CN1200096C - 含有人乳铁蛋白基因的重组甲醇毕赤氏酵母P.Pastoris - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种保藏号为CGMCC NO.0702的表达人乳铁蛋白的重组甲醇毕赤氏酵母菌株P.P020105。

Description

含有人乳铁蛋白基因的重组甲醇毕赤氏酵母P.Pastoris

技术领域

本发明涉及生物科学领域，具体涉及一种能高效表达人乳铁蛋白的重组菌株。

技术背景

乳铁蛋白是一种结合铁离子的糖蛋白，属于转铁蛋白家族。自从上世纪60年代以来，它在人乳中有较高的含量，已引起科学界广泛关注(Lnnerdal and Iyer，1995)。这种蛋白在所有的哺乳动物乳汁中都有发现，许多研究试图揭开乳铁蛋白的生物学功能(Reiter，1985；Sanchez et al.1992；Hambraeus and Lnnerdal，1994)，一般认为其功能与它较强的结合铁的活性有关。但也有发现其他的与结合铁离子无关的功能(Lnnerdal and Iyer，1995)。许多研究着对其结构进行了深入的研究(Steijns et al.2000)。乳铁蛋白主要存在于消化道、呼吸道、生殖系统等外分泌腺体密集的器官。这种分布提示乳铁蛋白具有非特异性免疫功能。人们不仅在乳腺中发现保护乳房的乳铁蛋白，在泪液、滑液、唾液、精液中也有存在，它是一种具有保护功能的蛋白(Inoue et al.1993)。表1列举乳铁蛋白在各种液体中的含量。乳铁蛋白还存在于血液中，中性粒细胞中也发现有乳铁蛋白，在发炎的部位，将加速合成并释放储存的乳铁蛋白(Britigan et al.1994；Levay & vilioen，1995)。

乳铁蛋白的浓度在整个泌乳期呈规律性变化(Schanbacher et al.1997)。奶牛在乳腺增殖期、初乳形成时期和乳腺衰退期，乳铁蛋白及其mRNA的浓度较高，而在正常的泌乳期乳铁蛋白的浓度降低，在这个时期酪蛋白的浓度升高。

表1.各种分泌液中乳铁蛋白的含量

分泌液    含量
	人初乳    ＞7mg/ml人常乳    ＞1mg/ml泪液      ＞2.2mg/ml精浆      ～0.4-1.9mg/ml滑液      ～10-80μg/ml唾液      ～7-10μg/ml牛初乳    ＞1.5mg/ml牛常乳    ＞20μg/ml

资料来源：Korhonen，1977；Amold et al.1979；Renner et al.1989；Levay & viljoen，1995.

乳铁蛋白可能具有生长因子的作用及保护非泌乳期乳腺和保护新生哺乳动物的作用(Steijns et al.2000)。

乳铁蛋白是一种单肽链蛋白，分子量约为80KD，含有约1-4个糖基化位点，糖基化位点的数量取决于不同的物种(Spik et al.1994)。牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白分别含有689个和691个氨基酸，氨基酸序列中有69％的残基相同(Pierce et al.1991)，Baker等人详细研究了牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白的3D构象(Haridas et al.1995；Moore et al.1997)。乳铁蛋白上结合的多糖基团结构随物种不同差别极大，在这方面Spik和Mootreuil的研究非常详细(Coclcleville et al.1992；Spik et al.1994)。

牛和人乳铁蛋白的3D结构非常相似，每个乳铁蛋白的分子包含两个同源结构域。分别在N端和C端。每个结构域分别包含两个亚结构域，两个亚结构域形成一个缝隙，缝隙中Fe³⁺离子与两个羧基结合。这些亚结构域分别叫N1、N2；C1、C2，牛乳铁蛋白的氨基酸序列1-9和251-233构成N1亚结构域，91-250构成N2亚结构域。345-431、593-676构成C1亚结构域。432-592构成C2亚结构域。氨基酸序列334-344形成一条绞链，行使结构域之间的开启和关闭功能。二级结构的稳定部分依赖半胱氨酸残基间形成的二硫键。亚结构域缝隙中与Fe³⁺结合有关的氨基酸残基主要是N端结构域中的Asp60、Tyr92、Tyr192、His253；C端结构域的Asp395、Tyr433、Tyr526、His595(Moore et al.1997；Haridas et al.1995)。

牛乳铁蛋白有5个N-糖基化位点，分别是Asn233、Asn281、Asn368、Asn476、Asn545，化学研究显示只有四个N-糖基化，而Asn281并未被使用。Asn476位点在不同物种的乳铁蛋白之间有极高的同源性。牛乳铁蛋白多糖基团主要有N-乙酰葡萄糖氨、N-乙酰半乳糖氨、半乳糖、果糖、甘露糖和神经氨酸(Spik et al.1994)。

在自然状态下，牛乳铁蛋白只有15-20％的铁饱和度，颜色为粉红色。色泽的深浅取决于铁饱和状态，小于5％铁饱和度的乳铁蛋白通常称为脱铁乳铁蛋白(apolactoferrin)，而铁饱和的乳铁蛋白通常称为全乳铁蛋白(hololactoferrin)。人乳中的乳铁蛋白主要是脱铁乳铁蛋白。

乳铁蛋白与铁离子的亲合力非常高，是血液中转铁蛋白的260倍。亲合平衡常数大约为10²⁰(Baker et al.1994)铁离子结合活性依赖于肽链上的羧基。用离子代换实验和定点突变实验证实：乳铁蛋白离子结合位点的大小、电荷数量、三维结构等都适合于结合Fe³⁺(Harrington et al.1987；Baker et al.1994；Brodie et al.1994；Faber et al.1997)。草酸能够将Fe^3-从乳铁蛋白中置换出来，但柠檬酸不能，在提取乳铁蛋白的过程中柠檬酸能结合乳铁蛋白，这反映了乳铁蛋白在乳汁中可能与有机酸结合在一起(Brodie et al.1994)。高浓度的柠檬酸能影响乳铁蛋白的结合铁能力(Reiter，1985)。

其他的阳离子也可以结合到分子缝隙中，这时可以用吸收峰的改变来检测。例如：Fe³⁺饱和的乳铁蛋白最大吸收峰为466nm，Cu²⁺饱和的乳铁蛋白最大吸收峰为434nm(Brodie et al.1994)。除了Cu²⁺离子外，乳铁蛋白也能结合Mn³⁺、Co³⁺、Zn²⁺。

利用定点突变技术，Ward et al.(1996)从转基因黄曲霉中纯化出突变C-和N-结构域的乳铁蛋白，将这两种乳铁蛋白的Fe³⁺结合位点的两个Tyr残基变为Ala残基，这项研究发现C端结构域与Fe³⁺的结合力大于N端结构域。

为研究牛、人乳铁蛋白N端结构域及铁结合位点，将30KD胰蛋白酶水解物N₄-N₂₈₈(包含亚结构域N₁、N₂)，和20KD胰蛋白酶水解物N₉₁-N₂₅₁(包含N₂)在以适当pH诱发的乳铁蛋白释放Fe³⁺的实验中，得出这样的结论，N₂中Asp60的缺失并不影响结合Fe³⁺的稳定性，此外还发现了N端结构域(30KD胰蛋白酶水解物)和C端结构域(50KD胰蛋白酶水解物)结合铁离子的稳定性相互促进。牛乳铁蛋白在pH小于4时开始释放Fe³⁺；而人乳铁蛋白在PH小于3时开始释放Fe³⁺，30KD胰蛋白酶水解物(N端结构域)在脱糖基化后丧失约50-100％的结合Fe³⁺活性(Legrand et al.1990)。对于脱糖基化的人乳铁蛋白未发现结合铁能力丧失(VanBerkel et al.1995)。

牛和人的乳铁蛋白的氨基酸组成请参阅表2，乳铁蛋白有较高的等电点，通过氨基酸组成推算的PI：牛乳铁蛋白为9.4，人乳铁蛋白为9.5。但实验的实测值与理论值相差较大，由于实验方法的差别，牛乳铁蛋白的等电点实测值约为8(Shimazaki et al.1993)。而人乳铁蛋白的等电点约为5.5-10都有报导。这种差别可能是因为分离蛋白的条件影响了N端精氨酸残基富含区域的状态。

 表2.牛乳铁蛋白和人乳铁蛋白中各种氨基酸残基的含量

氨基酸残基	牛乳铁蛋白	人乳铁蛋白
			丙氨酸脯氨酸精氨酸赖氨酸天冬酰氨缬氨酸色氨酸半胱氨酸苏氨酸异亮氨酸丝氨酸谷氨酰氨谷氨酸苯丙氨酸蛋氨酸亮氨酸甘氨酸酪氨酸天冬氨酸组氨酸氨基酸残基总数	67303954294713343615452940274654822369689	63354346334810323116502742305585421389691

资料来源：Pierce et al.(1991).

