CN117143919A - 一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3的制备方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明具体公开了一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3的制备方法及应用；所述重组病毒将包含miRNA的外源基因插入到CVB3病毒结构基因序列中构建得到重组质粒，通过Vero细胞，成功制备出高效稳定的rCVB3；所述制备方法通用性强、适合大规模放大生产，是对现有细胞体系制备rCVB3方法的突破。
Description
技术领域
本发明涉及重组柯萨奇病毒技术领域，特别涉及一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3的制备方法及应用。
背景技术
基因治疗是指将外源基因导入到患者体内，导入的外源基因可以表达产出功能蛋白，或者干扰蛋白的表达，或修正突变基因，从而起到治疗疾病的功能。溶瘤病毒疗法的发展从早期发现到相关技术的逐渐成熟，最后到成熟产品的上市历经百年。在19世纪末期，病毒及其在传染病中的作用被发现。在此期间报道了患有已知病毒病原体传染病的患者体内有癌症消退的现象，这种消退现象引发了首次尝试采用病毒用于肿瘤治疗。1950～1970s，大量野生型病毒治疗肿瘤的临床试验开始开展。由于无法有效控制病毒的病原性，病毒溶瘤效应很快就被免疫反应所抑制，疗效不能持续。
柯萨奇病毒小RNA病毒科，病毒颗粒无包膜，结构为直径约30nm的正二十面体。衣壳内为线状单股RNA，分子量为2.5～2.9×106Da。小RNA病毒的不同属和不同成员之间的区别，主要在于病毒RNA分子内核苷酸一级结构的不同。其结果病毒蛋白内氨基酸残基的排列顺序不同，从而导致不同的抗原性及其在各种细胞内的不同的生长能力，其对pH的抵抗力和在氯化铯中的浮密度也不相同。小RNA病毒呈L434结构，病毒RNA指导合成一条完整蛋白，在特定酶的作用下，分解成L、P1、P2和P3产物。P1、P2和P3又进一步分别分解为4个(VP1～VP4)、3个(2A～2C)和4个(3A～3D)最终蛋白产物。P1又称1ABCD，VP1～VP4相当于1D、1B、1C和1A。小RNA病毒衣壳构造的基本元件为蛋白亚单位，每个亚单位分别由1个VP1、VP2、VP3和VP4分子组成。VP1、VP2和VP3位于病毒粒子的表面，VP4位于衣壳内侧,紧贴于VP1、VP2、VP3复合体。亚单位以5对称轴首先形成五聚体,再由12个五聚体形成病毒衣壳。
衣壳表面围绕着每个五聚体的五重对称轴形成了一个凹陷，称为峡沟。在峡沟底部有一个疏水口袋，其内含有C16脂肪酸，被称为口袋因子，有助于病毒衣壳的稳定性。据认为，CAR(Coxsackievirus andAdenovirus Receptor，柯萨奇病毒和腺病毒受体)与口袋的结合取代了口袋因子，从而破坏了衣壳的稳定，触发了病毒的脱壳并递送RNA到细胞中。衣壳表面的另一个重要结构特征是升高的高变puff区，其位于峡沟的南部边缘，其已知功能是作为抗原位点。此外，其还参与了与衰变加速因子(DAF)的结合，后者是CVB3的共受体。
CVB3最早是在1950年代被开发成rCVB3载体。经过逐步发展，现在的rCVB3载体一般是用外源基因表达元件插入病毒的编码基因。rCVB3具有安全性高、免疫原性低、宿主范围广、能介导外源基因在动物体内长期稳定表达等特点,是基因治疗领域最具前景的载体之一，目前已有rCVB3基因药物正在进行临床研究。
然而，由于rCVB3包装难度大，RNA病毒不稳定的特点，使得rCVB3的稳定制备一直是限制其应用的瓶颈问题。现有制备rCVB3的方法存在灵活性差、病毒产量低、质量不稳定、生产成本高等缺点。因此，建立rCVB3稳定生产系统对于推动基因治疗的应用具有非常重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种插入外源microRNA的新型重组rCVB3质粒，用于高效稳定地制备rCVB3-miRNA，解决现有技术rCVB3制备过程中的产量及质量等多方面的缺陷。
鉴于此，本发明的方案为：
