CN1628249A - 副结核分枝杆菌感染的诊断和疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列，这种核酸序列的一部分，它编码这种蛋白的免疫原性片段，包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞。本发明也涉及这种序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性部分。此外，本发明涉及包含这种核酸序列或其一部分、包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞、蛋白或其免疫原性部分和抗这种蛋白或其免疫原性部分的抗体的疫苗。另外，本发明涉及所述蛋白在疫苗和制备疫苗中的用途。而且，本发明涉及所述核酸序列、蛋白或抗体用于诊断或接种目的的用途。而且，本发明涉及制备这种疫苗的方法。最后本发明涉及包含这种核酸、蛋白或抗这种蛋白的抗体的诊断试剂盒。

Description

副结核分枝杆菌感染的诊断和疫苗
本发明涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种(Mycobacterium aviumsubspecies paratuberculosis)蛋白的核酸序列，这种核酸序列的一部分，它编码这种蛋白的免疫原性片段，包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞。本发明也涉及这种序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性部分。此外，本发明涉及包含这种核酸序列或其一部分、包含这种核酸序列或其一部分的DNA片段、重组DNA分子、活重组载体和宿主细胞、蛋白或其免疫原性部分和抗这种蛋白或其免疫原性部分的抗体的疫苗。而且，本发明涉及所述蛋白在疫苗和制备疫苗中的用途。而且，本发明涉及所述核酸序列、蛋白或抗体用于诊断或接种目的的用途。而且，本发明涉及制备这种疫苗的方法。最后本发明涉及包含这种核酸、蛋白或抗这种蛋白的抗体的诊断试剂盒。
分枝杆菌属的细菌是革兰氏阳性抗酸生物体。该属包括许多重要的人和动物病原体。其中，鸟分枝杆菌副结核亚种是副结核或Johne’s疾病的病因物质，引起很多反刍动物疾病的慢性肉芽肿感染，目前对很多肉类和牛奶工业造成基本上是全世界的经济损失。全世界很大比例的兽群(在21-70％之间)被感染。在欧洲，估计每年的损失是大约GBP207/奶牛。在美国，估计每年的损失是大约15亿美元。(Harris，N.B.和Barletta，R.G.，Clinical Microbiology Reviews 14：489-512(2001))。
除了其对反刍动物的明显致病性之外，怀疑鸟分枝杆菌副结核亚种是Crohn′s病的原因，Crohn′s病是一种人的非特异性慢性透壁炎性疾病，最常影响末端回肠和结肠，但也可以发生在从口至肛门的胃肠道的任何部分和肛周区域。(P.Quirke，Gut 2001，49：755-760(2001))(″Possible links between Crohn′s disease and Paratuberculosis″，European Commission，D-G Health and Consumer Protection，Reportof the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare，2000年3月21日)。Crohn′s病的主要问题之一是对该病不能治愈的事实。这种疾病状况一旦积聚，一生保持存在，引起很大的发病率。
巴氏消毒过的牛奶中存在意外的鸟分枝杆菌副结核亚种的比较耐热菌株连同怀疑其在Crohn′s病发展中的作用也越来越引起关于其对人群潜在健康的影响的关注。Sung，N.和Collins，M.T.in Appl.Environm.Microbiol.64：999-1005(1998)已经描述了这个最新的和意外的发现。
对该问题的认识的增加引起了发展控制和消灭副结核的有效诊断学和疫苗的重新紧迫需要。
鸟分枝杆菌包括一大组分枝杆菌，可以分成三个亚种，鸟分枝杆菌鸟亚种，鸟分枝杆菌唾液亚种和鸟分枝杆菌副结核亚种。鸟分枝杆菌鸟亚种广泛分布在自然环境中，包括土壤和表面健康的动物，以及鸟类和人类中。鸟分枝杆菌鸟亚种分离株是机会病原体并且通常对无免疫应答的宿主引起感染和疾病。目前测定了鸟分枝杆菌鸟亚种菌株104的完整基因组序列。鸟分枝杆菌唾液亚种可对鹿引起类似于副结核的疾病。尽管多数反刍动物在六个月龄前感染鸟分枝杆菌副结核亚种，但是临床病变通常仅在在至少两岁后或更晚发生。在这期间，据信细菌存活在宿主细胞内，但是确实也发生胃肠腔中感染的细胞外发作(感染晚期频率增加)，期间细菌变得可以检测到。目前可利用的针对鸟分枝杆菌副结核亚种的(免疫学)诊断学敏感性相对较低，特别是关于感染早期或潜伏期感染的检测，因此不能有效作为疾病控制的工具。虽然可以获得在某些检测上认为可有效使自由兽群不发生临床疾病的全细胞分枝杆菌疫苗，但是这些疫苗基本上都干扰牛肺结核的免疫诊断并且不抑制疾病的传播。迄今为止，已经鉴定了鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原成分。以前描述的鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原分子包括糖脂和用小试验动物中产生的基本上单一特异性早期血清鉴定的蛋白抗原。细胞壁糖脂分子脂质阿拉的甘露聚糖(lipoarabinomannan)(LAM)是通过其被产生的抗细菌释放的细胞滤液的单克隆抗体识别而鉴定到的，并且随后被纯化和用于血清诊断学ELISA的开发(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65：387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57：189-198)。此外，分子量14kD(Olsen等Clin.Diagn.Lab.Immunol.2001.8：797-801)、18kD(bacterioferritin；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90：503-508)、19kD(AhpD；Olsen等，Infect.Immun.2000.68：801-808)、24kD(p24BCD；Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.1992 90：503-508)、30kD(p30；Burrels等；Vet.Immunol.Immunpathol.1995.45：311-320)、34kD(Gilot等J.Bact.1993.175：4930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31：947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5：446-451)、34.5kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65：387-394)，)、35kD蛋白(Dheenadhayalan和Chang，未发表数据)、38kD(Elsaghier等Clin.Exp.Immunol.199290：503-508)、44.3kD(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65：387-394)、45kD(AhpC；Olsen等，Infect.Immun.2000.68：801-808)、65kD(hsp65；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70：105-115)、70kD(hsp70；Stevenson等，1991.Nucleic Acids Res.19：4552；Koets等，Vet.Immunol.Immunopathol.1999.70：105-115)的蛋白抗原和过氧化物歧化酶分子(Mullerad等，FEMS Immunol.Med.Microbiol 34：81(2002))已经被鉴定和描述了(部分)特性。这些中仅少数被估价用于诊断学或疫苗(34kD；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5：446-451)。因此目前的诊断学和疫苗仍基于相当粗的抗原物质。DE19621488和中W09216628已描述了脂质阿拉伯甘露聚糖(Mutharia等，Infect.Immun.1997.65：387-394；Jark等，1997.Vet.Microbiol.57：189-198)和34 kD抗原(Gilot等J.Bact.1993.175：4930-4935；De Kesel等J.Clin.Microbiol.1993.31：947-954；Coetsier等，Clin.Diagn.Lab.Immunol.1998.5：446-451)用于诊断和疫苗。已经提出几个其它分子用于诊断学、疫苗和治疗。有插入序列ISM-1(EP0288306和US5225324；)的编码蛋白，分枝杆菌DAP分子(US9523226)，36kD抗原(US5776692)，可溶性抗原制剂(RU2118538)，具有还原铁的能力的细胞外蛋白(DE19728834)和酰基转移酶(WO9949054)。
本发明的一个目的是提供能够有助于保护哺乳动物，特别是人和牛不受鸟分枝杆菌副结核亚种感染的致病影响的多肽。而且，很多这些多肽和抗这些多肽的抗体提供了有效的诊断工具。
现在首次惊奇地发现在表达文库中可特异性鉴定和分离的九个不同的多肽，和在proteomics中可鉴定的两个另外的多肽，这些不同多肽中的每一个都能够诱导抗鸟分枝杆菌副结核亚种的免疫应答并适合作为疫苗成分。本发明已发现这些多肽可以单独或与彼此组合用作疫苗成分，提供确实有助于保护哺乳动物，特别是人和牛不受鸟分枝杆菌副结核亚种感染并且有助于降低鸟分枝杆菌副结核亚种引起的损害的疫苗。
三种不同的方法用于根据本发明的(编码疫苗成分的基因)疫苗成分和诊断学工具的检测。实施例中更详细地介绍这些方法。一个方法使用非常特异的抗血清检测表达文库中编码免疫反应性鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的基因。使用的抗血清在某种意义上不同于通常用于筛选表达文库的抗血清，即从感染鸟分枝杆菌副结核亚种很长时期的牛获得。而且，这些抗血清取自发现自然感染鸟分枝杆菌副结核亚种，但是没有感染肺结核、布鲁氏杆菌病或造白细胞组织增生(leucosis)的历史的牛。这通过下列发现证实，获得测试血清前大约两年长时间内的至少两个鸟分枝杆菌副结核亚种阳性粪便样品用于筛选，和基本上没有与副结核抗原发生交叉反应的抗引起肺结核的物质的抗体或其它免疫反应。由此获得的血清在鸟分枝杆菌副结核亚种抗原的免疫筛选中非常有效，因为它们非常广泛地反应对抗相关的鸟分枝杆菌副结核亚种肽片段，然而在另一方面，它们与引起肺结核、布鲁氏杆菌病或造白细胞组织增生(leucosis)的病原体显示基本上无或仅很低的特异反应性。
这个方法导致发现三个新的免疫原性蛋白，其编码序列在下面给出的SEQ ID NO：1、3和5中描述。
现在已经克隆和测序了编码第一个蛋白的基因，包含免疫原性决定簇的该基因的核酸序列在SEQ ID NO：1中描述。全长基因编码分子量28kD的蛋白(如SEQ ID NO：2中描述)。
本领域熟知，很多不同的核酸序列可编码一个和相同的蛋白。普遍已知这个现象是编码氨基酸的每个三联体的第二和特别是第三个碱基的波动。这个现象可产生仍编码相同蛋白质的两个核酸序列的异种性。因此，原则上，具有低如70％序列同源性的两个核酸序列仍可编码一个和相同的蛋白。
因此，本发明的一个实施方案的一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：1中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
下面定义了免疫原性片段的概念。编码免疫原性片段的核酸序列的长度通常至少18或更常21个核苷酸，但是优选24、27、30、33或甚至36个核苷酸。
由于本领域经常遇到的分子量测定的细微变异性，当在聚丙烯酰胺凝胶上凝胶电泳测定时，根据本发明的所有蛋白的分子量可以在一定程度上变化。因此根据本发明的蛋白的分子量应该解释为其理论分子量+/-5kD。
优选，编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的根据本发明的核酸序列或编码那个蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分与SEQ ID NO：1中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％，99％或甚至100％的同源性水平。
可以用可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.找到的计算机程序″BLAST 2 SEQUENCES″通过选择子程序：″BLASTN″确定核苷酸同源性的水平。这个程序的参考文献是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters 174：247-250(1999)。使用的参数是缺省参数：匹配奖励分：+1.不匹配罚分：-2开放gap：5延伸gap：2.Gapx_dropoff：50.
与SEQ ID NO 1或将在下面描述的SEQ ID NO 3、5、7、9、11、13、15或17中任何一个描述的序列互补的核苷酸序列，或包含根据本发明的序列串联排列的核苷酸序列，也包括在本发明范围内。
这个实施方案的另一个形式涉及编码14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：3中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的核酸序列的一部分与SEQ ID NO：3中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式还涉及编码9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：5中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码该9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO：5中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
用于检测免疫学重要的多肽的另一个方法基于使用抗鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的高度特异性单克隆抗体。这个方法具有甚至比使用上述抗鸟分枝杆菌副结核亚种的特异性抗血清的方法更特异的优点。
这些单克隆抗体的使用导致六个另外的免疫原性鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的鉴定和分离。
因此，这个实施方案的另一个形式涉及编码47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：7中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码该47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO：7中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：9中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO：9中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：11中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO：11中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：13中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO：13中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：15中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ ID NO：15中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的另一个形式涉及编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，其中所述核酸序列或所述其一部分与SEQ ID NO：17中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％的同源性。
优选，编码这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的根据本发明的核酸序列或编码该蛋白的免疫原性片段的该核酸序列的一部分与SEQ IDNO：17中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少90％、优选93％、更优选95％的同源性。
甚至更优选的是98％、99％或甚至100％的同源性水平。
第三个方法，基于鸟分枝杆菌副结核亚种的proteome的仔细分析产生了再两种新疫苗成分的检测。这个方法基于在2D凝胶中免疫原性蛋白的鉴定。它具有胜过其它方法的优点，即表达文库中尚未发现或鉴定的蛋白现在可以明确地鉴定为疫苗成分。下列实施例2给出了该方法的详细内容。
因此，本发明的另一个实施方案还涉及具有5.60-6.15的pI的60kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。
图1b和d中可见到这个蛋白是大约5个斑点的水平行(由于表现出如不同翻译后修饰或2D凝胶电泳样品制备引入的假象(artifacts)的同工形式的微小差异)。
另外，另一个实施方案涉及具有4.20-4.75的pI的33kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。图1b和d中可见到这个蛋白是大约3个斑点的水平行(由于表现出如不同翻译后修饰或2D凝胶电泳样品制备引入的假象的同工形式的微小差异)。
既然这些蛋白现在已被明确鉴定，那它们就可以被测序，如根据本领域已知的标准步骤可确定N末端的前15个氨基酸。现在这种N末端测序已商业化并且在标准基础上由专门蛋白测序的公司进行。接着可使用简并探针容易地鉴定编码这些蛋白的基因。这些技术是本领域熟知的。
由于本发明公开了编码新的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列，现在首次可能获得足够量的这些蛋白。这可以如使用表达系统表达根据本发明的编码该蛋白或其免疫原性片段的全部或部分基因来进行。因此，在涉及核酸序列的该实施方案的更优选形式中，本发明涉及包含根据本发明的核酸序列的DNA片段。DNA片段是作为根据本发明核酸序列的载体起作用的一段核苷酸。这种DNA片段可以是如质粒，其中克隆根据本发明的核酸序列。例如这种DNA片段可有效增加用作引物，DNA接种疫苗目的和表达根据本发明核酸序列的DNA量，如下所述。
表达核酸序列的必要条件是适当启动子与核酸序列功能性连接，使得该核酸序列处于启动子控制之下。对本领域技术人员来说，启动子的选择扩展到能够指导基因在用作蛋白表达的宿主细胞的细胞中转录的任何真核、原核或病毒启动子是显而易见的。
因此，这个实施方案的甚至更优选形式涉及包含根据本发明的DNA片段和/或核酸序列的重组DNA分子，其中根据本发明的核酸序列置于功能性连接的启动子控制之下。这可依靠如标准分子生物学技术完成。(Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.Molecular cloning：alaboratory manual，1989.ISBN 0-87969-309-6).