另外，中性粒细胞中的乳铁蛋白和乳腺分泌的乳铁蛋白经糖苷酶消化后，再做SDS-PAGE凝胶电泳时其性质略有差别：后者比前者小4KD。人、牛乳铁蛋白的凝集素结合特性也略有差别(Hurley et al.1993)。人、牛、猪的乳铁蛋白有共同的抗原决定簇(Magnusson et al.1990)。

人和牛的乳铁蛋白的N端都有较强的碱性区域，这与乳铁蛋白的许多结合特性有关，乳铁蛋白与细菌脂多糖有很高的结合能力。这取决于他的N1亚结构域，C结构域细菌脂多糖的结合能力比N结构域低100-130倍，与人乳铁蛋白结合位点是它的28-34氨基酸残基，与牛乳铁蛋白的结合位点是它的17-41氨基酸残基(Elass-Rochardet al.1995)。将乳铁蛋白的N端部分切除后研究它与溶菌酶、脂多糖、肝素，DNA的结合能力发现乳铁蛋白与这些分子的结合能力与Fe³⁺的饱和度无关，但是删除任何一个精氨酸残基(Arg²、Arg³、Arg⁴、Arg⁵)将降低它与上述分子的亲和力，切除越多，亲和力丧失越多。如果将N端的前五个氨基酸全部切除(Gly¹-Arg²-Arg³-Arg⁴-Arg⁵)将丧失全部结合能力。这说明N端的四个精氨酸残基参与宿主的防御功能(Van Berkel et al.1997)。去除N端精氨酸残基还会导致乳铁蛋白与T-细胞结合能力的降低(Legrand et al.1997)。

由于乳铁蛋白最初被分离出来并确定为铁离子结合蛋白，早期的功能方面的研究大多与此特性有关。因乳铁蛋白在某些物种的乳汁中含量很高，该蛋白的功能被认为是在母婴之间运送Fe³⁺；乳铁蛋白的铁饱和程度较低，某些研究者认为它的主要功能是抑制细菌，这种假设得到体外实验的证实；因为乳铁蛋白与Fe³⁺的结合程度高，所以有些研究者认为它具有消除体内自由基的功能。中性粒细胞在被激活的时候释放大量的乳铁蛋白，因此该蛋白又参与体内的非特异性免疫。

有些研究者发现乳铁蛋白有一些与铁离子结合无关的活性，比如具有生长因子的一些特征；在免疫系统中的有些功能不依赖于Fe³⁺的饱和程度等。表3总结了最近发表的一些证明乳铁蛋白具有多种功能的文章。需要说明的是这些生物学功能并不是孤立的，比如乳铁蛋白可以通过调节生长来影响宿主免疫。乳铁蛋白还有一些其他的作用，随着研究的深入，将被不断发掘出来。

  表3.乳铁蛋白的各种生物学功能

活性    机理                          参考文献

Fe³⁺吸 增加Fe³⁺的溶解度、受体介导吸 Kawakami et al.1988，1993；Mikogami et al.

收      收                            1995

抗氧化  降低Fe³⁺浓度                 Matsue et al.1994，1995

抗菌    降低环境Fe^3-浓度，破坏细胞膜 Reiter，1985；Naidu and Amold，1997

抗病毒  抑制病毒吸附                  Harmsen et al.1995；Marchetti et al.1996；Yi et

                                      al.1997

调节免  激活NK细胞，促进T-细胞成      Zimecki et al.1991；Cohen et al.1992；Mattsby-

疫          熟                        Baltzer et al.1996；Shimizuet al.1996

生长因  调节基因表达                  Berseth et al.1983；Heird et al.1984；Nichols et

子                                    al.1987；Nichols et al.1990

抗癌    尚未知                        Bezault et al.1996；Sekine et al.1997；Yoo et al.

                                      1997

早期的研究者观察到以下两个事实：首先，人乳中含有大量的乳铁蛋白，而且人乳中含有的绝大部分Fe³⁺都结合在上面(Franssonand Lnnerdal，1980)；其次，虽然人乳中Fe³⁺含量较低，母乳喂养的婴儿至少在六个月以前不会缺铁(Duncan et al.1985；Lnnerdal et al.1994；Siimes et al.1984)。很容易得出乳铁蛋白促进铁吸收的结论。有些实验得出不一致的结论(Scott，1989；Davidson et al.1990)，但是以下的事实支持乳铁蛋白促进铁吸收的结论：

a.肠表皮细胞能将乳铁蛋白携带的Fe³⁺释放出来(Levayand Viljoen，1995)，

b.肠表皮细胞对乳铁蛋白的吸收能力很强(Levay andViljoen，1995)，

c.婴儿从尿中排出的Fe³⁺与母乳中乳铁蛋白的含量及母乳的摄取量成正相关(Masson et al.1971)；

d.乳铁蛋白携带Fe³⁺穿梭于小肠肠腔和表皮细胞之间，Fe³⁺在肠内表皮细胞的内膜中聚积(Davidson et al.1989)；

e.食用配方奶粉和食用母乳的婴儿对比，虽然配方奶粉中的铁浓度远高于母乳，前者容易缺铁(Saarinen andSiimes，1977)。

乳铁蛋白与铁离子的亲合力非常高，是血液中转铁蛋白的260倍，亲合平衡常数大约为10²⁰(Baker et al.1994)。脱铁状态的乳铁蛋白具有广谱抑菌效果(Rainard，1986；Lnnerdal and Iyer，1995)。乳铁蛋白的抑菌作用不止限于它能阻断细菌的铁代谢，它能与革兰氏阴性菌的细菌脂多糖(LPS)结合，使脂多糖从细胞壁上释放出来，达到杀死细菌的效果(Ellison et al.1988)。乳铁蛋白还能与一组大肠杆菌的膜孔蛋白结合，从而改变膜的通透性(Erdei et al.1994)。

乳铁蛋白的杀菌作用主要是因为它具有N端碱性区域(Bellamyet al.1992；Tomita et al.1994；Kang et al.1996；Dionysius and Milne，1997；Hoek et al.1997)。通常将这一具有杀菌作用的肽段称为乳铁蛋白杀菌肽B(Lactoferricin B)该肽段与负责铁离子的结合的区域无关(Bellamy et al.1992)并且该肽段本身就具有广泛的抑菌效果(Saito et al.1991；Bellamy et al.1992)。

乳铁蛋白能促进中性粒细胞聚积并吸附于受伤的组织上，使粒细胞变粘，降低细胞表面电位，促进细胞通信。(Birgens，1984；Boxeret al.1982)。

乳铁蛋白能调节各种细胞因子，当血液中乳铁蛋白的含量低于10^-8M时，乳铁蛋白能抑制细胞因子IL-1、IL-2、TNF从白细胞中释放(Crouch et al.1992；Machnicki et al.1993)。当与细菌脂多糖结合时又促进上述细胞因子的释放(Paul et al.1993)。此外，还有报导说明乳铁蛋白能激活巨噬细胞(Silva et al.1989)。

早在上世纪八十年代，就有研究者发现，乳汁特别是初乳，有促进小肠生长的作用(Berseth et al.1983；Heird et al.1984)。后来发现胸苷掺入DNA的速度在乳铁蛋白存在的条件下加快，这种促进作用不依赖于乳铁蛋白的铁饱和程度(Nichols et al.1987)。有研究发现铁饱和的乳铁蛋白对小鼠胚胎细胞的DNA合成速度的影响是脱铁乳铁蛋白的四倍(Azuma et al.1989)。然而这种促进细胞增殖的作用并不能体现在癌细胞上，相反，它抑制癌细胞的增殖(Amouric et al.1984)。可能的解释是：有其他的因子协同乳铁蛋白的这种作用。

