SK279968B6 - Imunogénny prostriedok, sekvencia rekombinantnej d - Google Patents
Imunogénny prostriedok, sekvencia rekombinantnej d Download PDFInfo
- Publication number
- SK279968B6 SK279968B6 SK1341-95A SK134195A SK279968B6 SK 279968 B6 SK279968 B6 SK 279968B6 SK 134195 A SK134195 A SK 134195A SK 279968 B6 SK279968 B6 SK 279968B6
- Authority
- SK
- Slovakia
- Prior art keywords
- ospc
- antigens
- lyme disease
- immunogenic composition
- strains
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 141
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 141
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 141
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 61
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims abstract description 58
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims abstract description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 6
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 482
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 claims abstract description 138
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 75
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims abstract description 25
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 21
- 239000000463 material Substances 0.000 claims abstract description 17
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims abstract description 15
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 6
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims description 46
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 41
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 39
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 38
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 38
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims description 21
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 15
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 12
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 10
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 9
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 6
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 4
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 101150055083 ospC gene Proteins 0.000 claims description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 claims description 2
- 101150107995 ACA1 gene Proteins 0.000 claims 2
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 claims 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 claims 1
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 abstract description 12
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 abstract 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 abstract 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 53
- 238000000034 method Methods 0.000 description 44
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 42
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 41
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 40
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 29
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 24
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 20
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 18
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241000894007 species Species 0.000 description 13
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 13
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 12
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 12
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 12
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 11
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 11
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 11
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 10
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 241000699694 Gerbillinae Species 0.000 description 8
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 8
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 206010052057 Neuroborreliosis Diseases 0.000 description 7
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 6
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 6
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 6
- 238000013461 design Methods 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 6
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 5
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 239000004382 Amylase Substances 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 4
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 3
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 3
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 3
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 3
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 201000004625 Acrodermatitis Diseases 0.000 description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 241000831652 Salinivibrio sharmensis Species 0.000 description 2
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 2
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000011556 gerbil model Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 2
- 230000008569 process Effects 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 2
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 2
- 238000012916 structural analysis Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 1
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 102100036826 Aldehyde oxidase Human genes 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 102000013142 Amylases Human genes 0.000 description 1
- 108010065511 Amylases Proteins 0.000 description 1
- 101150076489 B gene Chemical group 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 241000833568 Borrelia afzelii PKo Species 0.000 description 1
- 241001034584 Borrelia burgdorferi 297 Species 0.000 description 1
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 description 1
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- SALAQKAJNFRKGL-UFLZEWODSA-N CO.OC(=O)CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12 Chemical compound CO.OC(=O)CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12 SALAQKAJNFRKGL-UFLZEWODSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 description 1
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 244000207620 Euterpe oleracea Species 0.000 description 1
- 235000012601 Euterpe oleracea Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000928314 Homo sapiens Aldehyde oxidase Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 1
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 1
- 101150005926 Pc gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035056 Tick-Borne disease Diseases 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000003650 acai Nutrition 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 235000019418 amylase Nutrition 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N carbamazepine Chemical group C1=CC2=CC=CC=C2N(C(=O)N)C2=CC=CC=C21 FFGPTBGBLSHEPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 1
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000009795 derivation Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000001617 migratory effect Effects 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000003208 petroleum Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000013606 secretion vector Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000007762 w/o emulsion Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000004804 winding Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Public Health (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Tento vynález sa týka imunogénneho prostriedku, sekvencie rekombinantnej DNA, rekombinantného expresného vektora obsahujúceho sekvenciu kódujúcu OspC antigén a hostiteľskej bunky, ktorá je transformovaná týmto expresným vektorom. Tento vynález sa týka tiež spôsobu rekombinantnej prípravy OspC antigénu a spôsobu jeho použitia na imunizáciu cicavca proti lymskej borehóze.
Doterajší stav techniky
Lymská choroba alebo lymská borelióza sú pojmy, ktoré sa používajú pri opise rôznych klinických príznakov súvisiacich s kliešťovými spirochétovými infekciami, ktoré vyvolávajú lymské ochorenie Borrelia. Medzi známe príznaky lymského ochorenia patrí choroba pokožky [erythema migrans (EM) alebo acrodermatitis chronica atroficans (ACA)] a choroba nervového systému [neuroborelióza] a kĺbov [artritída]. Infikované a poškodené môžu byť i iné orgány a tkanivá. Lymská choroba je rozšírená na celom svete a je najčastejšou chorobou spôsobenou kliešťom, tak v USA, ako aj v Európe. Rozsah klinických príznakov obyčajne súvisiacich s lymskou chorobou v Európe je väčší ako v USA. Ochorenie kože a nervového systému je v Európe bežné, v USA ojedinelé, zatiaľ čo artritída je bežnejšia v Amerike ako v Európe. Klinické príznaky v Severnej Amerike sa zdajú byť podpriznakmi tých, ktoré sú pozorované v Európe.
Lymská choroba sa obyčajne lieči antibiotikami. Liečenie sa však často oneskoruje vzhľadom na zložitý klinický obraz a nedostatok všeobecne dostupných a spoľahlivých diagnostických testov. Ak choroba prejde do chronického stavu, liečenie antibiotikami je ťažšie a nie je vždy úspešné. Pravdepodobnosť perspektívy, že dôjde k stálemu poškodeniu, sa ďalej zvyšuje s predĺženou dobou infekcie. Je teda potrebná očkovacia látka, ktorá bude chrániť pred lymskou chorobou.
Opísané sú dva antigény z Borrelie, ktorá spôsobuje lymskú chorobu a ktoré môžu chrániť pred infekciou alebo chorobou spôsobenou týmto organizmom, ako to bolo dokázané na zvieracích modeloch lymskej choroby. Tieto antigény, OspA a OspC (alebo „pC“), sú teda pravdepodobnými kandidátmi na zahrnutie do vakcíny, ktorá je určená na ochranu proti lymskej chorobe, pozri Šimon a kol.: európsky patent č. 418 827, Fikrig a kol.: Science 250, 553 (1990), Preac-Mursic a kol.: Infection 20, 342 (1992). OspA a OspC majú mnohé vlastnosti spoločné. Obidva sú lipoproteínmi, ktoré sa nachádzajú na povrchu buniek (Howe a kol.: Science 227, 645 (1985), Bergstromakol.: Mol. Microbiol. 3, 479 (1989), obidva sú kódované plazmidom (Barbour a kol.: Science 237, 409 (1987), Marconi a koľ: J. Bacteriol. 175, 926 (1993), gény týchto proteínov sú prítomné vo väčšine kmeňov (Barbour a kol.: J. Infect. Dis. 152, 478 (1985), Marconi a kol.: J. Bacteriol. 175, 926 (1993) a obidva existujú v násobných serologicky rozdielnych formách (Wilske a kol., 1989).
Existencia násobných, serologicky rozdielnych foriem týchto antigénov je prekážkou vývoja OspA a/alebo OspC vakcíny na ochranu proti väčšine, ak nie proti všetkým formám lymskej choroby. Bolo napríklad opísané (Fikrigom a kol.: J. Immun. 148, 2256, 1992), že imunizácia jednou serologickou formou OspA, akou je rekombinantný OspA kmeňa N40, nemusí chrániť proti stimulácii kmeňom, ktorý exprimuje iný OspA, napríklad kmeňom 25015. Je teda nutné vyvinúť takú typizačnú schému na klasifikáciu a skupinu rôznych variantov antigénu (t. j. OspA a/alebo OspC), ktorá by mohla určiť optimálnu zmes serologicky rozdielnych foriem antigénu (antigénov), ktoré sú potrebné na dosiahnutie širokej ochrany.
Pre OspA bol ako typizačný nástroj pomocou obmedzeného množstva monoklonálnych protilátok vyvinutý serotypizačný systém. Týmto spôsobom bolo opísaných 7 serotypov OspA (Wilske a kol.: Ann, N. Y. Acad. Sci. 539, 126, 1988). Analýza polymorfie dĺžky reštrikčného fragmentu (RFLP) OspA génov z 55 rôznych európskych a severoamerických kmeňov identifikovala šesť rôznych genoskupín (Wallich a kol.: Infection and Immunity 60, 4856, 1992). OspA proteíny zo severoamerických izolátov sa zdajú byť dostatočne jednotné, pretože 12 zo 14 OspA patrilo k OspA typu I a dva k OspA typu ΠΙ. Oproti tomu OspA z európskych izolátov sú oveľa heterogénnejšie a zahrnujú reprezentantov OspA typu I (18), Π (17), ľV (4) a V (1). Konštrukcia fylogenetického stromu na základe sekvenčných údajov pre 12 OspA proteínov z jednotlivých kmeňov B. burgdorferi podporuje zistenie RFLP analýzy, ale chýba ešte informácia o sekvencii izolátov dvoch zo šiestich genoskupín. V súčasnosti neexistuje žiadny typizačný systém pre OspC.
Iným zámerom pri výbere príslušných antigénov na zahrnutie do vakcíny je to, či sú odvodené od kmeňov, ktoré sú epidemiologicky dôležité pre chorobu. V polovici osemdesiatych rokov bolo považované za isté, že patogénne baktérie pochádzajú z obmedzeného počtu klonov veľmi príbuzných baktérií, ktoré majú v niektorom smere selektívnu výhodu pri vzniku ochorenia. Táto klonálna hypotéza bola od toho času potvrdená, pozri Achtman a kol.: J. Infect. Dis. 165, 53 (1992). Je teda veľmi pravdepodobné, že medzi mnohými kmeňmi Borrelia spôsobujúcimi lymskú chorobu a ktoré sa v prírode vyskytujú, existuje len obmedzený počet „klonov“, ktoré sú veľmi prispôsobené na to, aby spôsobovali cicavcom, najmä ľuďom, toto ochorenie. Pri vývoji vakcíny na ochranu proti ochoreniu cicavcov a teda aj ľudí, je rozhodne dôležité identifikovať klony súvisiace s ochorením, a potom by sa úsilie mohlo sústrediť na tieto klony. Je nutné vysvetliť populačnú štruktúru druhu Borrelia spôsobujúcu lymskú chorobu a identifikovať klony súvisiace s týmto ochorením.