功能性连接的启动子是能够控制与它们连接的核酸转录的启动子。这种启动子可以是根据本发明的新基因的天然启动子或鸟分枝杆菌副结核亚种的另一个启动子，只要那个启动子在用于表达的细胞中是有功能的。它也可以是异源启动子。当宿主细胞是细菌时，可以使用的有用的表达控制序列包括Trp启动子和操纵子(Godeddel等，Nucl.Acids Res.，8，4057，1980)；1ac启动子和操纵子(Chang，等，Nature，275，615，1978)；外膜蛋白启动子(Nakamura，K.和Inoμge，M.，EMBO J.，1，771-775，1982)，λ噬菌体启动子和操纵子(Remaut，E.等，Nucl.Acids Res.，11，4677-4688，1983)；α-淀粉酶(枯草芽孢杆菌)启动子和操纵子，与所选宿主细胞相容的终止序列和其它表达增强和控制序列。
当宿主细胞是酵母时，有用的表达控制序列包括如α-交配因子。对于昆虫细胞，可以使用多角体蛋白或杆状病毒的p10启动子(Smith，G.E.等，Mol.Cell.Biol.3，2156-65，1983)。当宿主细胞是脊椎动物时，示例的有用表达控制序列包括(人)巨细胞病毒即早启动子(Seed，B.等，Nature 329，840-842，1987；Fynan，E.F.等，PNAS 90，11478-11482，1993；Ulmer，J.B.等，Science259，1745-1748，1993)，鲁斯氏肉瘤病毒LTR(RSV，Gorman，C.M.等，PNAS 79，6777-6781，1982；Fynan等，前述；Ulmer等，前述)，MPSV LTR(Stacey等，J.Virology 50，725-732，1984)，SV40即早启动子(Sprague J.等，J.Virology 45，773，1983)，SV-40启动子(Berman，P.W.等，Science，222，524-527，1983)，金属硫蛋白启动子(Brinster，R.L.等，Nature 296，39-42，1982)，热休克启动子(Voellmy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82，4949-53，1985)，Ad2的主要晚期启动子和β-肌动蛋白启动子(Tang等，Nature 356，152-154，1992)。调节序列也可以包括终止和聚腺苷酸序列。其中可使用的序列是熟知的牛生长激素聚腺苷酸序列，SV40聚腺苷酸序列，人巨细胞病毒(hCMV)终止子和聚腺苷酸序列。
细菌、酵母、真菌、昆虫和脊椎动物细胞表达系统是很常使用的系统。这种系统是本领域熟知的并且通常可以从商业上获得，如从Clontech Laboratories，Inc.4030 Fabian Way，Palo Alto，California94303-4607，美国。仅次于这些表达系统，基于寄生虫的表达系统是有吸引力的表达系统。这种系统如在法国专利申请，公开号2714074，和美国NTIS公开号US08/043109中所述(Hoffman，S.和Rogers，W.：公开日：1993年12月1日)。
本发明这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及包含根据本发明的编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段的核酸序列、根据本发明的DNA片段或根据本发明的重组DNA分子的活重组载体(LRCs)。这些LRCs是含另外遗传信息的微生物或病毒，在这种情况下，已克隆了根据本发明的编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段的核酸序列。感染这种LRCs的牛不仅将产生抗载体的免疫原的免疫学应答，而且还产生抗蛋白的免疫原性部分(其遗传密码另外克隆入LRC，如一个或多个根据本发明的新的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因)的免疫学应答。
作为细菌LRCs的实例，可很吸引人地使用本领域已知的减毒沙门氏菌株。
而且，Vermeulen，A.N.(Int.Journ.Parasitol.28：1121-1130(1998))特别描述了活重组载体寄生虫。
此外，LRC病毒可以用作将核酸序列转入靶细胞的一种方法。活重组载体病毒也可以称作载体病毒。常常用作载体的病毒是牛痘病毒(Panicali等；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，79：4927(1982)，疱疹病毒(E.P.A.0473210A2)，和逆转录病毒(Valerio，D.等；in Baum，S.J.，Dicke，K.A.，Lotzova，E.和Pluznik，D.H.(主编)，ExperimentalHaematology today-1988.Springer Verlag，纽约：92-99页(1989))。
本领域熟知的体内同源重组技术可以用于将重组核酸序列导入选择的能够诱导插入的根据本发明的核酸序列在宿主动物中表达的细菌、寄生虫或病毒的基因组中。
本发明这个实施方案的最后一个形式涉及包含根据本发明的编码蛋白的核酸序列、包含这种核酸序列的DNA片段或包含在功能性连接的启动子控制之下的这种核酸序列的重组DNA分子的宿主细胞。这个形式也涉及含有包含根据本发明的编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段的核酸分子的活重组载体的宿主细胞。
宿主细胞可以是细菌来源的细胞，如大肠杆菌(Escherichia coli)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和乳酸杆菌(Lactobacillus)种，与基于细菌的质粒如pBR322，或细菌表达载体如pEX、pET、pGEX系列，或噬菌体组合。该宿主细胞也可以是真核来源，如酵母细胞与酵母特异性载体分子组合，或高级真核细胞象昆虫细胞(Luckow等；Bio-technology6：47-55(1988))与载体或重组杆状病毒，植物细胞与如基于Ti质粒的载体或植物病毒载体组合(Barton，K.A.等；Cell 32：1033(1983)，哺乳动物细胞象Hela细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或Crandell猫肾细胞，也与适当的载体或重组病毒组合。
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的新的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段。
下面将定义免疫原性片段的概念。
这个实施方案的一个形式涉及28kD的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：2中描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％、然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
SEQ ID NO：2和下述根据本发明的SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14、16和18中描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的免疫原性片段优选按照优选顺序具有至少6、更优选7、8、9、10、11、12、15、20、30或甚至40个氨基酸的长度。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：1描述的核酸序列编码的这个鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
如上面提及的，细菌存活在宿主细胞内，但是确实也发生胃肠腔感染的细胞外发作。这暗示细胞介导和抗体介导的免疫应答都在抵抗疾病的足够保护中起作用。如实施例所示，检查T细胞反应和B细胞反应的测试已经用于确定根据本发明的蛋白作为疫苗成分的价值。
这个实施方案的另一个形式涉及14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：4描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：3描述的核酸序列编码的14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的另一个形式涉及9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：6描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：5描述的核酸序列编码的9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的另一个形式涉及47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：8描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：7描述的核酸序列编码的47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的一个其它形式涉及鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：10描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：9描述的核酸序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的再一个其它形式涉及鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：12描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：11描述的核酸序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的再另一个形式涉及鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：14描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：13描述的核酸序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的再另一个形式涉及鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：16描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：15描述的核酸序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
这个实施方案的再另一个形式涉及鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白及其免疫原性片段，其中该蛋白或免疫原性片段与SEQ ID NO：18描述的氨基酸序列按照优选顺序具有至少90％的序列同源性，然而优选92％、更优选94％、95％或甚至96％的同源性。
甚至更优选的是按照优选顺序97％、98％、99％或甚至100％的同源性水平。
这个实施方案的仍甚至更优选形式涉及SEQ ID NO：17描述的核酸序列编码的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和所述蛋白的免疫原性片段。
可以用可在www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bl2seq/bl2.html.找到的计算机程序″BLAST 2 SEQUENCES″通过选择子程序：″BLASTN″确定蛋白质同源性的水平。这个程序的参考文献是Tatiana A.Tatusova，Thomas L.Madden FEMS Microbiol.Letters 174：247-250(1999)。使用的矩阵：“blosum62”。使用的参数是缺省参数：开放gap：11.延伸gap：1.Gapx_dropoff：50。
应该理解，对于这里包括的特定蛋白，个体鸟分枝杆菌副结核亚种菌株之间可存在自然变异。这些变异可以用整个序列中的氨基酸差异或通过所述序列中缺失、置换、插入、转化或添加氨基酸来表明。如Neurath等在″The Proteins″Academic Press New York(1979)中描述了基本上不改变生物学和免疫学活性的氨基酸置换。相关氨基酸之间的氨基酸取代或在进化中频繁发生的取代尤其是Ser/Ala，Ser/Gly，Asp/Gly，Asp/Asn，Ile/Val(见Dayhof，M.D.，蛋白序列和结构图谱，Nat.Biomed.Res.Found.，华盛顿特区，1978，第5卷，第3增刊)。其它氨基酸置换包括Asp/Glu，Thr/Ser，Ala/Gly，Ala/Thr，Ser/Asn，Ala/Val，Thr/Phe，Ala/Pro，Lys/Arg，Leu/Ile，Leu/Val和Ala/Glu。基于这个信息，Lipman和Pearson开发了快速和敏感蛋白比较并确定同源蛋白之间功能类似性的方法(Science，227，1435-1441，1985)。本发明的示例实施方案的这种氨基酸置换，以及具有缺失和/或插入的变异在本发明范围内，只要所得蛋白保持它们的免疫反应性。
这解释了为什么根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白，当从不同区域分离株分离时，可能具有大约70％的同源水平，而仍代表具有相同免疫学特性的相同蛋白。
认为仍提供了能够诱导抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染或至少抗感染的临床表现的免疫应答的蛋白的根据本发明的某些蛋白的氨基酸序列中的那些变异“基本上不影响免疫原性”。
但是当蛋白用于如接种疫苗目的或产生抗体时，其不是必须使用完整蛋白。也可能使用本身或与载体连接如KLH能够诱导抗那个蛋白的免疫应答的那个蛋白的片段，所谓的免疫原性片段。“免疫原性片段”被理解为仍保留其诱导脊椎动物宿主的免疫应答的能力的全长蛋白的片段，如包含B或T细胞表位。简言之，免疫原性片段是能够诱导抗根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的免疫原性反应的片段。在这种情况下，可利用多种技术容易地鉴定编码抗原性片段(决定簇)的DNA片段。Geysen等(专利申请WO84/03564，专利申请WO86/06487，美国专利NR.4,833,092，Proc.Natl Acad.Sci.81：3998-4002(1984)，J.Imm.Meth.102，259-274(1987))描述的方法，所谓的PEPSCAN方法是一种检测表位；和蛋白的免疫学重要区域的容易实施、快速和很好建立的方法。该方法被广泛使用并且本身是本领域技术人员熟知的。这个(经验)方法特别适合于B细胞和T细胞表位的检测。而且，给出编码任何蛋白的基因序列，计算机运算法则能够基于与现在已知表位的它们的序列和/或结构一致性指定特殊蛋白片段作为免疫学重要的表位。这些区域的确定是基于根据Hopp和Woods(Proc.Natl.Acad.Sci.78：38248-3828(1981))的亲水性标准和根据Chou和Fasman(Advances in Enzymology 47：45-148(1987)和US Patent 4,554,101)的二级结构方面的组合。通过计算机在Berzofsky′s两亲性标准(Science 235，1059-1062(1987)和美国专利申请NTIS US 07/005,885)的帮助下从序列可同样地预知T细胞表位。在Shan Lu的common principles：Tibtech 9：238-242(1991)，Good等的Malaria epitopes；Science 235：1059-1062(1987)，Lu的综述；Vaccine10：3-7(1992)，Berzofsky的HIV-表位；The FASEB Journal 5：2412-2418(1991)中可找到简短概述。免疫原性片段通常具有最小长度6，更常7-8个氨基酸，优选8个以上，如9、10、12、15或甚至20或更多氨基酸。因此编码这种片段的核酸序列具有至少18的长度，更常24和优选27、30、36、45或甚至60个核酸。
因此，本发明另一实施方案的一个形式涉及对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗，它包括至少一种上述根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段和药物可接受载体。
本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段用于疫苗。
本发明的再另一个实施方案涉及根据本发明的核酸序列、DNA片段、重组DNA分子、活重组载体、宿主细胞或蛋白或其免疫原性片段在制备疫苗、特别是对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗中的应用。
制备根据本发明疫苗的一种方法是通过使细菌生长，随后从细菌或上清中生物化学纯化鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段。然而这是一种非常耗时的制备疫苗的方法。
因此在疫苗中使用根据本发明的编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段的基因的表达产物要方便得多。现在首次成为可能，因为本发明提供了适合作为疫苗成分的编码9个新的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的基因的核酸序列。
通过将根据本发明的蛋白或根据本发明的其免疫原性片段与下面描述的药物可接受载体混合可容易地制备基于这些基因的表达产物的疫苗。
可供选择地，根据本发明的疫苗可以包括能够表达根据本发明的蛋白或其免疫原性片段的如上所述的活重组载体。这种疫苗，如基于沙门氏菌载体或病毒载体如疱疹病毒载体，比亚单位疫苗优越，它们更好地模拟鸟分枝杆菌副结核亚种感染的自然方式。而且，它们的自身繁殖是优点，因为免疫仅需要少量重组载体。
疫苗也可以基于如上所述的宿主细胞，它包含根据本发明的蛋白或其免疫原性片段。
根据本发明的疫苗比例如灭活全细菌疫苗和减毒活疫苗具有另外的优点。基于全细胞的疫苗诱导抗所有抗原决定簇的抗体，即细菌上存在的所有表位。因此，针对这种疫苗产生的抗体组可以与野生(field)感染产生的抗体相当。因此，不可能知道动物是否已经感染或已接种。根据本发明的蛋白或其免疫原性片段，即全细菌亚单位，作为疫苗成分具有优点，即接种的动物仅产生抗给予的亚单位的抗体。可疑动物的抗体组与接种和野生感染动物的抗体的简单比较将立即知道可疑动物是否野生感染或接种。对于这种检测，下面将更详细讨论，简单的ELISA检测足够。已知基于一个或多个亚单位的这种疫苗是标记疫苗：在它们可与野生感染区别的意义上，它们是“标记的”。下面，更详细地讨论标记疫苗的概念。
很有吸引力的标记疫苗是基于9kD蛋白或其免疫原性片段的疫苗，其序列在SEQ ID NO：6中描述。原因如下：抗鸟分枝杆菌副结核亚种和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis)产生的抗体之间有相对高水平的交叉反应性。牛分枝杆菌尤其是牛肺结核的原因。该细菌对其它动物种类也有传染性。而且，这个疾病是动物传染病，即它可以传染给人。世界卫生组织(WHO)估计1990至1999人肺结核(TB)发生率和死亡分别增长到8.8千万和3千万，在发展中国家病例更多。在监督和控制活动常常不充分或无效的多数发展中国家，动物传染病TB(由牛分枝杆菌引起)存在于动物中；因此，感染的很多流行病学和公共健康方面很多仍未知。
牛分枝杆菌对其它哺乳动物有传染性的事实是尝试消灭牛分枝杆菌的原因之一。达到这个目的所需的措施之一是消灭诊断检测(如牛PPD DTH检测)中发现的牛分枝杆菌阳性的牛。并且如上提及，由于消除了检测中发现阳性的牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌副结核亚种动物的血清的交叉反应性，所以不考虑感染的原因。
因此，可清晰区别用根据本发明的亚单位疫苗接种和野生感染牛分枝杆菌或鸟分枝杆菌副结核亚种的诊断检测将是很有价值的工具。
发现在PPD检测中，鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白不显示与牛分枝杆菌的交叉反应性是本发明的优点之一。氨基酸序列SEQ ID NO：6中给出的蛋白属于这些蛋白。
因此，这个实施方案的优选形式涉及包含如SEQ ID NO：6描述的蛋白或其免疫原性片段的疫苗。
如果想要一种疫苗不是必须具有可用于如上所述标记目的的性能，那么添加根据本发明的其它蛋白或65kD或70kD热休克蛋白，或其免疫原性片段将有益。当与单独疫苗比较时，这种组合疫苗增强疫苗的效率。因此，在更优选的形式中，根据本发明的疫苗包含根据本发明的9kD蛋白和一种和多种其它蛋白，或一种热休克蛋白或其免疫原性片段。