大量的实验证实乳铁蛋白具有多种生理作用，虽然现在用分解乳铁蛋白各个亚结构并研究每个部分的功能取得了一定的进步，乳铁蛋白整体在体内的功能还有待进一步研究。很久以来，如何获得廉价的人乳铁蛋白用于医疗目的对研究者来说是很困难的，转基因重组蛋白给人们提供了另一种人乳铁蛋白的来源。将来的几年里，对人乳铁蛋白的需要将会导致转基因重组蛋白的研究成为热点。

酵母菌是一类低等真核生物，它不仅具有类似原核生物的生长特性，还具有一般真核生物的分子生物学和细胞生物学特性。酵母表达系统是近几年来迅速发展起来的，具有诸多优点的表达系统。在表达真核细胞外源蛋白时，不仅具有原核生物生长快、操作简单的特点，还具有各哺乳类细胞的翻译后加工和修饰的功能，从而表达有生物活性的蛋白。长期以来，酿酒酵母作为一种基因工程表达系统为基础研究和基因工程的菌株和疫苗的产业化作出了巨大贡献，但酿酒酵母表达系统存在一些局限性，主要表现在：①酿酒酵母是一种以发酵为主的酵母，在采用常规的通气发酵条件下，酿酒酵母所能达到的生长速度和密度并不高。②外源基因不稳定，容易丢失。③蛋白质过度糖基化。④蛋白质翻译后的加工与高等真核生物有所不同(Romanos et al.1992)。因而促使人们寻找和建立新的载体-宿主系统，Pichia Pastoris就是在这种情况下产生的一种可代替酿酒酵母的新型表达系统。Pichia Pastoris有两种优势是无可比拟的：成熟的发酵方法和甲醇诱导启动子。自从70年代以来，PichiaPastoris就被用做生产单细胞蛋白(SCP)(Wegner，1983)，发酵液中细胞干重可达100g/L的密度，发酵方法已经相当完善。其培养基是无机盐、微量元素、生物素及碳源，这些原料廉价、无毒。

P.Pastoris AOX1基因的启动子是该表达系统的关键，克隆AOX1基因是通过甲醇、乙醇分别培养后的细胞的cDNA文库差异筛选获得的。然后根据已知AOX蛋白序列进一步确定AOX1基因(Ellis et al.1985)。进一步研究发现，P.Pastoris还能表达另一种甲醇氧化酶AOX2(Cregg et al.1989)。AOX1和AOX2蛋白序列有97％相同(Cregg etal.1989；Koutz et al.1989)。AOX1缺失的突变体在甲醇为单一碳源培养基上生长缓慢，因此，AOX1在甲醇代谢时起决定作用。这也是将AOX1的启动子用于外源基因表达的原因(Cregg et al.1993)

外源基因的分泌表达，不仅方便了表达产物的分离纯化，同时也和表达产物的翻译后正确加工有关。外源蛋白分泌时利用分泌信号表达蛋白并沿一定的途径分泌到细胞外，利用外源基因本身的分泌信号或酵母的分泌信号都已成功表达了大量外源基因。但是利用外源蛋白的天然信号肽分泌表达外源基因时有可能表达量低，表达产物也极有可能不能正确加工。例如在转位酶(invertase)的表达中就遇到这种情况(Tschopp et al.1987)。

在构建表达载体时，一般利用酵母本身的分泌信号，如把酿酒酵母(S.cerevisiae)的2-mating factor信号序列装进表达载体，它虽然是含有89个氨基酸的短肽，却能有效地介导外源蛋白的分泌。不过在外源蛋白与信号序列融合时，需要谨慎地保留与KEX2蛋白酶切位点相连的Glu-Ala间隔区，该间隔区在此能够帮助缓解由于融合蛋白而引起的空间位阻，因而使毕赤氏酵母KEX2蛋白酶能对原氨基酸序列进行有效的切割，继而，Glu-Ala间隔区被双肽酶(DAP)切除，这样不会使目的基因在N-末端添加不必要的氨基酸残基(Vedvick et al.1991；Clare et al.1991)。

在毕赤氏酵母中表达外源基因的质粒载体有许多共同特性(表1)外源基因表达框架一般包含毕赤氏酵母(P.Pastoris)的AOX1启动子，后面是克隆位点，用于插入外源基因，再后面是毕赤氏酵母(P.Pastoris)的AOX1基因转录终止序列。许多载体上还有P.Pastoris的HIS4基因，可用于营养缺陷型his4突变体菌株的筛选。一些载体上还有AOX1基因3′下游序列用于同源置换AOX1基因的3′端。分泌型表达载体在AOX1基因的启动子后面紧跟一个分泌信号，一般为2-mating factor分泌信号或酸性磷酸酶基因(acidphosphatase)的分泌信号(PHOI)。

表1.常用毕氏酵母表达载体

载体名称    筛选标记     特点                             参考文献

胞内型

pHIL-D2     HIS4         使用Notl酶切可在AOX1位点         Higgins and Cregg，1998

                         插入目的片段

pAO815      HIS4         由BglII和BamH I酶切产生          Cregg et al.1993

                         多拷贝表达框

pPIC3K      HIS4和kan^r  提供外源基因插入的多克隆位点     Scorer et al.1994

                         G418筛选多拷贝菌株

pPICZ       ble^r        提供外源基因插入的多克隆位点     Higgins and Cregg，1998

                         Zeocin筛选多拷贝菌株

                         外源蛋白可融合His6和myc尾巴

pHWO10      HIS4         表达受控于组成型启动子GAP        Waterham et al.1997

pGAPZ       ble^r        表达受控于组成型启动子GAP        Higgins and Cregg，1998

                         提供外源基因插入的多克隆位点

                         Zeocin筛选多拷贝菌株

                         外源蛋白可融合His6和myc尾巴

分泌型

pHIL-S1     HIS4         AOX1启动子融合酸性磷酸酶分泌信号 Higgins and Cregg，1998

                         提供Xho I，EcoR I和BamH I位点

                         插入外源基因

pPIC9K      HIS4和kan^r  AOX1启动子融合α分泌信号         Scorer et al.1994

                         提供Xho I，EcoR I，Not I和SnaB I

                         位点插入外源基因

                         G418筛选多拷贝菌株

pPICZα            ble^r        AOX1启动子融合α分泌信号         Higgins and Cregg，1998

                         提供外源基因插入的多克隆位点

                         Zeocin筛选多拷贝菌株

                         外源蛋白可融合His6和myc尾巴

pGAPZα            ble^r        GAPp启动子                       Higgins and Cregg，1998

                         GAPp融合α分泌信号

                         提供外源基因插入的多克隆位点

                         Zeocin筛选多拷贝菌株

                         外源蛋白可融合His6和myc尾巴

生化研究发现，甲醇代谢是通过一种代谢途径进行的(Veenhuset al.1983)从表达系统的角度看，最吸引人的是甲醇代谢的第一个酶—甲醇氧化酶(AOX)。它是个诱导酶，在含有葡萄糖、甘油或乙醇的培养基中AOX没有表达，但是在以甲醇为单一碳源的培养基中它可以达到细胞干重的30％(Couderc and Baratti 1980)。根据这个特点，人们已经把高诱导及严紧调控的甲醇氧化酶基因的启动子(P_AOX1)用来构建表达外源蛋白的载体。已见报导的产量较高的蛋白见表2：

