CN112313245A

CN112313245A - 屋尘螨变应反应的治疗和预防

Info

Publication number: CN112313245A
Application number: CN201980039448.5A
Authority: CN
Inventors: R·瓦伦察; M·邱林; K-W·陈; S·威塔拉
Original assignee: Bmx Biotechnology Hangzhou Co ltd
Current assignee: Bmx Biotechnology Hangzhou Co ltd
Priority date: 2018-05-18
Filing date: 2019-05-17
Publication date: 2021-02-02
Also published as: MA52622A; US11771760B2; JP7407176B2; BR112020023466A2; IL278831A; SG11202011123QA; CA3100175A1; AU2019270472A1; WO2019219907A1; MX2020012098A; CU20200085A7; EP3794020A1; JP2021524280A; EP3569612A1; TW202010751A; US20210128718A1; KR20210010931A; ZA202007022B

Abstract

本发明涉及一种融合蛋白，其具有式(I)：X₁‑Y‑X₂，其中X₁和X₂每个包含彼此融合的四至六个变应原片段或其变体，其中所述变应原片段源自尘螨(Dermatophagoides)属的至少两个变应原，并且其中Y是载体蛋白。

Description

屋尘螨变应反应的治疗和预防

技术领域

本发明涉及患有变应反应的患者，特别是屋尘螨变应反应的患者的免疫治疗领域。

背景技术

在工业化国家中，超过25％的人口患有IgE介导的变应反应。变应反应患者的特征在于针对本身无害的抗原(即，变应原)产生增加的IgE抗体。I型变应反应的直接症状(变应反应性鼻结膜炎、哮喘、皮炎、过敏性休克)是由变应原诱导的肥大细胞结合的IgE抗体的交联和生物活性介质(例如，组胺、白三烯)的释放引起的。

WO 2012/168487描述了嗜肝DNA病毒科的病毒(例如，乙型肝炎病毒)的表面多肽作为变应原片段的载体蛋白的用途。

在Banerjee S等人，(J Immunol 192(2014)：4867-4875)中公开了包含与PreS的N-和C-末端融合的两个或四个相同的Der p 23变应原片段的蛋白质。据Banerjee S等人，在PreS的C-末端包含两个相同的Der p 23片段并且在PreS的N-末端包含另外两个相同的Der p 23片段的融合蛋白诱导了Der p 23特异性抗体形成，其与在PreS的两个末端上包含相同的Der p 23片段的融合蛋白相比，具有显著的IgE抑制作用。

Curin M等人，(Allergy 73(2018)：1653-1661)公开了Der p 5和Der p 21的片段，可用于疫苗的进一步开发。

在EP 2727934中测试了缺乏IgE反应性并表现出T细胞反应性的几种Der p变应原的变应原片段。

Huey-Jy H等人，(J Immunol 196(2016)：Suppl 1 192，5)尤其描述了包含Der p1、Der p 2、Der p 7和Der p 8的片段的多肽。

BussièresL等人，(Int Arch Allergy Immunol 153(2010)：141-151)以及EP1908776描述了包含成熟Der p 1和Der p 2的融合蛋白。

WO 2009/118642公开了融合多肽，其包含具有至少50个氨基酸残基的长度的Derp 1和Der p 2的片段。

Chen A等人，(Mol Immunol 45(2008)：2486-2498)，Casset A等人，(Int ArchAllergy Immunol 159(253-262)，WO 2015/070925和Chen K-W等人，(Allergy 67(2012)：609-621)公开了Der p变应原的片段。这些片段中的一些可与载体蛋白结合。

屋尘螨(HDM)是世界范围最重要的变应原来源之一。几乎10％的人口和超过50％的变应反应患者对尘螨变应原敏感。户尘螨(HDM,Dermatophagoides pteronyssinus)(Derp)和粉尘螨(Dermatophagoides farina)(Der f)在世界范围内很普遍。Der p和Der f的变应原包含多于30种蛋白质或糖蛋白，到目前为止其中大多数已得到表征。第1、2和23组变应原(Der p 1、Der p 2和Der p 23以及Der f 1和Der f 2和Der f 23)代表来自HDM非常重要的变应原，80％以上的HDM变应反应患者对其敏感。但是，最近显示，其他HDM变应原(例如，Der p 5、Der p 7和Der p 21以及Der f 5、Der f 7和Der f 21)代表重要的HDM变应原，并在15％至>40％的HDM变应反应患者中引起过敏和变应反应症状(Posa等人，JAllergy Clin Immunol，2017年2月；139(2)：541-549.e8)。在这种情况下，发现基于目前变应原提取物的HDM疫苗无法诱导出针对Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23的足够的保护性IgG抗体，并且使许多HDM变应反应患者得不到治疗(Selection of house dust mite-allergic patients by molecular diagnosis may enhance success of specificimmunotherapy.Chen KW，Zieglmayer P，Zieglmayer R，Lemell P，Horak F，Bunu CP，Valenta R，Vrtala S.J Allergy Clin Immunol，2019年3月；143(3)：1248-1252.e12.doi：10.1016/j.jaci.2018.10.048。Epub 2018年11月14)。因此，发现和开发用于屋尘螨变应反应的变应反应免疫治疗的疫苗是重要任务，其通过诱导针对Der p 1、Der p 2、Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23以及相应的Der f变应原的阻断抗体为HDM变应反应患者提供全面保护。

发明内容

目前批准的用于屋尘螨变应反应的免疫治疗产品是基于HDM身体和粪便颗粒的提取物。这些产品包含浓度不同的Der p 1、Der p 2、Der f 1和Der f 2。它们不包含所有相关的HDM变应原，尤其是Der p 23和Der f 23的浓度非常低。因此，它们针对治疗或预防患有屋尘螨变应反应的患者仅提供不完整的解决方案(Casset等人，Int Arch AllergyImmunol，2013；161(3)：287–288)。例如，与安慰剂相比，ALK Abelló销售的舌下片剂仅能将变应反应的症状平均减少18％(Demoly等人，J.Allergy Clin.Immunol，2016；137：444-451)。由于不同的屋尘螨变应原数量相对较高，潜在的免疫疗法将需要施用许多不同的蛋白质和多肽，以便至少覆盖最重要的屋尘螨变应原。

因此，本发明的一个目的是提供一种疫苗和包含在其中的各个组分，其可以用于治疗和/或预防由所有六种主要变应原引起的屋尘螨变应反应。

该目的通过一种或多种融合蛋白来解决，所述融合蛋白具有式(I)

X₁-Y-X₂ (I)。

其中X₁和X₂每个包含彼此融合的四个至八个变应原片段或其变体，其中所述变应原片段衍生自尘螨属的至少两个变应原，并且其中Y是载体蛋白。

本发明的另一方面涉及包含至少一种如上所述的融合蛋白的药物制剂。

本发明的另一方面涉及本发明的融合蛋白或药物制剂，其用于治疗或预防由屋尘螨的变应原引起的变应反应。

本发明的另一方面涉及编码根据本发明的融合蛋白的核酸分子。

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸分子或载体的宿主细胞。

附图说明

图1显示了构建体Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)的示意图。PreS代表乙型肝炎病毒的表面抗原PreS。“P”表示源自表I所述的屋尘螨变应原Der p 1、Der p 2、Derp 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23的肽。

图2显示了通过SDS-PAGE分析的纯化的PreS融合蛋白。

图3显示了通过免疫印迹确定的Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)的IgE反应性测定的结果。

图4显示了嗜碱性粒细胞激活测定的结果，表明Der p 1-2C3缺乏变应原活性。

图5显示了嗜碱性粒细胞激活测定的结果，表明Der p 5 7 21 23_P6缺乏变应原活性。

图6显示了对Der p 1-2C3具有特异性的抗血清对患者的IgE与Der p 1和Der p 2结合的抑制作用。

图7显示对Der p 5 7 21 23_P6具有特异性的抗血清对患者的IgE与Der p 5、Derp 7、Der p 21和Der p 23结合的抑制作用。

图8A至图8F显示通过ELISA从兔血清中测定的与屋尘螨变应原Der p 1(图8A)、Der p 2(图8B)、Der p 5(图8C)、Der p 7(图8D)、Der p 21(图8E)和Der p 23(图8F)特异性结合的IgG的血清水平，所述兔血清用20μg BM35(“BM35 20”)、40μg BM35(“BM35 40”)、80μg BM35(“BM35 80”)、Tyro-SIT(“Bencard”)、Alutard SQ 503(“ALK D.pter”)、AlutardSQ 510(“ALK Dp/Df”)、ACAROID(“Allergoph”)、PURETHAL Milbenmischung(“HAL”)、CLUSTOID Milben Injektionssuspension(“Roxal”)和nDer p1、rDer p 2、rDer p 5、rDerp 7、rDer p 21和rDer p 23免疫。在第一次注射后的38和66天，回收(retrieve)样本。

图9A至图9F显示通过ELISA从兔血清测定的特异性结合屋尘螨变应原Der p 1(图9A)、Der p 2(图9B)、Der p 5(图9C)、Der p 7(图9D)、Der p 21(图9E)和Der p 23(图9F)的IgG的血清滴度，所述兔血清用20μg BM35(“BM35 20”)、40μg BM35(“BM35 40”)和80μgBM35(“BM35 80”)免疫，第一次注射所述免疫原之前和第一次注射之后38和66天，回收血清。作为对照，在接种了变应原nDer p 1、rDer p 2、rDer p 5、rDer p 7、rDer p 21和rDerp 23的兔子的血清样本中，确定了相应变应原的IgG血清滴度。

