CN1869242A

CN1869242A - 一种重组腺病毒及其应用

Info

Publication number: CN1869242A
Application number: CN 200610012154
Authority: CN
Inventors: 阮国瑞; 马大龙; 刘艳荣; 陈珊珊; 常艳; 邱晓彦; 秦亚溱; 付家瑜; 李金兰; 曹辉
Original assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University; Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2006-06-08
Filing date: 2006-06-08
Publication date: 2006-11-29
Anticipated expiration: 2026-06-08
Also published as: CN100429316C

Abstract

本发明公开了一种重组腺病毒及其应用。本发明的重组腺病毒，是将人PDCD5基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人PDCD5基因的表达盒包括启动子、人PDCD5的cDNA和终止子。本发明的重组腺病毒与多种化疗药物联合给药对造血系统来源的细胞或肿瘤治疗，都有明显的协同作用。本发明的重组腺病毒可广泛用于肿瘤基因治疗。

Description

一种重组腺病毒及其应用

技术领域

本发明涉及一种重组腺病毒及其应用，特别涉及含有该重组腺病毒的抑制肿瘤细胞的生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物。

背景技术

生物体的一切生命活动，从出生、成长、衰老、到出现疾病直至死亡都与基因有关，基因调控着细胞的各种功能。人们现在已经认识到肿瘤是基因异常的疾病，而恶性肿瘤发病率、死亡率较高，已经成为危害人类生命的第一、二位杀手，这使得肿瘤基因治疗的研究成为近20年来基因治疗的主要研究内容和热点。科学家利用基因工程技术，消除、修饰致病基因，注入或增强有益基因，达到治疗疾病的目的。

早在1989年，Rosenberg就首次对人恶性黑色素病患者进行了基因治疗，此后基因治疗的研究层出不穷，不少研究也显示出临床疗效。常用于肿瘤基因治疗临床试验的目的基因有抑癌基因、自杀基因、耐药基因、反义基因等。目前研究较多的是重组腺病毒p53，美国自1995年以来即开始了重组腺病毒p53制品的临床试验，并已完成了I、II期临床试验及部分III期临床试验。我国目前已有“今又生”上市(由正常人肿瘤抑制基因p53和改构的5型腺病毒基因重组而成)，获得了国家食品药品监督管理局颁发的新药证书、准字号生产批文、药品GMP证书，是世界首个获准上市的基因治疗药物。基因治疗不仅作为一个新的生物医学概念而为人们所接受，而且作为一种新的治疗手段和方法已被广大研究人员和临床工作者所实践。到目前为止所进行的不少研究表明，基因治疗实验是安全、有效和易于操作的。

TFAR19(TF-1 cell apoptosis-related gene 19)是最近发现的一种新的凋亡调控基因，国际人类基因命名委员会将其命名为PDCD5(programmed celldeath 5)，其编码的蛋白主要定位于细胞内，在人类50余种组织中广泛分布。

目前，国内外已有多家实验室利用不同技术发现PDCD5在疾病情况下，特别是在肿瘤如肝癌、乳腺癌及胃癌中的表达明显下降，PDCD5的低表达与胃癌的不良预后相关，而针对PDCD5的siRNA能减弱Bax过表达诱导的HeLa、HEK293和293T细胞凋亡，说明低表达PDCD5赋予这些细胞一定的抗凋亡能力。

阮国瑞等从mRNA及蛋白水平证实了PDCD5在白血病病人骨髓细胞中低表达。在国际上率先发现急性髓性白血病(acute myeloid leukemia，AML)病人比慢性髓性白血病(chronic myeloid leukemia，CML)病人表达更低的PDCD5，CML病人尤其是加速/急变期的CML病人，PDCD5表达量与BCR-ABL表达量呈负相关，马曦等进一步的研究表明，CML病人PDCD5基因5’调节区2个SNPs位点影响启动子活性并与CML易感性有关，拥有(_27G/_11A)这2个SNPs位点的启动子转录活性减低，并且不能被凋亡诱导因素所上调。利用酵母双杂交系统，发现PDCD5可结合多个重要的分子如HTATIP、EEF1G、KIAA1377、RIF1等，其中组蛋白乙酰转移酶HTATIP(histone acetyltransferase Tat interactive protein 60kD，HTATIP，TIP60)不仅在染色质基因转录中发挥重要作用，具有ATP酶、DNA解旋酶及与DNA结合的活性，而且，在DNA双链断裂修复和凋亡中发挥重要功能，由于CML病人PDCD5表达降低，拥有5’调节区2个SNPs位点(_27G/_11A)的启动子转录活性减低，并且不能被凋亡诱导因素所上调，因而推测，CML病人低表达或异常表达的PDCD5与TIP60结合的能力可能受到影响，从而，可能进一步影响到TIP60发挥的染色质基因转录、DNA双链断裂修复和凋亡等等重要功能，BCR-ABL表达量增加的CML病人PDCD5表达量进一步降低，不仅使这些细胞抗凋亡能力增强，也可能增加了基因组内在不稳定性。说明低表达PDCD5可能在AML、CML病理机制或疾病进展中起一定作用。

