MXPA06006282A - Vacuna de subunidad 26 kd de lawsonia intracellularis - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere entre otras cosas aácidos nucleicos que codifican proteínas novedosas de Lawsonia intracellularis. Se refiere además a fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden estas secuencias. También se refiere a células huésped que comprenden talesácidos nucleicos, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos. Además, la invención se refiere a proteínas codificadas por estas secuencias nucleótidas y a su uso para la elaboración de vacunas. La invención también se refiere a vacunas para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis y métodos para la preparación de las mismas. Finalmente, la invención se refiere a pruebas de diagnostico para la detección de antígenos de Lawsonia intracellularis y de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis.

Description

VACUNA DE SUBUNIDAD 26 KD DE LAWSONIA INTRACELLULARIS La presente ¡nvención se refiere, entre otras cosas, a ácidos nucleicos que codifican proteínas novedosas de Lawsonia intracellularis, a fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos que comprenden estas secuencias, a células huésped que comprenden tales ácidos nucleicos, fragmentos de ADN, moléculas de ADN recombinante y vehículos recombinantes vivos, a proteínas codificadas por estas secuencias nucleótidas y a su uso para la elaboración de vacunas, a vacunas para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis y métodos para la preparación de las mismas y a pruebas de diagnóstico para la detección de antígenos de Lawsonia intracellularis y para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. La enteropatía proliferativa porcina (PPE o PE) se ha vuelto una enfermedad importante de la industria porcina moderna a nivel mundial. La enfermedad afecta a 15% hasta 50% de las manadas en crecimiento y hasta 30% de los animales individuales en manadas problema establecidas. En la actualidad, las pérdidas económicas anuales se han estimado en EU$5-10 millones en costos de alimentación y tiempo en instalación extras por cerdo afectado. La PPE es un grupo de condiciones crónicas y agudas de señales clínicas ampliamente diversas (muerta, animales pálidos y anémicos, diarrea babosa, oscura o de rojo encendido, depresión, apetito reducido y renuencia a moverse, crecimiento retardado y FCR incrementada). Sin embargo, existen dos características consistentes. La primera, un cambio patológico solo visible en la necropsia, es un engrosamiento del intestino delgado y la mucosa del colon. La segunda es la ocurrencia de pequeñas bacterias curvas intracitoplasmáticas en los entericitos del intestino afectado. Estas bacterias se han establecido ahora como el agente etiológico de PPE y se ha nombrado Lawsonia intracellularis. Con los años, Lawsonia intracellularis se ha encontrado que afecta a un gran grupo de animales, incluyendo monos, conejos, hurones, hámsters, zorros, caballos y otros animales tan diversos como las ostras y emoe. Lawsonia intracellularis es una bacteria flagelada, gram-negativa que se multiplica solo en entericitos eucarióticos y no se ha descrito un cultivo libre de células. Con objeto de persistir y multiplicarse en la célula Lawsonia intracellularis, debe penetrar células cripta. La bacteria se asocia con la membrana celular e introduce rápidamente el entericito a través de una vacuola de entrada. Esta se fractura entonces rápidamente (dentro de 3 horas) y la bacteria florece y se multiplica libremente en el citoplasma. Los mecanismos mediante los cuales la bacteria origina que las células infectadas fallen en la maduración, continúan con la experimentación de mitosis y aún no se entienden las células cripta de forma hipoplástica. El entendimiento actual de la infección por Lawsonia intracellularis, tratamiento y control de la enfermedad se ha obstaculizado por el hecho de que Lawsonia intracellularis no puede cultivarse en medio libre de células. Aunque existen reportes de co- cultivo exitoso de Lawsonia intracellularis en entericitos de rata, esto no ha conducido al desarrollo de vacunas inactivadas para combatir Lawsonia intracellularis, aunque existe claramente una necesidad de tales vacunas. Un objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna para combatir infección por Lawsonia intracellularis. Se encontró ahora sorprendentemente que Lawsonia intracellularis produce una proteína novedosa que es capaz de inducir inmunidad protectora contra Lawsonia intracellularis. La proteína novedosa será referida como la proteína 26 kD. La secuencia amino acida de la proteína novedosa se presenta en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 2. El gen que codifica esta proteína se ordenado en secuencia y su secuencia de ácido nucleico se muestra en el identificador de secuencia SEQ ID NO: 1 . El gen también será referido en los Ejemplos como "gen 5608". Es bien sabido en la materia, que muchas diferentes secuencias de ácido nucleico pueden codificar la misma proteína. Este fenómeno es comúnmente conocido como fluctuación en la segunda y especialmente la tercera base de cada triplete que codifica un amino ácido. Este fenómeno puede dar como resultado una heterología de aproximadamente 30% para dos secuencias de ácido nucleico que aún codifican la misma proteína. Por consiguiente, dos secuencias de ácido nucleico que tienen una homología de secuencia de aproximadamente 70% pueden aún codificar la misma proteína.

