FR2571618A1 - Nouveau vaccin contre la tracheobronchite infectieuse canine et son procede de preparation - Google Patents
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Abstract
LA PRESENTE INVENTION CONCERNE UN NOUVEAU VACCIN CONTRE LA TRACHEOBRONCHITE INFECTIEUSE CANINE, PRESENTANT LA FRACTION PROTEINIQUE IMMUNOGENE DE BORDETELLA BRONCHISEPTICA, DEBARRASSEE DE SA FRACTION LIPOPOLYSACCHARIDIQUE TOXIQUE. IL EST CONSTITUE DE :-40 DE FRACTION ANTIGENIQUE BORDETELLA BRONCHISEPTICA CANINE;-40 DE SUSPENSION INACTIVEE DE VIRUS PARAINFLUENZAE;-10 DE STABILISATEUR;-10 D'ADJUVANT. LE VACCIN SELON L'INVENTION EST PARTICULIEREMENT DESTINE A LA PREVENTION DE LA TOUX DES CHENILS CHEZ LE CHIEN.
Description
La présente invention est relative à des nouveaux vaccins contre les maladies causées chez les animaux domestiques et l'homme par les bactéries du genre Bordetella.
Ces bactéries sont responsables de nombreuses infections telle que la rhinite atrophique du porc, la toux de chenil du chien, les toux d'origine infectieuse chez les bovins, les équins, et enfin de la coqueluche chez l'enfant.
Ces bactéries doivent en grande partie leur pouvoir pathogène à l'action de toxines provoquant des toux ou des nécroses tissulaires.
Des recherches ont été entreprises dans différents laboratoires pour produire des vaccins efficaces. Tous ceux existant actuellement utilisent dans leur conception des bactéries entières inactivées par différents moyens chimiques.
II est apparu à la demanderesse qu'il était possible d'isoler ia protéine bactérienne responsable de l'immunité dans ces diverses infections et. de l'utiliser comme vaccin purifié.
I1 est alors très actif et dénué de toute toxicité.
L'exemple qui sera ici décrit dans les détails, est plus particulièrement celui de la toux de chenil, mais des principes tout à fait identiques sont applicables à la Bordetella responsable par exemple de la rhinite du porc ou de la coqueluche chez l'enfant.
Dans le cas de la toux de chenil, parmi les bactéries isolées, la plus courante est Bordetella bronchiseptica, et parmi les virus isolés, le virus Parainfluenzae canin (le plus important) ainsi que l'Adénovirus type 2. Il est à noter que si Bordetellabronchiseptica utilisée seule reproduit les signes cliniques de la trachébronchite, l'action simultanée Bordetella-bronchiseptica et virus Parainfluenzae provoque plus sûrement et plus aisément les signes cliniques de la toux des chenils, le virus jouant très probablement un rôle dépressif, favorisant la multiplication bactérienne.
Il existe déjà (et notamment aux U.S.A. et en Allemagne) des vaccins pour la prévention de la trachéobronchite infectieuse canine.
Ceux-ci sont constitues soit de microorganismes atténués de Bordetella
Bronchiseptica S-55 d'origine porcine et de Parainfluenzae canin D 008 atténué, soit encore de virus sous forme inactivée. Autrement dit, on ne dispose actuellement que de souches attenuées vivantes, c'est-à-dire particulierement fragiles et instables (et qui ne sont pas particulierement adaptées a la tracheobronchite canine) ou de vaccins ne presentant pas la valence bactérienne Bordetella Bronchiseptica, la plus importante.
Bronchiseptica S-55 d'origine porcine et de Parainfluenzae canin D 008 atténué, soit encore de virus sous forme inactivée. Autrement dit, on ne dispose actuellement que de souches attenuées vivantes, c'est-à-dire particulierement fragiles et instables (et qui ne sont pas particulierement adaptées a la tracheobronchite canine) ou de vaccins ne presentant pas la valence bactérienne Bordetella Bronchiseptica, la plus importante.