Doteraz boli na vyšetrenie populačnej štruktúry Borrelia spôsobujúcej lymskú chorobu používané rôzne spôsoby, medzi ktoré patrí:
a) RFLP analýza genomovej DNA alebo špecifických génov (LeFebvre a kol.: J. Clin. Microbiol. 27, 636, (1989), Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174, 241 (1992), Postic a kol.: Res. Microbiol. 141, 465 (1990), Stahlhammar-Carlemalm a kol.: Zbi. Bak. 274, 28 (1990), Adam a kol.: Infect. Immun. 549, 2579 (1991), Wallich a kol.: Infect. Immun. 60,4856 (1992)),
b) DNA-DNA hybridizácia (LeFebvrea kol.: J. Clin. Microbiol. 27, 636 (1989), Postic a kol.: Res. Microbiol. 141,465(1990)),
c) analýza 16 S rRNA hybridizáciou na oligonukleotidové sondy (Marconi a kol.: J. Clin. Microbiol. 30, 628 (1992)), alebo sekvenovaním (Adam a kol.: Infect. Immun. 59, 2579 (1991), Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174, 241 (1992)),
d) ručným vytláčaním ľubovoľne senzibilizovaná polymerizovaná reťazová reakcia (Welsc a kol.: Int. J. Systém. Bacteriol. 42, 370 (1992)),
ŠK 279968 Β6
e) elektroforéza (multi-locus enzýme electrophoresis) (Boerlin a kol.: Infect. Immun. 60, 1677 (1992)) a
f) serotypizácia izolátov (Peter a Brett: Zbi. Baktk. 277, 28(1992)).
Medzi výsledky, ktoré boli získané týmito rôznymi postupmi, existuje veľká zhoda. Všeobecne platí, že sa zdá, že izoláty Borrelia, ktoré spôsobujú lymskú chorobu, je možné rozdeliť do aspoň troch hlavných skupín. Niektorí výskumníci skutočne veria, že genetické rozdiely medzi členmi týchto skupín sú dostatočné na opodstatnenie rozdelenia na tri rôzne druhy: B. burgdorferi sensu stricto (typ kmeňa B31), B. garinii sp. nov. (typ kmeňa 20047) a druhy označené B. afzelii alebo „skupina VS461 Borrelia“, pozri Baranton a kol.: Int. J. Syst. Bacteriol. 42, 378 (1992) a Marconi a Garon.
Ostáva úplne objasniť význam existencie týchto rôznych skupín na vývoj vakcíny. Z údajov Wallicha a kol.: Infection and Immunity 60, 4856 (1992) je jasné, že existuje silná asociácia medzi genoskupinou, ku ktorej izolát patrí, a typom OspA, ktorý je produkovaný: izoláty zo skupiny obsahujúcej kmeň B31 (genoskupina AAA alebo B. burgdorferi sensu stricto) produkujú OspA typ 1 (všetkých izolovaných 30 kmeňov), izoláty zo skupiny obsahujúcej kmeň 20047 (genoskupina BBB alebo B. garanti sp. nov.) obyčajne produkujú OspA typ II (17/19), boli ale tiež zaznamenané typy V (1/19) a VI (3/39), izoláty z klonu obsahujúceho kmeň B023 (genoskupina BBA alebo skupina VS 461) produkujú OspA typ IV (4/4), zvyšné dva izoláty (genoskupina B, B/A, A) produkujú OspA typ III.
Izoláty lymskej choroby zo Severnej Ameriky patria väčšinou k jednej skupine (genoskupina AAA alebo B. burgdorferi sensu stricto), reprezentovanej kmeňom B31, a výsledné produkujú OspA typ I. To ukazuje, že vakcína obsahujúca OspA typ I môže byť dnes postačujúca na ochranu proti väčšine izolátov spôsobujúcich lymskú chorobu v Severnej Amerike. V Európe je to zložitejšie, pretože tu boli nájdené všetky tri hlavné klony a tomu zodpovedá i zvýšená rozmanitosť prítomných typov OspA (genotypy I, II, IV, V, VI). Nebolo zistené, že by OspA chránil v dvoch štúdiách, uskutočnených s izolátmi lymskej choroby z Európy, čo tiež dokázalo vhodnosť OspC ako ochranného antigénu, pozri US patentová prihláška č. 07/903 580 a Preac-Mursic a kol.: Infection 20, 342 (1992).
Dosiaľ nebolo známe, či bol OspC klonovaný dedične so špecifickými typmi OspC obmedzenými na príslušné skupiny lymskej choroby (t. j. na B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii sp. nov., alebo skupinu VS461). Pretože OspC je kódovaný plazmidom (Marconi a kol.: J. Bacteriol. 175, 926 (1993)), predpokladalo sa, že existoval plazmidom sprostredkovaný prenos génu OspC medzi rôznymi druhmi izolátov lymskej choroby. Ak ide o tento prípad, potom rôzne typy OspC, o ktorých je známe, že existujú, ale ktoré neboli definované, by sa nutne dedične neklonovali.
Podstata vynálezu
Predmetom tohto vynálezu je poskytnúť efektívnu OspC vakcínu so širokým skríženým ochranným účinkom na všetky klony proti lymskej chorobe u cicavcov, zvolením OspC prostriedkov založených na definovaných OspC skupinách rozlíšených fenotypickým typizovaním (OspC „sérovar“ typizovaní), RFLP typizačnou a nalýzou a sekvenčnou analýzou viacerých rozmanitých kmeňov z celého sveta.
Ďalej bol zistený OspC kloň, ktorý' sa dedične klonuje. Preto je teraz možné interpretovať výsledky OspC typizačných schém z pohľadu epidemiologickej informácie z opísanej „typizačnej schémy známeho membránového antigénu“ CMAT, ktoré bolo použité na objasnenie štruktúry klonovej populácie kmeňov Borrelia lymskej choroby. Z toho istého dôvodu je možné vybrať najvhodnejšie prostriedky OspC vakcíny buď a) na navrhnutie vakcín na ochranu proti kmeňom prevládajúcim v definovaných geografických oblastiach, alebo b) na špecifickú a preferenčnú ochranu proti klonom alebo klonovým klastrom B. burgdorferi súvisiacu s epidemiologicky dôležitým ochorením.
Na dosiahnutie tohto a ďalších predmetov bol získaný podľa jedného uskutočnenia tohto vynálezu imunogénny prostriedok, ktorý obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu v podstate vyčistených z každej z 20 bežne rozlišujúcich OspC skupín na obrázku 11, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali produkciu ochranných látok, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
Podľa ďalšieho uskutočnenia uvedený imunogénny prostriedok obsahuje jeden alebo viac, výhodne dva alebo viac OspC antigénov Borrelia, spôsobujúcich lymskú chorobu, z 20 bežne rozlišujúcich OspC skupín na obrázku 11 alebo OspC variant alebo OspC mimetík uvedených antigénov, ako je definované pod ad ii) a fyziologicky prijateľný nosič, ako je to tiež uvedené pod ad b).
Podľa ďalšieho uskutočnenia tohto vynálezu sa získa imunogénny prostriedok, ktorý obsahuje také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu v podstate vyčistených z každej OspC skupiny na obrázku 19 exprimovanej jedným alebo viacerými klonmi alebo klonovými klastrami súvisiacimi s ochorením ľudí (HDA) alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá jc dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali produkciu ochranných látok, a fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
Výhodným uskutočnením je uvedený imunogénny prostriedok, ktorý obsahuje jeden alebo viac, výhodne dva alebo viac OspC antigénov OspC skupiny podľa obrázku 19, alebo OspC varianty alebo OspC mimetiká, ako je uvedené pod ad ii), a fyziologicky prijateľný nosič, ako je uvedené pod ad b).
Vo výhodnom uskutočnení je imunogénny prostriedok podľa tohto vynálezu navrhnutý ako ochrana proti kmeňom Borrelia, spôsobujúcich lymskú chorobu, prevládajúcim v príslušnej zemepisnej oblasti, ako je Severná Amerika, Európa alebo Rakúsko. Ako výhodné uskutočnenie je nárokovaná kombinovaná OspA/OspC vakcína, ktorá je lepšia ako vakcína pripravená z ktoréhokoľvek antigénu samotného.
Tento vynález opisuje tiež rekombinantné spôsoby produkcie nových OspC antigénov spoločne s DNA sek venciami, expresnými vektormi a transformovanými hostiteľskými bunkami.
Ďalšie možnosti, vlastnosti a výhody tohto vynálezu budú zrejmé z nasledujúceho podrobného opisu. Je to potrebné chápať tak, že podrobný opis a špecifické príklady uskutočnenia, aj keď predstavujú výhodné uskutočnenia vynálezu, sú tu uvedené len ako ilustrácie, pretože odborníkom v oblasti techniky budú na základe tohto podrobného opisu zrejmé rôzne možné zmeny a modifikácie v rozsahu tohto vynálezu.
V nasledujúcej časti opisu sú stručne opísané obrázky. Obrázok 1 opisuje 77 kmeňov Borrelia, ktoré boli použité v pokusoch tohto výskumu. Je opísaná krajina pôvodu a biologický zdroj (t. j. človek, kliešť alebo zviera), z ktorého boli tieto kmene izolované. Je uvedený tiež klinický materiál, z ktorého boli získané ľudské izoláty, a príznak ochorenia (skratky: CSF znamená mozgovomicchový mok, ACA znamená akrodermatitída chronická atrofická, EM znamená erytéma migrujúca). Sú tu uvedené taktiež vlastnosti 5 ďalších kmeňov, ktoré neboli experimentálne študované, pretože v niektorých analýzach boli použité publikované informácie týkajúce sa týchto kmeňov.
Obrázok 2 uvádza zoznam adries všetkých dodávateľov kmeňov. Obrázok 3 uvádza zoznam monoklonálnych protilátok a ich antigénové špecifiká. Je označený tiež homológny reagujúci kmeň a izotyp monoklonálnej protilátky.
Obrázok 4 uvádza jednotlivé skóre a reprezentatívne kmene každého CMAT vyriešeného CMAT typizačnou schémou.
Obrázok 5 ukazuje dendrogram klastrovej analýzy uskutočnený s CMAT typizačnými údajmi. Je uvedená taktiež frekvencia výskytu CMAT medzi testovanými kmeňmi, ako je zoskupenie jednotlivých CMAT klastrov (všetky CMAT s väčšou ako 50 % podobnosti) a CMAT podskupín (všetky CMAT s väčšou ako 20 % podobností).
Obrázok 6 ukazuje reakčnú zostavu panelulô OspC-špecifických monoklonálnych protilátok s kmeňmi rôznych sérovaných typov.