         表2毕氏酵母高表达外源蛋白例举

蛋白名称       表达量(克/升)      胞内/分泌    基因型(对甲醇代谢)  参考文献

转位酶         2.3                分泌         耐受                Tschopp et al.1987

α淀粉酶       2.5                分泌         敏感                Paifer et al.1994

百日咳抗原P69  3.0                胞内         敏感                Romanos et al.1991

破伤风毒素C    12.0               胞内         耐受                Clare et al.1991

HIV-1gp120     1.25               胞内         耐受                Scorer et al.1993

肿瘤坏死因子   10.0               胞内         敏感                Sreekrishna.1989

在多拷贝外源基因表达框架中添加抗性基因用以筛选多拷贝外源基因整合的酵母株。一组质粒(如pPic9K，pPic3K)里面含有卡那抗性基因，利用G418抗性梯度筛选实验，可以获得多拷贝外源基因克隆(Clare et al.1991)。类似的还有Zeocin抗性基因(sh ble)，该基因较小，仅有375bp，可以在大肠杆菌(E.coli)、酵母等生物体内发挥作用。这些特点非常适合构建表达载体。

在有些条件下利用甲醇诱导表达是有问题的或是对P.Pastoris有毒害的，现在又发展了利用磷酸甘油醛脱氢酶(GAP)基因启动子的表达系统(Waterham et al.1997)。

所有的表达菌株来源于NRRL-Y 11430(Northern RegionalResearch Laboratories，Peoria，IL)如表格3，大多数是组氨醇脱氢酶基因(HIS4)缺陷型。这可以很方便地利用回复突变体进行筛选，这些细胞在基本培养基上必须添加组氨酸才能生长。

              表3毕氏酵母表达菌株

菌株名称          基因型          表型               参阅

Y-11430           野生型          NRRLα

GS115             his4            Mut⁺His^-         Cregg et al.1985

KM71              aox1Δ∷SARG4   Mut^sHis^-         Tsehopp et al.1987

                  his4 arg4

MC100-3           aox1Δ∷SARG4   Mut^-His^-         Cregg et al.1989

                  aox2Δ∷Phis4

                  his4arg4

SMD1168           pep4Δhis4      Mut⁺His^-         Higgins and Cregg 1998

                                  Protease deficient

SMD1165           prb1his4        Mut⁺His^-         Higgins and Cregg 1998

                                  Protease deficient

SMD1163           pep4 prb1his4   Mut⁺His^-         Higgins and Cregg 1998

                                  Protease deficient

根据一个或两个AOX基因缺失可以将表达菌株分为三类(Mut⁺、Mut^s、Mut^-)，它们利用甲醇的能力不同，通常删掉AOX基因的酵母能更好地表达外源蛋白(Tschopp et al.1987；Cregg et al.1987；Chirulova et al.1997)。Mut⁺基因型的典型代表是GS115，其AOX1和AOX2两个基因与野生型一致。Mut^s基因型的典型代表是KM71，由于它的AOX1基因被部分删除而代之以酿酒酵母(S.Cerevisiae)的ARG4基因，因此，其基因型为his4 arg4 aox1Δ∷ARG4由于该酵母株只能依赖相对较弱的AOX2基因，其利用甲醇的速度较慢(Cregg and Madden，1987)。MC100-3是Mut^-基因型的酵母，由于它的AOX1、AOX2基因都已被删除，因此这类酵母不能在以甲醇为单一碳源的培养基上生存(Cregg et al.1989；Chirulovaet al.1997)。SMD系列菌株，蛋白酶被删除，适用于易被降解的外源蛋白表达(Higgins and Cregg，1998)。

与酿酒酵母(S.Cerevisiae)一样，线性载体DNA通过其两端和毕赤氏酵母(P.Pastoris)共有的序列同源组能产生稳定的转化酵母株(Cregg et al.1985；Cregg et al.1987)。所有的P.Pastoris表达载体至少含有一个P.Pastoris DNA的片段(如AOX1或GAP启动子)，内部至少有一个酶切位点，用于整合入酵母基因组。有些载体包含P.Pastoris的HIS4基因，也可用于整合酵母基因组HIS4位点。含有3’AOX1序列的表达载体可以以单点交叉整合入AOX1位点或HIS4位点，也可以以基因置换的方式整合入AOX1位点。后者引起AOX1基因的删除，所以表型是His⁺/Mut^s。

转基因毕赤氏酵母的筛选通常用his4基因的回复，进一步的筛选通常用PCR技术或Southern杂交技术(Clare et al.1991；Romannoset al.1991)，或者，直接用筛选产物的方法(Sreekrishna et al.1989；Wung and Gascoigne，1996)。通常转基因酵母中有1-10％的多拷贝转化几率(Sreekrishna et al.1989)，但是多拷贝转化体不一定高产，需要实验确定高产株。筛选高产株的方法还可以用G418或Zeocin抗性梯度筛选，高抗株一般含有5个以上的拷贝(Clare et al.1991)，若要筛选到30个以上的拷贝数还要进行严格的Southern杂交。

不同的酵母细胞系，既使用相同的表达质粒转化，其外源蛋白的表达量也不尽相同，这样必须做大量的筛选工作已确定哪一种菌系表达量最高。但是由于摇瓶培养和发酵罐培养的条件相差太大，这种筛选工作有时也是徒劳的。小量摇瓶的条件参数目前已被确定(Barr et al.1992)这包括：培养基对菌密度的缓冲能力；控制合适的pH以抑制外蛋白酶；充足的氧气；适量的胰蛋白酶水解物或酪蛋白氨基酸以抑制外蛋白酶活性并提供能量。

毕赤氏酵母的高密度发酵条件和工艺已经被详细探讨(Siegeland Brierley 1989；Brierley et al.1989；Brierley et al.1990；Siegel et al.1990)比较好的例子是AOX1基因被删除的表达菌系。细胞总量在含甘油的培养基上迅速增长，在此阶段，外源蛋白的表达被完全抑制，当甘油消耗完全后，甲醇的加入可诱导外源蛋白的表达，同时细胞总量有微弱升高(Cregg et al.1993)。

由于删除AOX1基因的菌系代谢降低，达到最大外源蛋白产量需用150～200小时(Tschopp et al.1991)这个问题目前可以使用野生型菌种发酵生产来解决。改进发酵条件也可以解决。(Siegel andBrierley 1989；Brierley et al.1989；Brierley et al.1990；Siegel et al.1990)这种发酵方法的大意是：当达到甘油耗尽时的生长限制期时，或者以生长限制速率供给甲醇，或者甲醇和甘油同时以生长限制速率提供，这样可以使表达菌系的代谢增强，产物明显增多。

高密度发酵分泌型蛋白随着细胞密度增加，外源蛋白含量增加。但是外蛋白酶含量也增加，有些产物明显降解。如EGF(Clare et al.1991；Siegel et al.1990)有三种方法可以减缓外蛋白酶的影响：第一种是添加蛋白水解物或其他饱含氨基酸及短肽的物质以竞争性抑制蛋白酶(Barr et al.1992)；第二种方法是调节pH值，蛋白酶在pH＜6.0活性较低(Siegal et al.1990)；第三种方法是使用删除PEP4基因的菌系，PEP4基因编码一种胞内蛋白酶，这种蛋白酶可以激活一系列其他蛋白酶(Hirsh et al.1989)。以上这三种方法可以同时使用，以获得最高产量。

酵母在分泌外源蛋白的过程中，对外源蛋白的一系列切割、糖基化、形成二硫键过程使酵母的表达系统极有价值。分泌型表达比组成型表达在纯化方面更具优势。

用毕赤氏酵母分泌表达蛋白不管其性质如何，以下的纯化方法在大多数情况下是适用的。首先，将酵母与培养液离心分离，培养液用50mM醋酸钠(pH5.0)以1∶1的体积比稀释，过合适的层析柱，并用NaAc缓冲液清洗层析柱，最后用0-1M的NaCl梯度洗脱。这样处理的样品，蛋白质纯度可达90％以上，蛋白再通过疏水层析柱(HIC)用0～40％(NH₄)₂SO₄洗脱后，纯度可提高到95％(Creggetal.1993)。当然，不同的蛋白有不同的特性，要根据不同蛋白的分子量、等电点、亚基结合状态等特点设计纯化方法。

