JP2009535041A - PHLP1 allergen derivative - Google Patents
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Abstract
野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １の誘導体を製造する方法であって、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １を準備するステップと、上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含むことを特徴とする。A method for producing a derivative of a wild-type protein allergen Phl p 1 having reduced allergen activity compared to a wild-type allergen, comprising the step of preparing the wild-type protein allergen Phl p 1 and at least 3 of the wild-type protein allergen Fragmenting into one fragment, wherein at least one of said at least three fragments comprises at least one T cell epitope, said at least three fragments having reduced allergen activity or allergen activity And fragmenting the at least three fragments in an order different from the order of the fragments of the wild-type allergen.
Description
本発明は、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １の誘導体、おとびその製造方法に関するものである。
The present invention relates to a derivative of wild-type protein
アレルギーとは、通常は無害である異物（つまり非自己）（「アレルゲン」）に対する反応可能性の遺伝的または後天的な特異的変更である。アレルギーは、病気に冒された臓器系（皮膚、結膜、鼻、咽頭、気管支粘膜、胃腸管）における炎症性反応と、アレルギー性鼻炎、結膜炎、皮膚炎、アナフィラキシーショックおよび喘息といった即時の病徴と、喘息およびアトピー性皮膚炎の後期反応といった慢性疾患の徴候と結びついている。 An allergy is a genetic or acquired specific change in the likelihood of response to a foreign body (ie, nonself) (“allergen”) that is normally harmless. Allergies include inflammatory reactions in affected organ systems (skin, conjunctiva, nose, pharynx, bronchial mucosa, gastrointestinal tract) and immediate symptoms such as allergic rhinitis, conjunctivitis, dermatitis, anaphylactic shock and asthma. , Associated with signs of chronic disease such as asthma and late reaction of atopic dermatitis.
Ｉ型アレルギーとは、遺伝的に決定される過敏性疾病を指し、これは、産業化した世界人口の約２０％に影響を及ぼしている。Ｉ型アレルギーの病態生理学的特質は、その他の場合には無害の抗原（アレルゲン）に対して、免疫グロブリンＥ（ＩｇＥ）抗体が産生されることである。 Type I allergy refers to a genetically determined hypersensitivity disease that affects approximately 20% of the industrialized world population. The pathophysiological attributes of type I allergy are the production of immunoglobulin E (IgE) antibodies against otherwise innocuous antigens (allergens).
現在、アレルギー治療の唯一の使役形態（causative form）は、アレルゲン特異的な免疫療法であり、該療法では、患者にアレルゲンの漸増用量を投与して、アレルゲン特異的な無反応を誘起させる。アレルゲン特異的な免疫療法の臨床効果については、いくつかの研究によって報告されているが、根源的な仕組みについては完全には理解されていない。 Currently, the only causative form of allergy treatment is allergen-specific immunotherapy, in which patients are given increasing doses of allergen to induce allergen-specific no response. Several studies have reported the clinical effects of allergen-specific immunotherapy, but the underlying mechanism is not fully understood.
アレルゲン特異的な免疫療法の主たる欠点は、天然アレルゲン抽出物の使用に依存している点である。この天然アレルゲン抽出物を少なくとも工業生産レベルまで規格化することは、不可能でないにしても難しいことである。このような天然アレルゲン抽出物は、様々な、アレルギー性および非アレルギー性化合物から成り、このため、投与された抽出物の中には特定のアレルゲンが存在しない可能性もあり、または、（もっと悪いことには）治療中の成分に対して、新たなＩｇＥの特異性が患者に発現する可能性もある。抽出物ベースの療法の他の欠点は、生物活性のあるアレルゲン製剤の投与がアナフィラキシー的副作用を誘発するという点に起因している。 The main drawback of allergen-specific immunotherapy is that it relies on the use of natural allergen extracts. It is difficult, if not impossible, to standardize this natural allergen extract to at least industrial production levels. Such natural allergen extracts consist of a variety of allergenic and non-allergenic compounds, so that certain allergens may not be present in the administered extract, or (worse In particular, there may be new IgE specificities in the patient for the component being treated. Another drawback of extract-based therapy stems from the fact that administration of biologically active allergen preparations induces anaphylactic side effects.
アレルゲンの特徴付けの分野で分子生物学的技法を用いることによって、関連する全ての環境アレルゲンをコードするｃＤＮＡコードを単離することが可能となり、組み換えアレルゲンの製造が可能となっている。このような組み換えアレルゲンを用いて、個々の患者の反応特質を生体外診断法（つまり、血清内のアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体を検出すること）または生体内検査によって特定することが可能となった。この技術を基に、各患者の感作特質に合わせて調整された、新規成分ベースの、アレルゲン、特にＩ型アレルゲンに対するワクチン接種戦略を開発することが可能であると思われる。しかしながら、組み換えアレルゲンがその天然の同等物と類似しているため、組み換えアレルゲンもまた、著しいアレルギー誘発性活動の兆候を示す。この組み換えアレルゲンは、野生型アレルゲンのアレルギー誘発性活動に極めて類似した反応を呈する。そのため、天然アレルゲンを適用する免疫療法におけるこのアレルギー誘発性活動に関連した全ての欠点が、組み換えアレルゲンの場合にも存在する。免疫療法を改善するには、アナフィラキシー的副作用のリスクを抑えたまま、投与されるアレルゲンの量を増大させることが可能なように、組み換えアレルゲンのアレルギー誘発性活動を低減させる必要がある。 By using molecular biological techniques in the field of allergen characterization, it is possible to isolate the cDNA code encoding all relevant environmental allergens and to produce recombinant allergens. Using such recombinant allergens, it has become possible to identify the response characteristics of individual patients by in vitro diagnostic methods (ie, detecting allergen-specific IgE antibodies in serum) or in vivo tests. Based on this technology, it would be possible to develop a new component-based allergen, especially a type I allergen, vaccination strategy tailored to the sensitization characteristics of each patient. However, because the recombinant allergen is similar to its natural equivalent, the recombinant allergen also shows significant signs of allergenic activity. This recombinant allergen exhibits a response very similar to the allergenic activity of the wild type allergen. Therefore, all the disadvantages associated with this allergenic activity in immunotherapy applying natural allergens also exist in the case of recombinant allergens. To improve immunotherapy, it is necessary to reduce the allergenic activity of recombinant allergens so that the amount of allergen administered can be increased while reducing the risk of anaphylactic side effects.
Ｔ細胞エピトープだけを含有するペプチドを投与することによって、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性だけを操作することが提案されている。Ｔ細胞エピトープは、低分子ペプチドであり、この低分子ペプチドは、抗原提示細胞による無傷アレルゲンのタンパク分解に起因している。このようなＴ細胞エピトープは合成ペプチドとして製造可能である。今までのところＴ細胞エピトープに関する試験は行われているが、結果は芳しくなく、有効性が低いことしか示されていない。このＴ細胞エピトープベースの免疫療法の有効性が低いことに関しては、いくつかの原因が考えられている。第１に、Ｔ細胞活性化ではなくＴ細胞寛容を実現するための最適量を投与することが困難であるという点、第２に、低分子Ｔ細胞エピトープペプチドは体内での半減期が短いという点。第３に、個々のアトピー患者におけるＩｇＥ産生が記憶免疫反応を示すという、無視できない証拠が存在する点である。この記憶免疫反応は、新たなクラススイッチを必要とせず、Ｔ細胞に由来するサイトカインによっては制御することが出来ない。従って、Ｔ細胞エピトープの投与だけに基づいた治療形態は、アレルゲン特異的Ｔ細胞の活性を調節するが、既にスイッチされた記憶Ｂ細胞によるアレルゲン特異的ＩｇＥ抗体の産生にはほとんど影響を及ぼさない。 It has been proposed to manipulate only the activity of allergen-specific T cells by administering peptides containing only T cell epitopes. T cell epitopes are small peptides that result from proteolysis of intact allergens by antigen presenting cells. Such T cell epitopes can be produced as synthetic peptides. So far, tests on T cell epitopes have been carried out, but the results have been poor and have only been shown to be less effective. There are several possible causes for the low effectiveness of this T cell epitope-based immunotherapy. First, it is difficult to administer an optimal amount for realizing T cell tolerance rather than T cell activation, and second, a small molecule T cell epitope peptide has a short half-life in the body. point. Third, there is non-negligible evidence that IgE production in individual atopic patients exhibits a memory immune response. This memory immune response does not require a new class switch and cannot be controlled by cytokines derived from T cells. Thus, therapeutic forms based solely on the administration of T cell epitopes modulate the activity of allergen specific T cells, but have little effect on the production of allergen specific IgE antibodies by already switched memory B cells.