具体实施方式

本发明涉及一种或多种融合蛋白，其具有式(I)

X₁-Y-X₂(I)，

其中X₁和X₂每个包含彼此融合的四至八个变应原片段或其变体，其中所述变应原片段衍生自尘螨(Dermatophagoides)属的至少两个变应原，并且其中Y是载体蛋白。

令人惊讶地发现，具有如式(I)所定义“结构”的融合蛋白诱导针对尘螨属的至少两种变应原在体内形成抗体。特别地，在载体蛋白的C-和N-末端存在四至八个变应原片段对于诱导抗体具有有利的作用，所述抗体抑制变应原特异性IgE与其各自的变应原相互作用。此类抗体的形成允许减少或甚至防止变应反应，导致治疗由尘螨属的变应原引起的变应反应。

如本文所用，“融合蛋白”是指通过使两个或更多个多肽和/或肽彼此连接而产生的蛋白质或多肽。融合蛋白可以通过重组DNA技术或通过化学共价缀合来产生。

如本文所用，“变应原片段”是指通过片段化变应原衍生的肽或多肽延伸(stretch)。

彼此融合的4至8个，优选4至6个变应原片段，源自尘螨属的一个或多个屋尘螨的至少2个，优选至少3个，更优选至少4个，特别是1、2、3或4个变应原。这些变应原片段由8至100个，优选8至80个，更优选8至60个，更优选10至60个，更优选10至50个，更优选15至50个，更优选20至50个，更优选25至50个所述变应原的连续氨基酸残基组成。

本发明的融合蛋白可包含多于一个源自相同变应原的片段。在这种情况下，片段可以源自相同变应原的不同(即不相邻)区域或源自邻近区域。在后一种情况下，片段的顺序可能不同于所述片段源自的变应原中的顺序。

本发明的融合蛋白还可以包含一种或多种具有相同或基本上相同的氨基酸序列的变应原片段。如本文所用，“基本上相同”是指源自相同变应原的两个或更多个序列显示出至少80％，优选至少85％，更优选至少90％，更优选至少95％的序列同一性。

可以通过使用某些算法直接比较两个氨基酸序列来确定第一氨基酸序列与第二氨基酸序列的同一性程度。例如，将这样的算法并入各种计算机程序或网站(例如，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中(例如，“BLAST 2SEQUENCES(blastp)”(Tatusova等人，(1999)FEMS Microbiol，Lett.174：247-25；Corpet F，Nucl.Acids Res.(1988)16：10881-10890)，其参数如下：Matrix BLOSUM 62；开放空位(Open gap)11和延伸空位(extension gap)1罚分；空位x_dropoff 50；期望10.0字长3；过滤：无。

本发明的融合蛋白还可包含变应原片段的变体。与变应原片段相比，变应原片段的特别优选的变体包含至少1个，优选至少2个，更优选至3个氨基酸交换。特别优选的是，变应原片段中天然存在的至少1个，优选至少2个，更优选至少3个，特别是所有的半胱氨酸残基被其他氨基酸残基，优选被丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸残基交换。因此，本发明的变应原片段的变体优选不包含任何半胱氨酸残基。

本发明的融合蛋白中的变应原片段可以彼此直接融合，或者可以被单个氨基酸残基、或由2至30个、优选2至20个、更优选2至10个、更优选2至5个氨基酸残基组成的接头肽所分隔开。X₁/X₂和载体蛋白Y也可以被单个氨基酸残基或如上定义的接头肽所分隔开。

本发明的融合蛋白可以在本领域已知的任何表达系统中重组产生。特别优选的表达系统包括细菌(例如，大肠杆菌)、酵母细胞(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris))、或昆虫细胞，例如来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的S2细胞，来自草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)的Sf9或Sf21细胞，或来自粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)的TNi细胞。

本发明的融合蛋白的变应原片段可以来自任何屋尘螨。然而，特别优选使用来自在大多数人中引起变应反应的屋尘螨的变应原。因此，优选变应原片段来源于户尘螨和/或粉尘螨的变应原。

根据本发明的另一个优选的实施方案，至少两种变应原是户尘螨的变应原，并且选自Der p 1、Der p 2、Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23。

根据本发明的另一个优选的实施方案，至少两种变应原是粉尘螨的变应原，并且选自Der f 1、Der f 2、Der f 5、Der f 7、Der f 21和Der f 23。

变应反应者对源自同一来源的变应原的反应不同。患有由户尘螨和/或粉尘螨引起的屋尘螨变应反应的人分别对变应原Der p 1和Der p 2和Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23、以及对变应原Der f 1和Der f 2和Der f 5、Der f 7、Der f 21和Der f 23有反应。因此，特别优选提供包含一种或多种这些变应原的变应原片段的融合蛋白。

根据本发明的另一个优选的实施方案，至少两种变应原的变应原片段由25至50个氨基酸残基，优选28至48个氨基酸残基，更优选30至45个氨基酸残基组成。

根据本发明的一个优选实施方案，变应原片段的半胱氨酸残基中的至少一个，优选至少两个，更优选至少三个，特别是所有的被丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸或亮氨酸取代。

在本发明的融合蛋白中使用的变应原片段的一些或全部半胱氨酸残基可以被其他氨基酸残基取代。一个或多个半胱氨酸残基的取代可以减少在本发明的融合蛋白重组表达过程中或在其加工过程(例如，从包涵体中纯化融合蛋白、制备疫苗制剂)中可能形成的二硫键数目。此外，变应原片段中半胱氨酸残基的取代导致融合蛋白中游离硫基的减少或完全去除，从而防止了能够与其他化合物反应的这些基团。

根据本发明的另一个优选实施方案，Der p 1的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的另一个优选的实施方案，Der p 2的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的一个优选的实施方案，Der p 5的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的另一个优选的实施方案，Der p 7的片段由与氨基酸序列

至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、特别是100％相同的氨基酸序列组成。

根据本发明的另一优选的实施方案，Der p 21的片段由与氨基酸序列

至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成。

根据本发明的一个优选的实施方案，Der p 23的片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的另一优选的实施方案，Der f 1的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的另一优选的实施方案，Der f 2的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％、优选至少92％、更优选至少95％、更优选至少97％、特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的一个优选的实施方案，Der f 5的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

和

根据本发明的一个优选的实施方案，Der f 7的片段由与氨基酸序列

根据本发明的另一优选的实施方案，Der f 21的片段由与氨基酸序列

根据本发明的一个优选的实施方案，Der f 23的片段与选自以下的氨基酸序列至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列组成：

根据本发明的另一个优选的实施方案，X₁包含Der p 1的四个变应原片段和Der p2的两个片段、或Der p 21的三个片段和Der p23的三个片段。

出人意料地是，包含这些以任何顺序与载体蛋白的N-末端融合的变应原片段、或者由其组成的X₁形成抗体，所述抗体能够抑制各个天然存在的变应原与变应原特异性IgE的结合。这允许使用这种融合蛋白作为疫苗来治疗或预防由各种变应原引起的变应反应。

根据本发明的另一个优选实施方案，X₂包含二至四个Der p 1的变应原片段、和两个Der p 2的片段、或四个Der p 5的片段、两个Der p 7的片段。

与载体蛋白的C-末端融合的X₂可以以任何顺序包含上述变应原片段或由其组成。事实证明，在载体蛋白的C-末端上的这种变应原片段导致融合蛋白诱导抗体形成，所述抗体能够抑制各天然存在的变应原与变应原特异性IgE的结合。这允许使用这种融合蛋白作为疫苗来治疗或预防由各种变应原引起的变应反应。

根据本发明的另一个优选的实施方案，所述融合蛋白包含至少一个具有选自以下的氨基酸序列的多肽：SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ IDNo.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和/或SEQ ID No.25。

由氨基酸序列SEQ ID No.18和19组成的多肽包含变应原Der p 1和Der p 2的片段：

SEQ ID No.18：

SEQ ID No.19：

由SEQ ID No.18组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₁。

由SEQ ID No.19组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₂。

由氨基酸序列SEQ ID No.20和21组成的多肽包含变应原Der p 5、Der p 7、Der p21和Der p 23的片段：

SEQ ID No.20：

SEQ ID No.21：

由SEQ ID No.20组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₁。

由SEQ ID No.21组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₂。

由氨基酸序列SEQ ID No.22和23组成的多肽包含变应原Der f 1和Der f 2的片段：

SEQ ID No.22：

SEQ ID No.23：

由SEQ ID No.22组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₁。

由SEQ ID No.23组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₂。

由氨基酸序列SEQ ID No.24和25组成的多肽包含变应原Der p 5、Der p 7、Der p21和Der p 23的片段：

SEQ ID No.24：

SEQ ID No.25：

由SEQ ID No.24组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₁。

由SEQ ID No.25组成的多肽可以是式(I)中的X₁或X₂，因此在本发明的最优选的实施方案中，所述多肽是式(I)中的X₂。

根据本发明的另一个优选的实施方案，载体蛋白是嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽或该表面多肽的片段。

根据本发明的优选实施方案，嗜肝DNA病毒科的病毒是乙型肝炎病毒。

根据本发明的另一个优选的实施方案，嗜肝DNA病毒科病毒的表面多肽是PreS。

根据本发明的另一个优选实施方案，表面多肽的片段是乙型肝炎PreS1或乙型肝炎PreS2。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述载体蛋白包含与SEQ ID No.26至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同的氨基酸序列。