目前基因治疗中常用的表达载体主要分为真核表达质粒和病毒表达载体，虽然二者都能有效地使外源基因在细胞中表达，但由于真核表达质粒在体内难以定向导入靶细胞，故在基因治疗应用上受到限制。

而病毒表达载体是利用宿主细胞表面天然存在的受体将外源基因定向导入靶细胞，且能转导不分裂的细胞。腺病毒(AdV)载体系统由于其基因组较易操作，具有可大量制备、表达量高及不整合等优点因而在目前的基因治疗中倍受青睐。

腺病毒载体的广谱性：腺病毒系统已被广泛应用于表达人体和非人体蛋白，腺病毒能感染很大范围的哺乳动物细胞，除了一些淋巴细胞外，腺病毒可以感染其他所有类型的细胞。在非复制细胞中研究基因表达，腺病毒系统为最佳。腺病毒系统已用于多项临床实验，取得了预期临床效果。

腺病毒载体的安全性：载体源于第一代人5型腺病毒，为腺病毒中致病力最弱的病毒株，该病毒株野生型也仅会偶致普通感冒；载体基因不整合到宿主细胞基因组中，无遗传毒性；载体经基因工程改构，只对细胞实施一次感染，不能复制，无环境污染。国内外10余年来批准的有关重组人p53腺病毒制品的临床试验达58项，使用过约30000个剂量，均未发现严重不良反应、未测及最大耐受剂量。与DNA损伤性肿瘤治疗方法(如放、化疗)联合应用时，未增加重组腺病毒的整合率。

发明内容

本发明的目的是提供一种含有人PDCD5基因的重组腺病毒。

本发明所提供的重组腺病毒，是将人PDCD5基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人PDCD5基因的表达盒包括启动子、人PDCD5的cDNA和终止子。

所述人PDCD5基因的表达盒中，启动子为MCMV启动子，所述终止子为SV40的终止子。

所述人PDCD5基因的表达盒还包括SV40 polyA信号序列。

所述人PDCD5基因的表达盒通过如下方法插入Ad5的基因组DNA中：利用AdMAX系统(microbix公司，购自本元正阳基因技术股份有限公司)将人PDCD5的cDNA插入pDC316的多克隆位点后再与Ad5基因组质粒pBHGIox(delta)E1，3Cre一起转化293细胞，培养被转染的293细胞，得到含有PDCD5基因的重组腺病毒。

本发明的另一个目的是提供一种抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物。

本发明所提供的抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物，它的活性成分为上述重组腺病毒和治疗肿瘤的化疗药物。

所述治疗肿瘤的化疗药物可以是任何一种目前可用的化疗药物，如可为依托泊甙(VP-16)，或甲磺酸伊马替尼(Imatinib)，或伊达比星(IDR)。

该药物可用于非实体瘤细胞或实体瘤细胞。

实验表明本发明的重组腺病毒与多种化疗药物联合给药对造血系统来源的细胞或肿瘤治疗，都有明显的协同作用。本发明的重组腺病毒可广泛用于肿瘤基因治疗。

附图说明

图1为pDC316-PDCD5的EcoR I和HindIII双酶切鉴定电泳图

图2为重组腺病毒Ad-PDCD5的鉴定图谱

图3为不同MOI的Ad-eGFP腺病毒感染白血病细胞系K562、Jurkat及CEM 48h后转染效率

图4为不同MOI的Ad-PDCD5感染K562细胞72h后对K562细胞存活率的影响

图5为流式细胞术测定Ad-PDCD5与VP-16对K562细胞凋亡的协同作用

图6为MTT实验测定Ad-PDCD5与VP-16对K562细胞凋亡的协同作用

图7A为MOI 400、1600的Ad-PDCD5和1.9ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