組み換えＤＮＡ技術またはペプチド合成によって、低アレルゲン性アレルゲン誘導体または断片を製造することもさらに提案されている。このような誘導体または断片は、Ｔ細胞エピトープを有しており、ＩｇＥ抗体を誘導することが可能である。このＩｇＥ抗体は、天然アレルゲンのＩｇＥ認識と競合する。２０年以上も前に、アレルゲンのタンパク分解により、部分的にはそのＩｇＥ結合能力を保持するが、即時型反応を誘発しない低分子アレルゲンの断片が生じることが実証されている。アレルゲンのタンパク分解を制御して規格化することは困難であるが、分子生物学によって、ＩｇＥ結合ハプテンを製造する新たな手段が開発された。このようなＩｇＥ結合ハプテンは、アナフィラキシー的作用を生じさせるリスクが少ない能動免疫法、および、アレルゲンと接触する前にエフェクター細胞結合ＩｇＥを飽和させて、これによってアレルゲン誘導性のメディエーター放出を阻止する受動的治療法に有効であることが示唆されている。 It has further been proposed to produce hypoallergenic allergen derivatives or fragments by recombinant DNA techniques or peptide synthesis. Such derivatives or fragments have a T cell epitope and are capable of inducing IgE antibodies. This IgE antibody competes with IgE recognition of natural allergens. Over 20 years ago, it has been demonstrated that proteolysis of allergens results in fragments of small molecule allergens that retain their IgE binding ability in part but do not elicit immediate responses. Although it is difficult to control and normalize allergen proteolysis, molecular biology has developed a new means of producing IgE-bound haptens. Such IgE-binding haptens are active immunization methods that are less at risk of producing anaphylactic effects and passive that saturate effector cell-bound IgE prior to contact with allergens, thereby preventing allergen-induced mediator release It has been suggested that it is effective for therapeutic treatment.
他にも、低アレルゲン性アレルゲンの変異体（version）を遺伝子工学によって製造することが提案されている。これは、アレルゲンが、いくつかのアミノ酸残基が異なる、および／または、ＩｇＥ結合能力が低い立体構造を有する点において異なるイソ型として自然に発生するという観察に基づいている。例えば、主要なカバノキの花粉アレルゲンＢｅｔ ｖ １を遺伝子工学によってオリゴマー化することによって、アレルゲン活性が大幅に低減した組み換え三量体が生じる。あるいは、点突然変異を導入することによって、アレルゲン構造の立体構造を変化させて非連続性ＩｇＥエピトープを分離させること、または、ＩｇＥの結合能力に直接影響を及ぼすことのいずれかが提案されてきている（Valenta et al．，Biol．Chem．380 （１９９９）、８１５−８２４頁）。 In addition, it has been proposed to produce a hypoallergenic allergen variant by genetic engineering. This is based on the observation that allergens naturally occur as different isoforms in that some amino acid residues are different and / or have a conformation with low IgE binding capacity. For example, oligomerization of the major birch pollen allergen Bet v 1 by genetic engineering results in a recombinant trimer with greatly reduced allergen activity. Alternatively, it has been proposed to either introduce a point mutation to change the conformation of the allergen structure to separate non-contiguous IgE epitopes or to directly affect the binding ability of IgE. (Valenta et al., Biol. Chem. 380 (1999), 815-824).
アレルゲンをいくつかの断片（例えば２つの断片）に断片化することによって、アレルゲンのＩｇＥ結合能力およびアレルゲン活性がほぼ完璧に失われる。これは、Ｂｅｔ ｖ １（Vrtala et al. J. Clin. Invest. 99 （１９９７）、１６７３〜１６８１頁）、Twardosz et al.（BBRC 239 (1997), 197-204頁）のＢｅｔ ｖ ４、Hayek et al.（J. Immunol. 161 (1998), 7031-7039頁）のＡｌｎ ｇ ４、Zeiler et al.（J. Allergy Clin. Immunol. 100 (1997), 721-727頁）のウシの鱗屑アレルゲン、Elfman（Int. Arch. Allergy Immunol. 117 (1998),167-173頁）のＬｅｐ ｄ２、Westritschnig（J. Immunol. 172 (2004), 5684-5692頁）のＰｈｌｐ ７の天然様折りたたみ構造が失われるためである。主として非連続／立体構造的なＩｇＥエピトープを含有するタンパク質の断片化は、アレルゲンのＩｇＥ結合能力を実質的に低減させる。この知見に基づいて、従来技術では、このような低アレルゲン性アレルゲンの断片が生体内で防御免疫反応を誘導し得るかどうかが研究されていた（Westritschnig et al.（Curr. Opinion in Allergy and Clin. Immunol. 3 (2003)、495-500頁））。
By fragmenting the allergen into several fragments (eg, two fragments), the allergen's IgE binding ability and allergen activity are almost completely lost. This is because of Bet v 4, Bet v 1 (Vrtala et al. J. Clin. Invest. 99 (1997), 1673-1681), Twardosz et al. (BBRC 239 (1997), 197-204), Hayek et al. (J. Immunol. 161 (1998), pages 7031-7039),
Ball et al.（Eur J Immunol 1999, 29: 2026-2036頁）には、免疫療法の過程で、水酸化アルミニウムを通して吸着した花粉抽出物を投与することが記載されている。 Ball et al. (Eur J Immunol 1999, 29: 2026-2036) describes administering a pollen extract adsorbed through aluminum hydroxide during the course of immunotherapy.
米国第２００２／００５２４９０Ａ１には、少なくとも１つのＰｈｌ Ｐ １−エピトープを含むポリペプチドをコードする組み換えＤＮＡ分子が開示されている。 US 2002/0052490 A1 discloses a recombinant DNA molecule encoding a polypeptide comprising at least one Phl P 1-epitope.
Flicker S et al.（J Allergy Clin Immunol 2006, 117：1336-1343頁）において、Ｐｈｌ Ｐ １アレルゲンのＣ末端技術が全Ｐｈｌ Ｐ １分子のアレルゲン性潜在能力のほとんどを含むことが見つかっている。
In Flicker S et al. (J Allergy Clin Immunol 2006, 117: 1336-1343), it has been found that the C-terminal technology of
Linhart B et al.（FASEB J 2002, 16:1301-1303頁）には、オオアワガエリのいくつかのアレルゲンを含有するハイブリッド分子の製造について記載されている。 Linhart B et al. (FASEB J 2002, 16: 1301-1303) describes the production of hybrid molecules containing several allergens of Pseudomonas aeruginosa.
ＤＥ第１０３５１４７１Ａ１はハイブリッドポリペプチドに関するものであり、このハイブリッドポリペプチドは、免疫的に優勢ないくつかの、アレルゲンのＴ細胞エピトープから成り、交差反応を起こさない。 DE 10351471 A1 relates to a hybrid polypeptide, which consists of several immunologically dominant, allergen T cell epitopes and does not cross-react.
本発明の目的は、上述の知見に基づいた、改善されたアレルギー免疫療法の手段および方法を提供することにある。このような方法および手段は、アナフィラキシーショックのリスクが低い点、容易に適用可能であると共に個々の患者の要求に合わせることができる点、および、容易に工業規模に変えることができる点と関連しているため、有効である。 An object of the present invention is to provide an improved means and method for allergic immunotherapy based on the above findings. Such methods and measures are associated with the low risk of anaphylactic shock, the ease with which they can be applied and tailored to individual patient requirements, and the ability to easily scale to the industrial scale. Therefore, it is effective.