用于本发明的载体蛋白可以包含氨基酸序列SEQ ID No.26(GenBank登录号AAT28678.1)或由其组成：

根据本发明的另一个优选的实施方案，融合蛋白包含氨基酸序列或由其组成，所述氨基酸序列与SEQ ID No.27、SEQ ID No.28、SEQ ID No.29、SEQ ID No.30、SEQ IDNo.31、SEQ ID No.32或SEQ ID No.33至少90％，优选至少92％，更优选至少95％，更优选至少97％，特别是100％相同。

本发明的融合蛋白可包含作为载体蛋白Y的PreS和形成分别与载体蛋白相邻的两个多肽X₁和X₂的各种变应原的片段(参见式(I))。特别优选的融合蛋白包含变应原Der p 1、Der p 2、Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23的片段。这样的融合蛋白可以包含以下的氨基酸序列，或由其组成：

SEQ ID No.27(“Der p 1-2C3”)

SEQ ID No.28(“Der p 572123_P6(大)”)

SEQ ID No.29(“Der p 1-2C1”)

SEQ ID No.30(“Der p 1-2C2”)

SEQ ID No.31(“Der p 5.7.21.23_P4P5”)

SEQ ID No.32(“Der p 5_7_21 C1”)

SEQ ID No.33(“Der p 5_7_21 C2”)

SEQ ID No.36(“Der f 1/2C3”)

SEQ ID No.37(“Der f 5 7 21 23_P6”)

本发明的另一方面涉及包含至少一种根据本发明的融合蛋白的药物制剂(即疫苗制剂)。

根据本发明的一个优选的实施方案，所述制剂包含含有氨基酸序列SEQ ID No.27的融合蛋白和含有氨基酸序列SEQ ID No.28的融合蛋白。

根据本发明的另一个优选的实施方案，所述制剂包含10ng至1g，优选100ng至10mg，尤其是0.5μg至200μg的本发明的融合蛋白，或编码所述融合蛋白的核酸分子，或包含所述核酸分子的载体。

根据本发明的特别优选的实施方案，本发明的融合蛋白以0.01pg/kg体重至5mg/kg体重的量，优选0.1pg/kg体重至2mg/kg体重的量，至少一次施用给个体。

根据本发明的另一个优选实施方案，将融合蛋白以5至100μg，优选10至80μg，更优选10至40μg的量施用于患者，所述量或者不依赖于体重(即，剂量可以包含15、20、25、30、或80μg)或者为每千克体重。

可与赋形剂结合以产生单一剂型的融合蛋白量将根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。多肽构建体的剂量可以根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及在个体中引起期望的抗体应答的能力等因素而变化。可以调整剂量方案以提供最佳治疗反应。例如，如治疗状况的紧急情况所示，可以每天施用数个分开的剂量或可以成比例地减少剂量。取决于情况，多肽构建体的剂量也可以变化以提供最佳的预防剂量反应。例如，本发明的融合蛋白可以以几天、一或两周或甚至几个月的间隔施用给个体，这取决于变应原特异性IgG诱导的水平。

在本发明的一个优选的实施方案中，本发明的融合蛋白和药物制剂施用2至10次，优选2至7次，甚至更优选多达5次。在本发明的另一个优选实施方案中，在第一次给药方案后的3个月至5年之间给予单次加强施用。可以重复进行这些加强施用2至10次，优选2至5次，最优选2至3次。在一个特别优选的实施方案中，随后的疫苗接种之间的时间间隔选择为2周至5年，优选3周至长达3年，更优选3周至1年。重复施用本发明的融合蛋白可以使治疗的最终效果最大化。

在本发明的一个特别优选的实施方案中，本发明的融合蛋白和/或药物制剂可以如下应用：每月注射3至6次，优选每月注射5次，之后每1至6个月，优选3至4个月给予如上所述的加强注射，持续至少一年，优选至少两年，更优选2至6年，更优选3至5年。

根据本发明的另一个优选实施方案，所述制剂还包含至少一种佐剂，药学上可接受的赋形剂和/或防腐剂。

本发明的融合蛋白和药物制剂可以皮下、肌内、静脉内、粘膜等方式施用。根据剂型和施用途径，本发明的多肽构建体可以与赋形剂、稀释剂、佐剂和/或载体组合使用。优选的佐剂是氢氧化铝。用于生产疫苗制剂的合适方案对于本领域技术人员是已知的，并且可以见于，例如“Vaccine Protocols”(A.Robinson，M.P.Cranage，M.Hudson；Humana出版社，美国；第2版，2003年)。

本发明的融合蛋白也可以与疫苗中常用的其他佐剂一起配制。例如，合适的佐剂可以是MF59、磷酸铝、磷酸钙、细胞因子(例如，IL2、IL-12、GM-CSF)、皂苷(例如，QS21)、MDP衍生物、CpG寡核苷酸、LPS、MPL、聚磷腈、乳液(例如，弗氏，SAF)、脂质体、病毒体、免疫刺激复合物、cochleates、PLG微粒、泊洛沙姆颗粒、病毒样颗粒、不耐热肠毒素(LT)、霍乱毒素(CT)、突变毒素(例如，LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合脂质体。合适的佐剂是商业上可获得的，例如，ASO1B(脂质体制剂中的MPL和QS21)、ASO2A、AS15、AS-2、AS-03及其衍生物(GlaxoSmithKline、美国)；CWS(细胞壁骨架)、TDM(海藻糖-6,6'-二霉菌酸酯)、LeIF(利什曼原虫(Leishmania)延伸起始因子)、铝盐，如氢氧化铝凝胶(alum)或磷酸铝；钙、铁或锌的盐；酰化酪氨酸的不溶性悬浮液；酰化糖；阳离子或阴离子衍生多糖；聚磷腈；可生物降解的微球；单磷酰脂质A和quil A.细胞因子，例如GM-CSF或白介素-2、-7或-12也可用作佐剂。用于引起主要Th1型应答的优选的佐剂包括，例如，单磷酰基脂质A(优选3-0-去酰基化的单磷酰基脂质A(3D-MPL))与任选地铝盐的组合。包含单磷酰基脂质A和表面活性剂的水性制剂已在WO 98/43670中描述。

另一种优选的佐剂是皂苷或皂苷模拟物或衍生物，优选QS21(AquilaBiopharmaceuticals Inc.)，其可以单独使用或与其他佐剂组合使用。例如，增强的系统涉及单磷酰基脂质A和皂苷衍生物的组合，例如，QS21和3D-MPL的组合。其他优选的制剂包括水包油乳液和生育酚。一种特别有效的佐剂制剂是水包油乳液中的QS21、3D-MPL和生育酚。用于本发明的其它皂苷佐剂包括QS7(在WO 96/33739和WO 96/11711中描述)和QS17(在US5,057,540和EP 0362279B1中描述)。

本发明的药物制剂最优选包含氢氧化铝作为佐剂。

本发明的另一方面涉及编码根据本发明的融合蛋白的核酸分子。本发明的核酸分子可以是RNA或DNA分子。所述核酸分子可以是可以被转染或引入任何种类的生物细胞中的载体(例如，蛋白表达载体、整合载体、克隆载体)的一部分。优选的细胞包括细菌细胞，如大肠杆菌、酵母细胞，如巴斯德毕赤酵母或酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、植物细胞、哺乳动物细胞和昆虫细胞。获得此类核酸分子、载体和细胞的手段和方法是本领域技术人员众所周知的。

编码根据本发明的融合蛋白的核酸分子也可以直接用于需要其的受试者的疫苗接种。这些核酸分子可以是RNA和/或DNA分子。

本发明的另一方面涉及包含根据本发明的核酸分子的载体。

根据本发明的优选实施方案，所述载体是表达或克隆载体。载体可以是细菌、真菌、昆虫、病毒或哺乳动物载体。

本发明的载体可优选用于在各种宿主中克隆和表达目的，所述宿主如细菌、酵母、丝状真菌、哺乳动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或任何其他原核或真核细胞。因此，所述载体除包含编码根据本发明的融合蛋白的核酸外还包含宿主特异性调控序列。

本发明的另一方面涉及根据本发明的融合蛋白或根据本发明的药物制剂，其用于治疗或预防由屋尘螨的变应原，特别是由Der p 1、Der p 2、Der p 5、Der p 7、Der p 21或Der p 23引起的变应反应。

如本文所用，术语“预防”和“防止”是指由于施用根据本发明的融合蛋白或药物制剂，而预防或抑制受试者中变应反应或其症状的复发、发作和发展。在一些实施方案中，“预防”或“防止”指降低针对特定变应原产生变应反应的风险。术语“预防”涵盖的措施不仅可以防止变应反应的发生，而且还可以阻止其进展并在其确立后减少其后果。

如本文所用，术语“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”是指减轻或抑制变应反应的进程和持续时间，减轻或改善变应反应的严重程度以及减轻其一种或多种症状。“治疗”还包括改善和/或逆转变应反应或变应反应的症状。引起与变应反应相关的任何参数改善的融合蛋白，可以被鉴定为治疗性融合蛋白或缀合物。术语“治疗”既指治疗性的治疗又指预防措施。例如，可以从用本发明的组合物和方法治疗中受益的那些对象包括已经具有变应反应的那些、以及待预防变应反应的那些。

通过以下实施例进一步说明本发明，但是不限于此。

实施例

实施例1：设计用于本发明融合蛋白的变应原片段

根据从ExPASY服务器(http://web.expasy.org/protscale/)的ProtScale生物信息学工具确定的氨基酸表面暴露预测，确定跨越目标变应原序列的肽。如果肽在其序列中不包含半胱氨酸残基，则在其N-或C-末端添加半胱氨酸，以使它们与匙孔戚血蓝蛋白(keyhole limpet hemocyanin)(KLH)偶联。使用Applied Biosystems433A型肽合成仪(美国，Foster City)合成肽，然后通过制备型高效液相色谱(HPLC)(Dionex，ThermofischerScientific，美国)纯化(Focke等人，FASEB J.2001；15(11)：2042-4)。肽的尺寸和同一性通过质谱法确认(Bruker，奥地利)。