Des essais ont été effectués pour la mise au point d'un vaccin anti-Bordetella Bronchiseptica inactivé, mais tous se sont soldés par un échecs car pour permettre une "certaine" réponse vaccinale, a l'aide d'une bacterie inactivée entière, l'apport d'un adjuvant puissant est indispensable pour le maintien des anticorps acquis. Or une émulsion bactéries huile amène des réactions vaccinales intenses, non spécifiques à Bordetella
Bronchiseptica, surtout chez le jeune chiot.
Bronchiseptica, surtout chez le jeune chiot.
De plus, lors de l'inactivation des bactéries entières par divers agents inactiveurs, on favorise la lyse non contrlee du corps bacterien ; or Bordetella Bronchiseptica contient une endotoxine de nature lipopolysaccharidique qui est à l'origine d'une forte toxicité (toxicité que l'on retrouve in vivo au niveau local apres attachement puis lyse du germe; on a déclenchement du réflexe de toux) chez des jeunes chiots pour lequel ce vaccin est destiné ; cette toxicité peut être dramatique.
La présente invention s'est par conséquent fixée pour but de pourvoir a un vaccin efficace contre la trachéobronchite canine qui répond mieux aux nécessités de la pratique que les vaccins proposes -conformèment a l'Art anterieur, notamment en ce qu'il presente la fraction protéinique Immunogène de Bordetella Bronchiseptica débarrassee de sa fraction lipopolysaccharidique toxique.
La Demanderesse qui a une grande expérience des maladies infectieuses des animaux a constaté que le pouvoir immunogène de l'extrait bactérien de Bordetella Bronchiseptica est lié au titre de la fraction antigénique détoxifiée.
La présente invention a pour objet un nouveau vaccin contre la trachéobronchite infectieuse canine, caractérisé en ce qu'il est constitue d'une association comprenant 1. la fraction antigénique de Bordetella Bronchiseptica purifiée et inactivée. .
2. le principal vecteur viral de la toux des chenils (Virus Parain
fluenzae canin) sous forme inactivée 3. le stabilisateur et l'adjuvant.
fluenzae canin) sous forme inactivée 3. le stabilisateur et l'adjuvant.
La présente invention a également pour objet un procédé de preparation du vaccin conforme a la présente invention qui est l'obtentention de la fraction antigénique de Bordetella-Bronchiseptica.
Selon un mode de realisation particulièrement avantageux du procedé objet de la présente invention, le temps de culture bactérienne au cours de la premiere étape (.Culture de Bordetella) doit au maximum durer 48 heures.
I1 existe en effet dans la maturation de Bordetella Bronchiseptica quatre phases correspondant'ata morphologie, a l'hémolyse, au pouvoir dermonécrotique et au pouvoir agglutinant de la bactérie. Pour avoir un maximum de l'activité immunogene, les bactaries ne doivent pas présenter un temps de culture supérieur a 48 heures.
Selon un autre modè de réalisation avantageux du procédé objet de la présente invention, la lyse du corps bactérien récolté au cours de la premiere étape est une'lyse par voie mécanique (ultra-sons et/ou implosion et/ou congélation-'décongélation et/ou différence de pression osmotique).
Selon un autre mode de réalisation avantageux du procédé de la présente invention, la lyse du corps bactérien récolté au cours de la premiere étape est favorisée par des agents chimiques (action du lysozyme, du Ethylènediaminetetraacétique acide et/ou du désoxycholate de sodium).
Conformément a l'invention, l'inactivation du Lysat obtenu au cours de la premiere étape est effectuée par l'action du formaldéhyde et/ou du glutardéhyde et/ou de bétapropiolactone et/ou du phénol et/ou par l'action ménagée de la chaleur.
Egalement conformement a l'invention, la purification de la fraction antigénique est effectuée par passage sur gel filtration et/ou résines échangeuses d'ions et/ou sur agarose.
Outre les dispositions qui précedent, l'invention comprend encore d'autres dispositions qui ressortiront de la description qui va suivre.
L'invention sera mieux comprise a l'aide du complement de déscription qui va suivre qui comprend des exemples de préparation du vaccin conforme à la présente invention, des exemples de caracterisa- tion des différentes composantes du vaccin et des compte-rendus des résultats serologiques et des vaccinations effectuées sur des chiens.