酿酒酵母(S.cerevisiae)表达系统表达的蛋白质和毕赤氏酵母(P.pastoris)表达系统表达的蛋白质在糖基化上有显著的不同(Tschopp et al.1987；Grinna and Tschopp，1989)。通过对毕赤氏酵母、酿酒酵母变位酶(invertase)的研究发现，毕赤氏酵母分泌蛋白的寡糖链长度远小于酿酒酵母，毕赤氏酵母的转位酶绝大部分糖基化水平在Man_8-14GlcNAc₂(Man：甘露糖、GlcNAc₂：N-乙酰葡萄糖胺)而酿酒酵母表达的蛋白只有约20％在这个范围(Grinna andTschopp，1989；Byrd et al.1982；Trimble et al.1991)。通过研究P.pastoris和S.cerevisiae糖蛋白发现P.pastoris表达蛋白的寡糖链最长的只有约30个甘露糖基，而S.cerevisiae的寡糖链通常在50-150个甘露糖基左右(KuKuruzinska et al.1987；Byrd et al.1982)。通过一维和二维核磁共振图谱研究寡糖链的结构发现P.pastoris和S.cerevisiae的寡糖链有明显的不同，P.pastoris和S.cerevisiae的转位酶最显著的区别是：P.pastoris分泌的转位酶没有α1，3-连接的末端甘露糖，这一点意义重大，酿酒酵母表达的蛋白主要是由于其末端的α1，3-连接的末端甘露糖使得其具有很高的抗原性从而限制了它在医药上的应用(Cregg et al.1993)

发明内容

本发明的目的是提供一种可高效表达人乳铁蛋白的重组甲醇毕赤酵母。其具体的发明步骤如下：

1从cDNA文库筛选hLF基因克隆

乳铁蛋白在人乳房中含量较高(Levay and Viljoen，et al.1995)，相应的，其mRNA的含量也较高。考虑到合成一段探针用于筛选文库不是太经济，用引物P1/P2来筛选噬菌体文库。用单引物对照来去除筛选到的一些可能是单引物的反应产物，以10倍的引物比验证出现特征片段对两条引物的依赖性，用以上方法筛选到一株阳性噬菌体PCR验证实验如图1所示，泳道5所示1.0kb的片段可能就是人乳铁蛋白基因的一部分，进一步需要测序验证。

换用引物P3/P4来进一步鉴定该噬菌体克隆，得到一个约2.1kb的片段，与预期产物的大小相符(如图2所示)。

将该克隆测序，测序引物为M17通用引物，该DNA序列分析表明，该cDNA克隆长度约2.5kb，接近全长。用DNAssist(v1.02)软件将获得的序列与Gene Bank中Rey等人的序列对比，结果显示：

our seq     1                                                     0

rey′s seq  1    GACTCCTAGGGGCTTGCAAACCTAGTGGGAGAGAAAGAACATCGCAGCAGCCAGGCAGAAC         61

由上可知，该克隆是个全长cDNA克隆，共有14个碱基与Rey等人的序列不同，这种差异可能反映了基因序列的多态性，我们进一步研究成熟蛋白序列的差别：

从两个蛋白序列的对比中可见，与Rey的cDNA序列的14处差异中，共有9处差异导致氨基酸的变化，其余碱基的变化并未导致氨基酸的改变。改变的氨基酸中，有两处是赖氨酸变为精氨酸(29位与164位)；另外有两处的氨基酸改变也不涉及氨基酸的理化性质(94位酪氨酸变为半胱氨酸、561位天冬氨酸变为谷氨酸)。与铁离子结合相关的氨基酸残基(Asp，Tyr，Tyr，His)(Spik et al.1994)不在这些差别之中，说明这些氨基酸残基是保守的。

2 hLF基因亚克隆到pPIC9质粒中

首先，用DNAssist软件分析我们克隆到的hLF基因的内切酶图谱，用于在亚克隆操作时区别使用内切酶，得到如图3所示内切酶图谱。质粒pPIC9的多克隆位点内切酶依次是Xho I、SnaB I、EcoRI、Avr II、Not I。我们选择Xho I和Not I两个内切酶插入hLF基因，设计两个引物P9a和P9b分别带有两个位点并沿着α分泌信号的读码框，截取hLF基因中的功能蛋白cDNA序列。PCR产物连接入pPIC9质粒中，酶切质粒，结果如图4所示。质粒pPIC9上有两个BglII位点，分别在+1和+5621(以5’AOX1启动子为起点)，hLF基因内部有两个Bgl II位点，分别在+890和+1500(以hLF功能蛋白cDNA起点为+1)，hLF基因克隆在α分泌信号(+949-+1218)后面，单酶切会产生0.61kb、2.10kb、2.41kb、4.97kb四个片段，实验结果与之相符(lane 5)。hLF功能蛋白cDNA内部+1534位置有一EcoRV位点，pPIC9质粒内部+1749和+5574各有一个EcoRV位点，在pPIC9质粒内部-6788位置有一Not I位点，两个酶双酶切会产生0.52kb、0.77kb、3.82kb、4.96kb四个片段，实验结果与之相符(lane3)。我们在亚克隆hLF基因时两端使用Xho I+Not I两个内切酶，lane4与之相符。

构建好的质粒经过测序(BioAsia公司 上海)，证明碱基顺序和读码框都是正确的。

3 重组质粒转入酵母中

线性载体DNA通过其两端和毕赤氏酵母(P.Pastoris)共有的序列同源组能产生稳定的转化酵母株(Cregg et al.1985；Cregg et al.1987)。将重组质粒用内切酶Sal I切成线形DNA，以电转化法转化毕赤氏酵母株KM71，该外源DNA能使KM71酵母株的his 4基因回复成有功能的基因，这样可以在不含任何氨基酸的最小培养基上生长(图5)。该重组毕赤氏酵母菌株已于2002年1月24保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCCNO.0702。

用这种方法，我们共筛选到326株阳性克隆。用摇瓶高密度培养转化酵母并诱导表达hLF基因，蛋白电泳筛选高产株，我们得到226、153、216等二十余个高表达酵母株电泳筛选，如图6所示。

通过PCR进一步鉴定阳性酵母株，用AOX1启动子内部的部分序列为5’引物(P5’_AOX1)、AOX1基因终止序列内部的部分序列为3’引物(P3’_AOX1)。由于我们外源DNA插入his4位点，阳性克隆PCR的结果应该有一条约2.5kbp的[α分泌信号-hLF cDNA]融合片段和一条约0.9kbp的AOX1功能基因被删除后的[5’AOX1-3’AOX1]融合片段，实验结果与之相符，如图7所示。

通常认为多拷贝插入的菌株都是高产的(Brierley et al.1994；Clare et al.1991；Scorer et al.1993；Scorer et al.1994)，一般5个以上的拷贝在所有转基因株中占10％(see：Pichia Expression KitInstruction manual)。将我们筛选到的较高产的菌株226按照3.3、3.4的方法提取DNA并做Southern杂交，验证外源基因的插入和拷贝数，结果如图8所示。

如图8所示，lane 4的结果印证了hLF基因在构建表达质粒时使用的内切酶位点，杂交带的大小为2.1kbp。lane 5、6的结果与质粒内切酶位点和插入基因内切酶位点吻合，印证了图4的结果并证明拷贝数大于3(lane1显示至少有三个位点插入了外源片段)，lane1的两条较小的杂交带说明可能有外源基因片段插入his4位点以外的区域或者是内切酶的star活性造成的。

4 hLF基因在转基因酵母中的表达

毕赤氏酵母在有其他碳源时抑制AOX1启动子，当在以甲醇为唯一碳源的培养基中它下游的基因表达的蛋白可以达到细胞干重的30％(Couderc and Baratti 1980)。根据这一特性，首先将转基因酵母在YPD培养基上使之菌密度达到OD：5～6，然后浓缩十倍体积并添加诱导物，使酵母在高密度环境下诱导表达hLF基因。这样即可以使用较小的设备和较少的培养基，关键还简化了纯化步骤。我们使用的酵母株是KM71，基因型是Mut^s，由于利用甲醇的速度比较慢，所以它在以甲醇为单一碳源时代谢较缓慢，这样使得诱导期较长，通常需要3～5天。在诱导前和诱导24小时时取样，提取酵母株226总RNA Northern杂交检测hLF基因的表达，结果如图9所示。