従って本発明は、野生型アレルゲンと比べてアレルゲン活性が低減した、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １（主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン）の誘導体を製造する方法であって、
野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含む方法に関する。
Accordingly, the present invention is a method for producing a derivative of the wild type protein allergen Phl p 1 (major pollen allergen), which has reduced allergen activity compared to the wild type allergen,
Providing a wild type protein
Fragmenting said wild type protein allergen into at least three fragments, wherein at least one of said at least three fragments comprises at least one T cell epitope, said at least three fragments comprising allergen activity; Fragmenting into fragments that are reduced or have lost allergen activity;
Recombining the at least three fragments in an order different from the order of the wild-type allergen fragments.
アレルギー性反応は、予め形成されているＩｇＥとクロスリンクしたアレルゲンがマスト細胞上の高親和性受容体ＦｃεＲＩと結合したときに引き起こされる。マスト細胞は、身体の表面に並んでおり、免疫システムに局部感染に対する注意を促すように機能している。一旦活性化されると、これらは、予め形成されている顆粒内に格納された化学的メディエータを分泌することによって、および、活性化が生じた後、ロイコトリエンおよびサイトカインを合成することによって、炎症反応を引き起こす。従って、アレルギーに苦しんでいるかアレルギーに苦しむ危険性のある各患者に対して、予防するため、治療するため、または敏感にさせるために野生型アレルゲンを投与することは、副作用が生じるために有効ではない。免疫療法においてアレルギー性反応を回避する１つの方法は、野生型アレルゲンを変形させて、この変形された「アレルゲン」がわずかな量だけＩｇＥに結合するか、または、全く結合しなくなる程度にまで変形することである。結果的に、このような分子は、強いアレルギー性反応を引き起こすことが不可能である。しかしながら、特定のアレルゲンの断片は、防御抗体応答を生じさせる程十分には免疫原性を有していないことに留意されたい（Westritschnig et al., （2004））。 An allergic reaction is triggered when a pre-formed IgE cross-linked allergen binds to the high affinity receptor FcεRI on mast cells. Mast cells are lined up on the surface of the body and function to alert the immune system to local infection. Once activated, these are inflammatory responses by secreting chemical mediators stored within preformed granules and by synthesizing leukotrienes and cytokines after activation has occurred. cause. Therefore, administering wild-type allergens to prevent, treat or sensitize each patient suffering from or at risk of suffering from allergies is effective because of the side effects. Absent. One way to avoid allergic reactions in immunotherapy is to modify the wild-type allergen to such an extent that this modified “allergen” binds to IgE in only a small amount or not at all. It is to be. As a result, such molecules are unable to cause a strong allergic reaction. However, it should be noted that certain allergen fragments are not sufficiently immunogenic to generate a protective antibody response (Westritschnig et al., (2004)).
本発明に係る方法により、ＩｇＥと結合する可能性が低いかまたはこの可能性がないが、Ｔ細胞性免疫応答を引き起こすために必要とされるアレルゲンの特性を一緒に保持するアレルゲン誘導体の製造が可能となる。これは、本発明に係る方法によって達成され得る。なぜなら、Ｔ細胞性免疫応答の誘発の原因となる構造要素、例えば野生型アレルゲンのＴ細胞エピトープは、本発明に係るアレルゲン誘導体内に実質的に保持された状態で残っているからである。しかしながら、アレルゲンの断片をシャッフルすること（断片化して再結合すること）によって、ＩｇＥに対する結合能力の大幅な低減、または、この結合能力の完全な欠損が引き起こされる。もちろん、アレルゲン誘導体の製造過程でいくつかのアミノ酸残基のみを欠失させる（除去する）か、または追加する（挿入する）した場合、または、各部分が直接結合する代わりにリンカーによって結合した場合にも、本発明に係る利点は依然として存在する。このアレルゲン活性の低減または消滅は、アレルゲンを確定した断片に分割する公知および通常の原理によって達成される。 The method according to the present invention makes it possible to produce an allergen derivative that is unlikely or unlikely to bind IgE but retains allergen properties required to elicit a T cell immune response. It becomes possible. This can be achieved by the method according to the invention. This is because the structural elements responsible for eliciting a T cell-mediated immune response, such as the T cell epitope of the wild type allergen, remain substantially retained within the allergen derivative according to the present invention. However, shuffling allergen fragments (fragmenting and rebinding) causes a significant reduction in binding ability to IgE or a complete loss of this binding ability. Of course, when only some amino acid residues are deleted (removed) or added (inserted) during the production of allergen derivatives, or when each part is bound by a linker instead of being directly bound Nevertheless, the advantages according to the invention still exist. This reduction or extinction of allergen activity is achieved by known and conventional principles of dividing the allergen into defined fragments.
本発明に係るアレルゲン誘導体は、組み換えにより製造されることが好ましい。当然ながら、単一のアレルゲンの断片を化学的に合成して、その後、これら断片を一緒につなげることも可能である。 The allergen derivative according to the present invention is preferably produced recombinantly. Of course, it is also possible to chemically synthesize single allergen fragments and then connect these fragments together.
本発明の好ましい一実施形態によれば、アレルゲン活性の低減を、野生型アレルゲンと比べて少なくとも１０％、好ましくは少なくとも２０％、より好ましくは少なくとも３０％、特には５０％のＩｇＥ結合能力の低減によって判定する。 According to one preferred embodiment of the invention, the reduction in allergen activity is at least 10%, preferably at least 20%, more preferably at least 30%, in particular 50% reduction in IgE binding capacity compared to the wild type allergen. Determine by.
アレルゲン活性の低減を、好ましくは、上記誘導体のドットブロットに対する、アレルゲンに過敏な患者の血清におけるＩｇＥ抗体の結合の欠如によって、または好塩基球放出分析によって判定する。 Reduction in allergen activity is preferably determined by the lack of binding of IgE antibodies in the serum of patients allergen-sensitive to a dot blot of the derivative or by a basophil release assay.
アレルゲン活性を評価する従来の生体外分析は、ＲＡＳＴ（Sampson and Albergo, J. Allergy Clin. Immunol. 74:26, 1984）、ＥＬＩＳＡ（Burks et al. N. Engl. J. Med. 314:560, 1986）、免疫ブロット法（Burks et al., J. Allergy Clin. Immunol. 81:1135, 1988）、好塩基球ヒスタミン放出分析（Nielsen, Dan. Med. Bull. 42:455, 1995 and du Buske, Allergy Proc. 14:243, 1993）、およびその他のもの（Hoffmann et al. Allergy 54:446, 1999）を含む。 Conventional in vitro assays to assess allergen activity are RAST (Sampson and Albergo, J. Allergy Clin. Immunol. 74:26, 1984), ELISA (Burks et al. N. Engl. J. Med. 314: 560, 1986), immunoblotting (Burks et al., J. Allergy Clin. Immunol. 81: 1135, 1988), basophil histamine release analysis (Nielsen, Dan. Med. Bull. 42: 455, 1995 and du Buske, Allergy Proc. 14: 243, 1993), and others (Hoffmann et al. Allergy 54: 446, 1999).
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ ｐ １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、および／または、２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成される。
According to a preferred embodiment of the present invention, the at least three fragments are
本発明に係る方法で用いられる少なくとも３つの断片は、上述のＴ細胞エピトープのうちの少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含んで構成されてよい（例えば、Schenk S. et al. J Allergy Clin Immunol. （1995）96:986-996参照）。 At least three fragments used in the method according to the present invention may comprise at least one T cell epitope of the T cell epitopes described above (for example, Schenk S. et al. J Allergy Clin Immunol. ( 1995) 96: 986-996).
本発明の他の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ ｐ １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択される。
According to another preferred embodiment of the present invention, the at least three fragments are
本発明の断片は、ＩｇＥ結合／Ｂ細胞エピトープおよび保存されているＴ細胞エピトープを破壊するように選択される。これらのエピトープは、これらのエピトープに対する適切な免疫応答の生成を引き起こす。野生型アレルゲンＰｈｌ ｐ １に自然にみられるＢ細胞エピトープの破壊／低減によって、各患者に投与される場合に、上記誘導体は、アレルギー性反応を誘導するよりもむしろ、主としてＴ細胞性応答を生じさせることができる（メディエーター放出細胞に結合しているＩｇＥへの結合を全く欠くか、または、結合が低減する）。
Fragments of the invention are selected to destroy IgE binding / B cell epitopes and conserved T cell epitopes. These epitopes cause the generation of appropriate immune responses against these epitopes. Due to the destruction / reduction of B cell epitopes naturally found in the wild-type
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることが好ましい。 The order of the fragments in the allergen derivative is preferably BDAC.