De este modo, una modalidad se refiere a ácidos nucleicos que codifican una proteína de Lawsonia intracellularis y a partes de ese ácido nucleico que codifican un fragmento inmunogénico de esa proteína, en donde aquellos ácidos nucleicos o partes de los mismos tienen un nivel de homología con el ácido nucleico del cual la secuencia se da en la SEQ I D NO: 1 de al menos 90%. Preferentemente, el ácido nucleico que codifica esta proteína de Lawsonia intracellularis o la parte de dicho ácido nucleico tiene al menos 92%, preferentemente 94%, más preferentemente 95% e incluso más preferentemente 96% de homología con el ácido nucleico que tiene la secuencia dada en la SEQ ID NO: 1 . Incluso se prefiere más un nivel de homología de 98% o incluso 100%. El nivel de homología nucleótida puede determinarse con el programa de computadora "BLAST2 SEQUENCES" mediante selección del sub-programa: "BLASÓN" que puede encontrarse en www.ncbi.nlm.nih.qov/blast/bl2seq/bl2.html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Los parámetros utilizados son los parámetros por omisión: Recompensa para una concordancia: +1 . Penalidad para una desigualdad: -2. Intervalo abierto: 5. Intervalo de extensión: 2. x_bajada perpendicular de intervalo: 50. Otro enfoque para decidir si un cierto ácido nucleico es o no un ácido nucleico de acuerdo con la invención se refiere a . la cuestión de si cierto ácido nucleico se hibridiza bajo condiciones estrictas para ácidos nucleicos que tienen la secuencia nucleótida que se ilustra en la SEQ ID NO: 1 . Si un ácido nucleico se hibridiza bajo condiciones estrictas para la secuencia nucleótida que se ilustra en la SEQ ID NO: 1 , se considera que es un ácido nucleico de acuerdo con la invención. La definición de condiciones estrictas sigue a partir de la fórmula de Meinkoth y Wahl (1984. Hibridización de ácidos nucleicos inmovilizados en soportes sólidos. Anal. Biochem. 138: 267-284). Tm = [81.5°C + 16.6(log M) + 0.41 (%GC) - 0.61 (%formamida) -500/L] - 1°C/1 %desigualdad En esta fórmula, M es molaridad de cationes monovalentes; %GC es el porcentaje de guanosina y nucleótidos de citosina en el ADN; L es la longitud del híbrido en pares base. Las condiciones estrictas son aquellas condiciones bajo las cuales se hibridizan aún los ácidos nucleicos o fragmentos de los mismos, si tienen una desigualdad de 10% cuando mucho, hacia el ácido nucleico que tiene la secuencia ilustrada en la SEQ ID NO: 1 . Ya que la presente invención expone ácidos nucleicos que codifican las proteínas novedosas de Lawsonia intracellularis, ahora es posible por primea vez obtener estas proteínas en cantidades suficientes. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante el uso de sistemas de expresión para expresar los genes que codifican las proteínas. Por consiguiente, en una modalidad más preferida, la invención se refiere a fragmentos de ADN que comprenden un ácido nucleico de acuerdo con la ¡nvención. Tales fragmentos de ADN pueden ser, por ejemplo, plásmidas, en las cuales se clona un ácido nucleico de acuerdo con la invención. Tales fragmentos de ADN son útiles, por ejemplo, para mejorar la cantidad de ADN para utilizarse como una carga de inicio, según se describe a continuación. Un requisito esencial para la expresión del ácido nucleico es un promotor adecuado, funcionalmente enlazado al ácido nucleico, a fin de que el ácido nucleico se encuentre bajo el control del promotor. Es obvio para aquellos expertos en la materia que la selección de un promotor se extiende a cualquier promotor eucariótico, procariótico o viral capaz de dirigir la trascripción genética en células utilizadas como células huésped para la expresión de proteína. Por consiguiente, una forma incluso más preferida de esta modalidad se refiere a un molécula de ADN recombinante que comprende un fragmento de ADN o un ácido nucleico de acuerdo con la invención, que se coloca bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado. Esto puede llevarse a cabo por medio de, por ejemplo, técnicas estándares de biología molecular. (Sambrook, J. y Russell, D.W. , Clonación molecular: un manual de laboratorio, 2001 . ISBN 0-87969-577-3). Los promotores funcionalmente enlazados son promotores que son capaces de controlar la trascripción de los ácidos nucleicos a los cuales se enlazan. Tal promotor puede ser un promotor de Lawsonia, por ejemplo, el promotor involucrado en la expresión in vivo del gen que codifica el gen 26 kD, tomando en cuenta que el promotor es funcional en la célula utilizada para expresión. También puede ser un promotor heterólogo. Cuando las células huésped son bacterias, las secuencias de control de expresión útiles que pueden utilizarse incluyen el promotor y operador de Trp (Goeddel, et al. , Nucí. Acids Res., 8, 4057, 1980); el promotor y operador lac (Chang, et al. , Nature, 275, 615, 1978); el promotor de proteína de membrana externa (Nakamura, K. , e Inouge, M. , EMBO Jr. , 1 , 771 -775, 1982); los promotores y operadores lambda bacteriófagos (Remaut, E. eí al. , Nucí. Acids Res. , 1 1 , 4677-4688, 1983); el promotor y operador de a-amilasa (B. subtilis), secuencias de terminación y otra mejora de expresión y secuencias de control compatibles con la células huésped seleccionada. Cuando la célula huésped es levadura, las secuencias de control de expresión útiles incluyen, por ejemplo, factor de a-acoplamiento. Para células de insecto, pueden utilizarse los promotores de polihedrina o p10 de baculovirus (Smith, G.E., et al. , Mol. Cell. Biol. 3, 2156-65, 1983). Cuando la célula huésped es de origen mamífero, las secuencias de control de expresión, útiles, ilustrativas, incluyen el promotor SV-40 (Berman, P.W. et al. , Science, 222, 524-527, 1983) o el promotor de metalotioneína (Brínster, R.L., Nature, 296-39-42, 1982) o un promotor de choque térmico (Voellmy er al. , Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 82, 4949-53, 1895). Los sistemas de expresión celular en bacterias, levadura, fungal, insectos y mamíferos son sistemas muy frecuentemente utilizados. Tales sistemas son muy conocidos en la materia y generalmente disponibles, por ejemplo, comercialmente a través de Invitrogen (www.invitrogen.com) , Novagen (www.merckbiosciences.de) o Clontech Laboratories, Inc. 4030 Fabián Way, Palo Alto, California 94303-46077, EUA. Enseguida de estos sistemas de expresión, los sistemas de expresión en base a parásitos son sistemas de expresión muy atractivos. Tales sistemas, por ejemplo, se describen en la Solicitud de Patente Francesa con Número de Publicación 2 714 074 y en la Publicación NTIS de E. U. No. 08/0431 09 (Hoffman, S, y Rogers, W. : Fecha de Public. Diciembre 1 , 1993). Una forma aún más preferida de esta modalidad de la invención se refiere a Vehículos Recombinantes Vivos (LRCs) que comprenden un ácido nucleico que codifica la proteína 26 kD o un fragmento ¡nmunogénico de la misma de acuerdo con la invención, un fragmento de ADN de acuerdo con la ¡nvención o una molécula de ADN recombinante de acuerdo con la invención. Tales vehículos son, por ejemplo, bacterias y virus. Estos LRCs son micro-organismos o virus en los cuales se ha clonado información genética adicional, en este caso, un ácido nucleico que codifica la proteína 26 kD o un fragmento inmunogénico de la misma, de acuerdo con la invención. Los animales infectados con tales LCRs producirán una respuesta inmunogénica no solo contra los inmunogenes del vehículo, sino también contra las partes inmunogénicas de la(s) proteína(s) para los cuales el código genético se clona adicionalmente en el LRC, por ejemplo, la proteína 26 kD. Como un ejemplo de LRCs bacterianos, las cepas de Salmonella atenuadas conocidas en la materia pueden utilizarse de manera atractiva. Los parásitos vehículo recombinantes, vivos, se han descrito, entre otras cosas, por Vermeulen, A. N. (Int. Journ. Parasitol. 28: 1 121 -1 130 (1998)). También, los virus de LRC pueden utilizarse como una vía para transportar el ácido nucleico hacia una célula objetivo. Los virus de vehículo, recombinantes, vivos, también son llamados virus de vector. Los virus utilizados con frecuencia como vectores son los virus de Vaccinia (Panicali eí al. ; Proc. Nati. Acad. Sci. EUA, 79: 4927 (1982), Virus de Herpes (E. P.A. 0473210A2) y Retrovirus (Valerio, D.

