびCNSの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記薬剤。
- 哺乳動物のCNSの間質、脳の間質、および/または脊髄の間質からの老廃産物のクリアランスを促進するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはL−NILであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびCNSの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、CNSの老廃産物の蓄積を低減、減少、発生遅延、または阻止する、前記薬剤。
- 老廃産物が、可溶性アミロイドβ(Aβ)、タウ、またはαシヌクレインである、請求項2に記載の薬剤。
- 哺乳動物の外傷性脳損傷後の障害の発症を遅延または阻止するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはL−NILであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびCNSの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、脳の間質中のアミロイドβ(Aβ)、タウ、および/またはαシヌクレインの蓄積を減少、低減、発生遅延、または阻止する、前記薬剤。
- 哺乳動物の脳の間質からの治療剤または調節剤のクリアランスを減少させるかまたは妨害するための、グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害する薬剤であって、
AVP(バソプレシン)、心房性ナトリウム利尿ペプチド(ANP)、またはアンジオテンシンIIである、前記薬剤。 - グリンファティック系のクリアランスを減少させるかまたは妨害することが、CNSの間質を通る液体の流れを遮断するかまたはそれに対するバリアを設けることを含む、請求項5に記載の薬剤。
- 哺乳動物のCNSにおける神経変性疾患の発症を遅延または阻止するための、グリンファティック系のクリアランスを増加または促進させる薬剤であって、ロサルタンまたはL−NILであり、該薬剤を哺乳動物に投与することおよびCNSの間質を通じて液体をポンピングすることを含む方法に使用するためのものであり、それによって、反応性グリオーシスを低減させるかまたは反応性グリオーシスの発症を遅延させる、前記薬剤。
- 神経変性疾患が、パーキンソン病(PD)、アルツハイマー病(AD)、レビー小体を伴うアルツハイマー病、レビー小体型認知症、混合型認知症、血管性認知症、前頭側頭型認知症、慢性外傷性脳症(CTE)、またはHIV関連認知症である、請求項7記載の薬剤。
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