仮に得られたアレルゲン誘導体のアレルゲン活性が野生型アレルゲンと比べて低い場合には、上記断片を他の順序で並べることも当然可能である（Ｄ−Ｂ−Ａ−Ｃ、Ｂ−Ａ−Ｄ−Ｃ等）。 If the allergen activity of the allergen derivative obtained is lower than that of the wild-type allergen, it is naturally possible to arrange the fragments in another order (D-B-A-C, B-A-D- C etc.).
本発明に従って得られた誘導体を、製薬基準を満たした賦形剤と組み合わせて医薬製剤に仕上げることは容易に可能である。 Derivatives obtained according to the invention can easily be finished into pharmaceutical formulations in combination with excipients that meet pharmaceutical standards.
好ましくは、上記誘導体を、好適なワクチンアジュバントと組み合わせて製薬基準を満たしたワクチン製剤に仕上げる。 Preferably, the derivative is combined with a suitable vaccine adjuvant into a vaccine formulation that meets pharmaceutical standards.
好ましい一実施形態では、本発明に係る誘導体をさらなるアレルゲンと組み合わせて、複合ワクチンにする。このようなアレルゲンは、野生型アレルゲン、特に野生型アレルゲンの混合物、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物であることが好ましい。この混合物は、特定の患者のニーズ（アレルゲンプロファイル）に合わせて特別に製造され得る。 In a preferred embodiment, the derivatives according to the invention are combined with further allergens into a combined vaccine. Such an allergen is preferably a wild type allergen, in particular a mixture of wild type allergens, a recombinant wild type allergen, a derivative of a wild type protein allergen or a mixture thereof. This mixture can be tailored to the specific patient needs (allergen profile).
好ましい一実施形態では、このような医薬製剤は、アレルゲン抽出物をさらに含む。 In a preferred embodiment, such pharmaceutical formulation further comprises an allergen extract.
本発明の他の好ましい一実施形態では、上記さらなるアレルゲンは、主要なカバノキの花粉アレルゲン（特にＢｅｔ ｖ １およびＢｅｔ ｖ ４）、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン（特にＰｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６、および、Ｐｈｌ ｐ ７）、主要なイエダニアレルゲン（特にＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２）、主要なネコアレルゲン（Ｆｅｌ ｄ １）、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン（特にＰｈｌ ｐ １２）、および、貯蔵庫ダニ（storage mite）アレルゲン（特にＬｅｐ ｄ ２）から成る群より選択される。
In another preferred embodiment of the invention, said further allergens are major birch pollen allergens (especially
本発明に係る医薬製剤およびワクチン製剤は、Ｐｈｌ ｐ １に近いもの、他のアレルゲンまたは誘導体およびこれらの断片、アレルゲン抽出物などを含んで構成されてもよい。
The pharmaceutical preparation and vaccine preparation according to the present invention may be configured to include those close to
本発明の別の態様は、本発明に係る方法によって得られるアレルゲン誘導体に関する。 Another aspect of the present invention relates to an allergen derivative obtained by the method according to the present invention.
本発明のさらに別の態様は、野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １のアレルゲン誘導体であって、上記野生型タンパク質アレルゲンの少なくとも３つの断片をふくみ、該３つの断片は上記野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序で互いに連結しており、上記少なくとも３つの野生型アレルゲン断片はアレルゲン活性が低減しているか、またはアレルゲン活性を欠いており、上記少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つは１つ以上のＴ細胞エピトープを含んで構成されているアレルゲン誘導体に関する。
Yet another aspect of the present invention is an allergen derivative of the wild-type protein
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記少なくとも３つのアレルゲン断片は、少なくとも６アミノ酸残基、好ましくは少なくとも１０アミノ酸残基、特に少なくとも１５アミノ酸残基を含んで構成されている。 According to a preferred embodiment of the present invention, the at least three allergen fragments comprise at least 6 amino acid residues, preferably at least 10 amino acid residues, in particular at least 15 amino acid residues.
上記少なくとも３つの断片は、好ましくは、Ｐｈｌ ｐ １の２５から３９番目までのアミノ酸残基、３４から４５番目までのアミノ酸残基、７３から８４番目までのアミノ酸残基、９１から１０２番目までのアミノ酸残基、１００から１１１番目までのアミノ酸残基、１０９から１３３番目までのアミノ酸残基、１２１から１３５番目までのアミノ酸残基、１２７から１３８番目までのアミノ酸残基、１５７から１６８番目までのアミノ酸残基、１６９から１８３番目までのアミノ酸残基、および２２６から２４０番目までのアミノ酸残基を含んで構成されている。
The at least three fragments are preferably
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記少なくとも３つの断片は、Ｐｈｌ ｐ １の１から６４番目までのアミノ酸残基（Ａ）、６５から１２５番目までのアミノ酸残基（Ｂ）、１２６から２０５番目までのアミノ酸残基（Ｃ）および２０６から２４０番目までのアミノ酸残基（Ｄ）から成る群より選択される。
According to another preferred embodiment of the present invention, the at least three fragments are
上記アレルゲン誘導体における上記断片の順序は、Ｂ−Ｄ−Ａ−Ｃであることが好ましい。 The order of the fragments in the allergen derivative is preferably BDAC.
本発明のアレルゲン誘導体は、Ｐｈｌ ｐ １感受性の検出および診断にも用いられ得る。例えば、この検出および診断は、感受性を評価する患者から採取した血液または血液製剤を、Ｐｈｌ ｐ １の活性を有するペプチドと生体外で組み合わせることによって実施可能であり、血液中の成分（例えば、抗体、Ｔ細胞、Ｂ細胞）と上記誘導体との結合およびこのような結合が生じる範囲の決定に適した環境下でなされる。本発明の誘導体が用いられ得るアレルギー性疾患の他の診断方法としては、放射性アレルギー吸着試験（RAST）、ペーパー放射性免疫吸着試験（PRIST）、酵素免疫吸着法（ELISA）、放射免疫測定法（RIA）、免疫放射定量測定法（IRMA）、発光免疫測定法（LIA）、ヒスタミン放出測定法およびＩｇＥ免疫ブロット法が挙げられる。
The allergen derivatives of the present invention can also be used for detection and diagnosis of
本発明の別の態様は、本発明に係るアレルゲン誘導体（上記参照）と、さらなるアレルゲン、好ましくは野生型アレルゲン、特には野生型アレルゲン、組み換え野生型アレルゲン、野生型タンパク質アレルゲンの誘導体またはこれらの混合物の混合物とを含んで構成されるアレルゲン組成物に関する。 Another aspect of the present invention relates to an allergen derivative according to the present invention (see above) and a further allergen, preferably a wild type allergen, in particular a wild type allergen, a recombinant wild type allergen, a derivative of a wild type protein allergen or a mixture thereof And an allergen composition comprising:
上記組成物は、好ましくはアレルゲン抽出物をさらに含む。 The composition preferably further comprises an allergen extract.
本発明の好ましい一実施形態によれば、アレルゲン組成物は製薬基準を満たした賦形剤を含む。 According to one preferred embodiment of the invention, the allergen composition comprises excipients that meet pharmaceutical standards.
本発明の別の好ましい実施形態によれば、上記組成物は、主要なカバノキの花粉アレルゲン（特にＢｅｔ ｖ １およびＢｅｔ ｖ ４）、主要なオオアワガエリの花粉アレルゲン（特にＰｈｌ ｐ ２、Ｐｈｌ ｐ ５、Ｐｈｌ ｐ ６およびＰｈｌ ｐ ７）、主要なイエダニアレルゲン（特にＤｅｒ ｐ １およびＤｅｒ ｐ ２）、主要なネコアレルゲン（Ｆｅｌ ｄ １）、主要なハナバチアレルゲン、主要なスズメバチアレルゲン、プロフィリン（特にＰｈｌ ｐ １２）および貯蔵庫ダニアレルゲン（特にＬｅｐ ｄ ２）から成る群より選択される１つ以上のアレルゲンをさらに含んで構成される。
According to another preferred embodiment of the present invention, the composition comprises a major birch pollen allergen (especially
本発明の別の態様は、アレルゲン特異的免疫療法薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。 Another aspect of the invention relates to the use of an allergen derivative or allergen composition according to the invention for the preparation of an allergen-specific immunotherapeutic agent.