图7B为MOI 400、1600的Ad-PDCD5和7.5ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

图7C为MOI 400的Ad-PDCD5和15ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

图8为Ad-PDCD5感染K562细胞增加Imatinib诱导的细胞凋亡

图9为K562细胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠体内生长情况

图10为K562细胞感染Ad-PDCD5后腹腔给予低剂量IDR治疗抑制其在裸鼠体内生长

图11为隔日腹腔给予Ad-PDCD5 24h后腹腔给予低剂量IDR治疗，各四次，抑制K562细胞在裸鼠体内生长

图12为隔日腹腔给予Ad-PDCD5 24h后腹腔给予低剂量IDR治疗，各四次，结束治疗24h后的瘤体组织内细胞凋亡情况

图13为肿瘤局部给予Ad-PDCD5 24h后腹腔给予低剂量IDR治疗，各四次，抑制其在裸鼠体内生长

图14为Ad 5基因组质粒pBHGIox(delta)E1，3Cre的物理图谱

具体实施方式

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例1、人PDCD5重组腺病毒的构建、鉴定及纯化

阳性对照质粒pCDI-TFAR19(含有PDCD5的cDNA序列)，制备方法见文献(LiuH T，Wang Y G，Zhang Y M，et al.TRAR19，a novel apoptosis-related genecloned from human leukemia cell line TF-1，could enhance apoptosis of sometumor cells induced by growth factor withdrawal.Biochem Biophy Res Commun，1999，254：203-210)，用EcoR V和HindIII切下目的基因PDCD5，pDC316(购自本元正阳公司)用SmaI和HindIII切开，纯化和回收相应的片段后，用T4连接酶将PDCD5基因连接到pDC316质粒上，筛选阳性克隆，得到含有PDCD5基因(序列表中序列1)的质粒，构建成pDC316-PDCD5。

其中，pDC316质粒含有以下元件：

1.Ampr：为质粒在E.coli(如DH5α)中扩增提供氨苄抗性(终浓度100μg/ml)。

2.ori：质粒在E.coli中的复制起点。

3.Ad：Ad序列，可以与Ad基因组质粒发生同源重组。

4.ITR：Ad反向末端重复序列，是Ad基因组的包装识别信号。

5.MCMV：来自MCMV病毒的立早启动子。

6.SV40 polyA：来自SV40病毒T抗原的mRNA加尾信号。

7.LoxP：真核重组酶(Cre)的重组识别序列。

将pDC316-PDCD5、阳性对照质粒pCDI-TFAR19和pDC316分别用EcoR I和HindIII进行双酶切，酶切产物进行电泳检测，质粒酶切鉴定电泳图如图1所示，与阳性对照质粒pCDI-TFAR19相比，构建的pDC316-PDCD5质粒均可切出目的基因片段PDCD5，说明pDC316-PDCD5的结构正确。图1中，1为pDC316的EcoR I和HindIII双酶切产物电泳结果，2-6为pDC316-PDCD5的EcoR I和HindIII双酶切产物电泳结果，7为阳性对照质粒pCDI-TFAR19的EcoR I和HindIII双酶切产物电泳结果。

将pDC316-PDCD5与Ad 5基因组质粒pBHGIox(delta)E1，3Cre(腺病毒骨架)(本元正阳公司购得，具体结构如图14)共转染293细胞，常规培养并对随机挑取的11个Ad-PDCD5重组腺病毒单斑的细胞培养上清和细胞裂解液进行PCR鉴定，PCR引物如下：上游：5’atggcggacgaggagcttg 3’；

下游：5’tcaataatcgtcatcttcatcag 3’

PCR扩增条件：94℃5min然后(94℃30sec，55℃30sec，72℃45sec)30个循环，最后72℃7min，放4℃待用。Ad-PDCD5重组腺病毒的鉴定结果如图2所示，表明随机挑取的11个单斑的细胞培养上清和细胞裂解液均扩增出与目的基因相符的片段，293细胞和无外源基因的腺病毒均无扩增产物，说明pDC316-PDCD5在293细胞中已完成重组出毒，已筛选出含有目的基因的重组腺病毒Ad-PDCD5。图2中，A组：以细胞培养上清为模板的扩增产物；B组：以细胞裂解液为模板的扩增产物。以下为各孔扩增产物的PCR模板：1-11：Ad-PDCD5重组腺病毒单斑；-1：293空细胞；-2：Ad-null空病毒；+1：pCDI-TFAR19质粒转染的293细胞；+2：pDC316-PDCD5质粒转染的293细胞；+3：pDC316-PDCD5质粒；M：DNA分子量标准。