一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3质粒，将包含miRNA的外源基因的一个或多个拷贝数插入到CVB3病毒结构基因序列中构建得到；插入位点为编码衣壳蛋白基因，和5’UTR或功能蛋白之间的间隔序列；所述编码衣壳蛋白基因为VP1、VP2、VP3和VP4；所述功能蛋白序列为2A、2B、2C。
进一步地，所述外源基因插入到柯萨奇病毒CVB3病毒结构基因VP1和2A的间隔序列中。
进一步地，所述外源基因插入到柯萨奇病毒CVB3病毒结构基因VP4和5’UTR的间隔序列中。
进一步地，所述miRNA不限于特定的miRNA的核心表达元件，适用于携带任何其他的miRNA核心表达元件。导入的外源基因可以表达产出功能蛋白，或者干扰蛋白的表达，或修正突变基因，从而起到治疗疾病的功能。
在另一方面，提供转染有以上所述重组质粒的病毒株，该毒株具有快速，通用性强，制备病毒质量高，适于大规模生产的优势，是对现有rCVB3制备方法的一种突破，为基于rCVB3的科学研究和基因治疗提供大量高质量的rCVB3载体工具。
还有一个方面在于，提供感染有以上所述病毒株的宿主细胞，宿主细胞包括但不限于感染上述病毒株的Vero细胞，制备病毒质量高，适于大规模生产的优势。
本发明另外一个目的在于，提供重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA的制备方法，包括如下步骤：
将miRNA置于穿梭质粒启动子下构建外源基因；
将外源基因的一个或多个拷贝数插入到柯萨奇病毒CVB3病毒编码衣壳蛋白基因，和5’UTR或功能蛋白基因之间的间隔序列中构建重组表达载体；
将重组表达载体进行转染，获得阳性重组CVB3的病毒株；
基于重组CVB3的病毒株感染宿主细胞获得重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA。
进一步地，所述穿梭质粒为pVAX1。
进一步地，所述转染过程将重组表达载体转染至Cos7细胞。
进一步地，所述宿主细胞为Vero细胞。
本发明以上制备方法得到的重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA，其病毒滴度较未插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3升高。
本发明还有一个目的在于，提供所述重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA在制备溶瘤病毒药物中的应用，所述miRNA为肿瘤抑制性miR靶序列；所述重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA作为基因治疗载体，进而发挥病毒溶瘤效应，用于肿瘤的治疗。
相对于现有技术，本发明的有益效果为：
1.本发明所述重组质粒将miRNA核心元件插入到柯萨奇病毒B3(CVB3)编码衣壳蛋白基因，和5’UTR或功能蛋白之间的间隔序列中得到，包装简单，易传染。
2.本发明利用转染病毒拯救，从而制备出重组柯萨奇病毒(rCVB3)的新毒株，该毒株具有快速，通用性强，制备病毒质量高，适于大规模生产的优势，是对现有rCVB3制备方法的一种突破，为基于rCVB3的科学研究和基因治疗提供大量高质量的rCVB3载体工具。
3.本发明所述重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA的制备方法以Vero细胞为宿主细胞获得呈完整实心、六角形均匀颗粒的rCVB3病毒，滴度高，稳定性好。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明整合后的pVAX1-rCVB3质粒示意图。
图2为本发明穿梭质粒按照标准流程转染Cos7细胞后的病变情况。
图3为本发明重组CVB3阳性病毒株感染贴壁培养的Vero细胞后产生病变示意图。
图4为本发明重组病毒荧光PCR测定的曲线结果。
图5为本发明利用重组病毒rCVB3-miRNA-eGFP感染Vero细胞制备病毒时感染情况示意图。
图6为本发明rCVB3-miRNA病毒颗粒的电镜检测结果。