本発明のさらに別の態様は、能動免疫付与用薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。 Yet another aspect of the invention relates to the use of an allergen derivative or allergen composition according to the invention for the preparation of a drug for active immunization.
本発明の別の態様は、予防免疫接種用薬剤の調剤のための本発明に係るアレルゲン誘導体またはアレルゲン組成物の使用に関する。 Another aspect of the present invention relates to the use of an allergen derivative or allergen composition according to the present invention for the preparation of a medicament for prophylactic immunization.
上記薬剤は、好ましくはアジュバント、希釈剤、防腐剤またはこれらの混合物をさらに含む。 The medicament preferably further comprises an adjuvant, diluent, preservative or mixtures thereof.
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記薬剤は、１０ｎｇから１ｇ、好ましくは１００ｎｇから１０ｍｇ、特には０．５μｇから２００μｇの上記組み換えアレルゲン誘導体を含んで構成される。好ましい投与の方法としては、概してワクチン接種用および特にはアレルギー免疫療法用に記述または提案されている全ての標準的な投与法が含まれる（経口、経皮、経静脈、経鼻、経粘膜など）。本発明は、本発明に係る医薬製剤の有効量を投与することによってアレルギーを治療および予防する方法を包含する。 According to a preferred embodiment of the invention, the medicament comprises 10 ng to 1 g, preferably 100 ng to 10 mg, in particular 0.5 μg to 200 μg of the recombinant allergen derivative. Preferred methods of administration include all standard administration methods generally described or proposed for vaccination and in particular for allergic immunotherapy (oral, transdermal, intravenous, nasal, transmucosal, etc. ). The present invention includes methods for treating and preventing allergies by administering an effective amount of a pharmaceutical formulation according to the present invention.
本発明の別の態様は、本発明に係るアレルゲン誘導体を製造する方法であって、
本発明に係るアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡ分子を準備するステップと、
上記ＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含む方法に関する。
Another aspect of the present invention is a method for producing an allergen derivative according to the present invention, comprising:
Providing a DNA molecule encoding an allergen derivative according to the present invention;
Transforming a host cell with the DNA molecule;
Expressing the derivative in the host cell and isolating the derivative.
本発明の好ましい一実施形態によれば、上記宿主細胞は、真核細胞、好ましくは酵母細胞もしくは植物細胞、または原核細胞、好ましくはエシェリキア・コリ（Escherichia coli）である。 According to a preferred embodiment of the invention, the host cell is a eukaryotic cell, preferably a yeast or plant cell, or a prokaryotic cell, preferably Escherichia coli.
好ましくは、上記宿主細胞は、高い発現能力を有する宿主細胞である。本明細書で用いられる場合、「高い発現能力を有する宿主細胞」は、関心をもっているタンパク質を、培養液に少なくとも１ｍｇ／ｌ、好ましくは少なくとも５ｍｇ／ｌ、より好ましくは少なくとも１０ｍｇ／ｌ、最も好ましくは少なくとも２０ｍｇ／ｌの量で発現する宿主である。もちろん、発現能力は、選択する宿主および発現システム（例えば、ベクター）によっても左右される。本発明に係る好ましい宿主はＥ．ｃｏｌｉ、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）、バチルス・スブティリス（Bacillus subtilis）、植物細胞（例えば、タバコ由来）などである。 Preferably, the host cell is a host cell having high expression ability. As used herein, “a host cell with high expression capacity” refers to a protein of interest in a culture medium of at least 1 mg / l, preferably at least 5 mg / l, more preferably at least 10 mg / l, most preferably Is a host expressed in an amount of at least 20 mg / l. Of course, expression capability also depends on the host chosen and the expression system (eg, vector). Preferred hosts according to the invention are E. coli. E. coli, Pichia pastoris, Bacillus subtilis, plant cells (for example, derived from tobacco), and the like.
もちろん、あらゆる他の好適な方法によっても本発明に係るアレルゲン誘導体を製造することができ、とりわけ、化学合成または半化学合成によっても製造することができる。 Of course, the allergen derivative according to the invention can also be produced by any other suitable method, in particular by chemical synthesis or semi-chemical synthesis.
本発明は、以下の図面および実施例によってさらに説明されるが、それらに限定されるものではない。 The present invention is further illustrated by the following figures and examples, but is not limited thereto.
図１Ａは、本発明に係る低アレルゲン性Ｐｈｌ ｐ１誘導体の構成を示している。 FIG. 1A shows the structure of a hypoallergenic Phl p1 derivative according to the present invention.
図１Ｂは、本発明に係るＰｈｌ ｐ１モザイクタンパク質のアミノ酸配列を示している（配列番号１）。 FIG. 1B shows the amino acid sequence of the Phl p1 mosaic protein according to the present invention (SEQ ID NO: 1).
図２Ａは、＞９０％の純度に精製したＰｌｍのクマシー染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示している。 FIG. 2A shows Colmsie-stained SDS-PAGE of Plm purified to> 90% purity.
図２Ｂは、Ｐｌｍの質量分光分析を示しており、レーザー脱離質量スペクトルは、ＴＯＦ Ｃｏｍｐａｃｔ ＭＡＬＤＩ ＩＩ ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｋｒａｔｏｓ社、英国）（ｐｉＣＨＥＭ社、オーストリア）を用いてリニアモードで得られた。 FIG. 2B shows mass spectrometry of Plm, and laser desorption mass spectra were obtained in linear mode using a TOF Compact MALDI II instrument (Kratos, UK) (piCHEM, Austria).
図２Ｃは、Ｐｌｍの円偏光二色性（ＣＤ）分析を示している。遠紫外ＣＤスペクトルを、Ｊａｓｃｏ Ｊ−８１０分光偏光計（Ｊａｓｃｏ社、イーストン、メリーランド州）において室温で回収した。このとき、最終的なタンパク質濃度は、Ｐｌｍについては４６μＭであり、組み換えＰｈｌについては１２μＭであり、経路長が０．００１ｃｍおよび０．０５ｃｍの石英キュベットをそれぞれ使用した。３回の独立の測定結果を記録し、各スペクトル点について平均化した。同じ条件により得られた対応するバッファースペクトルを差し引くことによって、最終的なスペクトルをベースライン修正した。結果は、所定の波長における平均残基楕円率[θ]として表されている。 FIG. 2C shows a circular dichroism (CD) analysis of Plm. Far UV CD spectra were collected at room temperature on a Jasco J-810 spectropolarimeter (Jasco, Easton, MD). At this time, the final protein concentration was 46 μM for Plm, 12 μM for recombinant Phl, and quartz cuvettes with path lengths of 0.001 cm and 0.05 cm were used, respectively. Three independent measurement results were recorded and averaged for each spectral point. The final spectrum was baseline corrected by subtracting the corresponding buffer spectrum obtained with the same conditions. Results are expressed as mean residue ellipticity [θ] at a given wavelength.
図３は、メンブレンに結合しているアレルゲンｒＰｈｌ ｐ １、ＰｌｍおよびＨＳＡに対するＩｇＥ結合を示している。４９人の花粉アレルギー患者からの血清および１人の非アトピードナーからの血清を（ｎ＝５０）、メンブレン結合組み換えアレルゲンｒＰｈｌ ｐ １、ＰｌｍおよびＨＳＡとともにインキュベートした。１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、結合したＩｇＥを検出した。
FIG. 3 shows IgE binding to the
図４は、５つのＰｈｌ ｐ１アレルギー性個体のサンプルをｒＰｈｌ ｐ１およびＰｌｍにさらしたときのＣＤ２０３ｃの発現の比較を示している。 FIG. 4 shows a comparison of CD203c expression when samples of 5 Phl p1 allergic individuals were exposed to rPhl p1 and Plm.