如图9所示，转hLF基因的毕赤氏酵母在含有丰富氨基酸的YPD培养基上生长时hLF基因的表达受到完全的抑制，转入以甲醇为唯一碳源的培养基上后强烈诱导该基因的表达。

表达的蛋白的产量和完整性是我们关心的，毕赤氏酵母在分泌表达本身就是体外蛋白或分泌过程没有受阻的蛋白时产量一般都在1g/L以上，我们根据蛋白电泳的结果半定量推算的产量226菌株大约500～1000mg左右。分泌蛋白的Western杂交结果如图10所示。

如图10所示，hLF基因的表达蛋白产量在500mg/L左右，表达的蛋白分子量大小与天然人乳铁蛋白相近，标准品在处理过程中有所降解。

直接用酵母诱导培养液电泳的杂交结果由于受浓度限制，杂交条带并不明显，我们将诱导培养液透析浓缩了100倍，上样量与上相同，得到如图11所示实验结果。

如图11所示，重组人乳铁蛋白在浓缩过程中遭到强烈的降解，当然在其中有自发降解的因素，对此合理的解释是：透析过程除区了培养液中的蛋白酶抑制剂并使溶液pH升高，这些条件下会激活毕赤氏酵母的外蛋白酶。目前已经有蛋白酶缺失的菌株，我们准备再做一株这样的菌株来进一步节省生产成本。

总之，乳铁蛋白在人乳房中含量较高相应的，其mRNA的含量也较高。考虑到合成一段探针用于筛选文库不是太经济，从基因内部取两段合适的引物截取1k bps左右的片段来筛选噬菌体文库。筛选到一株阳性噬菌体。

序列中共有14个碱基与Rey等人的序列不同，这种差异可能反应了基因序列的多态性。截取hLF基因中的功能蛋白cDNA序列连接入pPIC9质粒中。

通过电转化法得到300余株阳性酵母，通过产物筛选，我们得到226、153、216等二十余个高表达酵母株。

将转基因酵母在YPD培养基上使之菌密度达到OD：5～6，然后浓缩十倍体积并添加诱导物，使酵母在高密度环境下诱导表达hLF基因。时hLF基因的表达受到完全的抑制，转入以甲醇为唯一碳源的培养基上后强烈诱导该基因的表达。

毕赤氏酵母在分泌表达本身就是体外蛋白或分泌过程没有受阻的蛋白时产量一般都在1g/L以上，我们根据蛋白电泳的结果半定量推算的产量226菌株大约500～1000mg左右。分泌蛋白用Western杂交验证重组人乳铁蛋白。

附图说明

图1所示的是用P1、P2两个引物PCR筛选cDNA文库；

图2所示的是P3、P4两个引物进一步鉴定阳性克隆；

图3所示的是hLF基因的内切酶图谱；

图4所示的是质粒hLF/pPIC9酶切分析；

图5所示的是转基因示意图；

图6所示的是蛋白电泳筛选产人乳铁蛋白酵母株；

图7所示的是PCR鉴定转基因酵母株；

图8所示的是226菌株染色体DNA的Southern杂交；

图9所示的是226酵母株在诱导条件下表达hLF基因的Northern检测；

图10所示的是226菌株表达产物的Western杂交；

图11所示的是浓缩后的226菌株表达产物的Western杂交；

图12所示的是重组质粒hLF/pPIC9的亚克隆结构示意图。

具体实施方式

下面利用实施例对本发明作进一步说明：

实施例1 cDNA文库的操作

人乳腺癌cDNA文库购自Novagen公司商品名为Human BreastTumor cDNA Library in λSCREEN。经过验证，该文库的转化效率可以达到每微克10¹⁰个噬菌斑。

1.1准备感染噬菌体的细菌培养物

1、挑取ER1647菌株单菌落，接种于10mL含有0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄的LB培养基中，于37℃震荡培养过夜。

2、第二天，吸取500μl过夜培养物，接种于50mL LB培养基中(含有0.2％麦芽糖和10mM MgSO₄)，于37℃剧烈震荡培养2小时。

1.2铺制噬菌体平板

1、对噬菌体进行梯度稀释，噬菌体稀释于20mM Tris-HClpH7.4，100mM NaCl，10mM MgSO₄中，稀释倍数为1∶10⁵。

2、将100μl噬菌体稀释液与等体积的细菌培养物在5mL的容器中混匀，在37℃静止保温半小时。

3、加入于45℃保温的顶层胶，混匀后立即倒入37℃的新鲜LB平板上，顶层胶凝结后倒置放于37℃温箱中培养过夜。

1.3 PCR扩增h-LF基因的中间片段

1、按照Gene Bank查出的序列，从h-LF基因内部截取一段1k的片段，设计引物P1：5’-

GAGCCCATTGAGGCAGCTGTGGC-3’；P2：5’-

GTAAGGCTAGTGTCTGCTCTCCT-3’。

2、用以上引物和如下反应体系：1×PCR buffer；1pmol/L引物(每种)；200μmol/L dNTP(每种)；2μTaq酶；挑取单噬菌斑为模板，用水补足50μL的反应体系。

3、反应在PE2400型PCR仪上进行，首先94℃3分钟，其次，以94℃40秒、58℃40秒、72℃一分钟]进行35个循环，最后以72℃ 7分钟后4℃终止反应。

4、每个反应遇到有1k左右片段时再做单引物对照实验，该实验除以上反应外，设置等量的同种引物共做3个反应(P1/P1、P1/P2、P2/P2)，其余同上。

实施例2 质粒操作

2.1质粒的小量提取

1、LB培养基中接种单菌落，37℃振荡过夜。

2、在1.5毫升离心管中将两次离心所得3毫升菌液的菌体控干液体后加入100微升溶液I(50mmol/L葡萄糖、20mmol/LTris-Hcl pH8.0、10mmol/L EDTA pH8.0)重悬菌体，冰上放置一分钟。

3、加入200微升新配制溶液II(0.2mol/L NaOH、1％SDS)迅速上下颠倒5次，注意管底部分与溶液II充分混匀，之后放置冰上。

4、加入150微升冰预冷的溶液III(3mol/L KAc、2mol/L HAc)充分混匀10秒，于冰上放置3-5分钟。

5、4℃、1200g离心5分钟，将上清转移到另一离心管中并加入2微克RNA酶(Sigma)室温放置15分钟。

6、加入250微升Tris饱和苯酚，混匀后加入250微升氯仿。混匀后4℃、1200g离心1分钟。

7、将上清转移到另一离心管，加入500微升氯仿，混匀后4℃、1200g离心5分钟。

8、将上清转移到另一离心管(注意勿将下层有机溶剂吸起)加入2倍体积无水乙醇，混匀后混匀后4℃、1200g离心5分钟。

9、倒掉上清，加入1毫升75％乙醇，将沉淀充分悬起，然后4℃、1200g离心1分钟。

10、沉淀干燥后溶于50微升纯水中。

2.2质粒的酶切

1、将稀释到0.1～0.2ug/ul的质粒50ul加入5ul酶切缓冲液，并加入5u内切酶，37℃保温2小时，

2、琼脂糖电泳检测酶切反应是否完全。

3、双酶切时如果所用酶切缓冲液对两个内切酶不一致，则先进行一遍酶切之后，加入0.1体积5mol/L KAc用两倍体积乙醇沉淀，沉淀再用75％乙醇重悬沉淀，离心后将上清倒掉，干燥沉淀后将核酸稀释至0.2～0.3ug/ul加另一内切酶。