Il doit être bien entendu, toutefois, que ces exemples et compte-rendus sont donnes uniquement a titre d'illustration de l'objet de l'invention dont ils ne constituent, en aucune manière, une limitation.
EXEMPLE : OBTENTION DE LA FRACTION ANTIGENIQUE DE BORDETELLA -BRONCHISEPTICA a) FERMENTATION.
La souche utilisée était la souche 110 H (originaire de
James A. BAKER Institute for Animal Health, Cornell University Ithaca
N.Y., U.S.A.). Cette souche a été sélectionnée car sa virulence a servi a effectuer une épreuve sur chien (Dan W. CHLADEK Am vet Res Vol 42,
NO 2, pages 266-270, 1981)
La culture a été effectuée en milieu liquide dans un fermenteur agite et sous admission d'air stérile. Pour 1 l du milieu (autoclave 30 minutes a 1200C), on a utilise :
Hydrolysat trypsique de caseine : 17,0-9 Peptone de soja : : 3,0 g
Chlorure de sodium : 5,0 g
Phosphate de potassium: : 2,5 g
Glucose : 2,5 9
Le pH a été ajusté a 7,3, la température de fermentation a 370C + 20C. Après 48 heures d'incubation, on récolte environ 5 g de germes humides pour 1 litre du milieu.
James A. BAKER Institute for Animal Health, Cornell University Ithaca
N.Y., U.S.A.). Cette souche a été sélectionnée car sa virulence a servi a effectuer une épreuve sur chien (Dan W. CHLADEK Am vet Res Vol 42,
NO 2, pages 266-270, 1981)
La culture a été effectuée en milieu liquide dans un fermenteur agite et sous admission d'air stérile. Pour 1 l du milieu (autoclave 30 minutes a 1200C), on a utilise :
Hydrolysat trypsique de caseine : 17,0-9 Peptone de soja : : 3,0 g
Chlorure de sodium : 5,0 g
Phosphate de potassium: : 2,5 g
Glucose : 2,5 9
Le pH a été ajusté a 7,3, la température de fermentation a 370C + 20C. Après 48 heures d'incubation, on récolte environ 5 g de germes humides pour 1 litre du milieu.
b) TRAITEMENT DES BACTERIES.
Les bacteries sont récoltées par centrifugation a 6 000 g.
La récolte est contrôlée du point revue de la pureté par coloration de gram et isolement sur milieu solide.
On procède ensuite ainsi : Les germes subissent deux lavages successifs en tampon phosphate pH 7,2, en effectuant deux centrifugations a 6 000 g.
Le dernier culot de centrifugation est pesé et remis en tampon
Triss 1,5 M pH 9,8 additionné de 200 ua./ml de Ethtlenediamine tetracétique acide et 100 pSml de lysozyme. La suspension est portee a 2 heures à 37 C puis refroidie à OOC.
Triss 1,5 M pH 9,8 additionné de 200 ua./ml de Ethtlenediamine tetracétique acide et 100 pSml de lysozyme. La suspension est portee a 2 heures à 37 C puis refroidie à OOC.
Cette suspension est ensuite ultrasonnée, jusqu'à lyse complète des corps bactériens (20 KC/s).
Cette lyse est suivie par coloration au gramm.
Lorsque la suspension ne presente plus de corps figures, celle-ci est centrifugée à 1000 g pendant 30 minutes.
Pour l'inactivation du lysat, on utilise une solution de formaldehyde pur (37 % dans du méthanol) et on ajoute 1 %Ode formol (v/v) dans le lysat, puis on met en agitation 72 heures à 37 C, puis on neutralise l'excès de formaldéhyde à l'aide d'une solution à 35 % de bisulfite de sodium (1,24 % v/v de cette solution) ; on centrifuge ensuite 30 minutes à 5000 g.
Le surnageant est récupéré.
On le dépose sur une colonne de gel filtration (sephadex G 200), On procède à l'enregistrement des différents pics (280 nm de DO) obtenus apres passage sur colonne.