上述所有疫苗有助于有效接种，即它们触发宿主的防卫系统。
可供选择地，抗体可以在如兔子产生或可以从下面描述的抗体生成细胞系获得。这种抗体接着可以给予待接种/保护的哺乳动物。这个接种方法，被动接种，是当哺乳动物已经被感染时的接种选择，并且没有时间允许待触发的自然免疫应答。它也是接种倾向于突然高感染压力和免疫受损个体的哺乳动物的优选方法。在这些情况下，给予的抗根据本发明的蛋白或其免疫原性片段的抗体可干扰鸟分枝杆菌副结核亚种。这个方法具有降低或阻止鸟分枝杆菌副结核亚种发展的优点。因此，本发明这个实施方案的一个其它形式涉及对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗，包括抗根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或该蛋白的免疫原性片段的抗体，和药物可接受载体。
这个发明的另一个实施方案仍涉及抗根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或该蛋白的免疫原性片段的抗体。
大规模制备根据本发明的抗体的方法也是本领域已知的。这种方法依靠在用于噬菌体显示的丝状噬菌体中克隆编码根据本发明的蛋白的遗传(片段)信息。在尤其是http：//aximtl.imt.uni-marburg。de/-rek/aepphage.html.的″filamentous phagedisplay″下″AntibodyEngineering Page″和综述论文Cortese，R.等，(1994)在TrendsBiotechn.12：262-267、Clackson，T.& Wells，J.A.(1994)在TrendsBiotechn.12：173-183、Marks，J.D.等，(1992)在J.Biol.Chem.267：16007-16010、Winter，G.等，(1994)在Annu.Rev.Immunol.12：433-455和Little，M.等，(1994)Biotechn.Adv.12：539-555中描述了这种技术。噬菌体随后用于筛选表达camelid重链抗体的camelid表达文库。(Muyldermans，S.和Lauwereys，M.，Journ.Molec.Recogn.12：131-140(1999)和Ghahroudi，M.A.等，FEBS Letters 414：512-526(1997))。来自表达目的抗体的文库的细胞可复制并随后用于抗体的大规模表达。
仍另一个实施方案涉及制备根据本发明疫苗的方法，包括将根据本发明的抗体与药物可接受载体混合。
接种疫苗的可供选择和有效方法是用编码相关抗原的DNA直接接种。用编码蛋白的DNA直接接种对于很多不同蛋白已经成功(如例如Donnelly等The Immunologist 2：20-26(1993)综述)。更特别地，Velaz-Faircloth，M.等，(Infect.& Immun.67：4243-4250(1999))已经描述了DNA接种得到的抗鸟分枝杆菌的保护。
接种疫苗的这个方法对于接种牛抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染很有吸引力。因此本发明这个实施方案的其它形式仍涉及包含编码根据本发明蛋白或其免疫原性片段的核酸序列的疫苗，包含包括这种核酸序列的DNA片段的疫苗或包含根据本发明的重组DNA分子的疫苗，和药物可接受载体。
由于上面给出的原因，优选，编码9kD蛋白或其免疫原性片段和SEQ ID NO：5描述的根据本发明的核酸序列用于接种。
更优选，这种序列与如上所述根据本发明的编码另一个蛋白或其免疫原性片段组合。
适合用于根据本发明的DNA疫苗的DNA质粒的实例是用于细菌、真核和酵母宿主细胞的常规克隆或表达质粒，很多所述质粒商业上可获得。这种质粒的熟知实例是pBR322和pcDNA3(Invitrogen)。根据本发明的DNA片段或重组DNA分子应该能够诱导该核苷酸序列的蛋白表达。该DNA片段或重组DNA分子可以包含一个或多个根据本发明的核苷酸序列。此外，该DNA片段或重组DNA分子可以包含其它核苷酸序列如具有未甲基化CpG二寡核苷酸的免疫刺激寡核苷酸，或编码其它抗原性蛋白或辅佐细胞因子的核苷酸序列。
待用于根据本发明的疫苗的根据本发明的核苷酸序列或包含根据本发明的核苷酸序列的DNA质粒，优选可操作连接转录调节序列，可以是裸露的或可以包装在传递系统中。
合适的传递系统是脂类载体、iscoms、dendromers、niosomes、微粒，特别是基于壳聚糖的微粒、多糖基质等等，(更多见下面)，全部都是本领域熟知的。也非常适合作为传递系统的是减毒活细菌如沙门氏菌种，和减毒活病毒如疱疹病毒载体，如上提及。
这个实施方案的其它形式仍涉及包含根据本发明的重组DNA分子的疫苗。
DNA疫苗可例如通过皮内应用而容易地给予，如通过使用无针注射器。这种给药方法将DNA直接传递到接种的动物细胞中。10pg-1000μg的DNA量提供好的结果。特别是如果DNA本身是自身复制的，较少量将足够。优选，使用1-100μg的微生物中的量。
在更进一步实施方案中，根据本发明的疫苗另外包含得自牛病原生物和病毒的一种或更多抗原，抗那些抗原的抗体或编码这种抗原的遗传信息和/或药物成分如抗生素。当然，这种抗原，抗这种抗原的抗体，或遗传信息可以是鸟分枝杆菌副结核亚种来源的，如另一个鸟分枝杆菌副结核亚种抗原。它也可以是选自另一个牛病原生物或病毒的抗原、抗体或遗传信息。这种生物和病毒优选选自：牛疱疹病毒(BovineHerpesivirus)、牛病毒性腹泻病毒(Vira Diarrhoea virus)、3型副流感病毒(Parainfluenza type 3 virus)、牛副粘液病毒(BovineParamyxovirus)、口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus)、溶血巴斯德氏菌(Pasteurella haemolytica)、牛呼吸道合胞病毒(BovineRespiratory Syncytial Virus)、泰累尔氏梨浆虫属(Theileria sp.)，巴贝虫属(Babesia sp.)、锥虫种(Trypanosoma species)、微粒孢子虫属(Anaplasma sp.)、Neospora caninum、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)，支原体(Mycoplasma)、大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、克雷伯氏杆菌(Klebsiella)，柠檬酸杆菌属(Citrobacter)和停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)。
如早先提及的，基于一种或多种根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的疫苗也很适合作为标记疫苗。标记疫苗是能基于不同于野生型感染诱导的抗体组的特征性抗体组而区别接种的和野生感染的哺乳动物的疫苗。如当野生型鸟分枝杆菌副结核亚种上存在的免疫原性蛋白不存在于疫苗中时，诱导不同的抗体组：然后该宿主接种后将不能产生抗那个蛋白的抗体。因此，基于任何根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的疫苗将仅诱导抗该特定蛋白的抗体，而基于活野生型、活减毒或灭活全鸟分枝杆菌副结核亚种的疫苗将诱导抗全部或多数细菌蛋白的抗体。
简单的ELISA检测，使孔中包含除根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白之外的任何其它鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白和孔中仅包含一种或多种纯化的根据本发明鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白足以检测来自牛的血清并足以知道这些牛是用根据本发明蛋白疫苗接种的还是罹患鸟分枝杆菌副结核亚种野生感染。
根据本发明的全部疫苗包含药物可接受载体。药物可接受载体可以是例如无菌水或无菌生理盐溶液。在更复杂的形式中，载体可以是例如缓冲液。
制备疫苗的方法包括将根据本发明的蛋白或其免疫原性片段和/或根据本发明的抗该蛋白或其免疫原性片段的抗体，和/或核酸序列和/或DNA片段、重组DNA分子、活重组载体或宿主细胞，和药物可接受载体混合。
根据本发明的优选疫苗也可以含有免疫刺激物质，所谓的佐剂。佐剂一般包含以非特异方式加强宿主免疫应答的物质。本领域已知很多不同的佐剂。频繁用于牛疫苗的佐剂的实例是胞壁酰二肽、脂多糖类、几种葡聚糖和聚糖和Carbopol(R)(一种均聚物)。该疫苗也可以包含所谓的“载体”。载体是蛋白连接的化合物，没有共价结合之。这种载体尤其是生物微胶囊、微藻酸盐、脂质体和macrosols，全部都是本领域已知的。微粒，尤其是基于壳聚糖(chitosan)的那些，特别是用于经口接种的那些很适合作为疫苗载体。
这种载体的具体形式，其中抗原被部分包入载体中，是所谓的ISCOM(EP 109.942，EP 180.564，EP 242.380)。此外，该疫苗可以包含一种或多种适合的表面活性化合物或乳剂，如Span或Tween。
优选将抗原与容易获得的和登记用于家畜和/或人的佐剂组合，如氢氧化铝，Th2样调节佐剂。
也优选在质粒内部或外部添加CpG寡核苷酸提高保护。
通常，该疫苗与稳定剂混合，例如来保护倾向于降解的蛋白免遭降解，增加疫苗的保质期，或提高冻干效率。有效的稳定剂尤其是SPGA(Bovarnik等；J.Bacteriology 59：509(1950))，碳水化合物如山梨醇、甘露醇、海藻糖、淀粉、蔗糖、葡聚糖或葡萄糖，蛋白如白蛋白或酪蛋白或其降解产物，和缓冲液，如碱金属磷酸盐。此外，该疫苗可以悬浮于生理可接受稀释剂中。理所当然，辅佐的、添加载体化合物或稀释剂、乳化或稳定蛋白的其它方法也在本发明中范围中。
基于根据本发明的蛋白或其免疫原性片段的根据本发明的疫苗可以很适合地以每只动物1-100微克蛋白的量给予，尽管原则上也可以使用更小剂量。超过100微克的剂量，尽管免疫学上很适合，由于商业原因吸引力减少。
基于减毒活重组载体的疫苗，如上述LRC病毒、寄生虫和细菌可以以低得多的剂量给予，因为在感染期间它们自我繁殖。因此，对于细菌和病毒，很适合的量应该为103-109CFU/PFU。
根据本发明的疫苗可以例如皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或在粘膜表面如口腔或鼻内给予。
对于有效的抗疾病保护，鸟分枝杆菌副结核亚种感染的快速和正确诊断很重要。因此，本发明的另一个目的是提供适合鸟分枝杆菌副结核亚种感染的检测的诊断学工具。
根据本发明的核酸序列、蛋白和抗体也适合用于诊断学。
因此，本发明的另一个实施方案涉及根据本发明的核酸序列、蛋白和抗体用于诊断学。
根据本发明的核酸序列或其片段可以用于检测牛中鸟分枝杆菌副结核亚种的存在。取自鸟分枝杆菌副结核亚种感染的哺乳动物的样品将包含得自所述细菌的核酸物质，包括编码根据本发明的蛋白的核酸序列。这些核酸序列将与根据本发明的核酸序列杂交。检测与本发明的核酸序列反应的核酸序列的合适方法包括杂交技术，包括但不限于PCR技术和NASBA技术。因此，根据本发明的核酸序列可以用于制备用于PCR和或NASBA技术的探针和引物。
检测鸟分枝杆菌副结核亚种的诊断学检测试剂盒可以例如包含能够使分离自待检测的牛的鸟分枝杆菌副结核亚种核酸序列与这些工具反应的工具。这种工具是例如特异性引物或(PCR-)引物，也称作引物片段，其基于根据本发明核酸序列。如果动物中存在鸟分枝杆菌副结核亚种的遗传物质，那么这将例如特异性结合特异性PCR引物和例如在cNDA合成后，将随后变得在PCR反应中扩增。接着在DNA凝胶电泳中可以容易地检测PCR反应产物。标准的PCR教科书给出了确定与鸟分枝杆菌副结核亚种DNA选择性PCR反应的引物的长度。经常使用至少12个核苷酸的核苷酸序列的引物片段，但是15个以上，更优选18个核苷酸的引物也常选择。特别是至少20个，优选至少30个核苷酸长度的引物通常更适用。Dieffenbach & Dreksler；PCRprimers，a laboratory manual.ISBN0-87969-447-5(1995)中更广泛描述了PCR技术。
因此，根据本发明的核酸序列或按照优选顺序具有至少12、优选15、更优选18、甚至更优选20、22、25、30、35或40个核苷酸长度的那些核酸序列的引物，其中核酸序列或其一部分与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17中描述的核酸序列具有至少70％同源性，也是本发明的一部分。引物理解为具有至少12个核苷酸的长度和与SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15或17中描述的核酸序列按照优选顺序具有至少70％，更优选80％、85％、90％、95％、98％、99％或甚至100％同源性。这种核酸序列可以用作PCR反应中引物片段为了增加它们编码的DNA的量的或用在杂交反应中。这可以在特殊核酸序列印迹中的快速扩增或检测用作检测如上面指出的鸟分枝杆菌副结核亚种的诊断工具。
遗传物质的另一种检测是基于得自如棉拭(swab)的鸟分枝杆菌副结核亚种物质，随后典型的DNA纯化，之后与放射性或颜色标记的引物片段典型杂交。颜色标记和放射性标记的片段通常称作检测工具。PCR引物和杂交反应都是本领域熟知的并且在尤其是Maniatis/Sambrook(Sambrook，J.等Molecular cloning：a laboratorymanual.ISBN 0-87969-309-6)中描述。
因此，本发明的一个实施方案涉及检测鸟分枝杆菌副结核亚种核酸序列的诊断检测试剂盒。这种检测包含根据本发明的核酸序列或其引物片段。
基于检测根据本发明的特定鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的抗原性物质并且因此适合于检测鸟分枝杆菌副结核亚种感染的诊断检测试剂盒尤其可以包含标准ELISA检测。在这种检测的一个实例中，ELISA板的孔壁被针对根据本发明的任何蛋白的抗体包被。与待检测的物质温育后，标记的抗鸟分枝杆菌副结核亚种抗体添加到孔中。然后颜色反应揭示来自鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原性物质的存在。
因此，本发明的另一个实施方案涉及检测鸟分枝杆菌副结核亚种的抗原性物质的诊断检测试剂盒。这种检测试剂盒包含抗根据本发明的蛋白或根据本发明的其片段的抗体。
基于检测血清中抗根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的抗体并且因此适合于检测鸟分枝杆菌副结核亚种感染的诊断检测试剂盒尤其可以包括标准ELISA检测。在这种检测中，ELISA板的孔壁被根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白包被。与待检测的物质温育后，标记的抗那个蛋白的抗体添加到孔中。然后缺乏颜色反应揭示鸟分枝杆菌副结核亚种的抗体的存在。
因此，本发明的另一个实施方案涉及检测抗鸟分枝杆菌副结核亚种的抗体的诊断检测试剂盒。这种检测试剂盒包含根据本发明的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或根据本发明的其片段。
免疫检测的设计可以变化。例如，免疫检测可以基于竞争或直接反应。此外，方案可以使用固相载体或可以使用细胞材料。抗体-抗原复合体的检测可以包括标记抗体的使用；该标记可以是例如酶、荧光、化学发光、放射性或染料分子。
检测与样品中根据本发明的蛋白发生反应的抗体的合适方法包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫荧光检测(IFT)和Western印迹分析。
例如如上指出表达的根据本发明的蛋白或其免疫原性片段可以用于制备抗体，它可以是多克隆、单特异性或单克隆(或其衍生物)。如果想要多克隆抗体，制备和加工多克隆血清的技术是本领域已知的(如Mayer和Walter主编.Immunochemical Methods in Cell andMolecular Biology，Academic Press，London，1987)。
针对抗根据本发明的蛋白或根据本发明的其免疫原性片段反应的单克隆抗体可以用也是本领域已知的技术(Kohler和Milstein，Nature，256，495-497，1975)免疫近交小鼠来制备。
发现鸟分枝杆菌鸟亚种与鸟分枝杆菌副结核亚种具有极其高的同源性。在猪中，而且越来越常在人中，特别是在免疫缺陷的人(如HIV阳性)中以明显增加的发生率发现鸟分枝杆菌鸟亚种。
因此，如上提及的根据本发明的蛋白可以同样很好地用于猪和人抗鸟分枝杆菌鸟亚种接种的目的，而且可以用于猪和人的诊断。
实施例
实施例1
表达文库的筛选.为了鉴定和描述用于诊断、治疗和疫苗的鸟分枝杆菌副结核亚种中抗原的特征，使用λTripleEs表达载体根据Clontechmanual(pT3003-1)和Stratagene Gigapac III Gold Packaging manual构建基因组表达文库。简言之，用Tsp509I部分消化分离自鸟分枝杆菌副结核亚种菌株316F的细菌基因组DNA，蔗糖梯度离心得到的平均2.5千碱基对的大小的片段与EcoRI消化的去磷酸化λTripleEs臂连接。使用Gigapack III Gold Packaging Extract和大肠杆菌XLlBlue宿主菌株(Clontech(S0924))实施包装反应。文库铺板后，用1)阳性牛血清(记做3869)和2)特异性鸟分枝杆菌副结核亚种单克隆抗体来实施大约106个噬菌斑的免疫筛选。这导致选择了125个阳性λTriplEx重组体。使用Clontech manual(PT3003-1)描述的方案，这些125个阳性噬菌体重组体中的一百一十七个被成功转变为质粒(pTriplEx)重组体。
这117个pTriplEx重组体的DNA测序使它们分类为不同的抗原组，每组表达不同的抗原性蛋白或其片段。血清3869分离的重组体中发现SEQ 2、4和6，单克隆抗体FabG4分离的重组体中发现SEQ 8，和分别针对鸟分枝杆菌副结核亚种的5个抗原分子的5个单克隆抗体(13.67.1A；10.65.3B；13.67.2A；10.32.3B；和10.66.4B)分离的重组体中发现SEQ 10、12、14、16和18。Blast检索含有分枝杆菌基因组信息的各种数据库可以进一步鉴定很多抗原性多肽及其编码基因。除了SEQ ID NO：19和21找到和描述的hsp65和hsp70热休克蛋白抗原，迄今为止这里提供的抗原片段无一被鉴定为鸟分枝杆菌副结核亚种相关抗原或认为在上面讨论的鸟分枝杆菌副结核亚种的已知抗原中。
实施例2
鉴定相关蛋白的Proteomics方法。
a)样品的制备。从Waston和Reed培养基中的鸟分枝杆菌副结核亚种316F的培养物中离心收集细胞。细胞沉淀用PBS洗涤一次(10g沉淀/40ml PBS)，并以5ml的部分保存在-80℃。融解后，每个样品用100ml冷PBS(4℃)洗涤两次，并悬浮于5ml冷PBS。添加蛋白酶抑制剂(胃酶抑制剂12,5μg；亮抑酶肽25μg，PefablocTMSC 125μg；抑肽酶(aprotinine)5μg)；使用Branson sonifier 250以100％输出量和50％间隔在冰上超声处理悬液10分钟。随后添加Ureum(9M)、DTT(70mM)和Triton X-100(2％)，溶液保存在室温30分钟，偶尔振荡。随后在16℃以5,000g离心悬液15分钟，再次在16℃以100,000g离心30分钟。随后用PlusOne 2-D清理试剂盒(AmershamBiosciences)根据制造商提供的方案处理所得样品以除去少量盐、多糖、核酸和脂类。使用RC DC蛋白试验(Bio-Rad Laboratories)确定样品的蛋白浓度，样品保存在-80℃直到2D-PAGE。典型地，在2D-PAGE中使用大约100μg蛋白样品，随后银染或免疫印迹，和2D-PAGE时使用达1500μg蛋白样品，随后考马斯亮兰染色。
b)2D-PAGE.根据制造商提供的方案，使用IPGphor胶条再水合的Ettan IPGphor等电聚焦系统(Amersham Biosciences)实施等电聚焦(IEF)，和使用陶瓷胶条支撑物实施。典型地，在含1.4mgDTT和0.5％μl IPG-缓冲液的再水合缓冲液中添加450μl蛋白样品，随后O/N 20℃孵育实施24cm胶条的再水合和蛋白负载。随后，根据制造商提供的规程实施IEF。IEF后，胶条可以保存在-20℃直到二维PAGE。对于二维PAGE，在含140mgDTT的14ml平衡缓冲液中室温振荡15分钟，随后在含350mg碘乙酰胺的15ml平衡缓冲液中室温振荡15分钟平衡胶条。随后，胶条简短浸入负极缓冲液中并应用二维PAGE。根据制造商(Amersham Biosciences)提供的规程，在12.5％Ettan Dalt II凝胶(26×20cm；1mm厚)中，使用Ettan Dalttwelve大规格垂直系统实施电泳。对于银染，凝胶固定在40％乙醇、10％乙酸溶液中并用plus one银染试剂盒(Amersham Biosciences)染色。对于考马斯亮兰染色，根据制造商提供的规程，使用PhastGel Blue R(Amersham Biosciences)对凝胶染色。对于免疫印迹，根据制造商提供的规程，使用Trans-Blot SD Semi Dry Electrophoretic TransferCell(Bio-Rad Laboratories)将蛋白转移到硝酸纤维素(NitrocelluloseBA85；Schleicher和Schuell)。使用标准方案使用含5％脱酯奶的PBS缓冲液，与马辣根过氧化物酶缀合的兔抗小鼠或抗牛抗体，和过氧化物，TMB和DONS作为底物实施单克隆抗体或多克隆抗体对蛋白斑点的识别。结果：如后图1，这个方法可以检测两个免疫学高度相关的蛋白。