Obrázok 7 ukazuje veľkosti reštrikčných fragmentov získaných PCR amplifikáciou OspC génov (pripravených ako je uvedené v príklade 4) rozštiepených enzýmami Dpnll, Ddel a Dral. Sú tiež uvedené údaje, ktoré opisujú 35 jedinečných zostáv reštrikčných fragmentov (t. j. 35 OspC RFLP typov) identifikovaných analýzou údajov reštrikčných fragmentov z 82 kmeňov uvedených v zozname typov kmeňov vybraných ako reprezentantov každého z OspC RFLP typu.
Obrázok 8 ukazuje priradené čiastočné nukleotidové sekvencie 24 OspC génov vybraných z kmeňov patriacich OspC RFLP typov 1 až 24 na obrázku 1.
Obrázok 8a ukazuje úplné sekvencie nových OspC génov podľa obrázku 8 vrátane 3' konca. Obrázok 8a taktiež obsahuje sekvencie OspC génov kmeňov H13 a 28691.
Obrázok 9 ukazuje priradené čiastočné aminokyselinové sekvencie odvodené z nukleotidových sekvencií podľa obrázku 8. Oblasť, ktorá bola sekvenovaná, zodpovedá prvým 92 % maturovaného OspC proteínu.
Obrázok 9a ukazuje úplné aminokyselinové sekvencie nových OspC antigénov podľa obrázku 9 vrátane C-konca. Obrázok 9a obsahuje tiež sekvencie OspC antigénov kmeňov H13 a 28691.
Obrázok 10 znázorňuje dendrogram sekvenčných údajov OspC proteínu podľa obrázku 9 ukazujúci fylogenetický vzájomný vzťah medzi sekvenciami a stupňom identity sekvencie. Táto analýza bola použitá na zarade nie OspC proteinov do OspC skupín. Prvky OspC skupiny obsahujú príbuzné OspC sekvencie s väčšou ako 80 identitou. Je tiež uvedené, že OspC proteíny sa zhlukujú (kastrujú) druhovo špecifickým spôsobom, čo poukazuje na to, že OspC proteín sa dedične klonuje.
Obrázok 11 je zoznamom 20 OspC skupín a uvádza kmene vybrané ako predstaviteľov týchto skupín.
Obrázok 12 súhrnne uvádza výsledky CMAT a OspC typizačných analýz 82 kmeňov z obrázku 1. Tieto údaje sú zoradené podľa OspC skupiny a RFLP-typu, aby znázornili výskyt frekvencie, s ktorou kmene patria do príslušnej OspC skupiny. Kmene, ktorc neboli priradené k OspC skupine, sú označené 99. Sú uvedené biologické a zemepisné pôvody týchto kmeňov, aby sa umožnilo porovnanie týchto parametrov s OspC skupinou. Hodnoty CMAT boli priradené 5 kmeňom, pre ktoré bol publikovaný opis, ale ktoré neboli testované (t. j. kmene B. burgdorferi, B. afzelii a B. garanii odpovedajú CMAT 1, 3 a
4). OspC sérovary neboli priradené všetkým kmeňom; 5 kmeňov bolo nedostupných (NA), ďalšie neboli testované (NT), pretože exprimujú nedostatočné množstvá OspC na spoľahlivú typizáciu, a niektoré boli testované, ale boli nereaktívne (NR) s panelom monoklonálnych protilátok.
Obrázok 13 uvádza zoznam sekvencií mapovaných OspC epitopov spolu s frekvenciami ich výskytu medzi analyzovanými kmeňmi. Na konci tabuľky sú monoklony zoradené do kategórií podľa frekvencie, s ktorou reagujú so 77 kmeňmi v tejto štúdii.
Obrázok 14 ukazuje mapu generalizovaného OspC proteínu označujúceho umiestnenie epitopov mnohých BBM monoklonálnych protilátok označených ich číslami.
Obrázok 15 ukazuje výsledky pokusov aktívnej imunizácie použitím modelu gerbil. Skupiny zvierat boli imunizované vyčistenými variantmi OspC proteinov buď rovnakých (H7) alebo rôznych OspC skupín (ZS7, PKO a W) na vybraný kmeň Orth. Výsledky ukazujú, že existuje silná skrížená ochrana, ak sa imunizuje variantom rovnakej skupiny, ktorá je exprimovaná vybraným kmeňom, a tiež že existuje malá alebo žiadna ochrana, ak sa imunizuje OspC variantom inej OspC skupiny na vybraný kmeň.
Obrázok 16 zhrňuje informácie o OspC typizácii a distribúcii ľudských izolátov medzi rôznymi OspC typmi. Je uvedená tiež špecifickosť a prevaha OspC protilátok prítomných v ľudskom sére pri lymskej chorobe z Českej republiky. Špecifickosť OspC protilátky bola definovaná testovaním na panel 18 rôznych kmeňov Borrelia reprezentujúcich 16 OspC skupín.
Obrázok 17 ukazuje kvasinkový expresný vektor pPC-PP4 s OspC kódujúci sekvenciu pod transkripčnou kontrolou metanolom indukovateľného AOX-1 promótora.
Obrázok 18 ukazuje výsledky pokusov aktívnej imunizácie použitím modelu gerbil. Zvieratá boli imunizované vyčisteným OspC proteínom odvodeným od kmeňa Orth B. burgdorferi a rekombinantne produkovanom v P. pastoris GS115/pPC-PP4. Výsledky ukazujú na silnú ochranu OspC proteínom odvodeným od Borrelia i od kvasiniek.
Obrázok 19 ukazuje príklady prostriedkov OspC vakcíny navrhnutých ako ochrana proti klonom alebo klonovým klastrom Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu súvisiacich so špecifickým ochorením ľudí.
V ďalšej časti opisu je podrobne opísaný tento vynález. Pomocou sérovaru, polymorfle dĺžky reštrikčného fragmentu (RFLP) a sekvenčnej analýzy opísaných podrobnejšie, bolo zistené, že napriek vysokému stupňu heterogenity OspC proteínu v rôznych izolátoch lymskej choroby, sa OspC proteíny môžu zostaviť do obmedzeného počtu skupín na základe, okrem iného, podobnosti v sekvencii aminokyselín. Závery tohto zistenia sú podľa tohto vynálezu realizované navrhnutím vakcínových prostriedkov, ktoré vzhľadom na rôzne kmene dávajú vysokú úroveň skríženej ochrany, ktorá predtým nebola dosiahnutá.
Aby sa získala takáto skrížená ochrana, musí existovať schopnosť predpovedať efektívnosť zložiek príslušnej vakcíny pri ochrane proti všetkým možným kmeňom spôsobujúcich ochorenie. Podľa tohto vynálezu sa tento problém rieši tým, že heterogenita zložiek ochranných antigénov vo vakcíne odráža heterogenitu nachádzajúcu sa v prírode. Najmä potom v OspC proteíne sa toho dosiahne prípravou vakcín, ktorc obsahujú predstavitelia všetkých OspC skupín zistených tu opísanou sekvenčnou analýzou. Príkladom takéhoto prostriedku je, že do vakcíny sa pridá 20 OspC proteínov, ktoré sú reprezentantmi všetkých uvedených OspC skupín. OspC skupina je definovaná sama osebe skupina OspC proteínov, ktorá má väčšiu ako 80 % identitu v sekvencii aminokyselín oproti 92 % identite maturovaného OspC proteínu, t. j. okrem informácií pre leader sekvenciu 18 aminokyselín a koncovú sekvenciu 16 aminokyselín, ako je uvedené na obrázkoch 9, 9a a 10.
Tento vynález sa týka teda imunogénneho prostriedku obsahujúceho jeden alebo viac OspC antigénov v podstate vyčistených z každej z 20 OspC skupín, ktoré prvýkrát opísali autori tohto vynálezu. Použitie napríklad 20 antigénov je zlepšením oproti perspektíve zahrnutia všetkých možných OspC variantov nájdených v prírode (pozri 35 tu opísaných OspC RFLP typov). Podľa iného aspektu tohto vynálezu sa prostriedok vakcíny lymskej choroby ďalej zjednoduší obmedzením počtu antigénnych zložiek takým spôsobom, ktorý neznižuje ochrannú účinnosť vakcíny, spojenou aplikáciou OspC typizačných údajov a epidemiologických údajov. Príkladmi tohto postupu, ako sú podrobnejšie opísané, sú
a) návrh vakcínových prostriedkov na použitie v príslušnej zemepisnej oblasti, ako je Severná Amerika a Európa, alebo v príslušnej krajine, akou je Rakúsko a
b) návrh vakcíny, ktorá je určená ako špecifická ochrana len proti tým klonom, identifikovaných CMAT analýzou, ktoré súvisia s ochorením ľudí.
V jednom uskutočnení podľa ad a) je pripravená vakcína na použitie v Severnej Amerike a obsahuje antigény, ktoré sú predstavované len tými OspC skupinami, ktoré boli pozorované v amerických kmeňoch, najmä v skupine 2 a 3 (pozri obrázok 12).
Podľa iného uskutočnenia sa pripravuje vakcína na použitie v Severnej Amerike, ktorá obsahuje kmene zo skupín 2, 3, 18 a 20. Na identifikáciu klonov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu bola CMAT analýzou uskutočnená štruktúrna analýza populácie. „CMAT (typ)“ je definovaný ako jedinečný deväťmiestny výsledok pochádzajúci z kombinovaného skóre variantov molekulových hmotností deviatich detegovaných známych membránových antigénov, v niektorých prípadoch rôzne rozlíšiteľných daným radom monoklonálnych protilátok špecifických pre tieto antigény. „CMAT klaster“ je skupinou príbuznou CMAT (typov) s aspoň 50 % podobnosťou v ich CMAT výsledku. „CMAT skupina“ sa tu používa na označenie skupiny CMAT typov, ktoré majú viac ako 20 % podobnosť v ich CMAT výsledku. CMAT skupina môže teda obsahovať niekoľko CMAT klastrov, ktoré ďalej môžu obsahovať niekoľko CMAT typov.
„Kloň“ je definovaný ako CMAT typ obsahujúci viac ako jeden kmeň alebo inak, kloň znamená skupinu kmeňov, ktoré majú rovnaký CMAT typ a sú teda považované za pochádzajúce zo všeobecného dedičného kmeňa. „Klonový klaster“ je skupinou príbuzných klonov na úrovni CMAT klastra (t. j. taká, že jej CMAT typy majú väčšiu ako 50 % podobnosť). „Kloň súvisiaci s ochorením človeka“ je taký kloň, o ktorom je možné na základe epidemiologických a klinických údajov uviesť, že často súvisí s ochorením človeka. Podobne „klonový klaster súvisiaci s ochorením človeka“ je taký klonový klaster, o ktorom je možné na základe epidemiologických a klinických údajov uviesť, že často súvisí s ochorením človeka. V uskutočnení podľa ad b) sa teda pripravuje OspC vakcína proti CMAT klonom 1.2.4 a 3.2.13 a klonovým klastrom 4.2.17, 4.2.18, 4.2.20 a 4.2.22, ktoré súvisia s ochorením človeka.