表I列出源自屋尘螨变应原Der p 1的变应原片段

SEQ ID NO.35)、Der p 5(GenBank登录号:X17699)、Der p 7(GenBank登录号:U37044)、Der p 21(GenBank登录号:DQ354124)和Der p 23(GenBank登录号EU414751.1)，对这些变应原片段进行了有关IgE反应性、嗜碱性粒细胞激活、免疫原性和变应原特异性IgE分子阻断的测试。

表I：变应原片段

通过斑点印迹分析确定肽的IgE反应性。为此，将0.5μg相应变应原的每种肽的等分试样和作为对照的人血清白蛋白(HSA)点在Whatman Protran硝酸纤维素膜(GEHealthcare，Little Chalfont，UK)上。用金缓冲液(50mM磷酸钠[pH 7.4]，0.5％[v/v]Tween-20、0.5％[w/v]BSA和0.05％[w/v]叠氮化钠)封闭3次，20分钟后，将膜与HDM变应反应患者的血清(1:10，在金缓冲液中)、或非变应反应者的血清(1:10，在金缓冲液中)在4℃下孵育过夜。用1:10稀释的I125标记的抗人IgE Ab(Demeditec Diagnostics、Kiel,德国)检测结合的IgE抗体，并通过放射自显影(Kodak XOMAT胶片)进行可视化。

为了确定这些肽的免疫原性，分别用每种KLH-缀合肽(200μg/注射)、和作为对照目的的各变应原(200μg/注射)免疫兔子3次(4周后第一次加强注射，7周后第二次加强注射)，使用一次弗氏完全佐剂和两次弗氏不完全佐剂(Charles River、Chatillon surChalaronnne,法国)和/或Al(OH)₃(Serva)对。通过ELISA滴定分析兔的免疫应答。为了测量特异性兔IgG抗体，将ELISA板用相应的变应原包被过夜。封闭后，将板与相应的兔抗血清、或未免疫的兔的血清的系列稀释液(1：500、1：2.000、1：10.000和1：20.000)孵育过夜。用1：1.000稀释的辣根过氧化物酶标记的驴抗兔IgG抗血清(Amersham Biosciences，LittleChalfont，英国)检测结合的兔IgG抗体。

为了确定肽IgG的阻断能力，将用1μg/mL相应变应原包被过夜的ELISA板(Nunc，Roskilde，丹麦)与每种抗肽抗血清、抗变应原抗血清、或用于对照目的的未免疫兔的血清(均以1:50的稀释度稀释)分别孵育24小时，然后洗涤。与HDM变应反应患者的血清(以1:10稀释)过夜孵育后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgE抗体(KPL,Gaithersburg,MD)检测结合的IgE抗体。通过与兔抗血清预孵育来实现的IgE结合减少的百分比计算如下：100-(ODI/ODP)×100)。ODI和ODP分别代表与兔免疫血清或正常兔血清预孵育之后的光密度值。

为了测试这些肽的变应原活性，向表达人高亲和力IgE受体FcεRI的大鼠嗜碱性粒细胞(RBL)(1×10⁵/孔)加载1：10稀释的HDM变应反应患者的血清，过夜，一位非变应反应个体的血清作为对照。将细胞用Tyrode缓冲液(Sigma，奥地利)洗涤3次，然后将其暴露于变应原和肽的系列稀释液中1小时。如前所述，分析上清液的β-氨基己糖苷酶活性。一式三份地进行实验，结果表示为添加1％Triton X-100后释放的总β-氨基己糖苷酶的平均百分比+/-平均值的SE(SEM)。

表II

nd：未进行；粗体和下划线字母：半胱氨酸残基被丝氨酸或丙氨酸残基取代；+表示IgE反应性；-表示没有IgE反应性或没有嗜碱性粒细胞激活。

实施例2：蛋白的重组生产

合成编码融合蛋白Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)的基因(针对大肠杆菌表达进行密码子优化)(ATG:生物合成，Merzhausen,德国和GenScript,Piscataway，美国)，并将其插入pET-27b的NdeI/XhoI位点(Novagen,德国)。重组蛋白在大肠杆菌菌株BL21-Gold(DE3)中表达。通过向细菌培养物中加入0.5mM IPTG并在37℃孵育3小时，诱导OD600 0.4的Der p 1-2C3(见图1；SEQ ID No.27)表达。通过添加1mM IPTG，并将培养物在37℃下孵育2.5h，诱导OD600 0.6的Der p 5 7 21 23_P6(大)(见图1；SEQ ID No.28)。

收获并添加蛋白酶抑制剂后，进行包涵体制备以去除可溶性细菌蛋白。将包含部分纯化的Der p 1-2C3蛋白的沉淀溶解在6M尿素、10mM Tris PH 8、4％和异丙醇中，并使用HiTrap DEAE Sepharose FF(GE Healthcare)柱通过阴离子交换色谱法继续纯化。通过线性增加NaCl浓度从色谱柱上洗脱蛋白质。合并高纯度的洗脱级分，然后进行逐步透析以除去尿素和盐，并使蛋白质重新折叠而不会聚集。随后在以下溶液中于4℃将Der p 1-2C3蛋白孵育至少4-5h：1)6M尿素、154mM NaCl、10mM Tris PH 8、4％异丙醇，2)4M尿素、103mMNaCl、2mM Hepes、PH 8，3)2M尿素、50.2mM NaCl、2mM Hepes、PH 8，4)1M尿素、25mM NaCl、2mM Hepes、PH 8，5)0.5M尿素、12.5mM NaCl、2mM Hepes、PH 8，6)2mM Hepes、PH 8。

将含有Der p 5 7 21 23_P6(大)的细胞裂解物溶解在6M尿素、10mM Tris PH7.5、4％异丙醇中，施加至HiTrap DEAE Sepharose FF(GE Healthcare)柱，并通过线性增加NaCl浓度实现从柱上洗脱蛋白质。合并纯的级分并如下透析。逐步透析条件Der p 5 721 23_P6(大)：随后在以下溶液中于4℃孵育蛋白质至少4-5h：1)6M尿素，100mM NaCl，10mMTris PH 7.5、4％异丙醇，2)4M尿素、100mM NaCl、2mM Hepes、PH 7.5，3)2M尿素、100mMNaCl、2mM Hepes、PH 7.5，4)1M尿素、100mM NaCl、2mM Hepes、PH 7.5，5)0.5M尿素、100mMNaCl、2mM Hepes、PH 7.5，6)100mM NaCl、2mM Hepes、PH 7.5，7)50mM NaCl、2mM Hepes、PH7.5，8)25mM NaCl、2mM Hepes、PH 7.5，9)12.5mM NaCl、2mM Hepes、PH 7.5，10)2mM Hepes、PH 7.5。

通过SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检查蛋白质的纯度(见图2)。使用尺寸排阻色谱法确认没有发生重新折叠蛋白质的寡聚。

实施例3：IgE反应性测定

通过免疫印迹确定实施例2的构建体的IgE反应性(Curin M，等人，Sci Rep.22(2017):12135)。含有0.5μg纯化的nDer p 1(天然分离物；登录号：PDB：3RVW_A；参考方法：Hales，B.J.等人，Clin Exp Allergy.30(2000)：934–943)，rDer p 2(重组产生的Der p 2；序列发表于Chen KW等人，Allergy.67(2012)：609-21；参考方法：Chen，K，等人，MolImmunol.45(2008)：2486–2498.)，rDer p 5(GeneBank：X17699；参考方法：Weghofer M等人，Int Arch Allergy Immunol.147(2008):101-9.)，rDer p 7(GeneBank:U37044；参考方法：Resch Y等人，Clin Exp Allergy.41(2011)：1468-77)，rDer p 21(GeneBank：DQ354124；参考方法：Weghofer M等人，Allergy.63(2008)：758-67)，rDer p 23(GeneBank：EU414751.1；参考方法：Weghofer M等人，J Immunol.190(2013)：3059-67)，Der p 1-2C3(参见实施例2)，Der p 5 7 21 23_P6(大)(参见实施例2)的等分试样和用于对照目的的BSA点在硝酸纤维素膜上(Schleicher&Schuell；德国)。用金缓冲液(50mM磷酸钠[pH 7.4]、0.5％[v/v]Tween-20、0.5％[w/v]BSA、和0.05％[w/v]叠氮化钠)封闭膜三次，二十分钟，然后在4℃下与屋尘螨-变应反应患者的血清(在金缓冲液中以1:10稀释)和非变应反应的人的血清(在金缓冲液中以1:10稀释)孵育过夜。如前所述(Curin等人，Sci Rep.22(2017):12135)，通过1：10稀释的125I标记的抗人IgE Ab(Demeditec Diagnostics,Kiel,Germany)检测结合的IgE，通过放射自显影(Kodak XOMAT膜)可视化。