对照病毒Ad-eGFP，即PDCD5基因被增强型绿色荧光蛋白基因(greenfluorescent protein，GFP)取代的重组腺病毒和Ad-null(不含外源目的基因的重组腺病毒)用同样方式构建。病毒繁殖、纯化、滴度测定按Graham等人(GrahamF L，Prevce L.Gene transfer and expression protocols Methods in MolecularBiology，Vol 7.Murray Z J ed.Clifton，NJ：The Humane Press Inc，1991.109-128)的方法进行。

Ad-PDCD5及Ad-null毒种各生产50个125cm²培养瓶病毒，收获的病毒经纯化后进行质检，高效液相色谱法测二者纯度均达到98％以上，Ad-null及Ad-PDCD5产品TCID₅₀测定结果分别为：6.3×10¹⁰TCID₅₀/ml及2.2×10¹⁰TCID₅₀/ml。

实施例2、流式细胞术检测Ad-PDCD5对K562细胞存活率的影响

1、流式细胞术测定Ad-eGFP腺病毒感染白血病细胞48h时的转染效率

在肿瘤细胞K562、Jurkat及CEM生长处于对数生长期时，以5×10⁴个/孔接种于24孔板中，分别加入不同感染复数(multiplicity of infection，MOI，即病毒感染单位数/细胞数)的Ad-eGFP腺病毒(用1ml无血清的RPMI1640培养液稀释)37℃、5％CO₂孵育48h后，离心收集细胞，用PBS洗涤2次后，通过流式细胞仪检测(激发光为488nm，检测光为530nm)，用Cellquest软件进行数据获取与分析。

每一样品收集1×10⁴个细胞，每种细胞根据细胞大小设定一个单细胞区域，该区域的细胞用于荧光分析。以未转染的细胞作为阴性对照，设定GFP阳性细胞区(M1区)使阴性对照M1区细胞数不超过0.1％，FCM)分析结果用转染率表示。转染率即GFP阳性细胞阳性率，用下列公式计算：

转染率＝样品M1区细胞百分率-阴性对照M1区细胞百分率；

结果如图3所示，表明MOI为20、100、200、400的Ad-eGFP腺病毒感染白血病细胞系K562、Jurkat及CEM 48h后转染效率依次增加，MOI 400时K562、Jurkat及CEM细胞转染效率分别可达71.2％、86.6％及65.5％。图3中，Control为阴性对照，即未转染的白血病细胞系K562、Jurkat及CEM。

2、不同MOI的Ad-PDCD5感染K562细胞72h后对K562细胞存活率的影响

在肿瘤细胞K562生长处于对数生长期时，以5×10⁴个/孔接种于24孔板中，分别加入不同MOI的Ad-PDCD5重组腺病毒37℃、5％CO₂孵育72h后，离心收集细胞，用PBS洗涤2次后，按Annexin-V-Fluos试剂盒(北京宝赛公司)说明进行标记，以K562细胞为对照，流式细胞术(FACSort型，美国Becton Dickinson公司)上检测红色(PI，DNA)和绿色(Annexin-V，FITC)荧光强度。两者均阴性细胞为活细胞，FITC阳性、PI阴性细胞为早期凋亡细胞，两者均阳性细胞为晚期凋亡细胞，FITC阴性、PI阳性细胞为死亡细胞。根据FCM散点图，以对照管射门，计算凋亡细胞所占百分比。

结果如图4所示，表明用MOI为400、800、1600、3200的Ad-PDCD5感染K562细胞72h后，存活细胞均可达到85％以上，与不感染(control)或感染Ad-null相比没有明显差别。