O OspC je známe, že je vhodným imunogénnom na vyvolanie ochrannej imunitnej odpovede vo zvieracích modeloch lymskej choroby, ak vybraným organizmom je rovnaký izolát lymskej choroby, z ktorého je odvodený OspC. Ale vďaka sérologickej heterogenite OspC proteínov medzi kmeňmi Borrelia lymskej choroby sa predpokladalo, že imunizácia OspC z jedného kmeňa nemusí chrániť proti infekcii širokým rozpätím izolátov Borrelia lymskej choroby. Bola zistená potreba vyhodnotiť tento predpoklad založený na štúdiách skríženej ochrany (príklad 6). Na základe týchto štúdií je zrejmé, že vakcína založená na OspC by mala obsahovať niekoľko serologicky rozdielnych foriem OspC. Predpokladom prostriedku takejto násobnej OspC vakcíny je znalosť stupňa rozdielnosti rôznych foriem OspC a toho, ako spolu tieto rozdielne formy súvisia. Táto informácia sa potom aplikuje podľa tohto vynálezu pri vývoji nových vakcínových prostriedkov proti lymskej chorobe, ktorú spôsobuje Borrelia.
Prvým stupňom, ktorý vedie na získanie potrebnej informácie, bol vývoj typizačného systému založeného na monoklonálnej protilátke (príklad 1) na charakterizovanie OspC proteínov z rôznych kmeňov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu. Aby sa zistilo, že sa bude analyzovať najširšie rozpätie OspC proteínov, bol študovaný veľký počet kmeňov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu (t. j. bolo vybratých 62 z 82 kmeňov uvedených na obrázku 1 ako produkujúcich dostatočné množstvo OspC, čo umožňuje rozumnú charakterizáciu) z rozmanitých zemepisných miest a izolovaných z ľudí (napríklad pokožky, mozgovomiechovej kvapaliny a krvi), zvierat a kliešťov. Iným kľúčovým aspektom tejto analýzy bolo použitie veľkého počtu monoklonálnych protilátok špecifických na OspC (uvedené v príklade 25), ktoré boli produkované nielen na jeden OspC proteín, ale na šesť rôznych OspC proteínov, čím sa zvyšuje rozmanitosť OspC epitopov schopných byť rozlíšených a teda zvyšuje sa účinnosť rozlišovať rôzne OspC proteíny. Údaje získané touto analýzou jasne ukázali, že existuje veľký stupeň sérologickej homogenity medzi OspC proteínmi z rôznych zdrojov. Príkladmi týchto reakčných zoskupení 16 rôznych typov, alebo sérovarov, OspC, ktoré boli identifikované v zbierke 13 monoklonálnych protilátok, sú uvedené na obrázku 6. 12 kmeňov bolo netypizovateľných, pretože nereagovali so žiadnou z monoklonálnych protilátok.
Aj keď typizácia OspC serologickými prostriedkami bola vysoko efektívna, nebola však úplná, pretože vyža
SK 279968 Β6 duje jednak, aby OspC bol exprimovaný ako hlavný proteín a jednak, že je dostupný rad protilátok so širokým rozpätím špecifikácie. Z výsledkov serovarovej analýzy bolo jasné, že úplné spektrum antigénovej rozmanitosti nebolo detegované použitými monoklonálnymi protilátkami, aj keď boli vybrané tak, aby sa tento problém minimalizoval. Heterogenita OspC bola preto ďalej študovaná analyzovaním polymorfie dĺžok reštrikčných fragmentov (RFLP), ku ktorej dochádza v OspC géne (príklad 3). Analýza údajov 82 kmeňov (t. j. experimentálne údaje zo všetkých 77 kmeňov v našej zbierke kultúr a informácie odvodené z 5 publikovaných OspC sekvencií -
- pozri obrázok 1) odhalili prítomnosť 35 rôznych RFLP OspC typov. Aj keď tento spôsob deteguje viac variácií, ako je zrejmé zo serovarového typizovania, medzi výsledkami získanými týmito dvoma spôsobmi existuje mimoriadne dobrá zhoda (obrázok 12).
Klasifikácia kmeňov Borrelia na serovary a RFLP-typy podľa ich OspC proteínu alebo génu umožňuje podľa tohto vynálezu zvoliť na podrobnejšiu charakterizáciu obmedzený počet OspC variantov, ktoré sú reprezentatívne na populáciu ako celok. Bol teda vybraný panel 29 kmeňov obsahujúci jeden alebo viac predstaviteľov každého z najčastejšie prítomných OspC typov. OspC gén bol amplifikovaný PCR a bola stanovená nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia (pozri príklad 4). Aminokyselinová sekvencia maturovaného OspC proteínu (od cysteínu 19 ; pozri US patentová prihláška č. 07/903 589, uvedená ako odkaz) bez posledných 16 aminokyselín bola použitá na stanovenie vzájomného vzťahu medzi OspC proteínmi rôznych OspC serovarov/RFLP-typov.
Ako ďalšia kontrola platnosti typizačných systémov a na zistenie, či existuje ďalšia heterogenita v danom OspC type, bol skúmaný vzájomný vzťah medzi blízko príbuznými OspC proteínmi od rovnakého OspC typu. Nukleotidová a odvodená aminokyselinová sekvencia OspC proteínov z 24 kmeňov sú uvedené na obrázkoch 8 a 9 (t. j. 22 sekvencií z tejto štúdie a 2 publikované sekvencie pre kmene 2591 a PBI). Dendrogram ukazujúci fylogenetický vzájomný vzťah medzi OspC proteínom jc uvedený na obrázku 10.
Imunogén založený na OspC antigéne podľa tohto vynálezu obsahuje zmes rôznych serologických foriem prirodzene sa vyskytujúceho OspC proteínu. V inom uskutočnení podľa vynálezu imunogenný prostriedok obsahuje OspC varianty alebo OspC mimetiká OspC antigénov. Okrem OspC proteínu získaného z buniek Bomba lymskej choroby, ako je uvedené, sa teda môžu používať rekombinantné OspC varianty prirodzene sa vyskytujúcej molekuly („OspC varianty“) a „mimetiká“ -
- zlúčeniny, ktoré majú mimotopy a ktoré napodobňujú OspC epitopy.
Do kategórie OspC variantov patria napríklad oligopeptidy a polypeptidy zodpovedajúce imunogénnym častiam OspC molekuly a akejkoľvek neproteínovej imunogénnej časti OspC molekuly. Variant je teda chápaný tak, že zahrnuje polypeptid, ktorý je homológny s prírodným OspC molekulou a zachováva si nápadné imunologické vlastnosti prírodnej OspC molekuly. V tomto zmysle „homológia“ medzi dvoma sekvenciami zahrnuje podobnosť krátkej identity indukujúcej odvodenie prvej sekvencie od druhej. Napríklad polypeptid je „homológny“ s OspC vtedy, ak obsahuje aminokyselinovú sekvenciu, ktorá zodpovedá epitopu rozlíšenému OspC špecifickými protilátkami alebo T-bunkami. Takáto sekvencia môže byť dlhá len s niekoľkými aminokyselinami a mô že byť lineárnou determinantou alebo sekvenciou, ktorá vznikne vtedy, ak aminokyseliny z oddelených častí lineárnej sekvencie sú priestorovo postavené vedľa seba za proteínovým vinutím alebo vtedy, ak sú podrobené modifikácii kovalentnej väzby. Aminokyselinové sekvencie, ktoré sú antigénnymi determinantmi na účely podľa tohto vynálezu, môžu byť stanovené napríklad technikou analýzy monoklonálneho mapovania, ktoré je odborníkom v oblasti techniky známe, pozri Regenmortel: Immunology Today 10, 266 (1989) a Berzofsky a kol.: Immunological Reviews 98, 9 (1987). Napríklad podľa tohto vynálezu OspC antigén obsahuje jednu alebo viac z nasledujúcich sekvencií aminokyselín (obrázok 13):
1) VKLSESVASLSKAA,
2) TDNDSKEAILKTNGT,
3) KELTSPVVAETPKKP,
4) FVLAVKEVETL,
5) YAISTLITEKLKAL,
6) PNLTEISKKITDSNA,
7) ASANSVKELTSPVV,
8) SPVVAETPKKP,
9) GKKIQQNNGLGA a
10) SPWAESPKK, alebo varianty, alebo mimetiká uvedených sekvencií epitopov. Vo výhodnom uskutočnení by vakcína obsahovala peptidy zodpovedajúce serotypovo špecifickým epitopom vybraným z jedného alebo z viacerých tu opísaných OspC proteínov z OspC skupín. Štúdie skríženej ochrany (príklad 6) ukazujú, že ochranná imunita je serotypovo indukovaná špecifickými epitopmi. Príkladom serotypového špecifického epitopu je sekvencia číslo 2 z kmeňa Orth, ktorá je rozlišovaná monoklonálnymi protilátkami BBM38 a BBM39, ktoré sú špecifické pre OspC proteíny z OspC skupiny 5 (serovar 4). Tento epitop zodpovedá predpokladanému epitopu (DNDSKE) predpovedanému z analýzy hydrofilnosti Orth OspC. Je možné predpokladať, že potenciálne serotypovo špecifické epitopy sa vyskytujú medzi aminokyselinovými zvyškami 120 až 155 (začínajúc od prvého cysteínového zvyšku) v OspC proteínoch z iných OspC skupín (príklad 4). Takáto vakcína môže obsahovať varianty alebo mimetiká peptidových sekvencií, ako je to ďalej opísané. Testovanie podobnosti tohto typu je možné uskutočňovať tiež štúdiom kompetitívnej inhibície v prípade protilátok alebo proliferáciou T-bunkami.