图7为本发明重组病毒rCVB3-miRNA体外感染Vero细胞后的结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案和有益技术效果更加清晰明白，以下结合附图和具体实施方式，对本发明进行进一步详细说明。应当理解的是，本说明书中描述的具体实施方式仅仅是为了解释本发明，并不是为了限定本发明。
在一个实施例中，提供一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3的制备方法，包括以下主要步骤：
(1)基于pVAX1穿梭质粒，将miRNA基因置于pP10启动子下，将外源基因序列插入到结构基因VP1和2A的间隔序列中，实现将制备rCVB3所需的核心表达元件整合到一起。整合后的pVAX1-rCVB3质粒如图1所示。
(2)按照标准化的操作说明，将该穿梭质粒pVAX1-rCVB3-miRNA转化Cos7细胞，空斑纯化含有重组病毒基因组的细胞，抽提核酸。转染3天后的细胞可以检测到CVB3的核酸序列，继续培养。收集培养液上清，即获得重组CVB3病毒。
(3)利用重组病毒感染Vero细胞，感染3天后，即可产生出大量rCVB3病毒载体。
在另一个实施例中不仅限于本示例所描述的该种将外源基因序列插入到结构基因VP1和2A的间隔序列中的方案，其他类似以上实施例所做的方案：如外源基因序列插入到结构基因VP4和5’UTR的间隔序列中，制备rCVB3的方法也能够得到重组CVB3病毒。
在上述实施例中，所述miRNA为肿瘤抑制性靶序列，包含特异性靶向不限于特定的miRNA的核心表达元件，适用于携带任何其他的miRNA核心表达元件。
实施例1重组CVB3-miRNA-eGFP的制备与扩增
为了获得rCVB3制备的主要组件，将miRNA插入CVB3基因组中，miRNA序列为ctggtacaggcctgggggacag。我们利用了pVAX1穿梭载体，eGFP基因的功能性表达采用了核糖体扫描机制。eGFP基因置于CMV启动子的调控下。含有核心表达元件采用了pVAX1-rCVB3载体中的核酸片段，由CMV启动子控制GFP绿色荧光蛋白的表达，便于检测rCVB3的活性。利用分子克隆技术将miRNA的核心元件插入到rCVB3结构基因VP1和2A之间，eGFP基因插入到rCVB3结构基因5’UTR和VP4之间。构建pVAX1-rCVB3-miRNA-eGFP重组穿梭质粒。
然后，将该穿梭质粒按照标准流程转染Cos7细胞。通过筛选和鉴定获得含有阳性重组CVB3的病毒株。抽提纯化重组杆状病毒基因组。如图2所示，转染细胞后，可以看到细胞中有GFP的表达，直至完全感染，出现明显的细胞病变现象。收集培养上清后离心，取上清，获得了重组病毒株rCVB3-miRNA-eGFP。
将转染细胞后获得的病毒株感染贴壁培养的Vero细胞，感染3天后，如图3所示，细胞再次出现明显病变，收集培养上清后离心，取上清，即可获得大量重组病毒。重组病毒的滴度用荧光PCR的方法进行测定，结果如图4所示。
实施例2利用重组病毒rCVB3-miRNA-eGFP感染Vero细胞制备病毒并验证其活性
将制备得到的病毒株以MOI＝5感染贴壁培养的Vero细胞，感染72小时后，分别收集培养上清和细胞沉淀。重组病毒株产生后主要存在于细胞，由于细胞感染后发生病变，部分细胞会裂解，重组病毒株也会有部分释放到上清中。而病变产生后，主要通过分泌释放到培养基上清中，在细胞中也会有部分未释放的病毒株。因此上清和细胞沉淀中会同时存在病毒株。
我们通过病毒感染Cos7细胞和Vero细胞的实验证实该系统制备出了rCVB3。将细胞沉淀反复冻融裂解后，离心收集细胞裂解上清液。因为rCVB3无包膜，经60℃、30分钟处理，活性不受影响。接着，病毒感染细胞2天后检测荧光。由野生型Nancy株感染细胞制备的CVB3-Nancy对照组。重组病毒株感染组在处理前、后都有GFP表达。培养基上清组，未处理的有GFP表达，处理后仅有少量GFP表达。细胞裂解液上清实验组，未处理的有GFP表达，处理后仍有较强荧光。用相同的样品感染Vero细胞2天后，结果如图5所示。感染结果为：rCVB3对细胞有感染性，而细胞裂解液上清实验组，含有重组rCVB3-miRNA-eGFP，因而在未处理时有GFP表达。以上结果表明，本方案已建立的该重组病毒株能够制备出具有细胞转导活性的重组病毒。
实施例3rCVB3-miRNA的纯化与滴度测定