図５は、ｒＰｈｌ ｐ１およびＰｌｍにさらされたマウスにおけるＩｇＧ１応答の誘導を示している。 FIG. 5 shows the induction of an IgG1 response in mice exposed to rPhl p1 and Plm.
〔実施例：低アレルゲン性Ｐｈｌ ｐ １モザイク（Ｐｌｍ）タンパク質の特徴づけ〕
（実施例１：低アレルゲン性Ｐｈｌ ｐ １モザイク（Ｐｌｍ）タンパク質の構築）
組み換え低アレルゲン性Ｐｈｌ ｐ １モザイクを構築するために、４つのＰｈｌ ｐ １断片をコードするｃＤＮＡを増幅した。断片Ａ（アミノ酸１−６４）、Ｂ（アミノ酸６５−１２５）、Ｃ（アミノ酸１２６−２０５）およびＤ（アミノ酸２０６−２４０）は図１Ａに示されている。説明したｃＤＮＡ断片は、「ジーン・ソーイング法（gene soeing）」（Horton et al., 1999）によってＢ−Ｄ−Ａ−Ｃの順序でアセンブルされている。第１のＰＣＲ反応において、断片Ａ（プライマーＡＦ：5'ATC CCC AAG GTT CCC 3'およびＡＲ：5'CAG CTC GCC GGC GCT CTT GAA GAT GGG 3'）、Ｂ（プライマーＢＦ：5'C TCC TCC CAT ATG TCC GGA CGC GGC 3'およびＢＲ：5'GGT GAA GGG GCC CGT GCG CAG CTT CTG 3'）、Ｃ（プライマーＣＦ：5'AGC GCC GGC GAG CTG 3'およびＣＲ：5'C GGG ATC CTA ATG ATG ATG ATG ATG ATG GGC GGC GAG CTT GTC GGG AGT GTC 3'）およびＤ（プライマーＤＦ：5'ACG GGC CCC TTC ACC 3'およびＤＲ：5'GGG AAC CTT GGG GAT CTT GGA CTC GTA 3'）のためのｃＤＮＡを取得した。その後の第１のソーイング（ＳＯＥｉｎｇ）反応では、断片ＢＤ（プライマーＢＦおよびＤＲを使用）および断片ＡＣ（プライマーＡＦおよびＣＲを使用）をコードするｃＤＮＡを取得するために、ゲル精製したＰＣＲ産物をテンプレートとして用いた。その後の第２のソーイング反応では、プライマーＢＦおよびＣＲを用いてＢＤＡＣをコードするＰＣＲ産物を取得するために、ゲル精製した断片ＢＤおよびＡＣをテンプレートとして用いた（図１Ａに概略的に示している）。
Example: Characterization of
(Example 1: Construction of
To construct a recombinant
結果として得られたＢＤＡＣをコードするｃＤＮＡコンストラクトを、プラスミドｐＥＴ１７ｂ（ノバジェン社、マディソン、ウィスコンシン州）のＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩ制限酵素部位に挿入した。Ｎｉ２＋アフィニティクロマトグラフィによってモザイクタンパク質を精製できるように、ＢＤＡＣコンストラクトのＣ末端には、２つのグリシンの後に６ヒスチジンタグが続いている（図１Ｂ）。Ｐｈｌ ｐ １モザイク（Ｐｌｍ）をコードしているｃＤＮＡが正しい配列であることを、シーケンシングによって確認した。
The resulting cDNA construct encoding BDAC was inserted into the NdeI / BamHI restriction enzyme site of plasmid pET17b (Novagen, Madison, Wis.). The C-terminus of the BDAC construct is followed by two glycines followed by a 6 histidine tag so that the mosaic protein can be purified by Ni 2+ affinity chromatography (FIG. 1B). Sequencing confirmed that the cDNA encoding the
結果として得られる分子は、全一次配列（Laffer et. al., 1994）およびＴ細胞エピトープ（Schenk et al., 1995）を保持している。 The resulting molecule retains the entire primary sequence (Laffer et. Al., 1994) and T cell epitope (Schenk et al., 1995).
（実施例２：Ｐｌｍの生化学的特徴づけ）
Ｐｌｍの発現および精製
形質転換によりＰｌｍコンストラクトをＥ．ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）（ストラタジーン社、オーストラリア）内に導入し、１００ｍｇ／ｌのアンピシリンを加えたＬＢ培地中で発現させた。形質転換された細胞を３７℃でＯＤ６００＝０．９になるまで増殖させ、１ｍＭのイソプロピル−β−チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって組み換えＰｌｍの発現を誘導した。同じ条件下で４時間インキュベーションを継続し、その後、遠心分離によって細胞を回収した。変性条件を用いて、組み換えＰｌｍを不溶性ペレット画分から精製した。８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０中で６０分間攪拌することによって、細胞を溶解した。１４，０００×ｇで３０分間遠心分離した後、上清をＮｉ−ＮＴＡカラムにロードした。組み換えＰｌｍを、８Ｍの尿素、１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ４．５中に溶出させ、段階的透析によって再生した。１００ｍＭのＮａＨ２ＰＯ４、１０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ８．０で、６Ｍ、４Ｍ、３Ｍ、２Ｍ、１Ｍおよび０．５Ｍの尿素を含む段階的透析の各ステップにおいて、少なくとも４時間透析した。１０ｍＭのＴｒｉｓ、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ８．０でタンパク質の最終的な透析を実施し、Ａｍｉｃｏｎ ｃｅｎｔｒｉｃｏｎ ＹＭ．−３濃縮器を用いてタンパク質を濃縮した。
(Example 2: Biochemical characterization of Plm)
Expression and Purification of Plm The Plm construct was transformed into E. coli by transformation. E. coli BL21 (DE3) (Stratagene, Australia) was introduced and expressed in LB medium supplemented with 100 mg / l ampicillin. Transformed cells were grown at 37 ° C. until OD600 = 0.9, and recombinant Plm expression was induced by adding 1 mM isopropyl-β-thiogalactopyranoside (IPTG). Incubation was continued for 4 hours under the same conditions, after which the cells were harvested by centrifugation. Recombinant Plm was purified from the insoluble pellet fraction using denaturing conditions. Cells were lysed by stirring in 8M urea, 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, pH 8.0 for 60 minutes. After centrifugation at 14,000 × g for 30 minutes, the supernatant was loaded onto a Ni-NTA column. Recombinant Plm was eluted in 8M urea, 100 mM NaH 2 PO 4 , 10 mM Tris, pH 4.5 and regenerated by step dialysis. 100mM of NaH 2 PO 4, 10 mM of Tris, at pH8.0, 6M, 4M, 3M, 2M, at each step of the stepwise dialysis containing urea 1M and 0.5M, and dialyzed for at least 4 hours. Final dialysis of the protein was performed with 10 mM Tris, 100 mM NaCl, pH 8.0, and Amicon centricon YM. The protein was concentrated using a -3 concentrator.
タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥによって確認した。精製したサンプルのタンパク質濃度を２８０ｎｍにおけるＵＶ吸光度によって評価した。タンパク質のモル吸光係数をチロシンおよびトリプトファン含有量から計算した（Gill et al., 1989）。 Protein purity was confirmed by SDS-PAGE. The protein concentration of the purified sample was evaluated by UV absorbance at 280 nm. The molar extinction coefficient of the protein was calculated from tyrosine and tryptophan content (Gill et al., 1989).
Ｐｌｍは組み換えＰｈｌ ｐ １に類似した泳動パターンを示している（図２Ａ参照）。これは、タンパク質の推定アミノ酸配列に従って算出された分子量と一致する。 Plm shows an electrophoretic pattern similar to recombinant Phl p 1 (see FIG. 2A). This is consistent with the molecular weight calculated according to the deduced amino acid sequence of the protein.
質量分析によってＰｌｍの分子質量は２７０８２ダルトンと決定され、これは、タンパク質の予測分子量と一致する（図２Ｂ参照）。 Mass spectrometry determined the molecular mass of Plm to be 27082 daltons, which is consistent with the predicted molecular weight of the protein (see FIG. 2B).