Polypeptidy, ktoré sa kvalifikujú ako OspC varianty podľa týchto kritérií, sa môžu pripravovať podľa tohto vynálezu konvenčnými reverznými genetickými spôsobmi, t. j. navrhnutím genetickej sekvencie založenej na aminokyselinovej sekvencií, alebo konvenčnými genetickými strihovými spôsobmi. Napríklad OspC varianty sa môžu produkovať technikami, ktoré zahrnujú miestne riadenú mutagenézu alebo oligonukleotidom riadenú mutagenézu, pozri napríklad „Mutagenesis of Cloned DNA“ v Current Protocols in Molecular Biology“ 8.0.3 a nasl. (Ausubel a koľ, re., 1989) („Ausubel“).
Inými OspC variantmi v tomto vynáleze sú molekuly, ktoré zodpovedajú časti OspC, alebo ktoré obsahujú časť OspC, ale nesúhlasia s prírodnou molekulou a ktoré majú imunogénnu aktivitu OspC vtedy, ak sú prítomné samotné, alebo ak sú napojené na nosič. OspC variant tohto druhu by mohol byť reprezentovaný skutočným fragmentom prirodzenej molekuly, alebo by mohol byť polypeptidom, ktorý je syntetizovaný de novo alebo rekombinantne.
Na použitie v rekombinantnej expresii OspC alebo OspC variantu by polypeptidová molekula kódujúca ta kúto molekulu výhodne obsahovala sekvenciu nukleotidov zodpovedajúcu požadovanej aminokyselinovej sekvencii, ktorá je optimalizovaná pre zvoleného hostiteľa, pokiaľ ide o použitý kodon, iniciáciu translácie a expresiu komerčne vhodného množstva OspC alebo požadovaného OspC variantu. Vektor vybraný na transformovanie zvoleného hostiteľského organizmu takouto polynukleotidovou molekulou by mal tiež umožňovať účinné zachovanie a transkripciu sekvencie kódujúcej polypeptid. Kódujúca polypeptidová molekula môže kódovať chimémy proteín, to znamená, že môže mať nukleotidovú sekvenciu kódujúcu imunologickú časť OspC molekuly odštiepiteľne napojenú na kódujúcu sekvenciu ne-OspC časti, akou je signálny peptid pre hostiteľskú bunku.
Na izolovanie DNA segmentu, ktorý kóduje OspC molekulu, sa podľa publikovaných spôsobov pripraví celková DNA Borrelie spôsobujúca lymskú chorobu, pozri napríklad Maniatis a kol.: Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratories, NY 1982) a Baess: Acta Pathol. Microbiol. Scand. (Sect. B) 82, 780 (1974). Takto získaná DNA sa môže čiastočne rozštiepiť reštrikčným enzýmom. Získa sa viac-menej náhodná zostava genómových fragmentov. Na tento účel je vhodný enzým s tetranukleotidovým rozlišovacím miestom, akým je Sau3A (Mbol). Fragmenty z tohto čiastočného štiepenia sa potom môžu frakcionovať podľa veľkosti, napríklad odstreďovaním sacharózovým stupňom, (pozri Maniatis) alebo elektroforézou na géle s pulzujúcim polom, pozri Anál. Trends in Genetics (november 1986), str. 278. Získajú sa tak fragmenty s dĺžkou, ktorá je porovnateľná s DNA kódujúcou OspC molekulu.
Podľa dobre známych opísaných spôsobov, napríklad v Ausubelovi na 5.0.1 a nasl., môžu byť vybrané fragmenty klonované do vhodného klonovacieho vektora. Takto získaná DNA by sa potom mohla vložiť napríklad do miesta BamHI klonovacieho vektora puC18. Chimérne plazmidy alebo fág, okrem iného, produkované napojením fragmentov vybraných veľkostí na klonovací vektor, sa potom môžu transformovať do E. coli alebo do iných hostiteľských buniek, kde sú testované na expresiu kódovaného proteínu. Na prehľadávanie knižníc sa môžu použiť rozličné spôsoby, ktorými sa identifikuje kloň obsahujúci OspC gén. Medzi tieto spôsoby patrí hybridizačné prehľadávanie sondou špecifickou pre OspC, akou je oligonukleotidová sonda, alebo vyhľadávanie expresie OspC antigénu pomocou imunologického činidla špecifického pre OspC. Posledné je možné uskutočňovať imunoblotovaním knižnice anti-OspC monoklonálnymi protilátkami alebo špecifickou polyklonálnou protilátkou pripravenou zo živočíchov imunizovaných vyčisteným OspC. Sotva je raz kloň obsahujúci DNA kódujúci OspC v knižnici identifikovaný, môže sa izolovať DNA, úplne charakterizovať oblasť kódujúca OspC proteín (ako je sekvenovanie) a následne je možné DNA použiť na prípravu OspC expresných vektorov vhodných na prípravu OspC-aktívneho proteínu.
Ako bolo uvedené, na získanie efektívneho imunogénu by mala byť štruktúra rekombinantne exprimovaného pC proteínu dostatočne podobná štruktúre prírodného (nedenaturovaného) OspC, aby proteín indukoval produkciu ochranných protilátok. Je výhodné exprimovať DNA kódujúcu OspC tak, že nenastane intracelulárna proteolýza a agregácia expresného produktu v denaturovanej forme. Jedným zo spôsobov, ako zabrániť tomuto problému je rekombinantne produkovať pC v systéme hostiteľ-vektor, ktorý poskytuje sekréciu pC z hostiteľskej bunky, výhodne priamo do kultivačného média.
Jedným takýmto systémom je Bacillus subtilis. Je možné skonštruovať vhodný sekrečný vektor pre B. subtilis naviazaním signálnej sekvencie B. amyloliguefaciens -amylázy, pozri Young a kol.: Nucleic Acid Res. 11,237 (1983), na Bacillus plazmidový vektor pUBl 10, ako to opísal Ulmanen a kol.: J. Bacteriol. 162, 176 (1985). Podľa tohto prístupu sa sekvencia kódujúca cudzí proteín klonuje v smere vlákna promótora a ribozómového väzbového miesta a signálnej -amylázy. Transkripcia a translácia OspC je pod kontrolou -amylázového promótora translačného postupu tejto konštrukcie. Sekrécia pC z hostiteľskej bunky sa dosiahne -amylázovou signálnou sekvenciou. Tento vynález zahrnuje expresné vektory, ktoré sú funkčné v prokaryotoch rovnako ako v eukaryotoch. Boli opísané podobné vektory na použitie v kvasinkách. Týmito vektormi je možné dosiahnuť expresnú sekréciu OspC v kvasinkách. Vhodný expresný vektor je možné skonštruovať naviazaním sekvencie kódujúcej OspC na indukovateľný promótor v kvasinkovom replikačnom plazmide. Podľa tohto prístupu sa sekvencia kódujúca cudzí proteín klonuje v smere vlákna, napr. AOX1 promótora. Transkripciu a transláciu je možné indukovať pridaním metanolu ku kultivačnému médiu. Je možné získať buď intracelulámu expresiu, alebo sekréciu cudzieho proteínu (naviazaním signálnej sekvencie na kódujúcu sekvenciu maturovaného proteínu). Výhodným kvasinkovým kmeňom je Pichia pastoris. V kvasinkách, najmä P. pastoris, boli získané vysoké výťažky expresných produktov.
Iným spôsobom exprimovania OspC v systéme hostiteľ-vektor, ktorý sa vyhýba proteolýze, agregácii a denaturácii, je použitie vírusu vakcínie ako vektora schopného expresie v rozličných hostiteľských bunkách cicavcov citlivých na infekciu vakcínii. Tento prístup by vyžadoval prípravu rekombinantného vektora odvodeného od vírusu vakcínie, v ktorom je pC gén umiestnený pod kontrolu promótora, spolu so signálmi translácie a sekrécie vhodných na exprimovanie OspC proteínu u hostiteľa infikovaného vakcíniou, pozri US patent č. 4 603 112, ktorého obsah je tu zahrnutý ako odkaz, tento plazmid by obsahoval tiež 5’ k oblastiam kontroly transkripcie a 3' k 3' signálom terminácie a polyadenylácie, obklopujúcej sekvencie, ktoré prispievajú na homológnu rekombináciu v genóme vakcínie divokého typu. Ak sa do hostiteľskej bunky infikovanej vakcíniou zavedie konštrukcia tohto druhu, obklopujúce sekvencie riadia rekombináciu medzi plazmidovým vektorom a vírusom vakcínie tak, že klonovaná štruktúrna sekvencia (tu kódujúca OspC) sa stáva jej súčasťou, množí sa a je exprimovaná vírusom vakcínie. Oblasť medzi obklopujúcimi sekvenciami výhodne obsahuje tiež taký selektovateľný marker, že v prítomnosti selekčného média prežijú len tie bunky, ktoré obsahujú rekombinovaný vírus vakcínie (a v tejto súvislosti sekvenciu kódujúcu polypeptid s aktívnym OspC).
Rekombinantný vírus vakcínie produkovaný týmto spôsobom je možné použiť na infikovanie buniek cicavcov, akými sú bunky Vero, alebo bunky CVI, ktoré sú vhodné na fermentačný rast s vysokou hustotou. OspC-aktívny proteín exprimovaný v týchto bunkách počas fermentácie by mal byť sekretovaný do fermentačného média, z ktorého by bol vyčistený známymi spôsobmi.
Okrem prírodného OspC a OspC variantu zahrnuje tento vynález zlúčeniny („mimetiká“), ktoré napodobňujú OspC epitopy („mimotopy“). Jedným z príkladov mimetiká je anti-idiotypová protilátka, t. j. protilátka, ktorá je produkovaná imunizovaním živočícha protilátkou, ktorá sa špecificky viaže na epitop na antigéne, An tiidiotypová protilátka rozlišuje a zodpovedá spojenému miestu na prvej protilátke. Tvar tohto miesta spojenia preto veľmi pripomína epitop, ktorý spadne do spojovacieho miesta prvej protilátky. Pretože antiidiotypová protilátka má miesto spojenia, ktorého tvar napodobňuje pôvodný antigén, môže byť používaná ako vakcína na vznik protilátok, ktoré reagujú s pôvodným antigénom, pozri Fineberg a Ertl: CRC Critical Reviews in Immunology 7, 269 (1987). Príslušné mimetiká je možné identifikovať testovaním pomocou OspC protilátky, ktorá deteguje, ktoré zlúčeniny sa na ňu viažu alebo by mohli byť produkované molekulárnym modelovaním, pozri Morgan a kol.: „Approaches to the Discovery of NonPeptide Ligands for Peptide Receptors and Peptidases“ v Annual Reports in Medicinal Chemistry (Academic Press 1989), str., 243 a ďalšie.