通过斑点印迹测定法比较了20名HDM敏感患者中Der p 1-2C3的IgE反应性与Derp 1和Der p 2的IgE反应性(图3A)。虽然变应反应患者对Der p 1和Der p 2有反应，但没有患者表现出与Der p 1-2C3相关的IgE反应性。用非变应反应受试者(NA)的血清未观察到反应性，并且对照蛋白BSA也未显示IgE反应性(图3A)。在接下来的实验中，将Der p 5 7 2123_P6(大)的IgE反应性与对Der p 5、Der p 7、Der p21和Der p 23的IgE反应性进行了比较。18位HDM敏感的患者对Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23的反应依患者而定，但是接受测试的患者均未对Der p 5 7 21 23_P6(大)或对照蛋白BSA产生反应(图3B)。

实施例4：IgE竞争性测定

关于肽诱导阻断抗体的能力的信息很重要，因为已显示阻断抗体在变应反应的免疫治疗中起主要作用。

为了研究通过向哺乳动物施用Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)诱导的免疫球蛋白(特别是IgG)抑制屋尘螨变应反应患者的IgE与屋尘螨变应原结合的能力，进行ELISA竞争实验。

进行IgE ELISA竞争性测定，以分析通过抗-Der p 1-2C3和抗-Der p 5 7 21 23_P6(大)-特异性兔IgG对人IgE结合nDer p 1、rDer p 2、rDer p 5、rDer p 7、rDer p 21、rDer p 23的抑制作用。简而言之，用1μg/mL各个变应原包被过夜的ELISA板(Nunc，丹麦)与抗Der p 1-2C3抗血清、抗Der p 5 7 21 23_P6(大)、用于比较的各个抗变应原抗血清(抗-nDer p 1、抗-rDer p 2、抗-rDer p 5、抗-rDer p 7、抗-rDer p 21或抗-rDer p 23抗血清)、或用于对照目的的来自未免疫兔的血清(全部以1：3稀释)预孵育24小时，然后洗涤。与HDM变应反应患者的血清(以1:10稀释)孵育过夜后，用辣根过氧化物酶标记的山羊抗人IgE抗体(KPL，Gaithersburg,MD)检测结合的IgE抗体。通过与兔抗血清预孵育来实现的IgE结合减少的百分比计算如下：100–(ODI/ODP)×100)(见图6和图7)。ODI和ODP分别代表与兔免疫血清或正常兔血清预孵育后的光密度值(参见Curin M等人，Sci Rep.22(2017):12135)。

如下获得该实施例中使用的抗-Der p 1-2C3和抗-Der p 5 7 21 23_P6(大)-特异性兔IgG。用Der p 1-2C3或Der p 5 7 21 23_P6(大)对兔子(Charles River，法国)进行3次免疫(4周后第一次加强注射，7周后第二次加强注射)(200μg/注射)。Al(OH)₃(Serva)用作佐剂。每种蛋白免疫2只兔子。通过ELISA滴定分析兔的免疫应答。

用抗Der p 1-2C3抗体实现的患者IgE与nDer p 1结合的抑制作用稍低(平均抑制分别为53％和58％)，但接近抗nDer p 1的抑制作用(平均抑制为78％)。用兔抗-Der p 1-2C3抗体实现的对IgE结合rDer p 2的抑制作用(平均值为89％和85％)，与使用兔抗Der p2的抑制作用(平均值为84％)相当(图6)。用抗-Der p 5 7 21 23_P6(大)实现的对患者IgE结合Der p 5的抑制作用(平均抑制为76％和85％)，与使用抗-Der p 5的抑制作用(平均抑制88％)相当，而Der p 5 7 21 23_P6(大)对Der p 21的抑制(平均抑制58％和58％)要比抗Der p 21对Der p 21的抑制(平均抑制87％)低一些。与抗Der p 7(58％)和抗Der p 23(7％)相比，Der p 5 7 21 23_P6(大)对Der p 7和Der p 23的抑制作用较高(对Der p 7两个兔子均为74％，对于Der p 23分别为47％和42％)(图7)。

实施例5：通过嗜碱性粒细胞激活测定确定变应原活性

为了测试本发明构建体的变应原活性，特别是Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)的变应原活性，向表达人高亲和力IgE受体FcεRI的大鼠嗜碱性粒细胞白血病细胞(RBL)(1x 10⁵/孔)加载以1：10稀释的来自屋尘螨变应反应患者的血清，过夜。将细胞用Tyrode缓冲液(Sigma，澳大利亚)洗涤3次，并暴露于变应原的系列稀释液中(分别为100ng/mL、10ng/mL和1ng/mL的nDer p 1、rDer p 2、rDer p 5、rDer p 7、rDer p 21、rDer p 23、Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大))持续1小时。没有变应原的血清或没有血清的变应原被用作阴性对照。如先前所述(Hartl等人，Allergy 59(2004)：65-73)，分析上清液的β-氨基己糖苷酶活性。实验一式三份进行，结果表示为添加1％Triton X-100后释放的总β-氨基己糖苷酶的平均百分比+/-平均值的SE(SEM)(参见图4和图5)。

发现Der p 1和Der p 2诱导了加载来自HDM变应反应患者的血清IgE的嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶，而Der p 1-2C3没有激活嗜碱性粒细胞(图4)。下一组实验表明，Der p 5、Der p 7、Der p 21和Der p 23以患者依赖的方式诱导了加载血清IgE的嗜碱性粒细胞释放β-氨基己糖苷酶，而Der p 5 7 21 23_P6(大)针对相同患者血清没有诱导嗜碱性粒细胞释放(图5)。这些数据表明，构建体Der p 1-2C3和Der p 5 7 21 23_P6(大)没有表现出变应原活性。

实施例6：与市售HDM疫苗相比，BM35诱导形成变应原特异性IgG

分别用各种剂量的BM35(一种制剂，其包含重量比为1：1的包含氨基酸序列SEQ IDNo.27和28的融合蛋白)和根据制造商说明的市售制剂(参阅表III)皮下免疫两只新西兰白兔的组的每只兔子。对照兔用变应原nDer p1、rDer p 2、rDer p 5、rDer p 7、rDer p 21和rDer p 23进行免疫。

表III

在第一次免疫当天、以及第一次免疫之后的第38和66天，从兔采取血清样本，以监测特异性结合屋尘螨变应原nDer p 1、rDer p 2、rDer p 5、rDer p 7、rDer p 21和rDer p23的IgG的形成，以测定屋尘螨变应原特异性抗体反应。通过稀释血清1：500和使用ELISA测量变应原特异性兔IgG反应。用1：2000稀释的驴抗兔辣根过氧化物酶偶联的IgG抗体(NA934；GE Healthcare UK Limited,Chalfont St Giles，英国)检测结合的兔IgG。用2,2′-联氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)进行显色。用野生型屋尘螨变应原免疫后获得的血清用作阳性对照。

结果显示在图8和图9中，其清楚地表明，与市售产品相比，BM35能够诱导更高滴度的变应原特异性IgG形成。特别出人意料地是，BM35诱导了针对所有6种屋尘螨变应原的抗体形成，然而市售产品产生的变应原特异性IgG的滴度要低得多，并且仅针对单一变应原。因此，与BM35相比，所有市售产品均显示出较弱地诱导特异性结合数量非常有限的变应原的IgG。

序列表

<110> 百明信康生物技术（杭州）有限公司

<120> 屋尘螨变应反应的治疗和预防

<130> 25108-WO

<150> EP 18173258.7

<151> 2018-05-18

<160> 81

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 1

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

20 25 30

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 2

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 2

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 3

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 3

His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 4

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 4

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu

35

<210> 5

<211> 41

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 5

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 6

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 6

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 7

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 7

His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 8

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 8

Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln

1 5 10 15

Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 9

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 9

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 10

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 10

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

1 5 10 15

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 11

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 11

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 12

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 12

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln

20 25

<210> 13

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 13

Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu

1 5 10 15

Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

20 25 30

<210> 14

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 14

Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val

1 5 10 15

Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp

20 25 30

<210> 15

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 15

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr

<210> 16

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 16

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

35

<210> 17

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 17

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

35

<210> 18

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 18

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

100 105 110

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala

130 135 140

Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

180 185 190

<210> 19

<211> 250

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 19

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys

1 5 10 15

Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly

35 40 45

Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly

50 55 60

Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro

65 70 75 80

Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln

85 90 95

Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His

100 105 110

Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr

115 120 125

Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg

130 135 140

Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser

145 150 155 160

Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala

165 170 175

Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser

180 185 190

Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu

195 200 205

Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu

210 215 220

Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

245 250

<210> 20

<211> 216

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 20

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro

130 135 140

Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His

145 150 155 160

Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser

180 185 190

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp

195 200 205

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

210 215

<210> 21

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 21

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Tyr Gln

20 25 30

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys

35 40 45

Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp

50 55 60

Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala

65 70 75 80

Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile

85 90 95

Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu

100 105 110

Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys

115 120 125

Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val

130 135 140

Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

145 150 155 160

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys

165 170 175

Lys Ile Glu Val

180

<210> 22

<211> 192

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 22

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln

130 135 140

Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

180 185 190

<210> 23

<211> 254

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 23

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly

35 40 45

Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys Cys Pro Leu Val Lys Gly

50 55 60

Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro

65 70 75 80

Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr

85 90 95

Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His

100 105 110

Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr

115 120 125

Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu

130 135 140

Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

145 150 155 160

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu

165 170 175

Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp

180 185 190

Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile

195 200 205

Glu Tyr Ile Gln Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro

210 215 220

Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met

225 230 235 240

Gln Gly Gly Cys Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

245 250

<210> 24

<211> 210

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 24

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu

35 40 45

Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Phe

85 90 95

Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu

100 105 110

Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu

115 120 125

Leu Thr Cys Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe

130 135 140

Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn

145 150 155 160

Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr Cys Thr Gly Tyr Phe Ala Asp