ET AL. ; en Baum, S.J., Dicke, K.A. , Lotzova, E. y Pluznik, D.H. (Eds.), Hematología Experimental hoy - 1988. Springer Verlag, New Cork: pp. 92-99 (1989)). La técnica de recombinación homologa in vivo, muy conocida en la materia, puede utilizarse para introducir un ácido nucleico recombinante en el genoma de una bacteria, parásito o virus de su preferencia, capaz de inducir la expresión del ácido nucleico insertado de acuerdo con la invención en el animal huésped. Finalmente, otra forma de esta modalidad de la invención se refiere a una célula huésped que comprende un ácido nucleico que codifica una proteína de acuerdo con la invención, un fragmento de ADN que comprende tal ácido nucleico o una molécula de ADN recombínante que comprende tal ácido nucleico bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado. Esta forma también se refiere a una célula huésped que contiene un vehículo recombinante vivo que contiene una molécula de ácido nucleico de acuerdo con una proteína 26 kD o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención. Una célula huésped puede ser una célula de origen bacteriano, por ejemplo, Escherichia coli, Bacillus subtilis y especies de Lactobacíllus, en combinación con plásmidas a base de bacterias como pBR322 o vectores de expresión bacteriana como pGEX, o con bacteriófagos. La célula huésped también puede ser de origen eucariótico, por ejemplo, células de levadura en combinación con moléculas de vector específicas de levadura, o células eucarióticas mayores como células de insecto (Luckow eí al: Bio-Tecnología 6: 47-55 (1988)) en combinación con vectores o baculovirus recombinantes, células de planta en combinación con, por ejemplo, vectores a base de plásmida-Ti o vectores virales de planta (Barton, K.A. eí al; Célula 32: 1033 (1983), células mamíferas tales como células Hela,, células de Ovario de Hámster Chino (CHO) o células de Riñon Felino Crandell, también con vectores adecuados o virus recombinantes. Otra modalidad de la invención se refiere a las proteínas novedosas y a fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención. El concepto de fragmentos inmunogénicos se definirá a continuación. Una de esta modalidad se refiere, entre otras cosas, a proteínas de Lawsonia intracellularis que tienen una secuencia amino acida que es al menos 90% homologa con la secuencia amino acida, como se ilustra en la SEQ ID NO: 2 y fragmentos inmunogénicos de dicha proteína. En una forma preferida, la modalidad se refiere a proteínas tales como Lawsonia intracellularis que tienen una homología de secuencia de al menos 92%, preferentemente 94%, más preferentemente 96% de homología con la secuencia amino acida, como se ilustra en la SEQ ID NO: 2 y los fragmentos inmunogénicos de tales proteínas. Incluso se prefiere más un nivel de homología de 98% o incluso 1 00%. El nivel de homología de proteína puede determinarse con el programa de computadora "BLAS 2 SEQUENCES" mediante selección del sub-programa: "BLASTP" que puede encontrarse en www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/bt2seq/bl2.html. Una referencia para este programa es Tatiana A. Tatusova, Thomas L. Madden FEMS Microbiol. Letters 174: 247-250 (1999). Matriz utilizada: "blosum62". Los parámetros utilizados son los parámetros por omisión: Intervalo abierto: 1 1 , Intervalo de extensión: 1 . Intervalo x_caída: 50. Se entenderá que, para las proteínas abarcadas en la presente en particular, pueden existir variaciones naturales entre las cepas individuales de Lawsonia intracellularis. Estas variaciones pueden demostrarse por una(s) diferencia(s) de amino ácido en la secuencia general o por omisiones, sustituciones, inserciones, inversiones o adiciones de un(os) amino ácido(s) en dicha secuencia. Las sustituciones de amino ácido que no alteran esencialmente las actividades biológicas e inmunológicas se han descrito, por ejemplo, por Neurath eí al. en "Las Proteínas" Academia Press New Cork (1979). Los reemplazos de amino ácido entre amino ácidos relacionados o reemplazos que han ocurrido con frecuencia en la evolución son, entre otras cosas, Ser/Ala, Ser/Gly, Asp/Gly, Asp/Asn, He/Val (ver Dayhof, M.D. , Atlas de secuencia y estructura de proteínas, Nat. Biomed. Res. Found, Washington, D.C. , 1978, vol. 5, suppl. 3). Otras sustituciones amino acidas incluyen Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Thr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Leu/Me, Leu/Val y Ala/Glu. En base a esta información, Lipman y Pearson desarrollaron un método para la rápida y sensible comparación de proteínas (Science, 227, 1435-1441 , 1985) y la determinación de la similitud funcional entre proteínas homologas. Tales sustituciones amino acidas de las modalidades ejemplares de esta invención así como también variaciones que tienen omisiones y/o inserciones se encuentran dentro del alcance de la invención, siempre y cuando las proteínas resultantes retengan su reactividad inmune. Esto explica porqué las proteínas de Lawsonia intracellularis de acuerdo con la invención, cuando se aislan de diferentes aislados de campo, pueden tener niveles de homología de aproximadamente 90%, mientras representan aún la misma proteína con las mismas características inmunológicas. Aquellas variaciones en la secuencia amino acida de una cierta proteína de acuerdo con la invención que aún proporciona una proteína capaz de inducir una respuesta inmune contra infección con Lawsonia intracellularis o al menos contra las manifestaciones clínicas de la infección se consideran como "no esencialmente influyentes de la inmunogenicidad". Cuando una proteína se utiliza, por ejemplo, para propósitos de vacunación o para elevar anticuerpos, sin embargo no es necesario utilizar la proteína completa. También es posible utilizar un fragmento de esa proteína que sea capaz, como tal o acoplado a un vehículo tal como, por ejemplo, KLH, de inducir una respuesta inmune contra esa proteína, un fragmento inmunogénico así llamado. Se entiende que un "fragmento inmunogénico" es un fragmento de la proteína de longitud total que aún ha retenido su capacidad de inducir una respuesta inmune en el huésped, es decir, comprende un epítope de célula B o T. En este momento, una variedad de técnicas se encuentra disponible para identificar fácilmente fragmentos de ADN que codifican fragmentos antigénicos (determinantes). El método descrito por Geysen eí al. (Solicitud de Patente WO 84/03564, Solicitud de Patente WO 86/06487, Patente de EU NR 4,833,092, Proc. Nati Acad. Sci. 81 : 3998-4002 (1984), J. Imm. Meth 102, 259-274 (1987), el así llamado método PEPSCAN es un método fácil de llevar acabo, rápido y bien establecido para la detección de epítopes; las regiones inmunológicamente importantes de la proteína. El método se utiliza a nivel mundial y por lo tanto es muy conocido por los hombres expertos en la materia. Este método (empírico) es especialmente adecuado para la detección de epítopes de célula B. también, dada la secuencia del gen que codifica cualquier proteína, los algoritmos de cómputo son capaces de designar fragmentos de proteína específicos como los epítopes inmunológicamente importantes sobre la base de su acuerdo secuencial y/o estructural con epítopes que se conocen ahora. La determinación de estas regiones se basa en una combinación de los criterios de hidrofilicidad de acuerdo con Hopp y Woods (Proc. Nati. Acad. Sci. 78: 38248-3828 (1981 )), y