Vakcína podľa tohto vynálezu je určená na imunizáciu živočícha vrátane človeka, ktorý na ňu reaguje, proti lymskej chorobe. Pojem „imunogén“ znamená antigén, ktorý vyvoláva špecifickú imunitnú odpoveď smerujúcu na humorálnu alebo bunkami sprostredkovanú imunitu, v tomto prípade na infekciu Borrelií. „Imunita“ teda znamená schopnosť jednotlivca ľahšie odolávať alebo prekonávať infekciu v porovnaní s jednotlivcami, ktorí nie sú imunizovaní, alebo znášať infekciu bez toho, aby boli klinicky ovplyvnení.
Imunogén podľa tohto vynálezu môže ďalej obsahovať prijateľný fyziologický nosič. Takéto nosiče sú veľmi dobre známe z doterajšieho stavu techniky. Patria medzi nich makromolekuláme nosiče. Príkladom vhodného nosiča pre cicavcov je tuberkulínový PPD, hovädzí sérový albumín, ovoalbumín alebo KLC (kezyholc limpet hemocuanin). Nosič by mal byť výhodne netoxický a nealergický.
Imunogén môže ďalej obsahovať pomocné činidlo, akým je hlinitá zlúčenina, voda, emulzia rastlinných alebo minerálnych olejov (napr. Freundov adjuvant), lipozómy, ISCOM (imunostimulačný komplex), vo vode nerozpustné sklá, polyanióny (akým je poly A:U, dextransulfát alebo lentinan), netoxické analógy lipopolysacharidov, muramyldipeptid a imunomodulačné zlúčeniny (napríklad interleukíny 1 a 2) alebo ich kombinácie. Výhodným pomocným činidlom je hydroxid hlinitý. Imunogenita môže byť zvýšená tiež u tých cicavcov, ktorí dostali živé oslabené bakteriálne vektory, ako je Salmonella alebo Mycobacteria, alebo vírusové vektory podobné vakcínii, ktoré exprimujú OspC aktívny polypeptid.
Spôsoby prípravy takýchto imunogénov sú dobre známe v danej oblasti techniky. Napríklad imunogén podľa tohto vynálezu môže byť lyofilizovaný na následnú rehydratáciu vo fyziologicky prijateľnom nosiči, akým je soľný alebo iný fyziologický roztok. V každom prípade sa vakcína podľa tohto vynálezu pripravuje zmiešaním imunologický efektívneho množstva OspC s nosičom v takom množstve, ktoré poskytuje požadovanú koncentráciu imunogénnej účinnej zložke vakcíny. Množstvo tejto zložky vo vakcíne bude závisieť od cicavca, ktorý je imunizovaný, pričom sa berie do úvahy vek a hmotnosť subjektu, rovnako ako imunogenita imunogénnej zložky prítomnej vo vakcíne. Vo väčšine prípadov bude množstvo imunogénnej zložky vakcíny v rozpätí od 1 do 100 g na antigén v dávke, výhodne od 10 do 50 g na antigén v dávke.
V ešte inom uskutočnení podľa vynálezu imunogenný prostriedok pozostáva z jedného alebo z viacerých OspC antigénov, OspC variantov, OspC mimetík alebo OspC antigénov v podstate vyčistených z každej OspC skupiny na obrázku 11 exprimovaných klonmi a klonovými klastrami súvisiacimi s ľudským ochorením, ako je to opísané v príklade 1.
Tento vynález teda podľa nárokov 1 až 3 zahrnuje imunogenné prostriedky OspC antigénov Borrelia lymskej choroby obsahujúce jeden alebo viac, výhodne dvoch alebo viac, OspC antigénov z 20 bežne rozlíšených OspC skupín, ako to dokumentuje obrázok 11, alebo jeden alebo viac OspC antigénov z každej z 20 bežne rozlíšených OspC skupín podľa obrázku 11. Okrem uvedených OspC antigénov môže táto kombinácia obsahovať OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, OspC variantov alebo OspC mimetik, ktoré majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC na indukovanie ochrany ochrannými protilátkami.
Obrázok 11 znázorňuje sekvenciu podstatných epitopov. Podľa tohto vynálezu sem patria OspC antigény, ktoré obsahujú jeden alebo viac takýchto epitopov. Tieto antigény alebo polypeptidy podľa tohto vynálezu teda obsahujú aspoň epitolovú sekvenciu, ktorá je uvedená na obrázku 13. Táto epitopová sekvencia môže byť taká krátka, ako je aminokyselinová sekvencia uvedená v zátvorkách na obrázku 13.
Ako ďalšie uskutočnenie tento vynález obsahuje tiež imunogénne prostriedky, ktoré obsahujú buď jeden alebo viac, výhodne dva alebo viac, OspC antigénov OspC skupín podľa obrázku 19 alebo jeden alebo viac antigénov z každej OspC skupiny podľa obrázku 19. Tieto imunogénne prostriedky sú obsiahnuté v patentových nárokoch 4 až 6.
V inom uskutočnení sa pripravuje imunogénny prostriedok na ochranu proti kmeňom Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu v príslušnej zemepisnej oblasti. Podľa jedného uskutočnenia sa pripravuje teda vakcína, ktorá výhodne chráni proti takým kmeňom Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu, ktorá sa najviac vyskytuje v Severnej Amerike. V inom uskutočnení sa pripravuje vakcína, ktorá výhodne chráni proti takým kmeňom Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu, ktorá sa najviac vyskytuje v Európe. V treťom uskutočnení sa pripravuje vakcína proti takým kmeňom Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu, ktoré sa najviac vyskytujú v Rakúsku. Vakcínové prostriedky pre každú z týchto zemepisných oblastí sú uvedené na obrázku 7.
Okrem OspC vakcínových prostriedkov sa uvažuje tiež o kombinovanej OspA/OspC vakcíne, pretože táto vakcína môže byť lepšia ako vakcína pripravená s každým antigénom samostatne z týchto dôvodov:
1. preto, že kmene Borrelia spôsobujúce lymskú chorobu nemusia vždy exprimovať jeden alebo druhý z týchto antigénov, ale vždy exprimujú buď OspA alebo OspC,
2. bolo opísané, že existuje nepriamoúmemá regulácia týchto dvoch antigénov, t. j. taká, že ak je expresia jedného znížená (napríklad ako odpoveď na imunitnú odpoveď), expresia druhého je zvýšená,
3. aspoň v in vitro štúdiách s OspA bolo dokázané, že môžu vznikať mutanty, ktoré unikajú vakcíne. Existuje teda problém, ktorý je možné obísť zahrnutím druhého antigénu do vakcíny, pretože dvojitá mutačná schopnosť v dvoch nezávislých antigénoch je nepravdepodobná,
4. imunitná odpoveď očkovaných na príslušný antigén nie je jednotná. Zahrnutím dvoch antigénov sa zvyšuje pravdepodobnosť, že jednotlivec, ktorý zle odpovedá buď na OspA alebo na OspC, by bol chránený vyvolaním ochrannej odpovede na iný antigén.
Nakoniec, očakáva sa, že by mohol existovať synergický efekt a že by sa vakcínou, ktorá obsahuje Osp A i OspC, mohla získať väčšia imunita.
Podľa jedného uskutočnenia by sa jeden alebo viac OspC proteínov z OspC skupín 1 až 20 mohlo skombinovať s jedným alebo s viacerými OspA proteínmi, keď sú exprimované Borrelia kmeňmi B31, Orth, H4 a KL11.
Podľa iného uskutočnenia kombinovaná OspA/OspC vakcína pre USA obsahuje OspC z OspC skupiny 2 a 3 spoločne s OspA exprimovaným kmeňmi B31. Podľa ďalšieho uskutočnenia kombinovaná OspA/OspC vakcína na použitie v Európe obsahuje 14 OspC z OspC skupín 2, 4 až 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15 až 17 a 19 spoločne s OspA exprimovaným kmeňmi B31, Orth, H4 a KL11. Podľa ďalšieho uskutočnenia kombinovaná OspA/OspC vakcína pre Rakúsko obsahuje OspC zo skupín 2, 4 až 7, 10,13 a 19.
Tento vynález opisuje tiež použitie kombinácie antigénov, ktoré sú obsiahnuté v uvedených imunogenných prostriedkoch, na výrobu vakcíny na liečenie alebo predchádzanie lymskej boreliózy cicavcov. Výhodným uskutočnením tejto vakcíny je vakcína pre človeka.
Spôsoby prípravy vakcín podľa tohto vynálezu sú navrhnuté tak, aby zabezpečili zachovanie identity a imunologického účinku špecifických molekúl a neobsahovali nežiaduce mikrobiologické znečistenia. Konečné produkty sa dodávajú a udržiavajú v aseptických podmienkach. Spôsob imunizácie cicavca proti lymskej chorobe spočíva v podávaní efektívneho množstva imunogénu tomuto cicavcovi. Podávanie sa môže uskutočňovať hociktorým spôsobom známym z doterajšieho stavu techniky. Medzi vhodné spôsoby podávania patrí napríklad podávanie uvedenej vakcíny cicavcom, u ktorých sa predpokladá, že budú napadnutí kliešťami nesúcimi Borrelia, spôsobujúceho lymskú chorobu, približne 6 mesiacov až 1 rok pred dobou predpokladaného styku s týmto kliešťom. Môže sa použiť akákoľvek imunizačná cesta, o ktorej sa predpokladá, že smeruje na vyvolanie príslušnej imunitnej odpovede podľa tohto vynálezu, aj keď výhodné je parenterálne podávanie. Medzi vhodné formy podávania patria subkutánne, intrakutánne alebo intramuskuláme injekcie alebo prostriedky vhodné na orálne, nazálne alebo rektálne podávanie.
Pojem „v podstate vyčistený“ znamená homogénny proteín, ktorý neobsahuje žiadne toxické zložky, čím sa znižuje pravdepodobnosť nepriaznivej reakcie. Pojem „homogénny“ v tejto súvislosti znamená, že aspoň 80 % (hmotn. k obj. dielom) proteinu znamená úplne celý a neporušený OspC a takmer celý zvyšok predstavuje rozkladné produkty OspC. Ak sú teda prítomné nečistoty ako zložky prostredia a ďalšie Borrelia proteíny, potom iba v stopových množstvách. Homogénny OspC môže pozostávať z viac ako jednej serologickej formy OspC.