165 170 175

Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Ile

180 185 190

His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr

195 200 205

Cys Thr

210

<210> 25

<211> 180

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 25

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Tyr Gln

20 25 30

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln Met Arg

35 40 45

Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp

50 55 60

Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala

65 70 75 80

Ile Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile

85 90 95

Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu

100 105 110

Gln Ser Glu Thr Ile Asp Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys

115 120 125

Ser Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val

130 135 140

Lys Lys Ile Glu Val Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser

145 150 155 160

Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys

165 170 175

Lys Ile Glu Val

180

<210> 26

<211> 173

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> PreS 载体蛋白

<400> 26

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

1 5 10 15

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

20 25 30

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

35 40 45

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

50 55 60

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

65 70 75 80

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

85 90 95

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

100 105 110

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

115 120 125

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

130 135 140

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

145 150 155 160

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn

165 170

<210> 27

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 27

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Gln Leu

100 105 110

Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala

130 135 140

Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser

485 490 495

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg

500 505 510

Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala

515 520 525

Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 28

<211> 569

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 28

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro

130 135 140

Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His

145 150 155 160

Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser

165 170 175

Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser

180 185 190

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp

195 200 205

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg

210 215 220

Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe

225 230 235 240

Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro

245 250 255

Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln

260 265 270

Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly

275 280 285

Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser

290 295 300

Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro

305 310 315 320

Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln

325 330 335

Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg

340 345 350

Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro

355 360 365

Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly

370 375 380

Asp Pro Val Thr Asn Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

385 390 395 400

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr

405 410 415

Leu Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile

420 425 430

His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp

435 440 445

Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp

450 455 460

Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile

465 470 475 480

His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala

485 490 495

Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu

500 505 510

Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys

515 520 525

Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu

530 535 540

Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu

545 550 555 560

Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

565

<210> 29

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 29

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro

85 90 95

Tyr Val Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg

100 105 110

Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe

115 120 125

Gly Ile Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys

130 135 140

Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr

145 150 155 160

Ala Lys His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

165 170 175

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser

485 490 495

Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg

500 505 510

Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala

515 520 525

Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 30

<211> 615

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 30

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile

50 55 60

Ser Asn Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr

65 70 75 80

Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro

85 90 95

Tyr Val Val Ile Leu His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg

100 105 110

Tyr Val Ala Arg Glu Gln Ser Ser Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe

115 120 125

Gly Ile Ser Asn His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys

130 135 140

Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr

145 150 155 160

Ala Lys His Gly Ser Glu Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

165 170 175

Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Ala Thr Glu

355 360 365

Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln

370 375 380

Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile

385 390 395 400

Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly

405 410 415

Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro

420 425 430

Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly Val

435 440 445

Ala Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met

450 455 460

Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp

465 470 475 480

Ile Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro

485 490 495

Gly Ile Asp Pro Asn Ala Ser His Tyr Met Lys Ser Pro Leu Val Lys

500 505 510

Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys Ile Ala

515 520 525

Pro Lys Ser Glu Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn

530 535 540

Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln

545 550 555 560

His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

565 570 575

Thr Asn Ala Ser Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

580 585 590

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly

595 600 605

Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 31

<211> 568

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 31

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr

100 105 110

Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr

115 120 125

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

130 135 140

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Gly Gly Trp

145 150 155 160

Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro Asn

165 170 175

Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly Ala

180 185 190

Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His Trp

195 200 205

Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu Thr

210 215 220

Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly Ile

225 230 235 240

Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg Gln

245 250 255

Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser His

260 265 270

Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu Gln

275 280 285

Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser Ser

290 295 300

Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser Ile

305 310 315 320

Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

325 330 335

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

340 345 350

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu

355 360 365

Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu

370 375 380

Glu Thr Cys Thr Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu

385 390 395 400

Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu

405 410 415

Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His

420 425 430

Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro

435 440 445

Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu

450 455 460

Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His

465 470 475 480

Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val

485 490 495

Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu

500 505 510

Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu

515 520 525

Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met

530 535 540

Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu

545 550 555 560

Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

565

<210> 32

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 32

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu

100 105 110

Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro

115 120 125

Asp Glu Tyr Tyr Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile

130 135 140

Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr

145 150 155 160

Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys

165 170 175

Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp Tyr Gln

355 360 365

Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys

370 375 380

Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe

385 390 395 400

Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu

405 410 415

Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

420 425 430

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys

435 440 445

Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu

450 455 460

Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu

465 470 475 480

Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp

485 490 495

Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile

500 505 510

Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile

515 520 525

Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu

530 535 540

Val

545

<210> 33

<211> 545

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 33

Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys Lys

1 5 10 15

Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu Tyr

20 25 30

Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile Lys

35 40 45

Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp Glu

50 55 60

Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu Ile

65 70 75 80

Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro Asp

85 90 95

Glu Tyr Tyr Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu Glu Ser Ile Lys Leu Leu

100 105 110

Ile Lys Lys Leu Asp Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Asn Pro

115 120 125

Asp Glu Tyr Tyr Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu

130 135 140

Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu

145 150 155 160

Gln Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Glu Arg Ile His

165 170 175

Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Gly Gly

180 185 190

Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser Val Pro

195 200 205

Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala Phe Gly

210 215 220

Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys Asp His

225 230 235 240

Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro Gly Leu

245 250 255

Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala Gln Gly

260 265 270

Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr Asn Arg

275 280 285

Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg Asp Ser

290 295 300

His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln Ala Leu

305 310 315 320

Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile Ser Ser

340 345 350

Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp Pro Ile His Tyr

355 360 365

Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala

370 375 380

Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys

385 390 395 400

Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile

405 410 415

Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

420 425 430

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys

435 440 445

Ser Glu Thr Phe Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu

450 455 460

Ile Asn Lys Ala Val Asp Glu Ala Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu

465 470 475 480

Thr Phe Asp Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp

485 490 495

Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile

500 505 510

Glu Val Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly Asp Ile

515 520 525

Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys Lys Ile Glu

530 535 540

Val

545

<210> 34

<211> 222

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 34

Thr Asn Ala Cys Ser Ile Asn Gly Asn Ala Pro Ala Glu Ile Asp Leu

1 5 10 15

Arg Gln Met Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys Gly

20 25 30

Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu

35 40 45

Ala Tyr Arg Asn Gln Ser Leu Asp Leu Ala Glu Gln Glu Leu Val Asp

50 55 60

Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile

65 70 75 80

Glu Tyr Ile Gln His Asn Gly Val Val Gln Glu Ser Tyr Tyr Arg Tyr

85 90 95

Val Ala Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly

100 105 110

Ile Ser Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg

115 120 125

Glu Ala Leu Ala Gln Thr His Ser Ala Ile Ala Val Ile Ile Gly Ile

130 135 140

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln

145 150 155 160

Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val Gly

165 170 175

Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn Ser Trp

180 185 190

Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala Asn Ile

195 200 205

Asp Leu Met Met Ile Glu Glu Tyr Pro Tyr Val Val Ile Leu

210 215 220

<210> 35

<211> 131

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 35

Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val

1 5 10 15

Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly

20 25 30

Lys Pro Phe Gln Leu Glu Ala Val Phe Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys

35 40 45

Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser Ile Glu Gly Leu Glu Val Asp

50 55 60

Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys His Tyr Met Lys Cys Pro Leu

65 70 75 80

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ile Lys Tyr Thr Trp Ile Val Pro Lys

85 90 95

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Glu

100 105 110

Thr Gly Asp Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys

115 120 125

Ile Arg Asp

130

<210> 36

<211> 617

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 36

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val

35 40 45

Ala Arg Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile

50 55 60

Ser Asn His Gly Ser Asp Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe

65 70 75 80

Asn Leu Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

85 90 95

His Gly Ser Asp Pro Ser Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

100 105 110

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys Val Arg

115 120 125

Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr Phe Gln

130 135 140

Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val Val Ile

145 150 155 160

Met Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg

165 170 175

Glu Gln Gln Ser Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

180 185 190

Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn Leu Ser

195 200 205

Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro Ala

210 215 220

Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Ile Lys

225 230 235 240

Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe Gly Pro

245 250 255

Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro Gln Ala

260 265 270

Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala Ser Thr

275 280 285

Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu Arg

290 295 300

Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe His Gln

305 310 315 320

Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala Gly Gly

325 330 335

Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser His Ile

340 345 350

Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Glu Val Asp

355 360 365

Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Ser His Tyr Ile Lys Ser Pro Leu

370 375 380

Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys

385 390 395 400

Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr

405 410 415

Asn Ala Ser His Tyr Ile Lys Ser Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr

420 425 430

Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu

435 440 445

Asn Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp

450 455 460

Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser Gln His Gly Ser His

465 470 475 480

Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln Thr Ser Ala Ser

485 490 495

Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp Leu Arg Ser Leu

500 505 510

Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Ser Gly Ser Ser Trp

515 520 525

Ala Phe Ser Gly Val Ala Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg

530 535 540

Asn Thr Ser Leu Asp Leu Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Ser Ala Ser

545 550 555 560

Gln His Gly Ser His Gly Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile

565 570 575

Gln Thr Ser Ala Ser Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu

580 585 590

Asp Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly

595 600 605

Ser Gly Ser Ser Trp Ala Phe Ser Gly

610 615

<210> 37

<211> 563

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 融合蛋白

<400> 37

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr

20 25 30

Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu

35 40 45

Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Tyr Asn

50 55 60

Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp Leu Ala

65 70 75 80

Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp Gly Tyr Phe

85 90 95

Ala Asp Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu

100 105 110

Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu

115 120 125

Leu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe

130 135 140

Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Ser Pro Gly Asn

145 150 155 160

Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr Ser Thr Gly Tyr Phe Ala Asp