2.3新鲜感受态E.coli细胞的制备

1、将所有用到的玻璃器皿洗净后，用双蒸水装满，120℃灭菌30分钟。以确保无任何去污剂污染。配制新鲜LB，所用培养基均无任何去污剂污染。

2、挑选DH5α单菌落接种到1ml试管中37℃振荡过夜。次日在20ml新鲜LB培养基中接种过夜培养物20ul，37℃振荡2小时后将三角瓶置冰上放置10分钟。

3、配制冰预冷的、新鲜的、经过滤除菌的0.1mol/L CaCl₂50ml。

4、将菌液4℃、5000g离心10分钟，弃上清，并尽量控干离心管。

5、加入冰预冷的CaCl₂溶液20ml，重悬细菌。

6、4℃、5000g离心5分钟，弃上清，尽量控干离心管。

7、重复5、6，最后将菌液重悬于1mlCaCl₂中4℃放置过夜。

2.4质粒的连接、转化

1、在低熔点琼脂糖凝胶上，将需要的载体及待插入DNA片段于70℃将凝胶溶解。

2、按1∶2加入DNA结合缓冲液(Promega)在针管中混匀，并过柱。

3、70％乙醇2ml洗纯化柱2次。

4、将纯化柱于4℃、1200g离心5分钟除去残余乙醇。

5、20ul、80℃纯水将纯化柱洗脱。

6、电泳确定载体和待插入DNA片段的浓度。

7、将载体和待插入片段稀释到0.1ug/ul，并以摩尔比1∶5混匀，每个反应取8.8ul。

8、加入1ul的连接缓冲液，并加入1ul的T₄连接酶(用0.2ul5单位/微升T₄连接酶)。

9、6℃连接4小时后与3.1.3的新鲜感受态细胞混匀，并在冰上放置30分钟。

10、42℃热激90秒，冰上放置5分钟，加入1ml LB培养基，37℃培养30分钟。

11、离心、弃上清，用100ul LB重悬菌体，每20ul铺一块含有适当抗生素的9cm的LB平板。

12、挑取20个单菌落PCR鉴定重组质粒。适当的时候，测序鉴定。

2.5 hLF基因与pPIC9质粒的连接

1、设计引物P9a和P9b，在设计时去除hLF基因中分泌信号，以成熟人乳铁蛋白的Gly残基为起点，并保留a-分泌信号，保留与KEX2蛋白酶切位点紧密相连的Glu-Ala间隔区，使用pPIC9质粒上的XhoI和NotI两个酶切位点。

P_9a：5

TCT，CGA，GAA，AAG，AGG，CCG，TAG，GAG，AAG，GAG，TGT3′

P_9b：5′GCG，GCC，GCT，TAC，TTC，CTG，AGG，AAT，TCA，C3′

2、按下列体系扩增hLF基因：

1u Pfu聚合酶

dNTP每种30pmol/L

挑取模板DNA，并用水补足50ul

反应过程：94℃、2min——[94℃、40S——60℃、40S——72℃、2min](前面中括号内的循环要30次)——72℃、7min——4℃终止

3、反应产物加入1mlDNA结合缓冲液(Promega)在注射器中混匀后过纯化柱。

4、70％乙醇2ml洗纯化柱2次。

5、纯化柱于4℃、12000g离心10min。

6、用50ul、80℃纯水洗脱。

7、洗脱液加入1/10酶切缓冲液(Dbuffer，Promega)，并加入1ulXhoI、1ulNotI。

8、2小时后重复3-6的操作，纯化hLF扩增片段。

9、将pPIC9用XhoI和NotI酶切后，按3.2.4的方法纯化，并与hLF扩增片段连接，连接产物转化DH5a，筛选重组质粒。

实施例3毕赤氏酵母的电转化

3.1外源DNA的准备

1、提取重组质粒，按不同的插入方法酶切质粒成线状DNA，把hLF/pPIC9用SalI将其在HIS4中间位置切开。

2、按3.2.5 3-6的方法纯化外源DNA片段，并将浓度浓缩到0.5ug/ul。

3.2毕赤氏酵母感受态的制备

1、挑取毕赤氏酵母单菌落，在10mlYPD培养基中28℃，振荡培养48小时。

2、取1ml培养物接种到200mlYPD培养基中28℃，剧烈振荡4小时。

3、30ml菌液放冰上10min后，4℃、5000g离心5min，弃去上清，控干离心管中残留培养基。

4、用冰预冷的纯水30ml重悬菌体，4℃、5000g离心5min。弃上清，再重复一次。

5、用冰预冷的1mol/L的山梨醇10ml重悬沉淀，4℃、5000g离心5min，去上清。

6、用冰预冷的2ml lmol/L的山梨醇重悬沉淀，4℃、5000g离心5min，去上清。

7、菌体沉淀重悬在500ul 1mol/L的山梨醇中，放于4℃待用。

3.3电转化毕赤氏酵母

1、200ul感受态毕赤氏酵母中加入5ugDNA，混匀，在冰上放置30min。

2、转入2mm电转化池，将电转化仪(biorad)调至毕赤氏酵母档，电激。

3、转化物中加入1ml 1mol/L的山梨醇，混匀，取200ul的山梨醇液体铺平板培养。

实施例4  毕赤氏酵母核酸提取

4.1毕赤氏酵母染色体DNA的提取

1、挑取一个酵母单克隆，接种于50mlYPD培养基中，28℃振荡摇菌36小时(2OD600)。

2、取20ml 4℃、2500g离心5min。

3、弃上清，用10ml纯水重悬沉淀。

4、4℃、2500g离心5min。

5、弃上清，用0.4ml新配制的SZB溶液重悬菌体，并转入1.5ml离心管，37℃水浴40min。(SZB溶液：1M sorbital，10mMsodium citrate，pH7.5，10mM EDTA，10mM DTT，0.5mg/mlZymolyse)(Sigma)

6、加入0.4ml 1％SDS，轻轻混匀，在冰上放置5min。

7、加入0.3ml 5M KAc PH8.9，轻轻混匀。

8、10000g，4℃离心10min，将上清转到另一离心管。

9、加入2倍体积的乙醇，混匀，10000g、4℃离心10min。

10、弃上清，沉淀干燥后，溶解在0.7mlTE buffer中，加入1mgRNA酶，室温放20min。

11、加入0.3mlTris饱和酚，混匀，再加入0.3ml氯仿，混匀。10000g、4℃离心10min。

12、取上清加入等体积氯仿，混匀，10000g、4℃离心5min。

13、取上清加入0.1倍体积5M KAc，再加入2倍体积乙醇，混匀。10000g、4℃离心10min。

14、沉淀用75％乙醇重悬，10000g、4℃离心5min，弃上清。沉淀干燥，并保存于-70℃。

15、使用时，用纯水将沉淀溶解即可。

4.2毕赤氏酵母总RNA的提取

1、挑取酵母单菌落，接种于50mlYPD培养基中，在28℃，振荡培养36小时。

2、取20ml菌液于4℃、2000g离心10min，弃上清。

3、加入20ml纯水，重悬菌体，于4℃、2000g离心10min，弃上清。

4、菌体重悬于1ml纯水中，转入1.5ml离心管，在4℃、2000g离心10min，弃上清。

5、加入1ml Trizol(GEBCAL.BRL)混匀，放于65℃、2min。立即转入-70℃，放置2min。

6、加入0.2ml氯仿，混匀，4℃、10000g离心5min。

7、上清转入另一离心管，加入2倍体积乙醇，-70℃保存。

8、用前，离心，晾至半干后，加入适量纯水溶解。

实施例5核酸杂交

5.1Southern杂交

5.1.1DNA的酶切，电泳及向尼龙膜转移

1、取适量DNA样品，稀释到约0.1～0.2ug/ul，加入1/10体积的10×Buffer按1u/ug的酶量在适宜的反应温度下酶切4小时。

2、电泳检测酶切效果，如果未完全切开，酚仿抽提后重复上面的操作。

3、将酶切好的DNA样品在1.0％的琼脂糖凝胶上在低于1V/cm的电压降下电泳过夜。

4、将凝胶在0.2mol/LHCl中处理2×15分钟部分脱嘌呤。

5、在0.5mol/LNaOH，1.5mol/LNaCl的变性液中处理2×30分钟，然后在0.5mol/LTris-HCl(pH7.0)，1.5mol/LNaCl中和液中处理2×30分钟。

6、将凝胶用毛细管法在20×SSC的转移缓冲液中向经2×SSC预处理10分钟的尼龙膜(Boeringer Manheim)转移24小时。

8、转移结束后，用6×SSC冲洗尼龙膜10分钟，干燥半小时后于120℃烘烤30分钟。

5.1.2放射性探针的标记

A随机引物标记法，该方法参考Promega公司的Prim-a-gene试剂盒的使用说明。

1将50ng的模板DNA稀释到30ul，沸水浴10分钟，迅速置于冰上。

2加入10ul 5×标记缓冲液，2ul dATP，dGTP，dTTP的混合物，每种2mmol/L，2ul BSA，5u Klebknow Fragment，5ulα-³²P-dCTP(50uCi)，置于室温下1小时。