Les 3 pics obtenus correspondent aux différents ensembles de poids moléculaires différents. Le premier pic de filtration contient essentiellement notre molécule antigénique, son poids est plus important que celui des molécules constituant les deux pics suivants (voir courbe d'enregistrement tableau N01). Son caractère immunogène par rapport aux autres pics est démontré par sa capacité réactive vis-a-vis dlun sérum polyclonal par la méthode ELISA. En effet, seul le premier pic est positif en ELISA pour une concentration en protéine équivalente.
La mise en évidence de l'échelle moléculaire du premier pic a été réalisée par traitement de cèlui-ci par le Mercaptoéthanol et le SDS puis transfert sur gel gradient Acryl ami de en tampon Triss glycine SDS. Les bandes présentent iniquement dans le premier pic correspondant à la dissociation moleculaire sélective SDS-Mercaptoethanol se situe à 70 K dalton et à 35 K dalton.(Voir photographie sur gel, tableau N02).
CONSTITUTION DU VACCIN
Les différents composants du vaccin sont mélangés de manière à avoir
40 % de fraction antigénique (0,10 vg/ml)
40 % de suspension inactivée de virus Parainfluenzae, titrant
107 DICP50/ml avant inactivation.
Les différents composants du vaccin sont mélangés de manière à avoir
40 % de fraction antigénique (0,10 vg/ml)
40 % de suspension inactivée de virus Parainfluenzae, titrant
107 DICP50/ml avant inactivation.
10 % de stabilisateur
10 % d'adjuvant(s).
10 % d'adjuvant(s).
On procede ainsi
La fraction antigénique, la suspension de virus Parararainfluenzae et le stabilisateur (constitué par
- Peptone pancreatique : 15,0 C pour 1 litre
- Saccharose : 50,0 g
KH2 P04 : 0,5 g
- K2H P04 : 1,2 mg
- Rouge de phénol : 2,0 ml " "
- pH ajusté à 7,5 avec NaOH N ) sont additionnes de 5 ml de gel d'alumine pour 100 ml de suspension. On agite environ 12 heures à + 4"C.
La fraction antigénique, la suspension de virus Parararainfluenzae et le stabilisateur (constitué par
- Peptone pancreatique : 15,0 C pour 1 litre
- Saccharose : 50,0 g
KH2 P04 : 0,5 g
- K2H P04 : 1,2 mg
- Rouge de phénol : 2,0 ml " "
- pH ajusté à 7,5 avec NaOH N ) sont additionnes de 5 ml de gel d'alumine pour 100 ml de suspension. On agite environ 12 heures à + 4"C.
On ajoute ensuite 1 pour 10000 de mercuriothyolate.
Le tout est agité, le pH doit être de 7,5 + 0,5.
La répartition s'effectue sous 1,2 ml + 0,2 ml qui represente une dose de chien 1 PROTOCOLE VACCINAL 'SUR CHIEN
10 chiens de race beagle, agés de 8 à 12 semaines, séronégatifs vis-aivis des vaJences : Bordetella bronchiseptica, Parainfluenzae reçoivent par voie sous-cutanée ou intramusculaire deux doses de vaccin à 14 jours d'intervalle.
10 chiens de race beagle, agés de 8 à 12 semaines, séronégatifs vis-aivis des vaJences : Bordetella bronchiseptica, Parainfluenzae reçoivent par voie sous-cutanée ou intramusculaire deux doses de vaccin à 14 jours d'intervalle.
5 chiens beagle témoins du même âge sont associes a l'expérience.
Les prises de sang nécessaires à la cinétique des anticorps anti-Bordetella bronchiseptica sont effectués aux jours : J = O,
J = + 6, J = +9, J = + 13, J = + 16, J = + 20, J = + 23, J = + 30.
J = + 6, J = +9, J = + 13, J = + 16, J = + 20, J = + 23, J = + 30.
Les prises de sang nécessaires aux cinétiques des anticorps anti-Parainfluenzae sont effectués simultanement aux jours :
J = O, J = + 13, J = + 20, J = + 30.
J = O, J = + 13, J = + 20, J = + 30.