实施例3、Ad-PDCD5重组腺病毒与VP-16的协同作用

1、流式细胞术测定人Ad-PDCD5重组腺病毒与VP-16的协同作用

取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，分为6组，以MOI200分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各2组，2组K562细胞作为对照，24h后，以0.5μg/ml(终浓度)的VP-16分别处理K562、感染Ad-null的K562细胞及Ad-PDCD5的K562细胞各一组，24h后离心收集细胞，PBS洗涤2次，按Annexin-V-Fluos试剂盒(北京宝赛公司)说明进行标记，以K562细胞为对照，流式细胞术(FACSort型，美国Becton Dickinson公司)上检测红色(PI，DNA)和绿色(Annexin-V，FITC)荧光强度。两者均阴性细胞为活细胞，FITC阳性、PI阴性细胞为早期凋亡细胞，两者均阳性细胞为晚期凋亡细胞，FITC阴性、PI阳性细胞为死亡细胞。根据FCM散点图，以对照管射门，计算凋亡细胞所占百分比。

检测结果如图5所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加VP-16 0.5μg/ml再作用24h的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡细胞，对照细胞(control，未经感染和未经VP-16处理的K562细胞)、感染Ad-null的K562细胞(Ad-null)、感染Ad-PDCD5的K562细胞(Ad-PDCD5)、经VP-16处理的K562细胞(VP-16)、经Ad-null感染和经VP-16处理的K562细胞(Ad-null+VP-16)及经Ad-PDCD5感染和经VP-16处理的K562细胞(Ad-PDCD5+VP-16)凋亡细胞所占百分比依次为11.7％、14.4％、13.1％、30.4％、29.6％、49.3％。

2、MTT实验测定Ad-PDCD5重组腺病毒与VP-16的协同作用

取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×10⁵个/ml，分为6组，以MOI200分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各2组，2组K562细胞作为对照，24h后，以0.5μg/ml(终浓度)的VP-16分别处理K562、感染Ad-null的K562细胞及Ad-PDCD5的K562细胞各一组，细胞接种于96孔板，100μl/孔，于培养0、24、48小时加入MTT工作液(5mg/ml)，每孔20μl，继续培养4h后，加入10％SDS-0.01mol/LHCl溶解细胞，570nm波长(Bio-Rad 650型酶标仪)下测定OD值，每时间段每样品测定5孔求平均值。细胞增殖率＝(24h或48h OD值-Oh OD值)/Oh OD值。

检测结果如图6所示，表明与K562或感染Ad-null的K562细胞相比，感染Ad-PDCD5的K562细胞24h或48h时细胞增殖率没有明显差别，24h时，K562(对照，未经感染和未经VP-16处理的K562细胞)、感染Ad-null的K562细胞(Ad-null)及感染Ad-PDCD5的K562细胞(Ad-PDCD5)细胞增殖率分别为73.9％、69.8％、78.0％；48h时，分别为146.6％、151.4％、142.2％。但在0.5μg/ml VP16作用下，感染Ad-PDCD5的K562细胞增殖率比对照组明显下降甚至出现负增殖，24h时，经VP-16处理的K562细胞(VP16)、经Ad-null感染和经VP-16处理的K562细胞(Ad-null+VP16)及经Ad-PDCD5感染和经VP-16处理的K562细胞(Ad-PDCD5+VP16)细胞增殖率分别为57.3％、53.0％、23.8％；48h时，分别为26.5％、23.3％、-10.0％。图6中，control为未经感染和未经VP-16处理的K562细胞，Ad-null为感染Ad-null的K562细胞，Ad-PDCD5为感染Ad-PDCD5的K562细胞，VP16为经VP-16处理的K562细胞，Ad-null+VP16为经Ad-null感染和经VP-16处理的K562细胞，Ad-PDCD5+VP16为经Ad-PDCD5感染和经VP-16处理的K562细胞。

实施例4、Ad-PDCD5感染K562细胞增加IDR诱导的细胞凋亡

1、MOI 400、1600的Ad-PDCD5和1.9ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

取对数生长期的K562细胞，调整细胞浓度为1×10⁵/ml，分为10组，以MOI 400分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各2组，以MOI 1600分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各2组，2组K562细胞作为对照，24h后，以1.9ng/ml(终浓度)IDR分别处理K562、感染Ad-null的K562细胞及Ad-PDCD5的K562细胞各一组，24h后离心收集细胞，PBS洗涤2次，按Annexin-V-Fluos试剂盒(北京宝赛公司)说明进行标记，以K562细胞为对照，流式细胞术(FACSort型，美国Becton Dickinson公司)上检测红色(PI，DNA)和绿色(Annexin-V，FITC)荧光强度。两者均阴性细胞为活细胞，FITC阳性、PI阴性细胞为早期凋亡细胞，两者均阳性细胞为晚期凋亡细胞，FITC阴性、PI阳性细胞为死亡细胞。根据FCM散点图，以对照管射门，计算凋亡细胞所占百分比。