一个蛋白是pI为5.6-6.15的60kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。图1b和d中可看到这个蛋白是大约5个斑点的水平行。
另一个蛋白是pI为4.20-4.75的30KD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白。在图1a和d中可以看到这个蛋白是大约3个斑点的水平行。
实施例3
来自接种和感染山羊的T细胞对14kD蛋白、9kD蛋白和Hsp70和Hsp65的识别。
根据制造商提供的方案，使用牛干扰素γ试验(BOVIGAM；CSLlaboratories Parkville，Victoria，Australia)检测实验感染鸟分枝杆菌副结核亚种的山羊的外周血样品中T细胞的刺激。下列抗原添加到1.5ml全血中：分别来自牛分枝杆菌菌株AN5(ID-Lelystad，荷兰制备)，来自鸟分枝杆菌鸟亚种菌株D4(ID-Lelystad，荷兰制备)，和来自鸟分枝杆菌副结核亚种菌株3+5/C(ID-Lelystad，荷兰制备)的重组纯化的14kD蛋白、9kD蛋白、Hsp70和Hsp65(0.5和5μg)，和三个PPD(3μg)。在三个连续时间使用来自大约两岁龄前12次经口感染1ml(OD660＝0.059)鸟分枝杆菌副结核亚种菌株DSU405650号(超过4周的时间：每周在星期一、星期三和星期五)的9只山羊的双周样品检测这些抗原中的每一个。感染前4周用0.5ml基于减毒鸟分枝杆菌副结核亚种菌株316F(ID-Lelystad，荷兰制备)的实验灭活疫苗接种这些动物中的五只(188-193)。认为吸收值≥0.1(当针对背景值校正时)和≥2倍背景值被认为由于抗原的存在干扰素γ的产量增加。
结果：所有检测的重组抗原诱导至少一只动物干扰素γ的产量增加。这表明它们都在T细胞介导的免疫应答中起作用。典型的实验在表1中显示。9只动物中五只(56％)显示出对9kD抗原的应答增加，九只动物中的三只(33％)显示对14kD，9只中的8只(90％)对hsp65，和九只中的三只对hsp70的应答增加。
表1
Exp 5.040901  188  189  190 191  193  194  195  196  198
AG
牛PPD(3ug)  1.778  1.089  0.426 1.167  0.475  0.174  0.162  0.054  0.701
鸟PPD(3ug)  3.484  1.795  1.348 3.475  3.114  0.731  0.655  0.099  2.466
副结核PPD(3ug)  3.501  2.664  2.187 ＞4  3.319  1.919  1.339  0.254  3.078
14kD 0.5ug  0.022 -0.017  0.102 -0.023  0,022  0.103  0.004 -0.008  0.392
14kD 5ug  0.018  0.023  0.175 -0.017  0,011  0.151  0,131 -0.002  0.333
9kD 0.5ug  0.103  0.424  0.213  0.006  0.149  0.409  0.025  0.036  0.022
9kD 5ug  0.139  1.169  0.262  0.009  0.065  1.712  0.243  0.045  0.107
47kD 0.5ug -0.022 -0.020 -0.012 -0.040 -0.002 -0.007 -0.006 -0.007 -0.002
47kD 5ug -0.006  0.001 -0.007 -0.041 -0.010  0.019  0.009 -0.005 -0.010
Hsp70 0.5ug  0.092 -0.012  0.143 -0.006 -0.011  0.286  0.007 -0.010  0.070
Hsp70 5ug  0.174  0.032  0.220  0.023  0.001  0.969  0.094  0.001  0.187
Hsp65 0.5ug  0.633  0.945  0.390  0.105  0.111  0.247  0.456 -0.001  0.121
Hsp65 5ug  1,069  0.949  0.925  0.188  0.357  1.086  0.599  0.049  0.213
实施例4
用14kD、9kD、47kD、70kD和65kD蛋白免疫牛，特异性抗体反应的检测和DTH反应性的检测。
a)免疫
为了评估14kD、9kD、47kD、70kD和65kD蛋白的免疫原性和诱导对来自牛分枝杆菌的PPD的(交叉反应)DTH反应的能力，如下免疫牛：1)用基于减毒鸟分枝杆菌副结核亚种316F(ID-Lelystad，荷兰制备；4只动物)的灭活全细胞疫苗2)W/O佐剂中的纯化重组14kD蛋白(4只动物)3)W/O佐剂中的纯化重组9kD蛋白(4只动物)4)W/O佐剂中的纯化重组47kD蛋白(4只动物)5)W/O佐剂中的纯化重组hsp70(2只动物)6)W/O佐剂中的纯化重组hsp65(2只动物)7)单独W/O佐剂(3只动物)。在第0天和第127天给予下列量抗原的初次和加强免疫：
    抗原    初次(μg)    加强(μg)
    14kD     207         259
    9kD      156         236
    47kD     273         305
    70kD     348         342
    65kD     681         491
在第0天(1ml)和127天(0.5ml)给予实验疫苗进行的免疫。在第52和第178天取出血清样品。在第-56天(免疫前建立动物的DTH状态)、第52和178天进行DTH检测。
b)血清中抗体的检测
通过使用标准SDS-PAGE和免疫印迹方案，其中泳道中加样2.5μg纯化重组14kD、9kD、47kD、65kD和70kD蛋白和2.5μg各种提取物(来自牛分枝杆菌菌株AN5的全细胞超声处理物和PPD；来自鸟分枝杆菌副结核亚种菌株B854的全细胞超声处理物和来自鸟分枝杆菌副结核亚种菌株3+5/C的PPD)来检测来自每个免疫组的一只代表动物的血清样品中的总IgG抗体，确定PPD中抗原的免疫原性和它们的存在。
结果：所有代表性血清中的抗体检测相应重组14、9、47、65和70kD蛋白(图2图A-E，泳道1)；重组14kD蛋白的抗体不能识别牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌副结核全细胞超声处理物和PPD中的相应抗原(图2图A，泳道2-4)；重组9kD蛋白的抗体识别牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌副结核全细胞超声处理物和鸟分枝杆菌副结核PPD中的相应抗原，但不识别牛分枝杆菌PPD中的相应蛋白(图2图B，泳道2-4)；重组47kD蛋白的抗体识别(弱)牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌副结核全细胞超声处理物中的相应抗原，但不能识别PPD中的相应条带(图2图C，泳道2-4)；重组65和70kD蛋白的抗体识别牛分枝杆菌和鸟分枝杆菌副结核全细胞超声处理物和PPD中的相应抗原(图2图D和E，泳道2-4)。
另外，使用标准ELISA方案检测血清样品中总IgG抗体来确立抗原的免疫原性，其中用5μg各种鸟分枝杆菌副结核亚种菌株(B854，5255，316F，3+5/C，Teps)或牛分枝杆菌菌株AN5的各种提取物(全细胞超声处理物，KCL提取物，分泌的蛋白)和5μg重组纯化的14kD、9kD、47kD、70kD和65kD蛋白包被孔。任意地，认为在OD＝1.0超过1/80的滴度(titer)是阳性反应的标志。
结果：初次和加强免疫后，对14kD、9kD、47kD、70kD和65kD蛋白检测到强烈的特异性抗体反应(滴度＞640；表2和3)。加强免疫后，9kD蛋白检测到特异性抗体滴度(滴度160；表2和3)。
表2
                           OD＝10时的血清滴度(第52天)
 B854FormCells  5255USO  3+5/CJohn.  316FExcr.  TepsKCL  AN5KCL  14kD  9kD  47kD  Hsp70  Hsp65
 Paratb  840  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  ＜5  5  40  ＜5
 6431  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  ＜5  ＜5  40  10
 7029  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  ＜5  ＜5  20  5
 9293  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  5  ＜5  40  10
 14kD  5955  10  20  ＜5  10  20  40  320  ＜5  ＜5  5  20
 7002  ＜5  5  ＜5  ＜5  10  20  ＞640  ＜5  40  ＜5  10
 8546  40  40  10  20  160  20  ＞640  ＜5  ＜5  5  10
 9506  5  5  ＜5  10  40  40  ＞640  ＜5  ＜5  ＜5  20
 9kD  1728  ＜5  5  ＜5  5  10  ＜5  ＜5  ＜5  ＜5  ＜5  10
 7430  5  ＜5  ＜5  ＜5  40  10  ＜5  ＜5  5  10  10
 8116  ＜5  80  5  5  10  5  ＜5  ＜5  ＜5  ＜5  ＜5
 8783  20  80  20  20  40  40  ＜5  ＜5  5  5  10
 47kD   2968   10   20   ＜5   ＜5   20   10   ＜5   ＜5  ＞640  5  5
  2969   160   80   40   40   160   10   ＜5   ＜5  ＞640  5  10
  3847   ＜5   5   ＜5   ＜5   10   ＜5   ＜5   ＜5  ＞640  5  5
  3911   10   5   ＜5   5   10   5   10   ＜5  ＞640  5  10
 Hsp70   7020   20   10   10   5   80   10   5   ＜5  5  ＞640  ＜5
  7049   10   20   20   10   20   5   ＜5   ＜5  10  ＞640  ＜5
 Hsp65   3105   10   10   10   5   40   40   ＜5   ＜5  20  10  ＞640
  9505   5   40   20   5   40   80   ＜5   ＜5  ＜5  5  ＞640
佐剂   1727   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5   10   10   ＜5   ＜5  ＜5  ＜5  ＜5
  3848   10   10   10   20   10   5   ＜5   ＜5  ＜5  ＜5  ＜5
  7429
 无   8354   20   80   5   5   10   5   ＜5   ＜5  ＜5  ＜5  ＞5
  8738   ＜5   20   ＜5   10   5   ＜5   ＜5   ＜5  ＜5  10  ＞5
表3
                           OD＝10时的血清滴度(第178天)
 B854FormCells  5255USO  3+5/CJohn.  316FExcr.  CKCL  AN5KCL  14kD  9kD  47kD  Hsp70  Hsp65
Paratb  840  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  5  5  10  320  20
 6431  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜640  ＞640  ＜5  10  5  40  20
 7029  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  5  5  10  5
 9293  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＞640  ＜5  10  10  20  40
14kD  5955  20  80  ＜5  20  320  5  ＞640  5  20  10  40
 7002  ＜5  20  ＜5  ＜5  320  ＜5  ＞640  10  10  ＜5  20
 8546  10  80  5  20  80  10  ＞640  40  5  5  20
 9506  5  40  ＜5  10  160  5  ＞640  20  10  10  20
9kD  1728  ＜5  10  ＜5  20  80  ＜5  10  ＜5  40  10  80
 7430  ＜5  40  ＜5  5  80  20  5  160  20  ＜5  40
 8116  ＜5  20  ＜5  ＜5  160  40  40  160  80  10  80
 878  40  80  20  80  320  10  10  160  10  5  40
  3
  47kD   2968   40   80   10   10   40   ＜5   10   ＜5   ＞640   20   40
  2969   20   80   10   40   320   5   ＜5   ＜5   ＞640   5   20
  3847   ＜5   80   ＜5   ＜5   80   ＜5   ＜5   ＜5   ＞640   10   10
  3911   80   160   20   10   80   5   40   20   ＞640   10   40
  Hsp70   7020   ＞640   80   80   10   ＞640   40   ＜5   ＜5   20   ＞640   5
  7049   ＞640   640   ＞640   10   ＞640   320   ＜5   ＜5   80   ＞640   10
  Hsp65   3105   320   80   160   20   80   40   10   20   40   40   ＞640
  9505   ＞640   160   ＞640   20   80   80   80   320   160   80   ＞640
  佐剂   1727   ＜5   20   ＜5   ＜5   20   ＜5   5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5
  3848   10   80   10   10   20   5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5
  7429   ＜5   20   ＜5   ＜5   40   10   ＜5   ＜5   ＜5   5   10
  无   8354   ＜5  80   ＜5   ＜5   20   10   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5
  8738   ＜5  20   ＜5   ＜5   80   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5   ＜5
c)DTH反应性
根据EU指令(directive)64/432(指令97/12和指令98/46修正的)进行迟发型超敏(DTH)反应。简言之，注射2000IE鸟类PPD，和2000和5000IE牛PPD并在72小时后检测皮肤厚度的增加。增加超过2mm认为是DTH反应阳性。在全细胞灭活副结核疫苗组中，检测初次和加强免疫后所有四只动物中的牛PPD反应性(表4)。检测初次免疫后用14kD蛋白(1/4)和hsp65(1/2)，和加强免疫后47kD蛋白(1/4)接种的动物中的牛PPD反应性(表4)。在9kD蛋白和70kD蛋白免疫的组中未检测到牛PPD反应性(表4)。
结果：在DTH PPD检测中9kD和Hsp70蛋白没有给出反应。在需要有助于抗感染的保护和另外在DTH PPD检测中不与PPD交叉反应的疫苗的情况下，根据本发明的新的9kD蛋白将是选择的疫苗成分，优选与Hsp70组合。
表4.DTH反应
     DTH(第56天)                       DTH(第52天)            DTH(第178天)
 A2k  B2K     A2k     B2k  B5k     A2K     B2K     B5K
Ptb  840  0  0     23     6  9     12     2     8
 6431  0  0     25     15  23     6     3     5
 7019  0  0     11     5  7     10     4     4
 9293  0  0     17     8  11.5     6     6     6
14kD  5955  0  0     0.5     1.0  0     0     0     0
 7002  0  0     2.5     0  0     0     0     0
 8546  0  0     1.5     0  4.5     0     0     0
 9506  0  0     1.0     0  1.5     5     0     0
9kD  1728  0  0     0     0  0     0     0     0
 7430  0  0     0     0  0     0     0     0
 8116  0  0     0     0  0     0     0     0
 8783  0  0     0     0  0     0     0     0
47kD  2968  0  0  0  0  0  0  0  0
 2969  0  0  0  0  0  1  0  0
 3847  0  0  0  0  0  0  0  0
 3911  0  0  0  0  0  1  0  4
Hsp70  7020  0  0  1.5  0  0  0  0  0
 7049  0  0  0  0  0  0  0  0
Hsp65  3105  0  0  10  0.5  6  2  0  0
 9505  0  0  0  0  0  0  0  0
佐剂  1727  0  0  0  0  0  0  0  0
 3848  0  0  2.0  0.5  0  1  0  0
 7429  0  0  0  0  0  0  0  0
无  8354  2.7  0  2.5  0  0  NT  NT  NT
 8738  0  0  0  0  0  0  0  0
ΔDTH＞2mm为粗体。
NT为未检验；在实验中动物被去除。
附图说明
图1A显示2D凝胶的Western印迹中存在pI为4.20-4.75的33kD蛋白，看起来是大约3个斑点的水平行。
图1B显示2D凝胶的Western印迹中存在pI为5.60-6.15的60kD蛋白，看起来是大约5个斑点的水平行。
图1C显示考马斯亮兰染色的2D凝胶，其中可见33kD和66kD蛋白的特异斑点。
图1D显示银染的2D凝胶，其中再次可见33kD和66kD蛋白的特异斑点。
图2
来自重组纯化14kD蛋白(图A)、重组纯化9kD蛋白(图B)，重组47kD(图C)、重组纯化70kD(图D)和重组65kD(图E)免疫的动物的血清样品(第178天)的免疫印迹。
1道，14(A)，9(B)，47(C)，70(D)或65 kD(E)重组纯化蛋白。
2道，牛分枝杆菌菌株AN5全细胞超声处理物。
3道，鸟分枝杆菌副结核菌株B854全细胞超声处理物。
4道，来自鸟分枝杆菌副结核菌株3+5/C的PPD。
5道，来自牛分枝杆菌菌株AN5的PPD。
                                序列表
<110>ID-Lelystad，Instituut voor Dierhouderij en Diergezondheid B.V.