los aspectos de la estructura secundaria de acuerdo con Chou y Pasman (Avances en Enzimología 47: 45-148 (1987) y la Patente de E.U. 4,554, 101 ). Los epítopes de célula T pueden predecirse de igual modo a partir de la secuencia por computadora con la ayuda de criterios de anfifilicidad de Berzofsky (Science 235, 1059-1 062 (1987) y la Solicitud de Patente de EU NTIS EU 07/005,885). Un panorama general condensado se encuentra en: Shan Lu en principios comunes: Tibtech 9: 238-242 (1991 ), Good eí al. en epítopes de Malaria; Science 235: 1059-1062 (1987), Lu para una revisión; Vacuna 10: 3-7 (1 992), Berzowsky para epítopes de VIH; El FASEB Journal 5: 2412-2418 (1991 ). Por consiguiente, una forma de todavía otra modalidad de la ¡nvención se refiere a vacunas capaces de proteger a los cerdos contra infección por Lawsonia intracellularis, que comprende la proteína o un fragmento inmunogénico de la misma, de acuerdo con la invención, según se describe arriba en conjunto con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Todavía otra modalidad de la presente ¡nvención se refiere a las proteínas de acuerdo con la invención para utilizarse en una vacuna. Todavía otra modalidad se refiere al uso de una proteína de acuerdo con la invención para la elaboración de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis. Una manera de elaborar una vacuna de acuerdo con la invención es mediante purificación bioquímica de las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención a partir de bacterias obtenidas a través de raspados mucosales tomados de la pared de intestino infectado. Sin embargo, esta es una manera que lleva demasiado tiempo para la elaboración de la vacuna. Por consiguiente, es más conveniente utilizar los productos de expresión de los genes que codifican las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas, de acuerdo con la invención en las vacunas. El ácido nucleico del gen que codifica la proteína 26 kD se proporciona por la presente invención. Tales vacunas en base a los productos de expresión de estos genes pueden elaborarse fácilmente mediante mezcla de una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de la misma de acuerdo con la invención, con un vehículo farmacéuticamente aceptable, según se describe a continuación. De manera alternativa, una vacuna de acuerdo con la invención puede comprender vehículos recombinantes vivos, como se describe arriba, capaces de expresar las proteínas de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención. Tales vacunas, por ejemplo, en base a vehículo de Salmonella o un vehículo viral que infecta el epitelio entérico, o por ejemplo el epitelio respiratorio, tienen la ventaja sobre vacunas de sub-unidad ya que imitan mejor la manera natural de infección de Lawsonia intracellularis. Además, esta auto-propagación es una ventaja ya que solo son necesarias cantidades bajas del vehículo recombinante para la inmunización. Las vacunas arriba descritas contribuyen todas a activar la vacunación, es decir, el sistema inmune del huésped se activa por una proteína de acuerdo con la invención o un fragmento inmunogénico de la misma, para elaborar anticuerpos contra estas proteínas. De manera alternativa, tales anticuerpos pueden elevarse, por ejemplo, en conejos o pueden obtenerse de líneas celulares productoras de anticuerpos comos e describe a continuación. Tales anticuerpos pueden entonces administrarse al animal huésped. Este método de vacunación, vacunación pasiva, es la vacunación de selección cuando un animal ya se encuentra infectado, y no existe tiempo para permitir que se active la respuesta inmune natural. También es el método preferido para vacunación de animales de inmunidad comprometida. Los anticuerpos administrados contra Lawsonia intracellularis pueden enlazarse, en estos casos, directamente a la bacteria. Esto tiene la ventaja de que disminuye o detiene inmediatamente el crecimiento de Lawsonia intracellularis. Por consiguiente, otra forma de esta modalidad de la invención se refiere a vacunas que comprenden anticuerpos contra las proteínas 26 kD Lawsonia intracellularis de acuerdo con la invención. Las vacunas también pueden basarse en células huésped, como se describe arriba, que comprenden las proteínas o fragmentos inmunogénicos de las mismas de acuerdo con la invención. Una manera alternativa y eficaz de vacunación es la vacunación directa con ADN que codifica el antígeno relevante. La vacunación directa con proteínas codificadoras de ADN ha sido exitosa para muchas proteínas diferentes (Como se revisa en, por ejemplo, Donnelly eí al. The Immunologist 2: 20-26 (1993)). Esta manera de vacunación es muy atractiva para la vacunación de cerdos contra infección por Lawsonia intracellularis. Por consiguiente, todavía otras formas de esta modalidad de la invención se refieren a vacunas que comprenden ácidos nucleicos que codifican una proteína de acuerdo con la invención o fragmentos inmunogénicos de la misma de acuerdo con la invención y a vacunas que comprenden fragmentos de ADN que comprenden tales ácidos nucleicos. Todavía otras formas de esta modalidad se refieren a vacunas que comprenden moléculas de ADN recombinantes de acuerdo con la invención. Las vacunas de ADN pueden administrarse fácilmente a través de aplicación intradérmica, por ejemplo, mediante uso de un inyector sin aguja. Esta manera de administración suministra el ADN directamente en las células del animal por vacunarse. Las cantidades de ADN en el rango de microgramos entre 1 y 1 00 µg proporcionan muy buenos resultados. En una modalidad adicional, la vacuna de acuerdo con la presente invención adicionalmente comprende uno o más antígenos suministrados a partir de otros organismos patógenos y virus de cerdo, o información genética que codifica tales antígenos. Tales organismos y virus se seleccionan preferentemente a partir del grupo de virus Pseudorabies, virus de influenza Porcino, parvovirus Porcino, virus de gastro-enteritis transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelthrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella mutlocida, Streptococcus suis, Micoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae y Actinobacillus plueropneumoniae. Todas las vacunas de acuerdo con la presente invención comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable. Un vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, agua estéril o una solución salina fisiológica estéril. En una forma más compleja, el vehículo puede ser, por ejemplo, un regulador. Los métodos para la preparación de una vacuna comprenden la mezcla de una proteína de acuerdo con la invención, o un fragmento inmunogénico de la misma, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las vacunas de acuerdo con la presente invención pueden contener también, en una presentación preferida, un adyuvante. Los adyuvantes comprenden, en general, sustancias que refuerzan la respuesta inmune del huésped en una manera no específica. Un número de adyuvantes diferentes se conocen en la materia. Los ejemplos de adyuvantes son adyuvante Completo de Freunds e Incompleto, vitamina E, polímeros de bloque no iónico, muramildipéptidos, Quill A(R), aceite mineral, por ejemplo, Bayol(R) o Markol(R), aceite vegetal y Carbopol(R) (un homopolímero), o Diluvac(R) Forte. La vacuna también puede comprender un así llamado "vehículo". Un vehículo es un compuesto al cual se adhiere el