Týmto spôsobom tento vynález umožňuje odstránenie nežiaducich, potencionálne imunogénnych proteínov, ktoré by mohli indukovať protilátky' a spôsobiť škodlivé autoimunné reakcie v imunizovanom cicavcovi. Uvedený spôsob čistenia zabezpečuje tiež reprodukovateľnosť prípravy vakcíny.
Výhodný spôsob čistenia zahrnuje nasledujúce stupne:
a) rozrušenie buniek Borrelia, ktoré spôsobujú lymskú chorobu, a frakcionáciu odstreďovania na „membránové“ a „cytoplazmové“ zložky,
b) extrakciu membránovej frakcie nedenaturujúcim detergentným činidlom a následné odstreďovanie za získa nia supematantu, ktorý obsahuje solubilizovaný proteín, pričom sa nerozpustný materiál odstráni ako peleta, a
c) frakcionácia solubilizovaného antigénu chromatografiou na iónexe (dietyalaminoetylový alebo „DEAE“) a eluovanie adsorbovaných antigénov gradientom chloridu sodného.
Spôsob čistenia môže zahrňovať zahusťovanie a ďalšie čistenie antigénov:
a) chromatografiou na hydroxylapatite, pričom adsorbované antigény sú eluované zvyšujúcim sa obsahom fosforečnanu v pufri, a/alebo
b) afinitnou chromatografiou na imobilizovanom kove, pričom adsorbované antigény sú eluované imidazolom.
Medzi ďalšie elučné spôsoby známe v oblasti techniky patrí elúcia znížením pH alebo zvyšujúcej sa koncentrácie chloridu amónneho, histidínu alebo inej látky s afinitou na chelátovaný kov.
Rozbitie buniek sa môže uskutočniť lyžovaním buniek tak, že sa vytrepávajú ako suspenzie v bunkovom mlyne s malými sklenenými perličkami, pôsobením ultrazvuku alebo vo francúzskom mlyne. Antigény sa môžu extrahovať tiež priamo z povrchu buniek mikroorganizmu tým, že sa na bunky pôsobí detergentným činidlom, zmenou iónovej sily bunkového prostredia alebo miernym posunutím teploty. Môže sa tiež použiť východiskový materiál obsiahnutý v záhyboch membrán, ktorý sa uvoľňuje z buniek.
Extrakcia membránovej frakcie sa uskutočňuje detergentným činidlom, ktoré má výhodne dobré solubilizačné vlastnosti, je nedenaturujúce a je zlučiteľné s chromatografiou na ionexe. Výhodným obojakým detergentným činidlom je detergentné činidlo 3-14 vyrábané Calbiochom, aj keď je možné použiť akékoľvek detergentné činidlo alebo organické rozpúšťadlo, ktoré má uvedené vlastnosti. Detergentné činidlo sa typicky používa v koncentrácii 1 % (hmotn. k obj. dielom). Je však možné ho používať v rozpätí od 0,01 do 10 % (hmotn. k obj. dielom). Extrakcia detergentným činidlom sa uskutočňuje pri teplote od 0 do 60 °C výhodne pri 37 °C, a mala by trvať od 10 minút do 8 hodín, výhodne 1 hodinu. Okrem detergentného činidla sa na zlepšenie procesu solubilizácie môžu používať cheotrópne činidlá, akým je močovina.
Antigény solubilizované detergentným činidlom sa potom frakcionujú DEAE-chromatografiou. Výhodne sa používa DEAE ionexová živica, môžu sa však používať iné anexové alebo katexové živice alebo ich kombinácie. Podľa tohto vynálezu ionexová živica obsahuje nerozpustnú matricu, na ktorú sa nakondenzujú nabité skupiny. Medzi funkčné skupiny, ktoré sa používajú v anexoch, patrí skupina aminoetylová (AE), dietylaminoetylová (DEAE) a kvartéma aminoetylová (QAE) skupina. Katexy môžu mať karboxymetylovú (CM), fosfo- alebo sulfopropylovú (SP) skupinu. Aj keď sa vzorky nanášajú na kolónu v tris-pufri obsahujúcom obojaké detergentné činidlo 3-14 (1 %) a antigény sa eluujú gradientom chloridu sodného, môžu byť rovnako účinné i iné prostriedky.
Antigény sa môžu zahusťovať naviazaním na hydroxylapatit spôsobmi známymi v doterajšom stave techniky. Iným alebo doplnkovým postupom, podľa ktorého sa antigény môžu ďalej zahusťovať alebo vyčistiť, je afinitná chromatografia na imobilizovanom kove. Tento spôsob je výhodný pre chromatografiu na hydroxylapatite pri čistení OspC, pretože sa dosiahne lepšie oddelenie OspC od OspB.
Výhoda uvedeného nedenaturujúceho čistiaceho postupu spočíva v tom, že sa zachováva trojrozmerná kon formácia proteínu, čím sa zachovávajú všetky kombinujúce miesta protilátky nachádzajúcej sa v prírodných proteínoch vrátane tých, ktoré fungujú pri ochrane. Ak je proteín denaturovaný, väzbové miesta môžu byť čiastočne alebo úplne zničené a kapacita antigénu indukovať protilátky proti antigénnym miestam bude potom zodpovedajúcim spôsobom znížená. Takto zmenené proteíny by boli potom nežiaduce na použitie vo vakcínach.
Tento vynález ďalej opisuje rekombinantný prostriedok nových OspC antigénov, ktoré sú znázornené na obrázku 9a. Tento vynález opisuje tiež nové DNA sekvencie kódujúce OspC antigény podľa obrázku 9a. Tieto DNA sekvencie sú uvedené na obrázku 8a. Vynález opisuje tiež tie DNA sekvencie, ktoré majú aspoň 80 % homológiu s akoukoľvek sekvenciou na obrázku 8a.
Vynález opisuje tiež rekombinantné expresné vektory v prokaryotických a eukaryotických hostiteľských bunkách, najmä expresné vektory použiteľné v kvasinkách, výhodne Pichia pastoris. Podľa výhodného uskutočnenia tohto vynálezu je expresný vektor indukovateľný metanolom.
Vynález opisuje nové OspC antigény akými sú i) antigény kódované hociktorou sekvenciou podľa obrázku 8a alebo ii) antigény, ktoré majú aspoň 80 % homológiu s ktoroukoľvek aminokyselinovou sekvenciou podľa obrázku 9a.
Vynález je podrobnejšie opísaný v nasledujúcich príkladoch uskutočnenia, ktoré sú ilustračné a v žiadnom prípade nie je potrebné ich chápať ako obmedzenie rozsahu tohto vynálezu.
Príklady uskutočnenia vynálezu
Príklad 1
CMAT typizovanie kmeňov Borrelia burgdorferi a klastrová analýza výsledkov, ktoré umožňujú objasnenie CMAT klastrov, CMAT skupín a klonov a klonových klastrov „súvisiacich s ochorením ľudí“.
Z viacerých zdrojov, ktorých zoznam je uvedený na obrázku 2, bolo získaných 77 kmeňov (pozri obrázok 1). Starostlivosť bola venovaná tomu, aby zbierka obsahovala kmene rôzneho zemepisného pôvodu a z viacerých najrôznejších epidemiologických a klinických prípadov.
Zo všetkých kmeňov boli pripravené membránové frakcie nasledujúcim spôsobom:
Bunky Borrelia spôsobujúce lymskú chorobu boli získané odstreďovaním (7 000 x G, 20 minút, teplota 4 °C), bunková peleta bola dvakrát premytá PBS obsahujúcom 5 mM MgCl2 a bola stanovená sušina buniek. Premyté bunky boli potom lyzované vytrepávanim zmesi v bunkovom mlyne Vibrogen (model VI4, Buhler). Trojminútové cykly vytrepávania s chladením (4 °C) boli opakované dovtedy, pokiaľ lyžovanie nebolo vyššie ako 99 %, podľa vyhodnotenia mikroskopicky v tmavom poli. Lyzát sa potom sfíltroval filtrom zo sintrovaného skla, aby sa odstránili sklenené perličky. Zadržané perličky sa premyli pufrom na zvýšenie výťažku bakteriálnych antigénov vo fíltráte. Lyzát sa potom odstreďoval 20 minút pri 7 500 x G pri teplote 4 °C. Bola získaná surová membránová frakcia označená ako membránová frakcia 2 alebo „lsp“ (peleta získaná pri nízkej rýchlosti) frakcia. Supematant sa ďalej odstreďoval 30 minút pri 100 000 x G pri teplote 40 °C. Takto sa získa čistejšia membránová frakcia označená ako membránová frakcia 1 alebo „hsp“ (peleta získaná pri vysokej rýchlosti). Obidve membránové frakcie sa dvakrát premyli 100 mM tris-HCl puf rom, pH 7,4 v pôvodných podmienkach odstreďovania). Membránová frakcia 2 sa použije na typizovanie, zatiaľ čo membránová frakcia 1 sa nechá na čistenie antigénu.
Membránové proteíny prítomné v membránových frakciách 2 každého kmeňa sa potom analyzovali SDS-PAGE, ako to opísal Laemml U. K.: Náture (London) 227, 680 (1970). Variácie v molekulovej hmotnosti boli stanovené porovnaním s elektroforetickou pohyblivosťou množstva štandardných proteínov zahrnujúcich rozsah molekulových hmotností plného spektra markerov membránových antigénov použitých v analýze.
Antigény sa prenesú na nitrocelulózový filter a identifikujú sa panelom monoklonálnych protilátok, napríklad spôsobmi imunoblotovania dobre známymi z oblasti techniky, pozri Ausubel a kol.: 2 Current Protocols in Molecular Biology 10.8.1 a nasl. (1992). Monoklonálne protilátky sa pripravujú dobre známou technológiou hybridómov, pozri Kohler a Millstein: Náture 256, 495 (1975). Vo výhodnom uskutočnení tohto vynálezu sa analyzujú kmene uvedené na obrázku 1. Všeobecne platí, že výber membránového antigénu na zahrnutie do analýzy je daný:
a) dostupnosťou monoklonálnych protilátok ich detegovať a rozlíšiť ich od početných iných antigénov prítomných v SDS-PAGE profiloch membránových antigénov bakteriálnych kmeňov,
b) antigénom, o ktorý ide, prítomným vo významnom podiele analyzovaných kmeňov, t. j. všeobecným antigénom,
c) skutočnosťou, že môže byť reprodukovateľné detegovaný vo viacerých, oddelene pripravených membránových frakciách rovnakého kmeňa, t. j. že neexistuje žiadny dôkaz na intra-kmeňovú variáciu príslušného antigénu,
d) skutočnosťou, že antigénový marker je stabilne exprimovaný v rovnakom izoláte po násobnej kultivácii a pasážovaní a po značnom čase skladovania (až dva roky) a
e) chýbajúcim dôkazom v publikovanej vedeckej literatúre o tom, že gény kódujúce markery sú extrachromozomálne dedené alebo že variácie antigénov boli pod špecifickým mechanizmom antigénovej variácie, ktorá smeruje k intra-kmeňovej variácii.