检测结果如图7A所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加1.9ng/ml IDR再作用24h的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡细胞，对照细胞(Control，未经感染和未经IDR处理的K562细胞)、经MOI 400Ad-null感染和经IDR 1.9ng/ml处理的K562细胞(Ad-null，MOI 400+IDR 1.9ng/ml)、经MOI 1600Ad-null感染和经IDR 1.9ng/ml处理的K562细胞(Ad-null，MOI 1600+IDR 1.9ng/ml)、经IDR 1.9ng/ml处理的K562细胞(IDR 1.9ng/ml)、经MOI 400Ad-PDCD5感染和经IDR 1.9ng/ml处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR 1.9ng/ml)、经MOI 1600Ad-PDCD5感染和经IDR 1.9ng/ml处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI1600+IDR 1.9ng/ml)凋亡细胞所占百分比依次为13.5％、14.5％、38.9％、11.8％、32.2％、64.6％。

2、MOI 400、1600的Ad-PDCD5和7.5ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

除添加的IDR的终浓度为7.5ng/ml外，其它实验方法与步骤1相同，检测结果如图7B所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加7.5ng/ml IDR再作用24h的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡细胞，对照细胞(Control，未经感染和未经IDR处理的K562细胞)、经MOI 400Ad-null感染和经IDR 7.5ng/ml处理的K562细胞(Ad-null，MOI 400+IDR 7.5ng/ml)、经MOI 1600Ad-null感染和经IDR7.5ng/ml处理的K562细胞(Ad-null，MOI 1600+IDR 7.5ng/ml)、经IDR 7.5ng/ml处理的K562细胞(IDR 7.5ng/ml)、经MOI 400Ad-PDCD5感染和经IDR 7.5ng/ml处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR 7.5ng/ml)、经MOI 1600Ad-PDCD5感染和经IDR 7.5ng/ml处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI 1600+IDR 7.5ng/ml)凋亡细胞所占百分比依次为13.5％、22.8％、47.8％、23.4％、35.8％、71.8％。

3、MOI 400的Ad-PDCD5和15ng/ml IDR对K562细胞凋亡的影响

除感染的Ad-null及Ad-PDCD5分别为MOI 400、添加的IDR的终浓度为15ng/ml和IDR的处理时间为16小时外，其它实验方法与步骤1相同，检测结果如图7C所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加15ng/ml IDR再作用16h的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡细胞，对照细胞(Control，未经感染和未经IDR处理的K562细胞)、经IDR 15ng/ml处理的K562细胞(IDR 15ng/ml)、经MOI 400Ad-null感染和经IDR 15ng/ml处理的K562细胞(Ad-null，MOI 400+IDR15ng/ml)、经MOI 400Ad-PDCD5感染和经IDR 15ng/ml处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI 400+IDR15ng/ml)凋亡细胞所占百分比依次为13.5％、24.3％、22.6％、35.3％。

实施例5、Ad-PDCD5感染K562细胞增加Imatinib诱导的细胞凋亡

除感染的Ad-null及Ad-PDCD5分别为MOI 200、感染后48小时添加化疗药物0.5μmol/L(终浓度)的Imatinib和Imatinib处理时间为24小时外，其它实验方法与实施例4的步骤1相同，检测结果如图8所示，表明Ad-PDCD5感染24h后加0.5μmol/L Imatinib再作用24h的K562细胞与对照组相比有更多的凋亡细胞，对照细胞(Control，未经感染和未经Imatinib处理的K562细胞)、经MOI 200的Ad-null感染的K562细胞(Ad-null，M0I 200)、经MOI 200的Ad-PDCD5感染的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI 200)、经0.5μmol/L的Imatinib处理的K562细胞(Imatinib 0.5μmol/L)、经MOI 200的Ad-null感染和经0.5μmol/L的Imatinib处理的K562细胞(Ad-null，MOI200+Imatinib 0.5μmol/L)和经MOI200的Ad-PDCD5感染和经0.5μmol/L的Imatinib处理的K562细胞(Ad-PDCD5，MOI200+Imatinibμmol/L)凋亡细胞所占百分比依次为8.7％、15％、13.2％、15.3％、14.4％和26.5％。