polipéptido, sin enlazarse de manera covalente a éste. Los compuestos de vehículo utilizados con frecuencia son, por ejemplo, hidróxido de aluminio, -fosfato u -óxido, sílice, Caolina, y Bentonita. Una forma especial de tal vehículo, en la cual el antígeno se incrusta parcialmente en el vehículo, es el así llamado ISCOM (EP 109.942, EP 180.564, EP 242.380).. Además, la vacuna puede comprender uno o más compuestos activos en la superficie o emusificantes, adecuados, por ejemplo, Span o Tween. Con frecuencia, la vacuna se mezcla con estabilizadores, por ejemplo, para proteger a los polipéptidos propensos a la degradación de ser degradados, a fin de mejorar la vida útil en depósito de la vacuna, o para mejorar la eficiencia de líofilización. Los estabilizadores útiles son, entre otros, SPGA (Bovarnik eí al. ; J. Bacteriology 59: 509 (1950)), carbohidratos, por ejemplo, sorbitol, mannitol, tehalosa, almidón, sucrosa, dextrano o glucosa, proteínas tales como albúmina o caseína o productos de degradación de las mismas, y reguladores, tales como fosfatos de metal alcalino. Además, la vacuna puede suspenderse en un diluente fisiológicamente aceptable. Sin mencionar además, que también se incorporan en la presente invención otras maneras de adyuvar, agregar compuestos de vehículo o diluyentes, emulsificar o estabilizar un polipéptido. Las vacunas de acuerdo con la invención pueden administrarse de manera muy adecuada en cantidades que varían entre 1 y 1 00 microgramos, aunque pueden utilizarse dosis menores en un principio. Una dosis que excede 100 microgramos será menos atractiva por razones comerciales, aunque ¡nmunológicamente muy adecuada. Las vacunas en base a vehículos recombinantes atenuados vivos, tales como virus LRC y bacterias arriba descritos, pueden administrarse en dosis mucho menores, debido a que se multiplican por sí solas durante la infección. Por consiguiente, las cantidades muy adecuadas varían entre 103 y 1 09 CFU/PFU para bacteria y virus, respectivamente. Pueden aplicarse muchas maneras de administración. La aplicación oral es una manera muy atractiva de administración debido a que la infección es una infección del tracto digestivo. Una manera preferida de administración oral es el empaquetamiento de la vacuna en cápsulas, conocido y frecuentemente usado en la materia, que solo se desintegran después de que han pasado el ambiente altamente ácido del estómago. También, la vacuna podría mezclarse con compuestos conocidos en la materia para mejorar temporalmente el pH del estómago. La aplicación sistémica también es adecuada, por ejemplo, mediante aplicación intramuscular de la vacuna. Si se sigue esta ruta, son muy adecuados los procedimientos estándares conocidos en la materia para aplicación sistémica. Desde un punto de vista de protección contra la enfermedad, es importante un diagnóstico rápido y correcto de la infección por Lawsonia intracellularis. Por consiguiente, otro objetivo de esta invención es proporcionar herramientas de diagnóstico adecuadas para la detección de infección por Lawsonia intracellularis. Una prueba de diagnóstico para la detección de anticuerpos de Lawsonia intracellularis en suero puede ser, por ejemplo, una simple prueba de ELISA-emparedada estándar, en la cual la proteína 26 kD o fragmentos antigénicos de la misma de acuerdo con la invención cubren la pared de las cavidades de una placa de ELISA. Un método para la detección de tales anticuerpos es, por ejemplo, la incubación de proteína 26 kD o fragmentos antigénicos de la misma con suero de mamíferos por examinarse, seguida por, por ejemplo, incubación con un anticuerpo etiquetado contra el anticuerpo mamífero relevante. Una reacción de color puede revelar entonces la presencia o ausencia de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Otro ejemplo de un sistema de prueba de diagnóstico es, por ejemplo, la incubación de un manchado Western que comprende la proteína 26 kD o un fragmento antigénico de . la misma, de acuerdo con la invención, con suero de mamíferos por examinarse, seguido por análisis del manchado. De este modo, otra modalidad de la presente invención se refiere a pruebas de diagnóstico para la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis. Tales pruebas comprenden una proteína o fragmento de la misma de acuerdo con la invención. Una prueba de diagnóstico en base a la detección de material antigénico de la proteína 26 kD específica de antígenos de Lawsonia intracellularis y por consiguiente adecuada para la detección de infección por Lawsonia intracellularis puede ser también, por ejemplo, una prueba de ELISA estándar. En un ejemplo de tal, una prueba de las paredes de las cavidades de una placa de ELISA se cubre con anticuerpos dirigidos contra las proteínas 26 kD. Después de la incubación con el material por examinarse, los anticuerpos etiquetados con antl-Lawsonia intracellularis se agregan a las cavidades. Una reacción de color revela entonces la presencia de material antigénico de Lawsonia intracellularis. Por consiguiente, todavía otra modalidad de la presente invención se refiere a pruebas de diagnóstico para la detección de material antígénico de Lawsonia intracellularis. Tales pruebas comprenden anticuerpos contra una proteína o un fragmento de la misma de acuerdo con la invención. Los polipéptidos o fragmentos inmunogénicos de los mismos, de acuerdo con la invención, expresados como se caracteriza arriba, pueden utilizarse para producir anticuerpos, que pueden ser policlonales, monoespecíficos o monoclonales (o derivados de los mismos). Si se desean anticuerpos policlonales, las técnicas para la producción y procesamiento de suero policlonal son muy conocidas en la materia (por ejemplo, Mayer y Walter, eds. Immunochemical in Cell and Molecular Biology, Academic Press, Londres, 1987). Los anticuerpos monoclonales, reactivos contra el polipéptido de acuerdo con la invención (o variantes o fragmentos de los mismos) de acuerdo con la presente invención, pueden prepararse medíante inmunización de ratones innatos de inmunización mediante técnicas también conocidas en la materia (Kohier y Milstein, Nature, 256, 495-497, 1 975). Los métodos para producción a gran escala de anticuerpos de acuerdo con la invención también se conocen en la materia. Tales métodos dependen de la clonación de (fragmentos de) de la información genética que codifica la proteína de acuerdo con la invención en un fago filamentoso para exhibición de fago. Tales técnicas se describen, entre otras, en la "Página de Diseño de Anticuerpos" bajo "exhibición de fago filamentoso" en http://aximt1 .imt.uni-marburg.de/~rek/aepphaqe.html. y en documentos de revisión de Córtese, R. eí al. , (1994) en Trenes Biotechn. 12: 262-267, por Clackson, T. & Wells, J.A. 81994) en Trenes Biotechn. 12: 173-183, por Marks, J.D. eí al. (1992) en J. Biol. Chem. 267: 16007-16010, por Winter, G. eí al. , (1994) en Annu. Rev. Immunol. 12: 433-455 y por Little, M. eí al. (1994) Biotechn. Adv. 12: 539-555. Los fagos se utilizan posteriormente para seleccionar bibliotecas de expresión camelia que expresan anticuerpos de cadena pesada camelia (Muyldermans, S. y Lauwereys, M. , Journ. Molec. Recogn. 12: 131 -140 (1999) y Ghahroudi, M.A. eí al. , FEBS Letters 414: 512-526 (1997)). Las células de la biblioteca que expresan los anticuerpos deseados pueden reproducirse y posteriormente utilizarse para expresión a gran escala de los anticuerpos.