<120>用于副结核分枝杆菌感染的诊断学和疫苗
<130>XYZ
<160>22
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1175
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(134)..(1144)
<223>
<400>1
aattgcctca cgattcaata tcaccactct agtaatagga ttcccactcg taccatcgac    60
tgtgtgtgat tcctgccaga cagcatcggc ggggcgcgcc gacacaacac atagtcagat    120
agaggagact tcc gtg ccg aac cga cgc cga cgc aag ctt tcg aca gcc       169
               Val Pro Asn Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ser Thr Ala
               1               5                   10
atg agc gcg gtc gcc gcc ctg gca gtg gcg agt cct tgc gca tac ttc      217
Met Ser Ala Val Ala Ala Leu Ala Val Ala Ser Pro Cys Ala Tyr Phe
        15                  20                  25
ctt gtc tac gaa tcg acg gcc ggc aac aag gcg ccc gag cac cac gag      265
Leu Val Tyr Glu Ser Thr Ala Gly Asn Lys Ala Pro Glu His His Glu
    30                  35                  40
ttc aag cag gcc gca gtg atg agc gat ctg ccg ggc gag ctg atg ggt      313
Phe Lys Gln Ala Ala Val Met Ser Asp Leu Pro Gly Glu Leu Met Gly
45                  50                  55                  60
gcg ctg tcg cag ggc ctg tcg cag ttt ggg atc aac ctg ccc ccg gtg      361
Ala Leu Ser Gln Gly Leu Ser Gln Phe Gly Ile Asn Leu Pro Pro Val
                65                  70                  75
ccc gcc ctg agc ggc ggc gcc acc agc act ccc ggt ctg gcc agc ccc    409
Pro Ala Leu Ser Gly Gly Ala Thr Ser Thr Pro Gly Leu Ala Ser Pro
            80                  85                  90
ggc ctg ggt agc ccc ggc ctg ggc acg ccc ggc ctg gga acg ccg ggc    457
Gly Leu Gly Ser Pro Gly Leu Gly Thr Pro Gly Leu Gly Thr Pro Gly
        95                  100                 105
ctg acc aat ccc ggt ctg acg agc ccc ggt gcg acc agt ccc ggc ctg    505
Leu Thr Asn Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Ala Thr Ser Pro Gly Leu
    110                 115                 120
acc agt ccc ggc ctg acc agt cct ggt ttg acc agc ccc ggt ctg acc    553
Thr Ser Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Leu Thr
125                 130                 135                 140
agc ccg ggt gcg gcg ccg acg acg ccc ggg ctc acc gcg ccc ggc gcg    601
Ser Pro Gly Ala Ala Pro Thr Thr Pro Gly Leu Thr Ala Pro Gly Ala
                145                 150                 155
ctg ccg acc acg ccg ggc ggc ggg gtc gcc acc ccc ggc gcc ggg ctc    649
Leu Pro Thr Thr Pro Gly Gly Gly Val Ala Thr Pro Gly Ala Gly Leu
            160                 165                 170
aac ccc gcg ctg tcc aac ccc ggg ctg acc agc ccg gcc ggg acg gcg    697
Asn Pro Ala Leu Ser Asn Pro Gly Leu Thr Ser Pro Ala Gly Thr Ala
        175                 180                 185
ccg ggg ctg ggc agc ccg acc gtg gcg ccg agt gag gtg ccg atc gac    745
Pro Gly Leu Gly Ser Pro Thr Val Ala Pro Ser Glu Val Pro Ile Asp
    190                 195                 200
tcc ggg gcc ggc ctg gac ccg ggc gcc ggt ggc acg tac ccg atc ctg    793
Ser Gly Ala Gly Leu Asp Pro Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Pro Ile Leu
205                 210                 215                 220
ggc gac ccg tcg acc ttc ggt aac gcc tcg ccg atc ggc ggc ggt ggc    841
Gly Asp Pro Ser Thr Phe Gly Asn Ala Ser Pro Ile Gly Gly Gly Gly
                225                 230                 235
acc ggt ctg ggc ggc ggc tcg agc tcg ggt ggc agc ggc ggc ctg gtc    889
Thr Gly Leu Gly Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val
            240                 245                 250
aac gac gtg atg caa gcc gcc aac cag ctc ggc gcg ggt cag gcg atc    937
Asn Asp Val Met Gln Ala Ala Asn Gln Leu Gly Ala Gly Gln Ala Ile
        255                 260                 265
gac ctg ctc aag ggc ctg gtg atg ccg gcg atc acg cag ggc atg cac    985
Asp Leu Leu Lys Gly Leu Val Met Pro Ala Ile Thr Gln Gly Met His
    270                 275                 280
ggc ggc gcg gcc gcg ggt gct ttg ccc ggc gcg gcc ggt gct ctg ccc    1033
Gly Gly Ala Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro
285                 290                 295                 300
ggc gcg gcc ggc gcc ctg ccc ggt gcg gcc ggc gcc ctg ccg ggt gcg    1081
Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala
                305                 310                 315
gcg ggc gcc gcg ggt gcg ttg ccg gcg gcc gcc ggc gcc gcg ccg gca    1129
Ala Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ala
            320                 325                 330
ctg ccc ccg gtc tag accttttcca aaccatccac cagacggcac c             1175
Leu Pro Pro Val
        335
<210>2
<211>336
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>2
Val Pro Asn Arg Arg Arg Arg Lys Leu Ser Thr Ala Met Ser Ala Val
1               5                   10                  15
Ala Ala Leu Ala Val Ala Ser Pro Cys Ala Tyr Phe Leu Val Tyr Glu
            20                  25                  30
Ser Thr Ala Gly Asn Lys Ala Pro Glu His His Glu Phe Lys Gln Ala
        35                  40                  45
Ala Val Met Ser Asp Leu Pro Gly Glu Leu Met Gly Ala Leu Ser Gln
    50                  55                  60
Gly Leu Ser Gln Phe Gly Ile Asn Leu Pro Pro Val Pro Ala Leu Ser
65                  70                  75                  80
Gly Gly Ala Thr Ser Thr Pro Gly Leu Ala Ser Pro Gly Leu Gly Ser
                85                  90                  95
Pro Gly Leu Gly Thr Pro Gly Leu Gly Thr Pro Gly Leu Thr Asn Pro
            100                 105                 110
Gly Leu Thr Ser Pro Gly Ala Thr Ser Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly
        115                 120                 125
Leu Thr Ser Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Leu Thr Ser Pro Gly Ala
    130                 135                 140
Ala Pro Thr Thr Pro Gly Leu Thr Ala Pro Gly Ala Leu Pro Thr Thr
145                 150                 155                 160
Pro Gly Gly Gly Val Ala Thr Pro Gly Ala Gly Leu Asn Pro Ala Leu
                165                 170                 175
Ser Asn Pro Gly Leu Thr Ser Pro Ala Gly Thr Ala Pro Gly Leu Gly
            180                 185                 190
Ser Pro Thr Val Ala Pro Ser Glu Val Pro Ile Asp Ser Gly Ala Gly
        195                 200                 205
Leu Asp Pro Gly Ala Gly Gly Thr Tyr Pro Ile Leu Gly Asp Pro Ser
    210                 215                 220
Thr Phe Gly Asn Ala Ser Pro Ile Gly Gly Gly Gly Thr Gly Leu Gly
225                 230                 235                 240
Gly Gly Ser Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Leu Val Asn Asp Val Met
                245                 250                 255
Gln Ala Ala Asn Gln Leu Gly Ala Gly Gln Ala Ile Asp Leu Leu Lys
            260                 265                 270
Gly Leu Val Met Pro Ala Ile Thr Gln Gly Met His Gly Gly Ala Ala
        275                 280                 285
Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly
    290                 295                 300
Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Leu Pro Gly Ala Ala Gly Ala Ala
305                 310                 315                 320
Gly Ala Leu Pro Ala Ala Ala Gly Ala Ala Pro Ala Leu Pro Pro Val
                325                 330                 335
<210>3
<211>600
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(67)..(567)
<223>
<400>3
ttcgagaagg gatagcaggc ggggccgggc ggtgaacccg ggaggcgcgc ggtgcgtctt   60
cagggc atg tcc cgt ttg tca ttt gtc tgc agg ctt ttg gcc gca acc     108
       Met Ser Arg Leu Set Phe Val Cys Arg Leu Leu Ala Ala Thr
       1               5                   10
gct ttc gcc gtc gcc ctg cta ctc ggg ctg ggc gac gtg ccg cgc gcg    156
Ala Phe Ala Val Ala Leu Leu Leu Gly Leu Gly Asp Val Pro Arg Ala
15                  20                  25                  30
gcg gcc acc gac gac cgc ctg caa ttc acc gcg acc acg ctc agc ggc    204
Ala Ala Thr Asp Asp Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly
                35                  40                  45
gcg ccg ttc aac ggc gcc agt ctg cag ggc aag ccc gcc gtg ctg tgg    252
Ala Pro Phe Asn Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp
            50                  55                  60
ttc tgg acg ccg tgg tgc ccg tac tgc aac gcc gag gcc ccg ggc gtg    300
Phe Trp Thr Pro Trp Cys Pro Tyr Cys Asn Ala Glu Ala Pro Gly Val
        65                  70                  75
agc cgg gtg gcc gcc gcc aac ccg ggc gtc acc ttc gtc ggc gtc gcc    348
Ser Arg Val Ala Ala Ala Asn Pro Gly Val Thr Phe Val Gly Val Ala
    80                  85                  90
gcc cac tcc gaa gtc ggc gcc atg gcc aac ttc gtc tcc aag tac aac    396
Ala His Ser Glu Val Gly Ala Met Ala Asn Phe Val Ser Lys Tyr Asn
95                  100                 105                 110
ctg aac ttc acc acg ctc aac gac gcc gac ggc gcg atc tgg gcc cgc    444
Leu Asn Phe Thr Thr Leu Asn Asp Ala Asp Gly Ala Ile Trp Ala Arg
                115                 120                 125
tac ggc gtg ccc tgg cag ccc gcg tac gtg ttc tac cgg gcg gac ggc    492
Tyr Gly Val Pro Trp Gln Pro Ala Tyr Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly
            130                 135                 140
agc tcc acc ttc gtc aac aac ccc acc tcg gcg atg ccc cag gac gaa    540
Ser Ser Thr Phe Val Asn Asn Pro Thr Ser Ala Met Pro Gln Asp Glu
        145                 150                 155
ctg gcc gcc cgg gtg gcg gcg ctg cgc tgacgtggac cgcggtctgg          587
Leu Ala Ala Arg Val Ala Ala Leu Arg
    160                 165
tcgggctggc ggt                                                     600
<210>4
<211>167
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>4
Met Ser Arg Leu Ser Phe Val Cys Arg Leu Leu Ala Ala Thr Ala Phe
1               5                   10                  15
Ala Val Ala Leu Leu Leu Gly Leu Gly Asp Val Pro Arg Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Thr Asp Asp Arg Leu Gln Phe Thr Ala Thr Thr Leu Ser Gly Ala Pro
        35                  40                  45
Phe Asn Gly Ala Ser Leu Gln Gly Lys Pro Ala Val Leu Trp Phe Trp
    50                  55                  60
Thr Pro Trp Cys Pro Tyr Cys Asn Ala Glu Ala Pro Gly Val Ser Arg
65                  70                  75                  80
Val Ala Ala Ala Asn Pro Gly Val Thr Phe Val Gly Val Ala Ala His
                85                  90                  95
Ser Glu Val Gly Ala Met Ala Asn Phe Val Ser Lys Tyr Asn Leu Asn
            100                 105                 110
Phe Thr Thr Leu Asn Asp Ala Asp Gly Ala Ile Trp Ala Arg Tyr Gly
        115                 120                 125
Val Pro Trp Gln Pro Ala Tyr Val Phe Tyr Arg Ala Asp Gly Ser Ser
    130                 135                 140
Thr Phe Val Asn Asn Pro Thr Ser Ala Met Pro Gln Asp Glu Leu Ala
145                 150                 155                 160
Ala Arg Val Ala Ala Leu Arg
                165
<210>5
<211>366
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(34)..(366)
<223>
<400>5
tagcggtgca ttgactgggg aaggtgtcca cac atg agg ctg tcg ttg agc aaa    54
                                     Met Arg Leu Ser Leu Ser Lys
                                     1               5
ttg ggc gtt gcg gtg ggc agc gcg gca gtg gca ttg acc gcc gcg gcc    102
Leu Gly Val Ala Val Gly Ser Ala Ala Val Ala Leu Thr Ala Ala Ala
        10                  15                  20
ggt gtc gca tcc gcc gac ccc atg gac gcg atc atc aac acc acc tgc    150
Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Met Asp Ala Ile Ile Asn Thr Thr Cys
    25                  30                  35
aac tac ggg cag gtg atc gcc gcg ctg aac gcg tcc gac ccg gcg gct    198
Asn Tyr Gly Gln Val Ile Ala Ala Leu Asn Ala Ser Asp Pro Ala Ala
40                  45                  50                  55
gcc cag cag ctg aac tcg tcg ccg atg gcg cag tcc tac atc cag cgg    246
Ala Gln Gln Leu Asn Ser Ser Pro Met Ala Gln Ser Tyr Ile Gln Arg
                60                  65                  70
ttc ctg gcc tcc ccg ccg gcg aag cgt cag cag atg gcc cag cag atc    294
Phe Leu Ala Ser Pro Pro Ala Lys Arg Gln Gln Met Ala Gln Gln Ile
            75                  80                  85
cag ggc atg ccg gcc gcg cag cag tac atc aac gac atc aac cag gtc    342
Gln Gly Met Pro Ala Ala Gln Gln Tyr Ile Asn Asp Ile Asn Gln Val
        90                  95                  100
gcg gtc acc tgt aac aac ttc tga                                      366
Ala Val Thr Cys Asn Asn Phe
    105                 110
<210>6
<211>110
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>6
Met Arg Leu Ser Leu Ser Lys Leu Gly Val Ala Val Gly Ser Ala Ala
1               5                   10                  15
Val Ala Leu Thr Ala Ala Ala Gly Val Ala Ser Ala Asp Pro Met Asp
            20                  25                  30
Ala Ile Ile Asn Thr Thr Cys Asn Tyr Gly Gln Val Ile Ala Ala Leu
        35                  40                  45
Asn Ala Ser Asp Pro Ala Ala Ala Gln Gln Leu Asn Ser Ser Pro Met
    50                  55                  60
Ala Gln Ser Tyr Ile Gln Arg Phe Leu Ala Ser Pro Pro Ala Lys Arg
65                  70                  75                  80
Gln Gln Met Ala Gln Gln Ile Gln Gly Met Pro Ala Ala Gln Gln Tyr
                85                  90                  95
Ile Asn Asp Ile Asn Gln Val Ala Val Thr Cys Asn Asn Phe
            100                 105                 110
<210>7
<211>1410
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(46)..(1410)
<223>
<400>7
ctataggcat accccgacgc agaaacaaca cggaaggtag ctccg gtg gct ccg aag    57
                                                Val Ala Pro Lys
                                                1
gtc tcg tcc gat ctg ttc tcg cag att gtc aat tcc ggt cct gga tcg    105
Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Gln Ile Val Asn Ser Gly Pro Gly Ser
5                   10                  15                  20
ttt ctc gcc aag cag ctc ggc gtc ccg caa ccc gag acg ctg cgc cgc    153
Phe Leu Ala Lys Gln Leu Gly Val Pro Gln Pro Glu Thr Leu Arg Arg
                25                  30                  35
tac cgg ccc ggt gac ccg ccg ctg gcc ggg tcg ctg ctg atc ggc ggc    201
Tyr Arg Pro Gly Asp Pro Pro Leu Ala Gly Ser Leu Leu Ile Gly Gly
            40                  45                  50
gag ggc cgc gtg gtc gag ccg ctg cgg gcg gcg ctg gcc aag gac tac    249
Glu Gly Arg Val Val Glu Pro Leu Arg Ala Ala Leu Ala Lys Asp Tyr
        55                  60                  65
gac ctg gtc ggc aac aac ctg ggc ggg cgc tgg gcc gac cgg ttc ggc    297
Asp Leu Val Gly Asn Asn Leu Gly Gly Arg Trp Ala Asp Arg Phe Gly
    70                  75                  80
ggg ctg gtc ttc gac gcc acc ggg atc acc acc ccg gag ggc ctg aag    345
Gly Leu Val Phe Asp Ala Thr Gly Ile Thr Thr Pro Glu Gly Leu Lys
85                  90                  95                  100
ggg ctg tac gag ttc ttc acc cca ctg ctg cgc aac ctg ggt cac tgc    393
Gly Leu Tyr Glu Phe Phe Thr Pro Leu Leu Arg Asn Leu Gly His Cys
                105                 110                 115
gcc cgc gtg gtg gtg gtc ggc acc acg ccc gac gcc gcc gcc ggc ccg    441
Ala Arg Val Val Val Val Gly Thr Thr Pro Asp Ala Ala Ala Gly Pro
            120                 125                 130
cac gag cgg atc gcc cag cgc gcc ctg gag ggc ttc acc cgg tca ttg    489
His Glu Arg Ile Ala Gln Arg Ala Leu Glu Gly Phe Thr Arg Ser Leu
        135                 140                 145
ggc aag gag ctg cgc aac ggc tcg acg gtg gcg ctg gtg tac ctg tcg    537
Gly Lys Glu Leu Arg Asn Gly Ser Thr Val Ala Leu Val Tyr Leu Ser
    150                 155                 160
ccg gcc gcc aaa ccc gcc gcg acg ggc ctg gag tcg acc atg cgg ttc    585