精製したＰｌｍを円偏光二色性分析によって分析し、組み換えＰｈｌ ｐ １と比較して、その二次構造含量を決定した（図２Ｃ参照）。意外にも、Ｐｌｍは、２０７ｎｍおよび２１５ｎｍに最小点、１９５ｎｍに最大点を有する折りたたみ構造分子である。これは、かなりの量のβ−二次構造であることを示唆している。人工アレルゲンタンパク質であるＰｌｍは、バキュロ・ウイルス感染昆虫細胞で発現している組み換えＰｈｌ ｐ １の折りたたみ型とは異なるＣＤスペクトルを呈している（Ball et al.）。相対的に、Ｅ．ｃｏｌｉ発現組み換えＰｈｌ ｐ １は非折りたたみ構造タンパク質のスペクトルを呈し、この事実は最近報告されている（Ball et al., 2005）。
Purified Plm was analyzed by circular dichroism analysis and compared to
（実施例３：ＰｌｍにおけるＩｇＥ結合能力の低減）
抗原過剰の条件下におけるドットブロット実験によって、ＰｌｍのＩｇＥ反応性を測定し、ｒＰｈｌ ｐ １と比較した（Niederberger et al., 1998）。３μｇの精製組み換えタンパク質をニトロセルロースストリップ上に点状にのせ（ドットし）、４９人のＰｈｌ ｐ １アレルギー性患者の血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＥ抗体を、１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、γ−計測（Ｗａｌｌａｃ社、フィンランド）によって定量した（Ball et al., 1999）。
(Example 3: Reduction of IgE binding ability in Plm)
The IgE reactivity of Plm was measured by dot blot experiments under conditions of excess antigen and compared to rPhl p 1 (Niederberger et al., 1998). 3 μg of purified recombinant protein was spotted (dotted) onto a nitrocellulose strip and incubated with sera of 49
非変性条件下で決定したＰｌｍのＩｇＥ反応性は、ｒＰｈｌｐ１のＩｇＥ結合能力と比較して著しく低減していた（図３）。Ｐｌｍが結合したＩｇＥ抗体の定量化から、ｒＰｈｌ ｐ １と比較してＰｌｍのＩｇＥ結合能力が平均して８６．５％低減していることが示されている（表１）。 The IgE reactivity of Plm determined under non-denaturing conditions was significantly reduced compared to the IgE binding ability of rPhlp1 (FIG. 3). Quantification of IgE antibodies bound by Plm shows that the IgE binding ability of Plm is reduced by an average of 86.5% compared to rPhl p 1 (Table 1).
図３は、メンブレンに結合している組み換えアレルゲンｒＰｈｌ ｐ １、ＰｌｍおよびＨＳＡに対するＩｇＥ結合を示している。４９人の花粉アレルギー患者からの血清および１人の非アトピードナーからの血清を（ｎ＝５０）、メンブレン結合組み換えアレルゲンｒＰｈｌ ｐ １、ＰｌｍおよびＨＳＡとともにインキュベートした。１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて、結合したＩｇＥを検出した。
FIG. 3 shows IgE binding to recombinant
表１．ｒＰｈｌ ｐ １およびＰｌｍの血清ＩｇＥ反応性。ドットしたタンパク質を、２９人の花粉アレルギー患者の血清にさらした。結合したＩｇＥ抗体を、１２５Ｉ標識した抗ヒトＩｇＥ抗体を用いて検出し、γ−計測によって定量化した。
Table 1. Serum IgE reactivity of
（実施例４：Ｐｌｍはアレルゲン活性が低減している）
ＣＤ２０３ｃ発現によって測定された好塩基球の活性化
インフォームド・コンセントが得られた後、５人のアレルギードナーから末梢血を採取した。血液をヘパリン添加チューブに回収した。等分した血液（１００μｌ）を、ＰｌｍおよびｒＰｈｌ ｐ １の連続希釈（１０−３から１０μｇ／ｍｌ）、抗ＩｇＥ抗体（１μｇ／ｍｌ）（イムノテック社、マルセイユ、フランス）またはバッファー（リン酸緩衝生理食塩水＝ＰＢＳ）とともに、１５分間３７℃でインキュベートした。インキュベーションの後、細胞を２０ｍＭ ＥＤＴＡを含むＰＢＳ中で洗浄した。次いで、ＣＤ２０３ｃ ｍＡｂ ９７Ａ６（イムノテック社、マルセイユ、フランス）を含む１０μｌのＰＥとともに、細胞を１５分間室温（ＲＴ）でインキュベートした。その後、サンプルを、２ｍｌのＦＡＣＳＴＭライシング・ソリューション（ベクトン・ディッキンソン社、サンノゼ、カリフォルニア州）による赤血球溶解に供した。細胞を洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、Ｐａｉｎｔ−ａ−Ｇａｔｅソフトウェアを用いてＦＡＣＳｃａｎ（ベクトン・ディッキンソン社）で二色フローサイトメトリーにより解析した。ＣＤ２０３ｃのアレルゲン誘導亢進制御を、刺激細胞（ＭＦＩｓｔｉｍ）および非刺激細胞（ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）を用いて得られた平均蛍光強度（ＭＦＩｓ）から算出し、刺激指数（ＭＦＩｓｔｉｍ：ＭＦＩｃｏｎｔｒｏｌ）として表した。
(Example 4: Plm has reduced allergen activity)
Basophil activation as measured by CD203c expression After informed consent was obtained, peripheral blood was collected from 5 allergic donors. Blood was collected in heparinized tubes. Aliquoted blood (100 μl) was diluted in serial dilutions of Plm and rPhl p 1 (10 −3 to 10 μg / ml), anti-IgE antibody (1 μg / ml) (Immunotech, Marseille, France) or buffer (phosphate buffer) Incubation with saline (PBS) for 15 minutes at 37 ° C. After incubation, the cells were washed in PBS containing 20 mM EDTA. Cells were then incubated with 10 μl of PE containing CD203c mAb 97A6 (Immunotech, Marseille, France) for 15 minutes at room temperature (RT). Samples were then subjected to erythrocyte lysis with 2 ml of FACS ™ licensing solution (Becton Dickinson, San Jose, Calif.). Cells were washed, resuspended in PBS and analyzed by two-color flow cytometry on a FACScan (Becton Dickinson) using Paint-a-Gate software. CD203c allergen-induced enhanced control was calculated from mean fluorescence intensities (MFIs) obtained using stimulating cells (MFI stim ) and non-stimulated cells (MFI control ), and expressed as stimulation index (MFI stim : MFI control ). .