Eiemplos Ejemplo 1 : Aislamiento de Lawsonia intracellularis a partir de íleo porcino infectado íleo infectado por L. intracellularis, confirmado por histopatología y teñido ácido-rápido de Ziehl-Neelsen, se recolectó de cerdos muertos con PE, y se almacenó a -80°C. Después de descongelamiento, la bacteria L. intracellularis se aisló de raspados mucosales tomados de la pared intestinal infectada. Los rascados de íleo se homogenizaron repetidamente en PBS en un omnimezclador para liberar la bacteria intracelular como se describe por Lawson eí al. (Vet. Microbiol. 10: 303-323 (1985)). El sobrenadante obtenido después de centrifugación a baja velocidad para retirar residuos se filtró a través de filtros de 5.0, 3.0, 1 .2 y 0.8 µm (Millipore). El filtrado se centrifugó posteriormente a 8000 g durante 30 min, dando una pequeña bolita de bacteria L. intracellularis. Estas bacterias se purificaron aún más mediante el uso de una gradiente Percoll. La identidad de la bacteria purificada se determinó por PCR (Jones ef al. , J. Clin. Microbiol. 31 : 261 1 -2615 (1 993)) mientras que la pureza de la bacteria aislada (>95%) se determinó mediante microscopio de contraste de fase para revelar cualquier bacteria contaminante o residuo presente.