Pro Ala Ala Lys Pro Ala Ala Thr Gly Leu Glu Ser Thr Met Arg Phe
165                 170                 175                 180
atc ctg tcg gcc aag tcc gcc tac gtc gac ggc cag gtc ttc tac gtc    633
Ile Leu Ser Ala Lys Ser Ala Tyr Val Asp Gly Gln Val Phe Tyr Val
                185                 190                 195
ggc gag gcc gac tcc acc ccc ccg gcg gac tgg gaa cgg ccg ctg gac    681
Gly Glu Ala Asp Ser Thr Pro Pro Ala Asp Trp Glu Arg Pro Leu Asp
            200                 205                 210
ggc aag gtc gcc atc gtg acc ggt gcg gcc cgc gga atc ggc gcc acg    729
Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ala Arg Gly Ile Gly Ala Thr
        215                 220                 225
atc gcc gag gtg ttc gcc cgc gac ggc gcc cgc gtg gtc gcg atc gac    777
Ile Ala Glu Val Phe Ala Arg Asp Gly Ala Arg Val Val Ala Ile Asp
    230                 235                 240
gtg gaa tcg gcc gcc gag acg ctg gcc gag acg gcc agc cgg gtc ggc    825
Val Glu Ser Ala Ala Glu Thr Leu Ala Glu Thr Ala Ser Arg Val Gly
245                 250                 255                 260
ggc acc gcg ctg tgg ctc gac gtc acc gcc ccc gac gcc gtc gac aag    873
Gly Thr Ala Leu Trp Leu Asp Val Thr Ala Pro Asp Ala Val Asp Lys
                265                 270                 275
atc acc gag cac ctg cgc gag cac cac ggc ggt cac gcc gac atc ctg    921
Ile Thr Glu His Leu Arg Glu His His Gly Gly His Ala Asp Ile Leu
            280                 285                 290
gtc aac aac gcc ggg atc acc cgc gac aag ctg ctg gcc aac atg gac    969
Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Lys Leu Leu Ala Asn Met Asp
        295                 300                 305
gac gcg cgc tgg gac gcc gtg ttg gcc gtg aat ctg ctt gcc cca ctt    1017
Asp Ala Arg Trp Asp Ala Val Leu Ala Val Asn Leu Leu Ala Pro Leu
    310                 315                 320
cgc ctt acc gaa ggg ctg gtg ggc aac ggc agc atc ggc gaa ggc ggc    1065
Arg Leu Thr Glu Gly Leu Val Gly Asn Gly Ser Ile Gly Glu Gly Gly
325                 330                 335                 340
cgc atc gtc ggc ctt tcg tcg atg gcc ggc atc gcg ggc aac cgc ggc    1113
Arg Ile Val Gly Leu Ser Ser Met Ala Gly Ile Ala Gly Asn Arg Gly
                345                 350                 355
cag acc aac tac gcc acc acc aag gca ggc atg atc ggc ctc acc cag    1161
Gln Thr Asn Tyr Ala Thr Thr Lys Ala Gly Met Ile Gly Leu Thr Gln
            360                 365                 370
gcg ctg gcg ccg gag ctc tac gac aag ggc atc acc atc aac gcc gtc    1209
Ala Leu Ala Pro Glu Leu Tyr Asp Lys Gly Ile Thr Ile Asn Ala Val
        375                 380                 385
gcg ccg gga ttc atc gag acc cag atg acg gcc gcc atc ccg ctg gcc    1257
Ala Pro Gly Phe Ile Glu Thr Gln Met Thr Ala Ala Ile Pro Leu Ala
    390                 395                 400
acc cgc gag gtg ggg cgc cgg atg aac tcg ctg ctg cag ggc ggg cag    1305
Thr Arg Glu Val Gly Arg Arg Met Asn Ser Leu Leu Gln Gly Gly Gln
405                 410                 415                 420
ccg gtg gac gtc gcc gaa acc atc gcc tac ttc gcc agc ccg gcg tcg    1353
Pro Val Asp Val Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Phe Ala Ser Pro Ala Ser
                425                 430                 435
aac gcg gtg acc ggc aac gtc atc cgg gtc tgc ggc cag gcg atg ctg    1401
Asn Ala Val Thr Gly Asn Val Ile Arg Val Cys Gly Gln Ala Met Leu
            440                 445                 450
ggg gca tga                                                        1410
Gly Ala
<210>8
<211>454
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>8
Val Ala Pro Lys Val Ser Ser Asp Leu Phe Ser Gln Ile Val Asn Ser
1               5                   10                  15
Gly Pro Gly Ser Phe Leu Ala Lys Gln Leu Gly Val Pro Gln Pro Glu
            20                  25                  30
Thr Leu Arg Arg Tyr Arg Pro Gly Asp Pro Pro Leu Ala Gly Ser Leu
        35                  40                  45
Leu Ile Gly Gly Glu Gly Arg Val Val Glu Pro Leu Arg Ala Ala Leu
    50                  55                  60
Ala Lys Asp Tyr Asp Leu Val Gly Asn Asn Leu Gly Gly Arg Trp Ala
65                  70                  75                  80
Asp Arg Phe Gly Gly Leu Val Phe Asp Ala Thr Gly Ile Thr Thr Pro
                85                  90                 95
Glu Gly Leu Lys Gly Leu Tyr Glu Phe Phe Thr Pro Leu Leu Arg Asn
            100                 105                 110
Leu Gly His Cys Ala Arg Val Val Val Val Gly Thr Thr Pro Asp Ala
        115                 120                 125
Ala Ala Gly Pro His Glu Arg Ile Ala Gln Arg Ala Leu Glu Gly Phe
    130                 135                 140
Thr Arg Ser Leu Gly Lys Glu Leu Arg Asn Gly Ser Thr Val Ala Leu
145                 150                 155                 160
Val Tyr Leu Ser Pro Ala Ala Lys Pro Ala Ala Thr Gly Leu Glu Ser
                165                 170                 175
Thr Met Arg Phe Ile Leu Ser Ala Lys Ser Ala Tyr Val Asp Gly Gln
            180                 185                 190
Val Phe Tyr Val Gly Glu Ala Asp Ser Thr Pro Pro Ala Asp Trp Glu
        195                 200                 205
Arg Pro Leu Asp Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ala Arg Gly
    210                 215                 220
Ile Gly Ala Thr Ile Ala Glu Val Phe Ala Arg Asp Gly Ala Arg Val
225                 230                 235                 240
Val Ala Ile Asp Val Glu Ser Ala Ala Glu Thr Leu Ala Glu Thr Ala
                245                 250                 255
Ser Arg Val Gly Gly Thr Ala Leu Trp Leu Asp Val Thr Ala Pro Asp
            260                 265                 270
Ala Val Asp Lys Ile Thr Glu His Leu Arg Glu His His Gly Gly His
        275                 280                 285
Ala Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Ile Thr Arg Asp Lys Leu Leu
    290                 295                 300
Ala Asn Met Asp Asp Ala Arg Trp Asp Ala Val Leu Ala Val Asn Leu
305                 310                 315                 320
Leu Ala Pro Leu Arg Leu Thr Glu Gly Leu Val Gly Asn Gly Ser Ile
                325                 330                 335
Gly Glu Gly Gly Arg Ile Val Gly Leu Ser Ser Met Ala Gly Ile Ala
            340                 345                 350
Gly Asn Arg Gly Gln Thr Asn Tyr Ala Thr Thr Lys Ala Gly Met Ile
        355                 360                 365
Gly Leu Thr Gln Ala Leu Ala Pro Glu Leu Tyr Asp Lys Gly Ile Thr
    370                 375                 380
Ile Asn Ala Val Ala Pro Gly Phe Ile Glu Thr Gln Met Thr Ala Ala
385                 390                 395                 400
Ile Pro Leu Ala Thr Arg Glu Val Gly Arg Arg Met Asn Ser Leu Leu
                405                 410                 415
Gln Gly Gly Gln Pro Val Asp Val Ala Glu Thr Ile Ala Tyr Phe Ala
            420                 425                 430
Ser Pro Ala Ser Asn Ala Val Thr Gly Asn Val Ile Arg Val Cys Gly
        435                 440                 445
Gln Ala Met Leu Gly Ala
    450
<210>9
<211>625
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>misc_特征
<222>(592)..(592)
<223>″n″
<220>
<221>CDS
<222>(179)..(625)
<223>
<220>
<221>misc_特征
<222>(619)..(619)
<223>″n″
<400>9
aattcgcgca tacccgtcac tggtcacaac gccacatgct ggtaggctgt ggaatcgagg    60
gtcaatccgg atcggacccc aacgtcgact tgtgggcgcc aattcgcggg ttttcgccca    120
gcaagtcgac gttcggcgcg aatcggtgag gtgggcacag gtgaatgacg aagaggac      178
atg ctg gtc gcc acg gtg cgg gcg ttc atc gac cgc gag gtc aaa ccg      226
Met Leu Val Ala Thr Val Arg Ala Phe Ile Asp Arg Glu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
acc gtg cgc gag gtg gag cac gcc gat gcc tat ccc gag gcg tgg atc      274
Thr Val Arg Glu Val Glu His Ala Asp Ala Tyr Pro Glu Ala Trp Ile
            20                  25                  30
gag cag atg aag cgg atc ggg atc tac ggg ctg gcg gtg ccc gag gaa      322
Glu Gln Met Lys Arg Ile Gly Ile Tyr Gly Leu Ala Val Pro Glu Glu
        35                  40                  45
tac ggt ggt tcg ccg gtg tcc atg ccg tgc tac gtg cgg gtc acc gag      370
Tyr Gly Gly Ser Pro Val Ser Met Pro Cys Tyr Val Arg Val Thr Glu
    50                  55                  60
cag ctg gcg cgc ggc tgg atg agc ctg gcc ggg gcg atg ggc ggg cac      418
Gln Leu Ala Arg Gly Trp Met Ser Leu Ala Gly Ala Met Gly Gly His
65                  70                  75                  80
acc gtg gtg gcc aag ctg cta acg ctg ttc ggc acc gag gac cas aag      466
Thr Val Val Ala Lys Leu Leu Thr Leu Phe Gly Thr Glu Asp Xaa Lys
                85                  90                  95
cgg gcc tac ctg ccg cgg atg gcc agc ggc gaa atc cgg gcc acc atg      514
Arg Ala Tyr Leu Pro Arg Met Ala Ser Gly Glu Ile Arg Ala Thr Met
            100                 105                 110
gcg ttg acc gag ccc sgc ggc ggc tcg gac ctg cag aac atg tcg acc      562
Ala Leu Thr Glu Pro Xaa Gly Gly Ser Asp Leu Gln Asn Met Ser Thr
        115                 120                 125
acc gcg ctg ccc gac ccc gac tcc gac ggn ctg gtg gtc aac ggg gcc      610
Thr Ala Leu Pro Asp Pro Asp Ser Asp Gly Leu Val Val Asn Gly Ala
    130                 135                 140
aag acc tgn atc aac                                                  625
Lys Thr Xaa Ile Asn
145
<210>10
<211>149
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>misc_特征
<222>(95)..(95)
<223>95位的‘Xaa’代表Gln或His。
<220>
<221>misc_特征
<222>(118)..(118)
<223>118位的‘Xaa’代表Gly或Arg。
<220>
<221>misc_特征
<222>(147)..(147)
<223>147位的‘Xaa’代表Trp或Cys。
<220>
<221>misc_特征
<222>(592)..(592)
<223>″n″
<220>
<221>misc_特征
<222>(619)..(619)
<223>″n″
<400>10
Met Leu Val Ala Thr Val Arg Ala Phe Ile Asp Arg Glu Val Lys Pro
1               5                   10                  15
Thr Val Arg Glu Val Glu His Ala Asp Ala Tyr Pro Glu Ala Trp Ile
            20                  25                  30
Glu Gln Met Lys Arg Ile Gly Ile Tyr Gly Leu Ala Val Pro Glu Glu
        35                  40                  45
Tyr Gly Gly Ser Pro Val Ser Met Pro Cys Tyr Val Arg Val Thr Glu
    50                  55                  60
Gln Leu Ala Arg Gly Trp Met Ser Leu Ala Gly Ala Met Gly Gly His
65                  70                  75                  80
Thr Val Val Ala Lys Leu Leu Thr Leu Phe Gly Thr Glu Asp Xaa Lys
                85                  90                  95
Arg Ala Tyr Leu Pro Arg Met Ala Ser Gly Glu Ile Arg Ala Thr Met
            100                 105                 110
Ala Leu Thr Glu Pro Xaa Gly Gly Ser Asp Leu Gln Asn Met Ser Thr
        115                 120                 125
Thr Ala Leu Pro Asp Pro Asp Ser Asp Gly Leu Val Val Asn Gly Ala
    130                 135                 140
Lys Thr Xaa Ile Asn
145
<210>11
<211>241
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(147)..(239)
<223>
<400>11
gtgggggcaa gccaattacg ttcgcatcga cccggcacag gcggtcgctc acgtcatcaa    60
catgccgctc atccccgatg aggctcgaat gaccttgcta cgcaggcgct gaacgcacga    120
cgaaacggac cggaggtgaa agggac atg agc cac gcc gat caa ctc gct cgg     173
                             Met Ser His Ala Asp Gln Leu Ala Arg
                             1               5
acg cac ctg gcg ccc gat cct gcg gac ctg tcg cgc ctg gtc gcc ggc      221
Thr His Leu Ala Pro Asp Pro Ala Asp Leu Ser Arg Leu Val Ala Gly
10                  15                  20                  25
acc cac cac gac ccg cac gg                                           241
Thr His His Asp Pro His
                30
<210>12
<211>31
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>12
Met Ser His Ala Asp Gln Leu Ala Arg Thr His Leu Ala Pro Asp Pro
1               5                   10                  15
Ala Asp Leu Ser Arg Leu Val Ala Gly Thr His His Asp Pro His
            20                  25                  30
<210>13
<211>236
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(8)..(214)
<223>
<400>13
ggacacc aac gtg acc ggg gtg ttt ctc acc gcc cag gcg gcg gcc cgg    49
        Asn Val Thr Gly Val Phe Leu Thr Ala Gln Ala Ala Ala Arg
        1               5                   10
gcg atg atg cgg cag ggc cgc ggc ggc gcc atc atc acc acc gcc tcg    97
Ala Met Met Arg Gln Gly Arg Gly Gly Ala Ile Ile Thr Thr Ala Ser
15                  20                  25                  30
atg tcc ggg cac atc atc aac gtc ccg cag cag gtc ggc cac tac tgc    145
Met Ser Gly His Ile Ile Asn Val Pro Gln Gln Val Gly His Tyr Cys
                35                  40                  45
gcc agc aag gcg gcc gtg atc cag ctg acc aag gcc atg gcc gtc gaa    193
Ala Ser Lys Ala Ala Val Ile Gln Leu Thr Lys Ala Met Ala Val Glu
            50                  55                  60
ttc tgc agg atc cgt cga ctc tagactcgag caagcttatg ca               236
Phe Cys Arg Ile Arg Arg Leu
        65
<210>14
<211>69
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>14
Asn Val Thr Gly Val Phe Leu Thr Ala Gln Ala Ala Ala Arg Ala Met
1               5                   10                  15
Met Arg Gln Gly Arg Gly Gly Ala Ile Ile Thr Thr Ala Ser Met Ser
            20                  25                  30
Gly His Ile Ile Asn Val Pro Gln Gln Val Gly His Tyr Cys Ala Ser
        35                  40                  45
Lys Ala Ala Val Ile Gln Leu Thr Lys Ala Met Ala Val Glu Phe Cys
    50                  55                  60
Arg Ile Arg Arg Leu
65
<210>15
<211>419
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>misc_特征
<222>(331)..(331)
<223>″n″
<220>
<221>misc_特征
<222>(398)..(398)
<223>″n″
<220>
<221>CDS
<222>(25)..(417)
<223>
<400>15
cggccaccgc acccagggga ggcc atg act cac acc aag gcc ggt cgt gcc     51
                           Met Thr His Thr Lys Ala Gly Arg Ala
                           1               5
gcg tgg ccg gcc gcc tgc gcg gtc gtc ctg tcc gcc gcc gcg ctg ttg    99
Ala Trp Pro Ala Ala Cys Ala Val Val Leu Ser Ala Ala Ala Leu Leu
10                  15                  20                  25
tgc gcg gca gcg gcc gcc gcg gac gaa gcc gat gac gcg ttc ctc gcc    147
Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Asp Glu Ala Asp Asp Ala Phe Leu Ala
                30                  35                  40
ggc ctg gcc aag ggc ggg atc acc atg ttc gac gac gac gac gcg atc    195
Gly Leu Ala Lys Gly Gly Ile Thr Met Phe Asp Asp Asp Asp Ala Ile
            45                  50                  55
gcc atg ggc cac agc gtg tgc tcg agc atc gac gcc aac ccc aac gtg    243
Ala Met Gly His Ser Val Cys Ser Ser Ile Asp Ala Asn Pro Asn Val
        60                  65                  70
tcg atg ctg gcg ctg cgg ctg acc aag caa acc ccg ttg acg ccg aag    291
Ser Met Leu Ala Leu Arg Leu Thr Lys Gln Thr Pro Leu Thr Pro Lys
    75                  80                  85
caa tcc ggc tac ttc atc ggt ctt tcg gtc gcc agc tac ntg ccc gca    339
Gln Ser Gly Tyr Phe Ile Gly Leu Ser Val Ala Ser Tyr Xaa Pro Ala
90                  95                  100                 105
gta caa gga cga cgt cga ccc ctc gct ggg ctg gct gat ccc gcc gcc    387
Val Gln Gly Arg Arg Arg Pro Leu Ala Gly Leu Ala Asp Pro Ala Ala
                110                 115                 120
gct gat gtg ang ttg ccg gcc ggc atc ggc gt                         419
Ala Asp Val Xaa Leu Pro Ala Gly Ile Gly
            125                 130
<210>16
<211>131
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>misc_特征
<222>(103)..(103)
<223>103位的‘Xaa’代表Met、Val或Leu。
<220>
<221>misc_特征
<222>(125)..(125)
<223>125位的‘Xaa’代表Lys、Arg、Thr或Met。
<220>
<221>misc_特征
<222>(331)..(331)
<223>″n″
<220>
<221>misc_特征
<222>(398)..(398)
<223>″n″
<400>16
Met Thr His Thr Lys Ala Gly Arg Ala Ala Trp Pro Ala Ala Cys Ala
1               5                   10                  15