Le relevé de la température rectale, ainsi qu'une numeration leucocytaire sont effectués sur chaque chiot a : J = O, J = + 1,
J = + 2, J = + 3, J = + 4, J = + 6, J = + 8, apres la première injection vaccinale et à J = + 14, J = +15, j = + 16, J = + 17,
J = + 18, et J = ±20 apres 1o deuxième injection vaccinale.
J = + 2, J = + 3, J = + 4, J = + 6, J = + 8, apres la première injection vaccinale et à J = + 14, J = +15, j = + 16, J = + 17,
J = + 18, et J = ±20 apres 1o deuxième injection vaccinale.
Il résulte des données résumées dans les tableaux cidessus que les chiens répondent très bien aux différentes valences vaccinales.
La deuxième injection vaccinale n'est necessaire que dans le cas du Parainfluenzae : ceci s'explique par l'emploi du virus inactivé.
La reponse vis- -vis de Bordetella est très rapide et três importante.
L'innocuité du vaccin est parfaite car la temperature rectale comme la numération leucocytaire ne subissent aucune modification importante après la première et la deuxième injections vaccinales. ( Tableaux 5, 6, 71 8-).
2 ) DESCRIPTION DE 'L'EPREUVE
a) Protocole
16 jours après la deuxieme injection vaccinale, tous les chiens reçoivent 1 ml d'une suspension contenant 0,5 ml de Bordetella bronchiseptica 110H titrant 109 germes au ml et 0,5 ml de virus
Parainfluenzae virulent ( Manhattan ) titrant 106,5 DlCP5o/ml.
a) Protocole
16 jours après la deuxieme injection vaccinale, tous les chiens reçoivent 1 ml d'une suspension contenant 0,5 ml de Bordetella bronchiseptica 110H titrant 109 germes au ml et 0,5 ml de virus
Parainfluenzae virulent ( Manhattan ) titrant 106,5 DlCP5o/ml.
L'injection est effectuée par voie nasale apres anesthésie des chiens à l'aide d'un catheter de 1 mm de diamètre et 50 mm de long (0,5 ml dans chaque narine).
b) Etude des réponses à l'épreuve
Les réisolements, les temperatures rectales, les numerations leucocytaires, le relevé des signes cliniques sont effectués journellement pendant 21 jours après l'épreuve.
Les réisolements, les temperatures rectales, les numerations leucocytaires, le relevé des signes cliniques sont effectués journellement pendant 21 jours après l'épreuve.
Les etudes sérologiques correspondant à Bordetella bronchiseptica et au virus Parainfluenzae sont effectuées une fois par semaine pendant les trois semaines suivant l'épreuve.
c) Résultats
La durée de la toux (ou gene au niveau respiratoire) chez les chiens vaccines et les chiens témoins après l'épreuve n'est pas comparable. Chez tous les chiens, aussi bien ceux qui ont reçu le vaccin par voie sous-cutanée (SC) que par voie intramusculaire (IM), la toux a pratiquement disparu ; par contre, tous les chiens témoins ont été atteints.
La durée de la toux (ou gene au niveau respiratoire) chez les chiens vaccines et les chiens témoins après l'épreuve n'est pas comparable. Chez tous les chiens, aussi bien ceux qui ont reçu le vaccin par voie sous-cutanée (SC) que par voie intramusculaire (IM), la toux a pratiquement disparu ; par contre, tous les chiens témoins ont été atteints.
Il est difficile de reproduire expérimentalement les signes cliniques très prononcés (Bronchopneumonie purulente) de la toux des chenils en n'utilisant que le virus Parainfluenzae canin et la Bordetesla Bronchiseptica canine, et surtout en maintenant les chiens en épreuve particulièrement bien isolés ; car les surinfections naturelles (mycoplasmes, bactéries de surinfection) sont écartées de l'épreuve.
Cependant, il est à noter que le réflexe de toux, la gène respiratoire, les ecoulements nasaux et occulaires sont bien repro.- duits par l"'épreuve" que l'on a mise au point.
De plus, d'autres paramètres, tels que la température rectale, la numération leucocytaire, le réisolement des germes infectieux et les cinétiques serologiques, confirment l'efficacite du vaccin.