165 170 175

Pro Lys Asp Pro Ser Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Ile

180 185 190

His Lys Ser Ser Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Lys Glu Leu Thr

195 200 205

Ser Thr Gly Gly Trp Ser Ser Lys Pro Arg Lys Gly Met Gly Thr Asn

210 215 220

Leu Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp

225 230 235 240

Pro Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro

245 250 255

Ile Lys Asp His Trp Pro Ala Ala Asn Gln Val Gly Val Gly Ala Phe

260 265 270

Gly Pro Gly Leu Thr Pro Pro His Gly Gly Ile Leu Gly Trp Ser Pro

275 280 285

Gln Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Ser Thr Ile Pro Pro Pro Ala

290 295 300

Ser Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro

305 310 315 320

Leu Arg Asp Ser His Pro Gln Ala Met Gln Trp Asn Ser Thr Ala Phe

325 330 335

His Gln Ala Leu Gln Asp Pro Arg Val Arg Gly Leu Tyr Phe Pro Ala

340 345 350

Gly Gly Ser Ser Ser Gly Thr Val Asn Pro Ala Pro Asn Ile Ala Ser

355 360 365

His Ile Ser Ser Ile Ser Ala Arg Thr Gly Asp Pro Val Thr Asn Asp

370 375 380

Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln

385 390 395 400

Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Tyr Gln Asn

405 410 415

Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu Gln Met Arg Lys

420 425 430

Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys

435 440 445

Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile

450 455 460

Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr

465 470 475 480

Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Gln

485 490 495

Ser Glu Thr Ile Asp Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser

500 505 510

Asn Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys

515 520 525

Lys Ile Glu Val Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser Asn

530 535 540

Glu Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys Lys

545 550 555 560

Ile Glu Val

<210> 38

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 38

Thr Ser Ala Cys Arg Ile Asn Ser Val Asn Val Pro Ser Glu Leu Asp

1 5 10 15

Leu Arg Ser Leu Arg Thr Val Thr Pro Ile Arg Met Gln Gly Gly Cys

20 25 30

Gly Ser Cys Trp Ala Phe Ser Gly Val Ala

35 40

<210> 39

<211> 43

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 39

Ala Thr Glu Ser Ala Tyr Leu Ala Tyr Arg Asn Thr Ser Leu Asp Leu

1 5 10 15

Ser Glu Gln Glu Leu Val Asp Cys Ala Ser Gln His Gly Cys His Gly

20 25 30

Asp Thr Ile Pro Arg Gly Ile Glu Tyr Ile Gln

35 40

<210> 40

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 40

Gln Asn Gly Val Val Glu Glu Arg Ser Tyr Pro Tyr Val Ala Arg Glu

1 5 10 15

Gln Gln Cys Arg Arg Pro Asn Ser Gln His Tyr Gly Ile Ser Asn

20 25 30

<210> 41

<211> 35

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 41

Val Arg Asn Ser Trp Asp Thr Thr Trp Gly Asp Ser Gly Tyr Gly Tyr

1 5 10 15

Phe Gln Ala Gly Asn Asn Leu Met Met Ile Glu Gln Tyr Pro Tyr Val

20 25 30

Val Ile Met

35

<210> 42

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 42

His Gly Ser Asp Pro Cys Ile Ile His Arg Gly Lys Pro Phe Asn Leu

1 5 10 15

Glu Ala Ile Phe Asp Ala Asn Gln Asn Thr Lys Thr Ala Lys

20 25 30

<210> 43

<211> 42

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 43

Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Thr Asn Ala Cys His Tyr Ile Lys

1 5 10 15

Cys Pro Leu Val Lys Gly Gln Gln Tyr Asp Ala Lys Tyr Thr Trp Asn

20 25 30

Val Pro Lys Ile Ala Pro Lys Ser Glu Asn

35 40

<210> 44

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 44

Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met Gln Arg Ile His Glu

1 5 10 15

Gln Met Arg Lys Gly Glu Glu Ala Leu Leu His Leu Gln

20 25

<210> 45

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 45

Glu Arg Tyr Asn Val Glu Ile Ala Leu Lys Ser Asn Glu Ile Leu Glu

1 5 10 15

Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Gln Arg Val Lys Lys Ile Glu Val

20 25 30

<210> 46

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 46

Asp Pro Ile His Tyr Asp Lys Ile Thr Glu Glu Ile Asn Lys Ala Ile

1 5 10 15

Asp Asp Ala Ile Ala Ala Ile Glu Gln Ser Glu Thr Ile Asp

20 25 30

<210> 47

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 47

Tyr Asn Phe Glu Thr Ala Val Ser Thr Ile Glu Ile Leu Val Lys Asp

1 5 10 15

Leu Ala Glu Leu Ala Lys Lys Val Lys Ala Val Lys Ser Asp Asp

20 25 30

<210> 48

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 48

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro Cys Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Ile His Lys Ser Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Lys Glu Leu Thr Cys Thr