Val Val Leu Ser Ala Ala Ala Leu Leu Cys Ala Ala Ala Ala Ala Ala
            20                  25                  30
Asp Glu Ala Asp Asp Ala Phe Leu Ala Gly Leu Ala Lys Gly Gly Ile
        35                  40                  45
Thr Met Phe Asp Asp Asp Asp Ala Ile Ala Met Gly His Ser Val Cys
    50                  55                  60
Ser Ser Ile Asp Ala Asn Pro Asn Val Ser Met Leu Ala Leu Arg Leu
65                  70                  75                  80
Thr Lys Gln Thr Pro Leu Thr Pro Lys Gln Ser Gly Tyr Phe Ile Gly
                85                  90                  95
Leu Ser Val Ala Ser Tyr Xaa Pro Ala Val Gln Gly Arg Arg Arg Pro
            100                 105                 110
Leu Ala Gly Leu Ala Asp Pro Ala Ala Ala Asp Val Xaa Leu Pro Ala
        115                 120                 125
Gly Ile Gly
    130
<210>17
<211>392
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(94)..(390)
<223>
<400>17
cggcgtagca tcgtcaagtc gttgcccgcg ctgatgccgg agcggcagta aggagttcgg    60
ctggtgcaaa aacgcttgcc cacagtcgtt ttg gtg ctg acg gcc gtt gtc gcc    114
                                     Val Leu Thr Ala Val Val Ala
                                     1               5
ggt atc gcc ggg tgc agc gcg gcg cag acc gtg ccg cgc aag gcc gcc     162
Gly Ile Ala Gly Cys Ser Ala Ala Gln Thr Val Pro Arg Lys Ala Ala
        10                  15                  20
cgg ctg acc atc gac ggt gcc acc cac acg acc cgc ccg ccg tcc tgc    210
Arg Leu Thr Ile Asp Gly Ala Thr His Thr Thr Arg Pro Pro Ser Cys
    25                  30                  35
cgg cag gac cag atg tat cgg acc atc aac atc ccc gac cac gac ggt    258
Arg Gln Asp Gln Met Tyr Arg Thr Ile Asn Ile Pro Asp His Asp Gly
40                  45                  50                  55
gga gtc gaa gcg gtg gtg ctg ctc agc ggt tac cgg gtg atg ccg cag    306
Gly Val Glu Ala Val Val Leu Leu Ser Gly Tyr Arg Val Met Pro Gln
                60                  65                  70
tgg gtg aag atc cgg aac gtc gac ggc ttc acc ggc agt cta ctg gcc    354
Trp Val Lys Ile Arg Asn Val Asp Gly Phe Thr Gly Ser Leu Leu Ala
            75                  80                  85
asg gcg gag tgg gcg acg cgc acg tcg atc tca cma at                 392
Xaa Ala Glu Trp Ala Thr Arg Thr Ser Ile Ser Xaa
        90                  95
<210>18
<211>99
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>misc_特征
<222>(88)..(88)
<223>88位的‘Xaa’代表Arg或Thr
<220>
<221>misc_特征
<222>(99)..(99)
<223>99位的‘Xaa’代表Gln或Pro。
<400>18
Val Leu Thr Ala Val Val Ala Gly Ile Ala Gly Cys Ser Ala Ala Gln
1               5                   10                  15
Thr Val Pro Arg Lys Ala Ala Arg Leu Thr Ile Asp Gly Ala Thr His
            20                  25                  30
Thr Thr Arg Pro Pro Ser Cys Arg Gln Asp Gln Met Tyr Arg Thr Ile
        35                  40                  45
Asn Ile Pro Asp His Asp Gly Gly Val Glu Ala Val Val Leu Leu Ser
    50                  55                  60
Gly Tyr Arg Val Met Pro Gln Trp Val Lys Ile Arg Asn Val Asp Gly
65                  70                  75                  80
Phe Thr Gly Ser Leu Leu Ala Xaa Ala Glu Trp Ala Thr Arg Thr Ser
                85                  90                  95
Ile Ser Xaa
<210>19
<211>1884
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(1884)
<223>
<400>19
taaccaggag ca atg gct cgt gcg gtc ggt atc gac ctc ggg acc acc aac  51
              Met Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn
              1               5                   10
tcc gtc gtc gca gtc ctc gag ggc ggt gac ccc gtc gtc gtc gcc aac    99
Ser Val Val Ala Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn
    15                  20                  25
tcc gag ggc tcg cgg acc acc ccg tcc atc gtc gcg ttc gcc cgc aac    147
Ser Glu Gly Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn
30                  35                  40                  45
ggc gag gtg ctc gtc ggc cag ccc gcc aag aac cag gcg gtg acc aac    195
Gly Glu Val Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn
                50                  55                  60
gtc gac cgc acc atc cgt tcg gtc aag cgg cac atg ggc acc gac tgg    243
Val Asp Arg Thr Ile Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Thr Asp Trp
            65                  70                  75
tcc atc gag atc gac ggc aag aaa tac acc gct cag gag atc agc gcc    291
Ser Ile Glu Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala Gln Glu Ile Ser Ala
        80                  85                  90
cgc gtg ctg atg aag ctc aag cgc gac gcc gag gcc tat ctg ggt gag    339
Arg Val Leu Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu
    95                  100                 105
gac atc acc gac gcg gtc atc acc gta ccg gcg tac ttc aac gac gcc    387
Asp Ile Thr Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala
110                 115                 120                 125
cag cgt cag gcg acc aag gaa gcc ggc cag atc gcc ggc ctc aac gtg    435
Gln Arg Gln Ala Thr Lys Glu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val
                130                 135                 140
ctg cgc atc gtc aac gag ccg acc gcg gcc gcg ctg gcc tac ggc ctg    483
Leu Arg Ile Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu
            145                 150                 155
gac aag ggc gag aag gag cag acc atc ctg gtc ttc gac ctc ggc ggc    531
Asp Lys Gly Glu Lys Glu Gln Thr Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly
        160                 165                 170
ggc acg ttc gac gtt tcg ctg ctc gag atc ggc gag ggt gtg gtc gag    579
Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu
    175                 180                 185
gtc cgc gcc acc agc ggt gac aac caa ctc ggt ggc gac gac tgg gac    627
Val Arg Ala Thr Ser Gly Asp Asn Gln Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp
190                 195                 200                 205
gac cgg atc gtc aac tgg ctg gtc gac aag ttc aag ggc acc agc ggc    675
Asp Arg Ile Val Asn Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly
                210                 215                 220
atc gac ctg acc aag gac aHg atg gcc atg cag cgg ctg cgt gag gcc    723
Ile Asp Leu Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala
            225                 230                 235
gcc gag aag gcc aag atc gag ttg tcc agc tcg cag agc acc tcg atc    771
Ala Glu Lys Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile
        240                 245                 250
aac ctg ccc tac atc acc gtc gac gcg gac aag aac ccg ctg ttc ctc    819
Asn Leu Pro Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu
    255                 260                 265
gac gag cag ctg acc cgc gcc gaa ttc cag cgc atc acc cag gat ctg    867
Asp Glu Gln Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu
270                 275                 280                 285
ctg gac cgc acc cgt cag ccg ttc aag tcg gtg atc gcc gac gcc ggc    915
Leu Asp Arg Thr Arg Gln Pro Phe Lys Ser Val Ile Ala Asp Ala Gly
                290                 295                 300
atc tcg gtg tcc gac atc gac cac gtg gtg ctg gtg ggt ggt tcc acc    963
Ile Ser Val Ser Asp Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr
            305                 310                 315
cgg atg ccc gcg gtg acc gac ctg gtc aag gaa ctc acc ggc ggc aag    1011
Arg Met Pro Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys
        320                 325                 330
gag ccc aac aag ggc gtc aac ccc gac gag gtt gtc gcg gtg ggt gcc    1059
Glu Pro Asn Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala
    335                 340                 345
gcc ctg cag gcc ggt gtg ctt aag ggc gag gtg aaa gac gtt ctg ctg    1107
Ala Leu Gln Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu
350                 355                 360                 365
ctt gac gtt acg ccg ctg agc ctg ggt atc gag acc aag ggt ggc gtg    1155
Leu Asp Val Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val
                370                 375                 380
atg acc aag ctg atc gaa cgc aac acc acc atc ccg acc aag cgg tcc    1203
Met Thr Lys Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser
            385                 390                 395
gag acg ttc acc acg gcc gac gac aac cag ccg tcg gtg cag atc cag    1251
Glu Thr Phe Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln
        400                 405                 410
gtg tat cag ggt gag cgc gaa atc gcc gcg cac aac aag ctg ctc ggc    1299
Val Tyr Gln Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly
    415                 420                 425
tcc ttc gag ctg acc gga att ccg ccg gcg ccc cgc ggc gtg ccg cag    1347
Ser Phe Glu Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln
430                 435                 440                 445
atc gag gtc acc ttc gac atc gac gcc aac ggc atc gtg cac gtc acc    1395
Ile Glu Val Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr
                450                 455                 460
gcc aag gac aag ggc acc ggt aag gag aac acg atc aag atc cag gag    1443
Ala Lys Asp Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Lys Ile Gln Glu
            465                 470                 475
ggc tcc ggc ctg tcc aag gag gag atc gac cgg atg atc aag gac gcc    1491
Gly Ser Gly Leu Ser Lys Glu Glu Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala
        480                 485                 490
gag gcg cac gcc gag gag gac cgc aag agg cgc gag gaa gcc gac gtc    1539
Glu Ala His Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val
    495                 500                 505
cgc aac caa gcg gaa tcg ctt gtc tac cag acg gag aag ttc gtc aag    1587
Arg Asn Gln Ala Glu Ser Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys
510                 515                 520                 525
gac cag cgc gag gcc gag ggc ggc tcg aag gtt ccc gag gag acg ctg    1635
Asp Gln Arg Glu Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Glu Thr Leu
                530                 535                 540
tcc aag gtc gac gcc gcg atc gcc gac gcc aag acg gcc ctg ggc ggc    1683
Ser Lys Val Asp Ala Ala Ile Ala Asp Ala Lys Thr Ala Leu Gly Gly
            545                 550                 555
acc gac atc acc gcg atc aag tcg gcg atg gag aag ctc ggc cag gag    1731
Thr Asp Ile Thr Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu
        560                 565                 570
tcg caa gcg ctg gga cag gca atc tac gag gcc acc cag gcc gag tcc    1779
Ser Gln Ala Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Thr Gln Ala Glu Ser
    575                 580                 585
gcc cag gct ggc ggg ccg gac ggt gcc gcg gcc ggc ggc ggg tcc gga    1827
Ala Gln Ala Gly Gly Pro Asp Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly
590                 595                 600                 605
tcc gcc gac gat gtt gtg gac gcg gag gtg gtc gac gat gac cgg gag    1875
Ser Ala Asp Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Asp Arg Glu
                610                 615                 620
tcc aag tga                                                        1884
Ser Lys
<210>20
<211>623
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>20
Met Ala Arg Ala Val Gly Ile Asp Leu Gly Thr Thr Asn Ser Val Val
1               5                   10                  15
Ala Val Leu Glu Gly Gly Asp Pro Val Val Val Ala Asn Ser Glu Gly
            20                  25                  30
Ser Arg Thr Thr Pro Ser Ile Val Ala Phe Ala Arg Asn Gly Glu Val
        35                  40                  45
Leu Val Gly Gln Pro Ala Lys Asn Gln Ala Val Thr Asn Val Asp Arg
    50                  55                  60
Thr Ile Arg Ser Val Lys Arg His Met Gly Thr Asp Trp Ser Ile Glu
65                  70                  75                  80
Ile Asp Gly Lys Lys Tyr Thr Ala Gln Glu Ile Ser Ala Arg Val Leu
                85                  90                  95
Met Lys Leu Lys Arg Asp Ala Glu Ala Tyr Leu Gly Glu Asp Ile Thr
            100                 105                 110
Asp Ala Val Ile Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp Ala Gln Arg Gln
        115                 120                 125
Ala Thr Lys Glu Ala Gly Gln Ile Ala Gly Leu Asn Val Leu Arg Ile
    130                 135                 140
Val Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Leu Ala Tyr Gly Leu Asp Lys Gly
145                 150                 155                 160
Glu Lys Glu Gln Thr Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly Gly Gly Thr Phe
                165                 170                 175
Asp Val Ser Leu Leu Glu Ile Gly Glu Gly Val Val Glu Val Arg Ala
            180                 185                 190
Thr Ser Gly Asp Asn Gln Leu Gly Gly Asp Asp Trp Asp Asp Arg Ile
        195                 200                 205
Val Asn Trp Leu Val Asp Lys Phe Lys Gly Thr Ser Gly Ile Asp Leu
    210                 215                 220
Thr Lys Asp Lys Met Ala Met Gln Arg Leu Arg Glu Ala Ala Glu Lys
225                 230                 235                 240
Ala Lys Ile Glu Leu Ser Ser Ser Gln Ser Thr Ser Ile Asn Leu Pro
                245                 250                 255
Tyr Ile Thr Val Asp Ala Asp Lys Asn Pro Leu Phe Leu Asp Glu Gln
            260                 265                 270
Leu Thr Arg Ala Glu Phe Gln Arg Ile Thr Gln Asp Leu Leu Asp Arg
        275                 280                 285
Thr Arg Gln Pro Phe Lys Ser Val Ile Ala Asp Ala Gly Ile Ser Val
    290                 295                 300
Ser Asp Ile Asp His Val Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Met Pro
305                 310                 315                 320
Ala Val Thr Asp Leu Val Lys Glu Leu Thr Gly Gly Lys Glu Pro Asn
                325                 330                 335
Lys Gly Val Asn Pro Asp Glu Val Val Ala Val Gly Ala Ala Leu Gln
            340                 345                 350
Ala Gly Val Leu Lys Gly Glu Val Lys Asp Val Leu Leu Leu Asp Val
        355                 360                 365
Thr Pro Leu Ser Leu Gly Ile Glu Thr Lys Gly Gly Val Met Thr Lys
    370                 375                 380
Leu Ile Glu Arg Asn Thr Thr Ile Pro Thr Lys Arg Ser Glu Thr Phe
385                 390                 395                 400
Thr Thr Ala Asp Asp Asn Gln Pro Ser Val Gln Ile Gln Val Tyr Gln
                405                 410                 415
Gly Glu Arg Glu Ile Ala Ala His Asn Lys Leu Leu Gly Ser Phe Glu
            420                 425                 430
Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu Val
        435                 440                 445
Thr Phe Asp Ile Asp Ala Asn Gly Ile Val His Val Thr Ala Lys Asp
    450                 455                 460
Lys Gly Thr Gly Lys Glu Asn Thr Ile Lys Ile Gln Glu Gly Ser Gly
465                 470                 475                 480
Leu Ser Lys Glu Glu Ile Asp Arg Met Ile Lys Asp Ala Glu Ala His
                485                 490                 495
Ala Glu Glu Asp Arg Lys Arg Arg Glu Glu Ala Asp Val Arg Asn Gln
            500                 505                 510
Ala Glu Ser Leu Val Tyr Gln Thr Glu Lys Phe Val Lys Asp Gln Arg
        515                 520                 525
Glu Ala Glu Gly Gly Ser Lys Val Pro Glu Glu Thr Leu Ser Lys Val
    530                 535                 540
Asp Ala Ala Ile Ala Asp Ala Lys Thr Ala Leu Gly Gly Thr Asp Ile
545                 550                 555                 560
Thr Ala Ile Lys Ser Ala Met Glu Lys Leu Gly Gln Glu Ser Gln Ala