En effet, seuls les chiens temoins non vaccinés ont présenté tous les paramètres caractéristiques de l'atteinte des voies respiratoires.
Parmi ces paramètres, on peut noter que le réisolement dé la
Bordetella qui s'est poursuivi pendant plus d'un mois après l'épreuve chez les chiens non vaccinés est un critère important, laissant à penser que la bactérie epreuve n'a pu adhérer et se multiplier que chez les chiens ne presentant pas d'anticorps localement ; ce qui confirme que le taux d'anticorps humoraux est lié au taux de protection locale.
Bordetella qui s'est poursuivi pendant plus d'un mois après l'épreuve chez les chiens non vaccinés est un critère important, laissant à penser que la bactérie epreuve n'a pu adhérer et se multiplier que chez les chiens ne presentant pas d'anticorps localement ; ce qui confirme que le taux d'anticorps humoraux est lié au taux de protection locale.
La "toux des chenils" intervenant le plus couraninent dans les élevages de jeunes chiots, il est prudent de vacciner les animaux à l'aide du vaccin (1 dose de 1 ml) par voie sous-cutanée dès l'âge de 5 semaines puisque nous avons:remargue qu'à cet âge, les chiots repre- sentaient plus d'anticorps maternels vis-à-vis des valences qui nous intéressent, et que ceux-ci etaient déj immunocompétants vis- -vis de notre antigène.
La vaccination de rappel peut s'effectuer à 8 semaines d'âge, en association avec les primo-vaccinatio s habituelles : carré, hepatite, parvovirus, leptospires.
Une vaccination de rappel annuel est conseillée en association avec les autres vaccinations de rappel.
Cette souche a été sélectionnée car sa virulence a servi à effectuer une épreuve sur chien (Dan W. CHLADEK Am Vet Res Vol 42,'N02, p 266-270, 1981).
Ainsi que cela ressort de ce qui précède, l'invention ne se limite nullement à ceux de ses modes due mise en oeuvre, de realisation et d'application qui viennent d'être decrits de façon plus explicite elle en embrasse au contraire toutes les variantes qui peuvent venir à l'esprit du technicien en là matière, sans s'écarter du cadre, ni de la portée, de la presente invention.
Claims (1)
- c) inactivation du lysatd) Purification et stérilisation de la fraction antigenique, 50) Procédé selon la revendication 4, caractérisé en ce que le tempsde culture bactérienne au cours de la premiere étape (culture deBordetella) doit au maximum durer 48 heures.6Q) Procedé selon la revendication 5, caractérisé en ce que la lysedu corps bactérien recolté au cours de la premiere étape estune lyse par voie mécanique (ultra-sons et/ou implosion et/oucongelation-decongelation et/ou difference de pression osmotique).70) Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que la lysedu corps bactérien récolté au cours de la première étape estfavorisée par action du lysozyme et/ou du désoxycholate de sodiumet/ou du Ethylènediaminetétraacétique acide ).8 ) Procédé selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'inactivation du lysat obtenue au cours de la première étape est effectuéepar l'action du formaldéhyde et/ou du glutaraldéhyde et/ou debétapropiolactone et/ou du phénol et/ou par l'action ménagéede la chaleur.9 ) Procedé selon la revendication 1 et 2, caractérisé en ce que lapurification de la fraction antigénique est effectuée par gel filtration et/ou colonne échangeuse d'ion et/ou colonne d'affinité.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8416096A FR2571618A1 (fr) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | Nouveau vaccin contre la tracheobronchite infectieuse canine et son procede de preparation |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FR8416096A FR2571618A1 (fr) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | Nouveau vaccin contre la tracheobronchite infectieuse canine et son procede de preparation |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FR2571618A1 true FR2571618A1 (fr) | 1986-04-18 |
Family
ID=9308851
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FR8416096A Pending FR2571618A1 (fr) | 1984-10-12 | 1984-10-12 | Nouveau vaccin contre la tracheobronchite infectieuse canine et son procede de preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| FR (1) | FR2571618A1 (fr) |
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1984
- 1984-10-12 FR FR8416096A patent/FR2571618A1/fr active Pending
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