3反应结束后，将其置于沸水浴中10分钟变性，然后置于冰上待用。

B用PCR方法标记探针，该方法与做常规PCR的唯一区别在于用α-³²P-dCTP代替非放射性的dCTP。

5.1.3杂交程序

1用6×SSC浸泡尼龙膜10分钟，移入杂交管中，加入20ml杂交液(5×SSC，50％Formamide，1％Blocking reagent(B.M.)，10％PEG(6000)，10mmol/LEDTA，20mmol/LNa₂HPO₄-NaH₂PO₄pH7.0，7％SDS)在42℃预杂交1-2小时。之后将杂交管中的液体倒掉。

2将变性的放射性标记探针与适量杂交液混匀，加到杂交管中，42℃杂交30小时。

3用2×SSC，0.5％SDS  42℃洗膜2×15分钟，0.1×SSC，0.5％SDS 65℃洗膜2×15分钟。

4用保鲜膜将尼龙膜包好后，压在X光片下暴光3-5天，冲洗X光片。

5.2Northern杂交

5.2.1RNA电泳，转膜

1配制1％甲醛变性胶(Sambrook，et al.1989)，将RNA与点样缓冲液混匀后点样，在3V/cm的电压降下电泳2-3小时。2电泳结束后，将胶用DEPC处理的双蒸水浸泡2×15分钟，然后参照3.5.1.1的方法转膜。

3转膜结束后，用0.5mol/L乙酸钠将尼龙膜冲洗10分钟，凉干后80℃烘烤2小时。

5.2.2Northern杂交程序

1将尼龙膜用6×SSC浸泡10分钟，装入杂交管中。

2向杂交管中加入20ml杂交液(5×SSC，5×Denhart’s reagent，20mmol/L EDTA，50ug/ml鲑鱼精DNA)在65℃预杂交1-2小时，

3将用4.2的方法标记的探针与适量的杂交液混合好，更换杂交液后于65℃杂交过夜，然后在56℃退火2-3小时。

4用0.5×SSC，0.5％SDS和0.1×SSC，0.5％SDS的洗膜液各洗2×15分钟，将尼龙膜用保鲜膜包好后用X光片暴光。

5.2.3探针模板的制备

1 50ul的反应体系中加入5u限制性内切酶，5ul 10×Buffer，5ug质粒，酶切3小时。

2用低熔点琼脂糖凝胶回收目的片段。

实施例6蛋白SDS-PAGE凝胶电泳

6.1蛋白电泳

1、取1ml菌液，4℃、5000g离心5min。取上清50ul加入等体积，加样缓冲液(50mmol/L Tris-Hcl PH6.8，100mmol/LDTT，2％SDS，0.1溴酚蓝，10％甘油)。

2、沸水浴煮10min，取10～30ul上样。

6.2凝胶配制及染色程序

6.2.1聚丙烯酰胺凝胶的配制

1、按照电泳设备的说明安装玻璃板。

2、根据分离不同蛋白分子量的要求，配制分离胶，分离胶中含有0.1％SDS，0.1％过硫

酸氨，0.4M Tris-HCl pH8.8，0.008％TEMED，根据所需凝胶浓度添加30％丙烯酰氨

溶液和水，一般来说分离80KD蛋白质需要用6-8％的丙烯酰氨凝胶。

3、上述溶液混匀后立即灌注在两层玻璃之间，留出灌注基层胶所需的空间(梳子的齿长再加1厘米)，然后在胶上覆盖一层0.1％SDS，将凝胶垂直放置于室温下。

4、30分钟后用滤纸除去覆盖层液体，在凝胶上灌制积层胶(68％水，1.7％30％丙烯酰

氨溶液，0.125M Tris-HCl pH6.8，0.1％SDS，0.1％过硫酸氨，0.001％TEMED)，然后

将梳子放置好并尽量赶走气泡。

5、约40分钟后凝胶聚合，紫外灯照射会加快凝聚。

6.2.2用考马斯亮蓝对SDS聚丙烯酿氨凝胶进行染色

1、在90ml甲醇∶水(1∶1 v/v)和10ml冰乙酸的混合液中溶解0.25g考马斯亮蓝，用滤

纸过滤除去不溶物。

2、用5倍体积的染液浸泡凝胶，放在摇动平台上于室温染色4小时。

3、回收染液，用不含染料的甲醇.乙酸溶液平缓摇动48小时，期间更换脱色液若干次。

4、扫描凝胶，记录凝胶影像。

实施例7蛋白从SDS-PAGE凝胶转到PVDF膜上。固定化蛋白的Western杂交

1.SDS-PAGE凝胶电泳结束后，将凝胶取下，放于一张大小一样的用移缓冲液(39mmolN

甘氨酸，48mmol/L Tris，0.37％SDS，20％甲醇)浸湿的滤纸上。

2.剪一张与凝胶大小一致的PVDF膜，先用酒精浸润5分钟，再用转移缓冲液平衡30分钟。

3.将PVDF膜覆盖在凝胶上，上面再盖一层用转移缓冲液霞湿的滤纸上，将整个夹子夹好，放于转移电泳槽中。

4.PVDF膜的一方朝向阳极，7mA40℃转移8小时。

5.转移结束后，PVDF膜取出室温晾10分钟，转入TBST榕液中浸泡10分钟。

6.将滤膜转入含1％BSA的IBST中室温摇动1小时，弃掉溶液。

7.加入适量TBST(刚刚浸没PVDF膜)，再加入1/5000第一抗体，室温摇动1小时。

8.室温下20mlTBST洗PVDF膜3×15分钟。

9.加入适量TBST(浸没PVDF膜)，再加入1/2000HRP标记第二抗体，室温轻轻摇动40分钟。

10.室温下，20ml TBST洗PVDF膜3×15分钟。

11.用TBS洗膜一次，去除TweedO。

12.加入显色缓冲液(Piece)放置5分钟，捞出后用杂交袋包装好，在暗室中与X光片夹在一起使之曝光3分钟。

13.冲洗X光片。

实施例8毕赤氏酵母分泌人乳铁蛋白发酵方法

8.1大量培养方法

1.挑取单菌落，接种在20mlBMMGY培养基中，(在250ml锥形瓶中)28℃振荡摇菌过夜。

2.将上述培养物转入200ml BMMGY培养基中，(在1000ml三角瓶中)28℃振荡摇菌过夜。

3.上述培养物转入3.7L发酵罐培养到OD6005-7。

4.培养液在室温2000g，离心10分钟，弃上清。用200mlBMMY培养基将菌体悬起，转入3.7L发酵罐中，再补足BMMY培养基。每隔8小时补充甲醇至终浓度05％。

5.每隔24、36、72、96小时取样分析。

8.2小量培养方法

1.按3.8.1，1-2的方法培养菌体。

2.室温2000g离心10分钟后弃上请，用20ml BMMY培养基重悬菌体，并倒回原三角瓶中，继续培养。

3.每天补充甲醇0.2ml，每隔24小时取样分析。

8.3发酵粗提物的抑菌实验

1.将E.coli接种在20mlLB中37口振荡培养过夜。

2.将含2％琼脂糖的LB培养基加热溶化后冷却至50℃，并与E.coli过夜培养物按1∶10混合。

3.混合液倒在平板上，上面均匀放置金杯。

4.将待检测流体倒入金杯中，12、24、48小时观察抑菌实验。

                                  序列表

(1)一般信息

  (i)发明名称：

  (ii)序列数目：2

(2)SEQ ID NO：1的信息

  (i)序列特征

    (A)长度：2496bp

    (B)类型：核酸

    (C)链性：双链

    (D)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：cDNA

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：1：

(3)SEQ ID NO：2的信息

  (i)序列特征

    (A)长度：692个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)拓扑结构：线性

  (ii)分子类型：多肽

  (iii)序列描述：SEQ ID NO：2：

Claims (1)

1.一种能够高效表达人乳铁蛋白基因的重组甲醇毕赤氏酵母P.Pastoris的菌株P.P020105，其保藏号为：CGMCC NO.0702。

Images