５人のＰｈｌ ｐ １アレルギー患者の血中好塩基球におけるＣＤ２０３ｃの発現を測定することによって、Ｐｌｍのアレルゲン活性を解析した。図４に表されているように、タンパク質濃度を１μｇ／ｍｌにしてｒＰｈｌ ｐ １とともにインキュベートすると、ＣＤ２０３ｃの発現は著しく（ｐ＜０．０５）亢進制御される。一方、Ｐｌｍとの場合には、ＣＤ２０３ｃの発現は誘導されない。Ｐｌｍの濃度が１０μｇ／ｍｌに上昇した場合のみ、ＣＤ２０３ｃの発現は亢進制御される。そのため、Ｐｌｍと比較すると、Ｐｈｌ ｐ １は１０倍のアレルゲン活性を呈する。
Plm allergen activity was analyzed by measuring the expression of CD203c in the blood basophils of five
（実施例５：Ｐｌｍを用いた免疫付与により誘導されたＩｇＧ抗体は、患者のＩｇＥのｒＰｈｌ ｐ １に対する結合を阻害する）
ウサギへの免疫付与
まず、ＣＦＡを用いて、２００μｇのＰｌｍおよびｒＰｈｌ ｐ １によりウサギを免疫した。また、その後のＩＦＡ（チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー、キスレッグ、ドイツ）を用いた追加免疫注射のために、１００μｇの免疫原により免疫付与した（第１の追加免疫注射を４週間後に付与し、不完全アジュバントを含む第２の追加免疫注射を７週間後に付与した）。最初の免疫から８週間後、ウサギは出血させられた（bled）。
(Example 5: IgG antibody induced by immunization with Plm inhibits patient IgE binding to rPhl p 1)
Immunization of rabbits First, rabbits were immunized with 200 μg Plm and
Ｐｌｍ誘導ＩｇＧによる、ｒＰｈｌ ｐ １に対するアレルギー患者のＩｇＥ結合の阻害
ｒＰｈｌ ｐ １へのアレルギー患者のＩｇＥ結合を阻害する、ＰｌｍおよびｒＰｈｌ ｐ １により誘導したウサギＩｇＧの阻害能力を、ＥＬＩＳＡ競合アッセイ（Focke et al., 2001）により試験した。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ社、デンマーク）を、１μｇ／ｍｌのｒＰｈｌ ｐ １でコートし、ｒＰｈｌ ｐ １およびＰｌｍ抗血清の１／１００希釈液を用いて、また、コントロール目的のために対応する免疫前血清を用いて、プレインキュベートした。洗浄後、４３人のＰｈｌ ｐ １感作花粉アレルギー患者からの血清１／１０希釈とともに、プレートをインキュベートした。ＨＲＰに連結したヤギ抗ヒトＩｇＥ Ａｂｓ（１／２５００に希釈）（ＫＰＬ、ゲイサーズバーグ、メリーランド州）を用いて、結合したＩｇＥ Ａｂｓを検出した。抗Ｐｈｌ ｐ １および抗Ｐｌｍ抗血清を用いたプレインキュベーションにより実現したＩｇＥ結合の阻害の割合を、以下のように算出した。ＩｇＥ結合の阻害の割合＝１００−ＯＤＩ／ＯＤＰ×１００
。ＯＤＩおよびＯＤＰは、それぞれ、ウサギの免疫血清および対応する免疫前血清を用いてプレインキュベーションした後の吸光度を表している。
Inhibition of IgE binding of allergic patients to
. OD I and OD P, respectively, represent the absorbance after preincubation with immune sera and the corresponding preimmune rabbit serum.
患者のＩｇＥのｒＰｈｌ ｐ １への結合を阻害する、Ｐｌｍの能力を、割合の減少として表２に示している。抗Ｐｌｍ Ａｂｓを用いた場合には、患者のＩｇＥにおけるｒＰｈｌ ｐ １への結合の最も強い阻害が、０から８９％（減少の平均は５２％）の範囲となり、一方、抗Ｐｈｌ ｐ １ Ａｂｓを用いた阻害では、４から７５％（平均は４３％）の範囲となった。
The ability of Plm to inhibit patient IgE binding to
表２．ｒＰｈｌ ｐ １およびＰｌｍに対して高められたウサギ抗血清は、ｒＰｈｌ ｐ １に対する花粉アレルギー患者のＩｇＥの結合を阻害する。ＥＬＩＳＡプレートに結合したｒＰｈｌ ｐ １およびＰｌｍを、ウサギ抗ｒＰｈｌ ｐ１および抗Ｐｌｍ抗血清とともにプレインキュベートした。４３人の花粉アレルギー患者について得られたＩｇＥ結合の割合の減少を示している。
Table 2. Rabbit antiserum raised against
（実施例６：Ｐｌｍの免疫原性）
ｉｎ ｖｉｖｏにおいて、Ｐｈｌ ｐ １モザイクタンパク質がアレルゲン特異的ＩｇＧ応答を誘導するかを調べるために、６週齢の雌のＢＡＬＢ／ｃマウス（チャールズ・リバー・ブリーディング・ラボラトリー）を皮下免疫した。５匹のマウスからなる複数のグループについて、５μｇのＰｌｍ、ｒＰｈｌ ｐ １、およびコントロール目的のためにＡｌ（ＯＨ）３に吸着したＰＢＳのみ（Ａｌｕ−Ｇｅｌ−Ｓ、セルバ、ドイツ）を用いて免疫した（Vrtala et al., 1998）。マウスを３回免疫し（１日目、２８日目、５６日目）、４週間おきに尾の静脈から採血し、分析まで血清を−２０℃で保存した。
(Example 6: Immunogenicity of Plm)
To examine whether
ｒＰｈｌ ｐ １に対するＩｇＧ１応答をＥＬＩＳＡにより測定した（Vrtala et al., 1998）。ＥＬＩＳＡプレート（ヌンク・マキシソープ社、デンマーク）を５μｇのＰｌｍでコートし、１：１０００希釈したマウス血清とともにインキュベートした。結合したＩｇＧ１抗体を、１：１０００希釈したモノクローナルラット抗マウスＩｇＧ１（ファルミンゲン社、カリフォルニア州）および１：２００希釈したＨＲＰ標識ヒツジ抗ラット抗血清（アマシャム、英国）を用いて検出した。
The IgG1 response to
図５に図示するように、ｒＰｈｌ ｐ １に対するＰｌｍ誘導ＩｇＧ１応答は、ｒＰｈｌ ｐ １を用いた免疫化による誘導の場合と、ほぼ同程度である。
As shown in FIG. 5, the Plm-induced IgG1 response to
図５．Ｐｌｍの免疫原性。ＰＢＳ、ｒＰｈｌ ｐ１またはＰｌｍまたは（ｘ軸）により免疫した５匹のマウスの平均ＩｇＧ１応答を、免疫後４、８週間または１２週間におけるＯＤ値と（ｙ軸）して図示している。 FIG. Plm immunogenicity. Mean IgG 1 responses of 5 mice immunized with PBS, rPhl p1 or Plm or (x axis) are plotted as OD values (y axis) at 4, 8 or 12 weeks after immunization.
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Claims (31)
野生型タンパク質アレルゲンＰｈｌ ｐ １を準備するステップと、
上記野生型タンパク質アレルゲンを少なくとも３つの断片に断片化するステップであって、該少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つの断片は少なくとも１つのＴ細胞エピトープを含み、該少なくとも３つの断片は、アレルゲン活性が低減しているかまたはアレルゲン活性を失っている断片に断片化するステップと、
上記少なくとも３つの断片を、上記野生型アレルゲンの断片の順序とは異なる順序で再結合させるステップとを含むことを特徴とする方法。 A method for producing a derivative of a wild-type protein allergen Phl p 1 having reduced allergen activity compared to a wild-type allergen,
Providing a wild type protein allergen Phl p 1;
Fragmenting said wild type protein allergen into at least three fragments, wherein at least one of said at least three fragments comprises at least one T cell epitope, said at least three fragments comprising allergen activity; Fragmenting into fragments that are reduced or have lost allergen activity;
Recombining the at least three fragments in an order different from the order of the wild-type allergen fragments.
上記野生型タンパク質アレルゲンの少なくとも３つの断片をふくみ、該３つの断片は上記野生型アレルゲンにおける順序とは異なる順序で互いに連結しており、
上記少なくとも３つの野生型アレルゲン断片はアレルゲン活性が低減しているか、またはアレルゲン活性を欠いており、上記少なくとも３つの断片のうちの少なくとも１つは１つ以上のＴ細胞エピトープを含んで構成されていることを特徴とするアレルゲン誘導体。 An allergen derivative of the wild-type protein allergen Phl p 1,
Including at least three fragments of the wild-type protein allergen, the three fragments being linked together in an order different from that in the wild-type allergen;
The at least three wild-type allergen fragments have reduced allergen activity or lack allergen activity, and at least one of the at least three fragments comprises one or more T cell epitopes. An allergen derivative, characterized in that
請求項１５から１８の何れか１項に記載のアレルゲン誘導体をコードするＤＮＡ分子を準備するステップと、
上記ＤＮＡ分子を用いて宿主細胞を形質転換するステップと、
上記宿主細胞内で上記誘導体を発現させ、上記誘導体を単離するステップとを含むことを特徴とする方法。 A method for producing the allergen derivative according to any one of claims 15 to 18, comprising:
Providing a DNA molecule encoding the allergen derivative of any one of claims 15 to 18;
Transforming a host cell with the DNA molecule;
Expressing the derivative in the host cell and isolating the derivative.
上記アレルゲン誘導体は化学合成によって製造されることを特徴とする方法。 A method for producing the allergen derivative according to any one of claims 15 to 18, comprising:
A method wherein the allergen derivative is produced by chemical synthesis.
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