Cepas bacterianas y plásmidas Las células de L. intracellularis se aislaron de material íleo infectado como se describe arriba. La cepa huésped de Escherichia coli BL21 star(DE3) que contiene vector pLysSrare y plásmida pET22b se adquirieron en Novagen (Madison, Wisconsin, EUA cepa de E.coli TOP10F' se adquirió en Invitrogen (Groningen, Países Bajos). Los depósitos de todas las cepas bacterianas, que contienen 30% de glicerol de almacenaron a -70°C. Se prepararon placas de LB y caldo de Luria Bertani (LB) de acuerdo con procedimientos estándares.

Aislamiento de ADN Con objeto de obtener ADN cromosómico de L. intracellularis altamente purificado, se preparó ADN a partir de células bacterianas mediante el uso de un equipo de aislamiento de ADN cromosómico Biorad (Biorad, Veenendaal, Países Bajos). El ADN de plásmlda se aisló mediante el uso de productos Qiagen.

Amplificación de PCR La amplificación de PCR se llevó a cabo mediante el uso de una mezcla de PCR que contiene 52 U/ml de Mezcla de Enzima de Alta Fidelidad de Expansión, regulador HF de Expansión con 2.5 mM de MgCI2, 16 mM de dNTPs (Promega, Wisconsin, EUA), 20 pmoles de cargas de inicio y 15 ng de ADN cromosómico de L. intracellularis como patrón. Para aplicaciones estándares (es decir, PCR de colonia) la mezcla de PCR contuvo 20 U/ml de Supertaq y regulador Supertaq (HT Biotechnology Ltd, Cambridge, Reino Unido), que contiene 8 mM de dNTPs (Promega, Wisconsin, EUA), 10 pmoles de cargas de inicio y 15 ng de patrón.

Litigación y transformación Las ligaciones se llevaron a cabo en 1 x regulador de ligación con 1 unidad de enzima de ligación (Gibco BRL Life Technologies Inc. , EUA) a 16°C durante la noche. Se transformó 1 µl de reacción de ligación en células competentes de E.coli mediante choque térmico. Las células competentes de E.coli BL21 star(DE3) y las células competentes de E.coli TOP10F' se hicieron competentes mediante el uso de métodos estándares.

Expresión de proteínas de fusión 10xHIS La secuencia de ADN del vector de expresión se confirmó antes de que el vector de expresión se transformara en BL21 star(DE3) que contiene pLysSrare. La cepa resultante se desarrolló durante la noche a 37°C a 200 rpm en 5 ml de LB con 1 00 µg/ml ampicilina. El cultivo durante la noche se diluyó a 1 : 100 en 50 ml de LB con 100 µg/ampicilina. Este cultivo se desarrolló bajo las mismas condiciones hasta que el OD6oo alcanzó 0.5. El cultivo se indujo con IPTG hasta una concentración final de 1 mM y continuó desarrollándose por 3 horas más. Las muestras 1 00 µl se tomaron para análisis de cepa E. coli BL21 star(DE3) que contiene pLysSrare desarrollado e inducido bajo las mismas condiciones y se tomaron muestras como un control negativo. Las muestras se analizaron por SDS PAGE.

Electroforesis de gel de poliacrilamida y manchado Western SDS-PAGE se llevó a cabo mediante el uso de geles Bis-Tris al 4-12% a partir de sistema de electroforesis NuPAGE (Invitrogen, www.invitroqen.com). El manchado Western se llevó a cabo mediante el uso de procedimientos de manchado semi-secos. Los manchados Western se desarrollaron mediante el uso de suero policlonal de pollo anti-Lawsonia que se elevó contra una preparación celular completa en una emulsión de agua:aceite = 45:55 o mediante el uso de un suero de cerdo que se había obtenido de un animal que se había reforzado oralmente con células purificadas de L.intracellularis y que había desarrollado señales clínicas y lesiones post-mortem típicas de infección por L-intracellularis. El suero se pre-absorbió mediante el uso de extractos de célula crudos, de volumen igual, de vector pLysSrare que contiene BL21 star(DE3) a 4°C durante 4 horas.

Resultados Clonación de gen 5608 de L. intracellularis en vector de expresión a base de T7 El gen 5608 se amplificó mediante el uso de carga de inicio 2179 (CATGCCATGGATTTGATGGAACAGGATTAAAG) y 2180 (CCGCTCGAGCCATAACCCCTTTTCGATAC). En el proceso, un sitio 5'Ncol y 3'Xhol se introdujeron en el producto de PCR. El producto de PCR obtenido se ligó posteriormente mediante el uso de enzimas de restricción Ncol y Xhol. El producto de PCR digerido se ligó posteriormente a pET22b que se había cortado con las mismas dos enzimas de restricción. La mezcla de ligación se transformó en TOP10F de E.coli y se incubó durante la noche a 37°C. Los transformantes putativos se verificaron respecto a la plásmida correcta, mediante el uso de PCR de colonia. Las inserciones de plásmida, de transformantes positivas de PCR de colonia, se verificaron mediante análisis de secuencia nucleótida. Uno de los clones que contuvo una secuencia según lo esperado sobre la base de la estrategia de clonación se seleccionó y designó pET5608.