实施例6.荷瘤动物实验

1、K562细胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠体内生长情况

大量培养的对数生长期K562细胞台盼兰活细胞计数后，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，分为3组，以MOI 400分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各1组，不感染组作为对照(control)，感染24h后，分别离心收集，用无血清RPMI 1640洗涤，以1.5×10⁷个/点分别接种三组4-5周龄雌性裸鼠腋窝皮下，观察其在裸鼠体内生长情况(裸鼠接种细胞前2天开始腹腔注射给予环磷酰胺100mg/Kg体重/次，共2次)。结果如图9所示，表明接种细胞后第7、9、11天，各组间肿瘤大小无差别，K562细胞感染Ad-null或Ad-PDCD5后在裸鼠体内生长的肿瘤大小无差别。图9中，Control表示接种K562细胞的裸鼠；Ad-null表示接种感染Ad-null的K562细胞的裸鼠；Ad-PDCD5表示接种感染Ad-PDCD5的K562细胞的裸鼠；肿瘤照片表示的是接种细胞11天后的肿瘤。

2、K562细胞感染Ad-PDCD5后给予低剂量IDR治疗抑制其在裸鼠体内生长

大量培养的对数生长期K562细胞台盼兰活细胞计数后，调整细胞浓度为5×10⁵个/ml，分为3组，以MOI 400分别感染Ad-null及Ad-PDCD5各l组，不感染组作为对照(control)，感染24h后，分别离心收集，用无血清RPMI 1640洗涤，以1.5×10⁷个/点分别接种三组4-5周龄雌性裸鼠腋窝皮下，接种后第二天，感染Ad-null及Ad-PDCD5组，分别在接种细胞局部隔日给予IDR 375μg/Kg体重/次，共4次，隔日观察各组K562细胞在裸鼠体内生长情况(裸鼠接种细胞前2天开始腹腔注射给予环磷酰胺100mg/Kg体重/次，共2次)。

结果如图10所示，表明在接种K562细胞后第7、9、11天时，Ad-PDCD5+IDR组的肿瘤明显小于Ad-null+IDR组的肿瘤，Ad-null+IDR与Ad-PDCD5+IDR组相比，P小于0.05。图10中，Control表示接种K562细胞的裸鼠；Ad-null+IDR表示接种感染Ad-null的K562细胞后再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接种感染Ad-PDCD5的K562细胞后再注射IDR的裸鼠；肿瘤照片表示的是接种细胞11天后的肿瘤。

3、腹腔给予Ad-PDCD5 24h后给予低剂量IDR治疗抑制K562细胞在裸鼠体内生长

大量培养的对数生长期K562细胞，台盼兰活细胞计数后，离心收集，用无血清RPMI 1640洗涤，以1.5×10⁷个/点接种4-5周龄雌性裸鼠腋窝皮下，接种后第二天随机分为六组，分别隔日(24h)腹腔注射感染Ad-null及Ad-PDCD5(各3×10⁹TCID₅₀/ml)各2组共4次，不感染组作为对照，感染24h后，分别隔日腹腔注射给予低剂量IDR(375μg/Kg体重/次)共4次，观察其在裸鼠体内生长情况(裸鼠接种细胞前2天开始腹腔注射给予环磷酰胺100mg/Kg体重/次，共2次)。结果如图11所示，在接种K562细胞后第7、9、11天时，Ad-PDCD5+IDR组的肿瘤明显小于Ad-null+IDR组的肿瘤，Ad-null+IDR与Ad-PDCD5+IDR组相比，P小于0.01。图11中，Control表示接种K562细胞的裸鼠；Ad-null表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-null的裸鼠，Ad-PDCD5表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-PDCD5的裸鼠，IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射IDR的裸鼠，Ad-null+IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-null和再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-PDCD5和再注射IDR的裸鼠；肿瘤照片表示的是接种细胞11天后的肿瘤。

4、腹腔给予Ad-PDCD5 24h后给予低剂量IDR治疗，结束治疗后24h的瘤体组织内细胞凋亡情况

具体的实验方法同步骤3。结束治疗后24h处死裸鼠，肿瘤组织用4％甲醛固定，常规制备蜡块及切片，按TUNEL试剂盒(Invotrogen公司)操作说明进行组化染色，显微镜下以×250，视野范围0.72mm²下计数3个视野内的TUNEL阳性细胞数，取其平均值代表每张切片TUNEL阳性细胞数，在接种K562细胞后第11天时，实验各组肿瘤组织内细胞凋亡情况总结如图12。Ad-PDCD5+IDR组的肿瘤组织凋亡细胞明显多于Ad-null+IDR组的肿瘤组织凋亡细胞，分别为47.7凋亡细胞/视野，22.3凋亡细胞/视野，P小于0.01。