                565                 570                 575
Leu Gly Gln Ala Ile Tyr Glu Ala Thr Gln Ala Glu Ser Ala Gln Ala
            580                 585                 590
Gly Gly Pro Asp Gly Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Ser Ala Asp
        595                 600                 605
Asp Val Val Asp Ala Glu Val Val Asp Asp Asp Arg Glu Ser Lys
    610                 615                 620
<210>21
<211>1701
<212>DNA
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<220>
<221>CDS
<222>(76)..(1701)
<223>
<400>21
gcagcctggt cgtccgtcgc gggcactgca cccggccagg acgtgtcatc cccaatccgg    60
aggaatcact tcgca atg gcc aag aca att gcg tac gac gaa gag gcc cgt    111
                 Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg
                 1               5                   10
cgc ggc ctc gag cgg ggg ctc aac gcc ctc gcc gac gcg gta aag gtc     159
Arg Gly Leu Glu Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val
        15                  20                  25
acg ttg ggc ccc aag ggt cgc aac gtc gtc ctg gag aag aag tgg ggt     207
Thr Leu Gly Pro Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly
    30                  35                  40
gcc ccc acg atc acc aac gat ggt gtg tcc atc gcc aag gag atc gag     255
Ala Pro Thr Ile Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu
45                  50                  55                  60
ctg gag gac ccg tac gag aag atc ggc gcc gag ctg gtc aag gaa gtc     303
Leu Glu Asp Pro Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val
                65                  70                  75
gcc aag aag acc gac gac gtc gcc ggt gac ggc acg acg acg gcc acg     351
Ala Lys Lys Thr Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr
            80                  85                  90
gtg ctc gcc cag gcg ttg gtc cgc gag ggc ctg cgc aac gtc gcg gcc     399
Val Leu Ala Gln Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala
        95                  100                 105
ggc gcc aac ccg ctg ggt ctc aag cgc ggc atc gag aag gcc gtc gag    447
Gly Ala Asn Pro Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu
    110                 115                 120
aag gtc acc gag acc ctg ctc aag tcg gcc aag gag gtc gag acc aag    495
Lys Val Thr Glu Thr Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys
125                 130                 135                 140
gac cag atc gct gcc acc gcg gcc atc tcc gcg ggc gac cag tcg atc    543
Asp Gln Ile Ala Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile
                145                 150                 155
ggc gac ctg atc gcc gag gcg atg gac aag gtc ggc aac gag ggc gtc    591
Gly Asp Leu Ile Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val
            160                 165                 170
atc acc gtc gag gag tcc aac acc ttc ggc ctg cag ctc gag ctc acc    639
Ile Thr Val Glu Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr
        175                 180                 185
gag ggt atg cgg ttc gac aag ggt tac atc tcg ggc tac ttc gtc acg    687
Glu Gly Met Arg Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr
    190                 195                 200
gac gcc gag cgt cag gaa gcg gtc ctc gag gac ccg ttc atc ctg ctg    735
Asp Ala Glu Arg Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Phe Ile Leu Leu
205                 210                 215                 220
gtc agc tcc aag gtc tcg acc gtc aag gac ctg ctg ccg ctg ctg gag    783
Val Ser Ser Lys Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu
                225                 230                 235
aag gtc atc cag gcc ggc aag ccg ctg ctg atc atc gcc gag gac gtc    831
Lys Val Ile Gln Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val
            240                 245                 250
gag ggc gag gcc ctg tcc acc ctg gtc gtc aac aag atc cgc ggc acc    879
Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr
        255                 260                 265
ttc aag tcg gtg gcc gtc aag gcg ccc ggc ttc ggc gac cgc cgc aag    927
Phe Lys Ser Val Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys
    270                 275                 280
gcg atg ctt cag gac atg gcc atc ctc acc ggc ggc cag gtc atc agc    975
Ala Met Leu Gln Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser
285                 290                 295                 300
gaa gag gtc ggc ctg tcg ctg gag agc gcc gac atc tcg ctg ctc ggt    1023
Glu Glu Val Gly Leu Ser Leu Glu Ser Ala Asp Ile Ser Leu Leu Gly
                305                 3l0                 315
aag gcc cgc aag gtc gtc gtc acc aag gac gag acc acc atc gtc gag    1071
Lys Ala Arg Lys Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu
            320                 325                 330
ggc gcc ggt gac tcc gac gcc atc gcc ggc cgg gtg gcc cag atc cgc    1119
Gly Ala Gly Asp Ser Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg
        335                 340                 345
acc gag atc gag aac agc gac tcc gac tac gac cgc gag aag ctg cag    1167
Thr Glu Ile Glu Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln
    350                 355                 360
gag cgg ctg gcc aag ctg gcc ggc ggc gtg gcg gtg atc aag gcc ggc    1215
Glu Arg Leu Ala Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly
365                 370                 375                 380
gcc gcg acc gag gtc gag ctc aag gag cgc aag cac cgc atc gag gac    1263
Ala Ala Thr Glu Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp
                385                 390                 395
gcg gtc cgc aac gcc aag gcg gcc gtg gag gag ggc atc gtc gcc ggc    1311
Ala Val Arg Asn Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly
            400                 405                 410
ggt ggc gtg gcc ctg ctg cac gcg atc ccg gct ctg gac gag ctg aag    1359
Gly Gly Val Ala Leu Leu His Ala Ile Pro Ala Leu Asp Glu Leu Lys
        415                 420                 425
ctc gag ggc gaa gag gcg acc ggc gcc aac atc gtc cgg gtg gcc ctc    1407
Leu Glu Gly Glu Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Arg Val Ala Leu
    430                 435                 440
gag gct ccg ctg aag cag atc gcc ttc aac ggt ggc ctg gag ccc ggc    1455
Glu Ala Pro Leu Lys Gln Ile Ala Phe Asn Gly Gly Leu Glu Pro Gly
445                 450                 455                 460
gtg gtg gcc gag aag gtc cgc aac tcg ccc gcc ggt acc ggc ctc aac    1503
Val Val Ala Glu Lys Val Arg Asn Ser Pro Ala Gly Thr Gly Leu Asn
                465                 470                 475
gcc gcc acc ggt gag tac gag gac ctg ctc aag gcc ggc att gcc gac    1551
Ala Ala Thr Gly Glu Tyr Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Ile Ala Asp
            480                 485                 490
ccg gtg aag gtc acc cgc tcg gcg ctg cag aac gcg gcg tcc atc gcg    1599
Pro Val Lys Val Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala
        495                 500                 505
ggg ctg ttc ctg acc acc gag gcg gtc gtc gcc gac aag ccg gag aag    1647
Gly Leu Phe Leu Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys
    510                 515                 520
gcg gcc gct ccc gcg ggc gac ccg acc ggc ggc atg ggc ggc atg gac    1695
Ala Ala Ala Pro Ala Gly Asp Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Met Asp
525                 530                 535                 540
ttc tga                                                            1701
Phe
<210>22
<211>541
<212>PRT
<213>鸟分枝杆菌副结核亚种
<400>22
Met Ala Lys Thr Ile Ala Tyr Asp Glu Glu Ala Arg Arg Gly Leu Glu
1               5                   10                  15
Arg Gly Leu Asn Ala Leu Ala Asp Ala Val Lys Val Thr Leu Gly Pro
            20                  25                  30
Lys Gly Arg Asn Val Val Leu Glu Lys Lys Trp Gly Ala Pro Thr Ile
        35                  40                  45
Thr Asn Asp Gly Val Ser Ile Ala Lys Glu Ile Glu Leu Glu Asp Pro
    50                  55                  60
Tyr Glu Lys Ile Gly Ala Glu Leu Val Lys Glu Val Ala Lys Lys Thr
65                  70                  75                  80
Asp Asp Val Ala Gly Asp Gly Thr Thr Thr Ala Thr Val Leu Ala Gln
                85                  90                  95
Ala Leu Val Arg Glu Gly Leu Arg Asn Val Ala Ala Gly Ala Asn Pro
            100                 105                 110
Leu Gly Leu Lys Arg Gly Ile Glu Lys Ala Val Glu Lys Val Thr Glu
        115                 120                 125
Thr Leu Leu Lys Ser Ala Lys Glu Val Glu Thr Lys Asp Gln Ile Ala
    130                 135                 140
Ala Thr Ala Ala Ile Ser Ala Gly Asp Gln Ser Ile Gly Asp Leu Ile
145                 150                 155                 160
Ala Glu Ala Met Asp Lys Val Gly Asn Glu Gly Val Ile Thr Val Glu
                165                 170                 175
Glu Ser Asn Thr Phe Gly Leu Gln Leu Glu Leu Thr Glu Gly Met Arg
            180                 185                 190
Phe Asp Lys Gly Tyr Ile Ser Gly Tyr Phe Val Thr Asp Ala Glu Arg
        195                 200                 205
Gln Glu Ala Val Leu Glu Asp Pro Phe Ile Leu Leu Val Ser Ser Lys
    210                 215                 220
Val Ser Thr Val Lys Asp Leu Leu Pro Leu Leu Glu Lys Val Ile Gln
225                 230                 235                 240
Ala Gly Lys Pro Leu Leu Ile Ile Ala Glu Asp Val Glu Gly Glu Ala
                245                 250                 255
Leu Ser Thr Leu Val Val Asn Lys Ile Arg Gly Thr Phe Lys Ser Val
            260                 265                 270
Ala Val Lys Ala Pro Gly Phe Gly Asp Arg Arg Lys Ala Met Leu Gln
        275                 280                 285
Asp Met Ala Ile Leu Thr Gly Gly Gln Val Ile Ser Glu Glu Val Gly
    290                 295                 300
Leu Ser Leu Glu Ser Ala Asp Ile Ser Leu Leu Gly Lys Ala Arg Lys
305                 310                 315                 320
Val Val Val Thr Lys Asp Glu Thr Thr Ile Val Glu Gly Ala Gly Asp
                325                 330                 335
Ser Asp Ala Ile Ala Gly Arg Val Ala Gln Ile Arg Thr Glu Ile Glu
            340                 345                 350
Asn Ser Asp Ser Asp Tyr Asp Arg Glu Lys Leu Gln Glu Arg Leu Ala
        355                 360                 365
Lys Leu Ala Gly Gly Val Ala Val Ile Lys Ala Gly Ala Ala Thr Glu
    370                 375                 380
Val Glu Leu Lys Glu Arg Lys His Arg Ile Glu Asp Ala Val Arg Asn
385                 390                 395                 400
Ala Lys Ala Ala Val Glu Glu Gly Ile Val Ala Gly Gly Gly Val Ala
                405                 410                 415
Leu Leu His Ala Ile Pro Ala Leu Asp Glu Leu Lys Leu Glu Gly Glu
            420                 425                 430
Glu Ala Thr Gly Ala Asn Ile Val Arg Val Ala Leu Glu Ala Pro Leu
        435                 440                 445
Lys Gln Ile Ala Phe Asn Gly Gly Leu Glu Pro Gly Val Val Ala Glu
    450                 455                 460
Lys Val Arg Asn Ser Pro Ala Gly Thr Gly Leu Asn Ala Ala Thr Gly
465                 470                 475                 480
Glu Tyr Glu Asp Leu Leu Lys Ala Gly Ile Ala Asp Pro Val Lys Val
                485                 490                 495
Thr Arg Ser Ala Leu Gln Asn Ala Ala Ser Ile Ala Gly Leu Phe Leu
            500                 505                 510
Thr Thr Glu Ala Val Val Ala Asp Lys Pro Glu Lys Ala Ala Ala Pro
        515                 520                 525
Ala Gly Asp Pro Thr Gly Gly Met Gly Gly Met Asp Phe
    530                 535                 540

Claims (37)

1)编码9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：5描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
2)编码14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：3描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
3)编码28kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：1描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
4)编码47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：7描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
5)编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：9描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
6)编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：11描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
7)编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：13描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
8)编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：15描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
9)编码鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分，所述核酸序列或所述其一部分与如SEQ ID NO：17描述的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白基因的核酸序列具有至少85％，优选90％，更优选95％同源性。
10)编码具有5.60-6.15的pI的60kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分。
11)编码具有4.20-4.75的pI的33kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白的核酸序列或编码所述蛋白的免疫原性片段的所述核酸序列的一部分。
12)包含根据权利要求1-11的核酸序列的DNA片段。
13)包含根据权利要求1-11的核酸序列或根据权利要求12的DNA片段的重组DNA分子，在功能性连接的启动子控制下。
14)包含根据权利要求1-11的核酸序列、根据权利要求12的DNA片段或根据权利要求13的重组DNA分子的活重组载体。
15)包含根据权利要求1-11的核酸序列、根据权利要求12的DNA片段、根据权利要求13的重组DNA分子或根据权利要求14的活重组载体的宿主细胞。
16)9kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：6描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
17)14kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：4描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
18)28kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：2描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
19)47kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：8描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
20)鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：10描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
21)鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：12描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
22)鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：14描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
23)鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：16描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
24)鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或其免疫原性片段与如SEQ ID NO：18描述的氨基酸序列具有至少90％，优选92％，更优选94％的序列同源性。
25)具有5.60-6.15的pI的60kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段。
26)具有4.20-4.75的pI的33kD鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段。
27)根据权利要求16-26的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段，其特征在于所述蛋白或免疫原性片段由根据权利要求1-11的核酸序列编码。
28)根据权利要求16-26的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或其免疫原性片段或根据权利要求1-11的核酸序列用于疫苗。
29)根据权利要求1-11的核酸序列、根据权利要求12的DNA片段、根据权利要求13的重组DNA分子、根据权利要求14的活重组载体、根据权利要求15的宿主细胞或根据权利要求16-26的蛋白或其免疫原性片段在制备对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗中的应用。
30)对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含至少一种根据权利要求16-26的鸟分枝杆菌副结核亚种蛋白或所述蛋白的免疫原性片段和药物可接受载体。
31)对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含根据权利要求1-11的核酸序列、根据权利要求12的DNA片段、根据权利要求13的重组DNA分子、根据权利要求14的活重组载体或根据权利要求15的宿主细胞和药物可接受载体。
32)对抗鸟分枝杆菌副结核亚种感染的疫苗，其特征在于所述疫苗包含抗根据权利要求16-26的蛋白或所述蛋白的免疫原性片段的抗体和药物可接受载体。
33)根据权利要求30-32的疫苗，其特征在于所述疫苗包含佐剂。
34)根据权利要求30-33的疫苗，其特征在于所述疫苗包含得自对牛致病的病毒或微生物的另外的抗原、抗所述抗原的抗体或编码所述抗原的遗传信息。
35)根据权利要求34的疫苗，其特征在于所述对牛致病的病毒或微生物选自下组：牛疱疹病毒、牛病毒性腹泻病毒、3型副流感病毒、牛副粘液病毒、口蹄疫病毒、溶血巴斯德氏菌、牛呼吸道合胞病毒、泰累尔氏梨浆虫属、巴贝虫属、锥虫属种，微粒孢子虫属、Neosporacaninum、金黄色葡萄球菌、无乳链球菌、支原体属、大肠杆菌、肠杆菌属、克雷伯氏菌属、柠檬酸杆菌属和停乳链球菌。
36)根据权利要求30-35的疫苗的制备方法，所述方法包括将根据权利要求1-11的核酸序列、根据权利要求12的DNA片段、根据权利要求13的重组DNA分子、根据权利要求14的活重组载体、根据权利要求15的宿主细胞、根据权利要求16-26的蛋白或抗根据权利要求16-26的蛋白的抗体与药物可接受载体混合。
37)诊断试剂盒，包括合适的检测工具和根据权利要求1-11的核酸序列或其引物、根据权利要求16-26的蛋白或其免疫原性片段，或与根据权利要求16-26的蛋白反应的抗体。
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