Expresión de gen 5608 de L. intracellularis a partir de promotor T7 en E.coli La plásmida pET5608 se transformó en BL21 Star(DE3)pLysSrare. La cepa resultante se examinó respecto a producción de proteína recombinante como se describe arriba. Las muestras del cultivo inducido y las muestras de control se analizaron por electroforesis en gel de SDS-PAGE (Fig. 1 A). Una banda de proteína clara de aproximadamente 26 kDa se observó en la muestra que se había tomado después de 3 horas de inducción (Fig. 1A, hilera 3) en comparación con la muestra no inducida (Fig. 1A, hilera 2). Las mismas muestras se analizaron también mediante manchado Western utilizando el suero de cerdo y pollos. Se observó una reacción con proteína 5608 mediante el uso del suero proveniente del cero que se había reforzado oralmente con células purificadas de L. intracellularis (Fig . 1 B, hilera 3) y con el suero de pollo anti-L. intracellularis (Fig. 1 C, hilera 3).

Conclusión: el componente de vacuna 26 kD podría expresarse con éxito en grandes cantidades y no obstante se reconoce claramente mediante el refuerzo oral tanto de suero de cerdo anti-L. intracellularis como mediante suero de pollo anti-L. intracellularis.

Leyenda de la Figura Fig. 1 . Análisis de la sobre-expresión del gen 5607 de Lawsonia intracellularis en Escherichia coll BL21 STAR/pLysSRARE mediante SDS-PAGE (A) y manchado Western con suero de cerdo policlonal (B) y suero de pollo policlonal (C). Hilera 1 , marcador de peso molecular; hilera 2, pET5608 T = 0; hilera 3, pET5608 T = 3. Las flechas indican la ubicación del producto de expresión.

Claims (16)

1. REIVINDICACIONES 1 . Ácido nucleico que codifica una proteína 26 kD de Lawsonia intracellularis o una parte de dicho ácido nucleico que codifica un fragmento inmunogénico de dicha proteína, teniendo dicho ácido nucleico o parte del mismo al menos 90%, preferentemente 92%, más preferentemente 94%, incluso más preferentemente 96% de homología con un ácido nucleico que tiene una secuencia según se ilustra en la SEQ ID NO: 1 .
2. 2. Fragmento de ADN que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 .
3. 3. Molécula de ADN recombinante que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 , o un fragmento de ADN según la reivindicación 2, caracterizado por se encuentra bajo el control de un promotor funcionalmente enlazado.
4. 4. Vehículo recombinante vivo que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 , caracterizado por un fragmento de ADN según la reivindicación 2 o una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 3.
5. 5. Células huésped que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 , un fragmento de ADN según la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 3 o un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 4. 6. Una proteína 26 kD de Lawsonia intracellularis, comprendiendo dicha proteína una secuencia amino acida que es al menos 90%, preferentemente 92%, más preferentemente 94%, incluso más preferentemente 96% homologa a la secuencia amino acida según se ilustra en la SEQ ID NO: 2, o un fragmento inmunogénico de dicha proteína. 7. Proteína de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 6 para utilizarse en una vacuna. 8. Uso de una proteína de Lawsonia intracellularis según la reivindicación 6 para la elaboración de una vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis. 9. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada porque comprende un ácido nucleico según la reivindicación 1 , un fragmento de ADN según la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 3, un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 4, una célula huésped según la reivindicación 5 o una proteína según la reivindicación 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. 10. Vacuna según la reivindicación 9, caracterizada porque comprende un adyuvante. 1 1 . Vacuna según la reivindicación 9 o 10, caracterizada porque comprende un antígeno adicional, derivado de un virus o microorganismo patógeno para cerdos o información genética que codifica dicho antígeno. 12. Vacuna según la reivindicación 1 1 , caracterizada porque dicho virus o microorganismo patógeno para cerdos se selecciona a partir del grupo de virus Pseudorabies, virus de influenza Porcino, parvovirus Porcino, virus de gastro-enteritis transmisible, Rotavirus, Escherichia coli, Erysipelthrix rhusiopathiae, Bordetella bronchiseptica, Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis, Pasteurella mutlocida, Streptococcus suis, Micoplasma hyopneumoniae, Brachyspira hyodysenteriae y Actinobacillus plueropneumoniae. 13. Vacuna para combatir infecciones por Lawsonia intracellularis, caracterizada porque comprende anticuerpos contra una proteína según la reivindicación 6. 14. Método para la preparación de una vacuna según la reivindicación 9-13, caracterizado dicho método porque comprende la mezcla de un ácido nucleico según la reivindicación 1 , un fragmento de ADN según la reivindicación 2, una molécula de ADN recombinante según la reivindicación 3, un vehículo recombinante vivo según la reivindicación 4, una célula huésped según la reivindicación 5 o una . proteína según la reivindicación 6, o anticuerpos contra una proteína según la reivindicación 6, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. fe 15. Prueba de diagnóstico para . la detección de anticuerpos contra Lawsonia intracellularis, caracterizada porque dicha prueba comprende una proteína o un fragmento de la misma, según se define en la reivindicación 6. 16. Prueba de diagnóstico para la detección de materiai antigénico de Lawsonia intracellularis, caracterizada porque dicha prueba comprende anticuerpos contra una proteína o un fragmento de lá misma, según se define en la reivindicación
6. 6.