分别按照实施例1的方法在CVB3基因组中插入miRNA，不插入miRNA分别获得重组病毒rCVB3-miRNA和rCVB3。将重组病毒株感染后后收集得到的Vero细胞约为1×108cells，加入裂解缓冲液后反复冻融3次，离心收集上清，在上清中加入benzonase(sigma)至终浓度50U/ml，37℃水浴60min处理。处理后离心，收上清。上清用氯仿抽提，再用(NH4)2SO4和PEG8000的两相沉淀的方法进行纯化。两相沉淀后的上清，用截留分子量为100000的Amiconultra-4的透析柱，用PBS进行透析脱盐处理，最后一次离心透析浓缩用含有0.01的F-68的PBS。加入10％的甘油，无菌分装-80℃保持备用。滴度测定采用荧光定量PCR的方法，滴度单位用pfu/ml表示，结果如表1所示。
表1：
从表1中不难看出，插入miRNA后的重组病毒rCVB3-miRNA滴度相对上升，说明基于感染Vero细胞获得重组病毒，基于rCVB3-miRNA制备的病毒更有优势。
实施例4rCVB3-miRNA病毒颗粒的电镜检测与完整性测定
将一滴纯化的rCVB3-miRNA约10ul置于200目碳涂层铜格栅上5min.在超纯水中洗4次。样品加一滴1％乙酸铀酰染色，空气干燥5min。用H-7000FA型100千伏透射电子显微镜观察观察病毒颗粒(75KV，30000倍)。电镜观察结果如图6所示，可以看到完整的实心rCVB3颗粒，呈6角形均匀颗粒，空心无核酸的缺陷颗粒中间被染色深色。
实施例5rCVB3-miRNA的体外细胞水平
将Vero细胞以1×104cells/well铺板到96孔板中，6h后感染相应量的纯化的rCVB3-miRNA病毒，感染48h后，用荧光显微镜观察GFP荧光的表达情况，发现表达情况与实施例2相当(图7)，说明重组病毒rCVB3-miRNA的体外细胞感染能力与实施例2相当，说明rCVB3-miRNA感染能力强、稳定性好，适用于工业大量制备重组病毒。
本发明并不仅仅限于说明书和实施方式中所描述，因此对于熟悉领域的人员而言可容易地实现另外的优点和修改，故在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念的精神和范围的情况下，本发明并不限于特定的细节、代表性的设备和这里示出与描述的图示示例。
Claims (10)
1.一种插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3质粒，其特征在于，将包含miRNA的外源基因的一个或多个拷贝数插入到CVB3病毒结构基因序列中构建得到；插入位点为编码衣壳蛋白基因，和5’UTR或功能蛋白基因之间的间隔序列。
2.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述外源基因插入到柯萨奇病毒CVB3病毒结构基因VP1和2A的间隔序列中。
3.根据权利要求1所述的重组质粒，其特征在于，所述外源基因插入到柯萨奇病毒CVB3病毒结构基因VP4和5’UTR的间隔序列中。
4.转染有权利要求1所述重组质粒的病毒株。
5.感染有权利要求4所述病毒株的宿主细胞。
6.重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
将miRNA置于穿梭质粒启动子下构建外源基因；
将外源基因的一个或多个拷贝数插入到柯萨奇病毒CVB3病毒编码衣壳蛋白基因，和5’UTR或功能蛋白之间的间隔序列中构建重组质粒；
将重组质粒进行转染，获得阳性重组CVB3的病毒株；
基于重组CVB3的病毒株感染宿主细胞获得重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述转染过程将重组表达载体转染至Cos7细胞。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述宿主细胞为Vero细胞。
9.权利要求6-8任意一项制备方法得到的重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA，其特征在于，其病毒滴度较未插入外源miRNA的重组柯萨奇病毒rCVB3升高。
10.权利要求9所述重组柯萨奇病毒rCVB3-miRNA在制备溶瘤病毒药物中的应用；所述miRNA为肿瘤抑制性靶序列。
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