35

<210> 49

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 49

Arg Glu Gln Ser Cys Arg Arg Pro Asn Ala Gln Arg Phe Gly Ile Ser

1 5 10 15

Asn Tyr Cys Gln Ile Tyr Pro Pro Asn Val Asn Lys Ile Arg Glu Ala

20 25 30

Leu Ala Gln Thr His

35

<210> 50

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 50

Lys Asp Leu Asp Ala Phe Arg His Tyr Asp Gly Arg Thr Ile Ile Gln

1 5 10 15

Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His Ala Val Asn Ile Val

20 25 30

<210> 51

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 51

Gly Arg Thr Ile Ile Gln Arg Asp Asn Gly Tyr Gln Pro Asn Tyr His

1 5 10 15

Ala Val Asn Ile Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp

20 25 30

Ile

<210> 52

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 52

Val Gly Tyr Ser Asn Ala Gln Gly Val Asp Tyr Trp Ile Val Arg Asn

1 5 10 15

Ser Trp Asp Thr Asn Trp Gly Asp Asn Gly Tyr Gly Tyr Phe Ala Ala

20 25 30

Asn Ile

<210> 53

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 53

Asp Gln Val Asp Val Lys Asp Cys Ala Asn His Glu Ile Lys Lys Val

1 5 10 15

Leu Val Pro Gly Cys His Gly Ser Glu Pro Cys Ile Ile His Arg Gly

20 25 30

Lys

<210> 54

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 54

Glu Ala Asn Gln Asn Ser Lys Thr Ala Lys Ile Glu Ile Lys Ala Ser

1 5 10 15

Ile Glu Gly Leu Glu Val Asp Val Pro Gly Ile Asp Pro Asn Ala Cys

20 25 30

<210> 55

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 55

Ala Pro Lys Ser Glu Asn Val Val Val Thr Val Lys Val Met Gly Asp

1 5 10 15

Asn Gly Val Leu Ala Cys Ala Ile Ala Thr His Ala Lys Ile Arg Asp

20 25 30

<210> 56

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 56

Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

1 5 10 15

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr

20 25 30

Leu Gln

<210> 57

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 57

Lys Lys Gly Glu Leu Ala Leu Phe Tyr Leu Gln Glu Gln Ile Asn His

1 5 10 15

Phe Glu Glu Lys Pro Thr Lys Glu Met Lys Asp Lys Ile Val Ala Glu

20 25 30

Met Asp Thr Ile

35

<210> 58

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 58

Asp Gly Val Arg Gly Val Leu Asp Arg Leu Met Gln Arg Lys Asp Leu

1 5 10 15

Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser Gly

20 25 30

<210> 59

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 59

Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

1 5 10 15

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val Lys

20 25 30

Lys Ile Glu Val

35

<210> 60

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 60

Glu Asp Lys Lys His Asp Tyr Gln Asn Glu Phe Asp Phe Leu Leu Met

1 5 10 15

Glu Arg Ile His Glu Gln Ile Lys Lys Gly Glu Leu Ala

20 25

<210> 61

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 61

Asp Leu Asp Ile Phe Glu Gln Tyr Asn Leu Glu Met Ala Lys Lys Ser

1 5 10 15

Gly Asp Ile Leu Glu Arg Asp Leu Lys Lys Glu Glu Ala Arg Val

20 25 30

<210> 62

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 62

Phe Ile Val Gly Asp Lys Lys Glu Asp Glu Trp Arg Met Ala Phe Asp

1 5 10 15

Arg Leu Met Met Glu Glu Leu Glu Thr Lys Ile Asp Gln Val Glu Lys

20 25 30

Gly Leu

<210> 63

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 63

Leu His Leu Ser Glu Gln Tyr Lys Glu Leu Glu Lys Thr Lys Ser Lys

1 5 10 15

Glu Leu Lys Glu Gln Ile Leu Arg Glu Leu Thr Ile Gly Glu Asn Phe

20 25 30

Met Lys Gly Ala Leu

35

<210> 64

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 64

Met Lys Gly Ala Leu Lys Phe Phe Glu Met Glu Ala Lys Arg Thr Asp

1 5 10 15

Leu Asn Met Phe Glu Arg Tyr Asn Tyr Glu Phe Ala Leu

20 25

<210> 65

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 65

Val Ala Ala Ile Glu Lys Ser Glu Thr Phe Asp Pro Met Lys Val Pro

1 5 10 15

Asp His Ser Asp Lys Phe Glu Arg His Ile Gly Ile Ile Asp Leu

20 25 30

<210> 66

<211> 31

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 66

Leu Lys Gly Glu Leu Asp Met Arg Asn Ile Gln Val Arg Gly Leu Lys

1 5 10 15

Gln Met Lys Arg Val Gly Asp Ala Asn Val Lys Ser Glu Asp Gly

20 25 30

<210> 67

<211> 36

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 67

Val His Asp Asp Val Val Ser Met Glu Tyr Asp Leu Ala Tyr Lys Leu

1 5 10 15

Gly Asp Leu His Pro Asn Thr His Val Ile Ser Asp Ile Gln Asp Phe

20 25 30

Val Val Glu Leu

35

<210> 68

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 68

Val Glu Leu Ser Leu Glu Val Ser Glu Glu Gly Asn Met Thr Leu Thr

1 5 10 15

Ser Phe Glu Val Arg Gln Phe Ala Asn Val

20 25

<210> 69

<211> 28

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 69

Val Asn His Ile Gly Gly Leu Ser Ile Leu Asp Pro Ile Phe Ala Val

1 5 10 15

Leu Ser Asp Val Leu Thr Ala Ile Phe Gln Asp Thr

20 25

<210> 70

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 70

Thr Ala Ile Phe Gln Asp Thr Val Arg Ala Glu Met Thr Lys Val Leu

1 5 10 15

Ala Pro Ala Phe Lys Lys Glu Leu Glu Arg Asn Asn Gln

20 25

<210> 71

<211> 32

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 71

Met Ala Asn Asp Asn Asp Asp Asp Pro Thr Thr Thr Val His Pro Thr

1 5 10 15

Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg Phe Gly

20 25 30

<210> 72

<211> 34

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 72

Pro Thr Thr Thr Glu Gln Pro Asp Asp Lys Phe Glu Cys Pro Ser Arg

1 5 10 15

Phe Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys

20 25 30

Ser Asn

<210> 73

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 73

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Ala Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Ala Ala Val His Lys Ala Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Ala Ala Ala Ala Thr Cys Thr

35

<210> 74

<211> 39

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 74

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Ala Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val Ala Ala Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

35

<210> 75

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 75

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr

20 25

<210> 76

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 76

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Ser Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro Gly Asn Thr

20 25

<210> 77

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 77

Lys Phe Tyr Ile Cys Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro

1 5 10 15

Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

20 25

<210> 78

<211> 29

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 78

Lys Phe Tyr Ile Ser Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Ser Pro

1 5 10 15

Gly Asn Thr Arg Trp Asn Glu Asp Glu Glu Thr Ser Thr

20 25

<210> 79

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 79

Ser Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp

1 5 10 15

Asn Glu Asp Glu Glu Thr Cys Thr

20

<210> 80

<211> 33

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 80

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu

<210> 81

<211> 37

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> 变应原片段

<400> 81

Gly Tyr Phe Ala Asp Pro Lys Asp Pro His Lys Phe Tyr Ile Cys Ser

1 5 10 15

Asn Trp Glu Ala Val His Lys Asp Cys Pro Gly Asn Thr Arg Trp Asn

20 25 30

Glu Asp Glu Glu Thr

35

Claims

1.融合蛋白，其具有式(I)

X₁-Y-X₂ (I)，

其中X₁和X₂各包含彼此融合的四至八个变应原片段或其变体，其中所述变应原片段源自尘螨(Dermatophagoides)属的至少两个变应原，并且其中Y是载体蛋白。

2.根据权利要求1所述的融合蛋白，其中所述至少两个变应原是户尘螨(Dermatophagoides pteronyssinus)的和/或粉尘螨(Dermatophagoides farinae)的变应原。

3.根据权利要求1或2所述的融合蛋白，其中所述至少两个变应原是户尘螨的变应原，并且选自Der p1、Der p2、Der p5、Der p7、Der p21和Der p23。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的融合蛋白，其中所述至少两个变应原的变应原片段由25至50个氨基酸残基组成，优选地由28至48个氨基酸残基组成，更优选由30至45个氨基酸残基组成。

5.根据权利要求1至4中任一项所述的融合蛋白，其中所述变应原片段的半胱氨酸残基中的至少一个、优选至少两个、更优选至少三个、特别是所有的半胱氨酸残基被丝氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丙氨酸、或亮氨酸所取代。

6.根据权利要求3至5中任一项所述的融合蛋白，其中

a)Der p1的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：

TNACSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA(SEQ ID No.1)、ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDCASQGGCHGDTIPRGIEYIQ(SEQ ID No.2)、HNGVVQESYYRYVAREQSCRRPNAQRFGISN(SEQID No.3)、VRNSWDTNWGDNGYGYFAANIDLMMIEEYPYVVIL(SEQ ID No.4)、TNASSINGNAPAEIDLRQMRTVTPIRMQGGSGSSWAFSGVA(SEQ ID No.5)、ATESAYLAYRNQSLDLAEQELVDSASQHGSHGDTIPRGIEYIQ(SEQ ID No·6)、和HNGVVQESYYRYVAREQSSRRPNAQRFGISN(SEQ ID No.7)和/或

b)Der p2的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成∶

CHGSEPCIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK(SEQ ID No.8)、EVDVPGIDPNACHYMKCPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN(SEQ ID No.9)、HGSEPSIIHRGKPFQLEAVFEANQNSKTAK(SEQ ID No.10)和EVDVPGIDPNASHYMKSPLVKGQQYDIKYTWIVPKIAPKSEN(SEQ ID No·11)、和/或

c)Der p5的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：

DYQNEFDFLLMERIHEQIKKGELALFYLQ(SEQ ID No.12)和EQYNLEMAKKSGDILERDLKKEEARVKKIEV(SEQ ID No.13)、和/或

d)Der p7的变应原片段由与氨基酸序列DPIHYDKITEEINKAVDEAVAAIEKSETFD(SEQ IDNo.14)至少90％相同的氨基酸序列组成，和/或

e)Der p21的变应原片段由与氨基酸序列YNYEFALESIKLLIKKLDELAKKVKAVNPDEYY(SEQID No.15)至少90％相同的氨基酸序列组成，和/或

f)Der p23的变应原片段由与选自以下的的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：GYFADPKDPHKFYICSNWEAVHKDCDCPGNTRWNEDEETCT(SEQ ID No.16)和GYFADPKDPHKFYISSNWEAVHKDSPGNTRWNEDEETST(SEQ ID No.17)，和/或

g)Der f1的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：TSACRINSVNVPSELDLRSLRTVTPIRMQGGCGSCWAFSGVA(SEQ ID No.38)、ATESAYLAYRNTSLDLSEQELVDCASQHGCHGDTIPRGIEYIQ(SEQ ID No.39)、QNGVVEERSYPYVAREQQCRRPNSQHYGISN(SEQ IDNo.40)和VRNSWDTTWGDSGYGYFQAGNNLMMIEQYPYVVIM(SEQ ID No.41)、和/或

h)Der f2的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：HGSDPCIIHRGKPFNLEAIFDANQNTKTAK(SEQ ID No.42)和EVDVPGIDTNACHYIKCPLVKGQQYDAKYTWNVPKIAPKSEN(SEQ ID No.43)，和或

i)Der f5的变应原片段由与选自以下的氨基酸序列至少90％相同的氨基酸序列组成：DYQNEFDFLLMQRIHEQMRKGEEALLHLQ(SEQ ID No.44)和ERYNVELALKSNEILERDLKKEEQRVKKIEV(SEQ ID No.45)、和/或

j)Der f7的变应原片段由与氨基酸序列DPIHYDKITEE1NKAIDDAIAAIEQSETID(SEQ IDNo.46)至少90％相同的氨基酸序列组成，和/或

k)Der f21的变应原片段由与氨基酸序列YNFETAVSTIEILVKDLAELAKKVKAVKSDD(SEQ IDNo.47)至少90％相同的氨基酸序列组成，和/或

1)Der f23的变应原片段由与氨基酸序列GYFADPKDPCKFYICSNWEAIHKSCPGNTRWNEKELTCT(SEQ ID No.48)至少90％相同的氨基酸序列组成。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含至少一个多肽，所述多肽含有选自以下的氨基酸序列：SEQ ID No.18、SEQ ID No.19、SEQ ID No.20、SEQ ID No.21、SEQ ID No.22、SEQ ID No.23、SEQ ID No.24和/或SEQ ID No.25。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的融合蛋白，其中所述载体蛋白是嗜肝DNA病毒科的病毒的表面多肽或所述表面多肽的片段。

9.根据权利要求1至8中任一项所述的融合蛋白，其中所述融合蛋白包含氨基酸序列SEQ ID No.27或氨基酸序列SEQ ID No.28。

10.编码根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白的核酸分子。

11.包含根据权利要求10所述的核酸分子的载体。

12.宿主细胞，其包含根据权利要求10所述的核酸分子或根据权利要求11所述的载体。

13.药物制剂，其包含至少一种根据权利要求1至9中任一项所述的融合蛋白或至少一种根据权利要求10所述的核酸分子。

14.根据权利要求13所述的药物制剂，其中所述制剂中包含的两个融合蛋白或核酸分子的重量比为1∶10至10∶1，优选为1∶5至5∶1，更优选为2∶1至1∶2，更优选为1∶1。

15.根据权利要求13或14所述的药物制剂，其中所述制剂包含含有氨基酸序列SEQ IDNo.27的融合蛋白和/或含有氨基酸序列SEQ ID No.28的融合蛋白、或编码含有氨基酸序列SEQ ID No.27的融合蛋白和/或含有氨基酸序列SEQ ID No.28的融合蛋白的核酸分子。

16.根据权利要求1-9中任一项所述的融合蛋白、根据权利要求10所述的核酸分子、或根据权利要求13-15中任一项所述的药物制剂，其用于治疗或预防由屋尘螨的变应原引起的变应反应中的用途。