图12中，Control表示接种K562细胞的裸鼠；Ad-null表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-null的裸鼠，Ad-PDCD5表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-PDCD5的裸鼠，IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射IDR的裸鼠，Ad-null+IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-null和再注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接种K562细胞后再腹腔注射Ad-PDCD5和再注射IDR的裸鼠；肿瘤组化照片表示的是接种细胞11天后的肿瘤组织内细胞凋亡情况。

5、局部给予Ad-PDCD5 24h后腹腔给予低剂量IDR抑制其在裸鼠体内生长

大量培养的对数生长期K562细胞，台盼兰活细胞计数后，离心收集，用无血清RPMI 1640洗涤，以1.5×10⁷个/点接种4-5周龄雌性裸鼠腋窝皮下，接种后第2天随机分为2组，分别隔日(24h)在接种局部注射Ad-null及Ad-PDCD5(各3×10⁹TCID₅₀/ml)共4次，感染24h后，分别隔日腹腔注射给予低剂量IDR(375μg/Kg体重/次)共4次，观察其在裸鼠体内生长情况(裸鼠接种细胞前2天开始腹腔注射给予环磷酰胺100mg/Kg体重/次，共2次)。结果如图13所示，表明在接种K562细胞后第19、21、22天时，Ad-PDCD5+IDR组的肿瘤明显小于Ad-null+IDR组(P小于0.01)。

图13中，Ad-null+IDR表示接种K562细胞后在接种局部注射Ad-null和再腹腔注射IDR的裸鼠；Ad-PDCD5+IDR表示接种K562细胞后在接种局部注射Ad-PDCD5和再腹腔注射IDR的裸鼠；肿瘤照片表示的是接种细胞后第22天的肿瘤。

序列表

<160>1

<210>1

<211>378

<212>DNA

<213>人属人(Homo sapiens)

<400>1

atggcggacg aggagcttga ggcgctgagg agacagaggc tggccgagct gcaggccaaa 60

cacggggatc ctggtgatgc ggcccaacag gaagcaaagc acagggaagc agaaatgaga 120

aacagtatct tagcccaagt tctggatcag tcggcccggg ccaggttaag taacttagca 180

cttgtaaagc ctgaaaaaac taaagcagta gagaattacc ttatacagat ggcaagatat 240

ggacaactaa gtgagaaggt atcagaacaa ggtttaatag aaatccttaa aaaagtaagc 300

caacaaacag aaaagacaac aacagtgaaa ttcaacagaa gaaaagtaat ggactctgat 360

gaagatgacg attattga 378

Claims

1、一种重组腺病毒，是将人PDCD5基因的表达盒插入Ad5的基因组DNA中得到的重组腺病毒；所述人PDCD5基因的表达盒包括启动子、人PDCD5的cDNA和终止子。

2、根据权利要求1所述的重组腺病毒，其特征在于：所述人PDCD5基因的表达盒中，启动子为MCMV启动子，所述终止子为SV40的终止子。

3、根据权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于：所述人PDCD5基因的表达盒还包括SV40 polyA信号序列。

4、根据权利要求1或2所述的重组腺病毒，其特征在于：所述人PDCD5基因的表达盒通过如下方法插入Ad5的基因组DNA中：将人PDCD5的cDNA插入pDC316的多克隆位点后再与Ad5基因组质粒pBHGIox(delta)E1，3Cre一起转化293细胞，培养被转染的293细胞，得到含有人PDCD5基因的重组腺病毒。

5、一种抑制肿瘤细胞生长和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物，它的活性成分为权利要求1至4中任一所述的重组腺病毒和治疗肿瘤的化疗药物。

6、根据权利要求5所述的药物，其特征在于：所述治疗肿瘤的化疗药物为VP-16，或Imatinib，或IDR。

7、根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于：所述肿瘤细胞为非实体瘤细胞。

8、根据权利要求5或6所述的药物，其特征在于：所述肿瘤细胞为实体瘤细胞。