Obrázok 3 znázorňuje monoklonálne protilátky použité na identifikáciu 9 známych antigénov použitých v analýze (E90, E 59, E 43, Fía, E29, E22 antigény, kombinovaný antigén E18 + E20 a E10 antigén). Tieto antigény sú zoradené podľa molekulovej hmotnosti a v prípade, v ktorom existuje viac ako jedna monoklonálna proti látka, podľa ich nepatrne sa odlišujúcej reaktivity (napríklad E60 a E43) a podľa reakčnej zostavy antigénu s monoklonálnymi protilátkami.
Obrázok 4 uvádza zoznam všetkých jedinečných kombinácií 9 zistených výsledkov analyzovaných kmeňov, ktoré sú reprezentované deväťmiestnym číslom. Toto deväťmiestne číslo je považované za známy typ membránového antigénu (CMAT) tohto kmeňa. Na stanovenie vzájomného vzťahu medzi všetkými pozorovanými CMAT bola uskutočnená klastrová analýza a to stanovením genetickej odlišnosti každého antigénu a stanovením neváženej nepodobnosti vypočítanej z údajov všetkých jedinečných CMAT. Neprítomnosť výsledkov jednotlivých známych antigénov bola považovaná tak, ako keby tieto údaje chýbali. Vytvorená matrica bola podrobená klastrovej analýze spôsobom skupiny váženého páru použitím aritmetických priemerov (Sneath a Sokal) na osobnom počítači kompatibilným s IBM s programom CSS Statistica Statsoft.
Výsledný dendrogram klastrovej analýzy je uvedený na obrázku 5. Tento dendrogram skutočne ukazuje, že populácia Borrelia spôsobujúca lymskú chorobu je dobre štruktúrovaná. Vynesením vlastných hodnôt, pri ktorých dochádza ku každému klastrovému stupňu, do grafu je možné vybrať najvhodnejšiu hladinu, pri ktorej je možné baktérie zaradiť do kategórií.
Najideálnejšími miestami na rozdelenie pre nasledujúce stupne klastrovania sú tie body na krivke, kde sú hlavné skoky vo vlastných hodnotách. Ako ukazuje dendrogram na obrázku 5, dochádza k tomu tam, kde je rozdiel v CMAT výsledkom medzi 68 a 88 %. Toto delenie delí populáciu na štyri hlavné skupiny označené ako CMAT skupiny. K druhému hlavnému skoku vo vlastných hodnotách na postupné klastrovanie dochádza tam, kde je rozdiel v CMAT výsledku 40 a 52 %. Toto delenie rozdelí každú CMAT skupinu na dva alebo tri klastre jednotlivých CMAT. Z dôvodu vhodnosti bol rozdiel výsledku 80 % uvažovaný ako hladina, pri ktorej dochádza k zoskupeniu CMAT a 50 % ako hladiny, pri ktorej dochádza ku klastrovaniu.
Z predchádzajúceho je zrejmé, že populácia B. burgdorferi sa môže rozdeliť na štyri hlavné CMAT skupiny, každá z nich pritom pozostáva z dvoch až troch CMAT klastrov. Každý CMAT klaster bol sám zložený z jedného až piatich jednotlivých CMAT. Porovnanie týchto výsledkov s výsledkami taxonomických štúdií štruktúrnej analýzy iných populácií [Marconi a Garon: J. Bacteriol. 174, 241 (1992), Boerlin akoh: Infect. Immun. 60, 1677 (1992), Baranton a koh: Int. J. Systém Bacteriol. 42, 378 (1992)] ukazuje, že skupina CMAT 1 zodpovedá génovému druhu Borrelia burgdorferi sensu stricto, že skupina CMAT 3 je ekvivalentná s Borrelia afzelii, tiež známa ako „skupina VS461“, a že skupiny CMAT 2 a 4 zodpovedajú B. garinii sp. nov. Dôvod, prečo CMAT analýza rozdelila génové druhy B. garinii na dve CMAT skupiny, nie je jasný, ale môže to byť preto, že bolo použitých menej markerov ako v prípade izoenzýmovcj clcktroforetickej štúdie (Boerlin a kol.: Infect. Immun. 60, 1677 (1992).
Ak si pozrieme výskyty príslušných kmeňov v každom CMAT (obrázok 5), je zrejmé, že 7 CMAT má viac ako jedného reprezentanta a môžu byť teda považované za klony, t. j. kmene, ktoré majú všeobecnú príbuznosť. V skutočnosti 67 % všetkých kmeňov patrí práve do troch rôznych CMAT klonov, napríklad CMAT 4 (kloň 1:2:4) obsahuje 12 kmeňov, CMAT 13 (kloň 3:2:13) obsahuje 23 kmeňov a CMAT 18 (kloň 4:2:18) 15 kmeňov. Je pozoruhodné, že bolo zistené, že 76 % (31 z 41) analyzovaných ľudských izolátov je distribuovaných medzi tieto tri hlavné kmene. Ďalej je pozoruhodné, že ak sa CMAT 17, 18, 20 a 22 považujú spoločne ako časť príbuzného klonového klastra, všetky patria k CMAT klastru 4.2 a potom súvislosť s ochorením ľudí je až 87 %. Vďaka tejto úzkej súvislosti s ochorením ľudí môžu byť považované za klony alebo klanové klastre „súvisiace s ochorením ľudí“ (HRA) (pozri definícia). Ak si pozrieme typy izolátov nachádzajúcimi sa medzi týmito tromi hlavnými klonmi, je zrejmé, že napríklad CMAT 13 súvisí s chronickým syndrómom pokožky ACA (5 kmeňov) a že tento kloň všeobecne súvisí so syndrómami pokožky (17 z 19). Oproti tomu zdá sa, že ďalšie dva HDA kmene majú prevahu pri šírení ochorenia, to znamená, že sú izolované z krvi alebo C SF pacientov trpiacich na neuroboreliózu alebo lymskú artritídu. V prípade CMAT klastra 4.2 (t. j. CMAT 17, 18, 20 a 22) epidemiologické údaje ukazujú na úzku súvislosť s neurobore liózou. Z 10 ľudských izolátov 6 ich bolo izolovaných z CSF materiálu alebo z pacientov s neuroboreliózou a 4 boli izolované z pacientov s ECM, syndrómom normálne súvisiacim s akútnym ochorením, ktoré môže tiež súvisieť s neuroboreliózou. Súvislosť kmeňov CMAT 4 s príznakmi nie je celkom jasná, pretože 2 z ľudských izolátov bolo izolovaných z krvi, 3 z CSF a 1 z pacienta s EM.
Ďalšou analýzou epidemiologických údajov týkajúcich sa rôznych kmeňov bolo zistené, že tri hlavné klony alebo klonové klastre majú rozdielne zemepisné rozšírenie a že táto vlastnosť zodpovedá všeobecným rozdielom v primárnom syndróme lymskej choroby pozorovanej v týchto oblastiach. Napríklad CMAT 4 je najviac prevládajúci CMAT pozorovaný v Severnej Amerike, v oblasti, kde prevládajú príznaky artritídy. Bolo zistené, že CMAT 13 a CMAT 18 boli potvrdené prevažne v severnej strednej Európe, kde prevládajú neurologické príznaky a príznaky chronického ochorenia pokožky. Z 3 hlavných kmeňov len CMAT 4 bol zistený jednak v Severnej Amerike, jednak v Európe (Francúzsko, Rakúsko, Rusko), pričom v obidvoch svetadieloch je veľmi rozšírený. Je zaujímavé, že v oblastiach strednej Európy, najmä v Rakúsku a Švajčiarsku, kde je lymská choroba endemická, existujú spoločne všetky tri hlavné klony súvisiace s ochorením ľudí.
Uvedomujúc si skutočnosť, že ochorenie ľudí spôsobuje práve jeden kloň (CMAT 4) v skupine CMAT 1 (Borrelia burgdorferi sensu stricto), jedným klonom (CMAT 18) skupiny CMAT 3 (Borrelia afzelii) a klonovým klastrom (CMAT klaster 4.2) skupiny CMAT 4 (B. garinii sp. nov.) umožňuje, v súlade s týmto vynálezom, sústrediť sa na tieto klony/klonové klastre s cieľom navrhnúť vakcíny, akou je OspC vakcína alebo kombinovaná OspC/OspA vakcína, ktoré proti nim špecificky chránia. Táto vakcína by potom mohla byť využívaná v tých zemepisných oblastiach, v ktorých tieto klony extrémne prevládajú. Ďalej potom, vzhľadom na to, že rôzne klinické príznaky súvisia s rôznymi klonmi, je možné zacieliť vakcínu proti týmto klonom. Výsledkom je teda navrhnúť takú vakcínu, ktorá chráni proti špecifickým príznakom.
Príklad 2
Vývoj OspC serovarovej typizačnej schémy na analyzovanie serologickej variácie OspC antigénu Borrelia spôsobujúceho lymskú chorobu
Príprava anti-OspC protilátok
Bol pripravený panel 25 monoklonálnych protilátok oproti a) štyrom vyčisteným OspC proteínom odvodených od 1) rakúskeho kmeňa Orth (BBM 34 až 39), 2) nemeckého kmeňa PKO (BBM 42 až 45), 3) československých kmeňov E61 (BBM 46, 47 a 49) a 4) KL10 (BBM 40 až 41), b) OspC proteínom obohatenej zmesi antigénov odvodených od rakúskeho kmeňa W (BBM 22, 24, 25, 27, 28 a 29) a c) membránovej frakcii 2 českého kmeňa M57 (BBM 75 až 77).
Špecifickosť anti-OspC proteínu rôznych monoklonálnych protilátok bola potvrdená blotovou analýzou proti membránovej frakcii kmeňa W alebo M57 v prípade BBM 22, 24, 25, 27 až 29 a BBM 75 až 77, v prípade ďalších potom radovou blotovou analýzou oproti príslušne vyčistenému proteínu.
Membránová ELISA
Sérotypizácia OspC proteínov sa uskutočňuje štandardným spôsobom membránovej ELISA. Membránové frakcie 2 kmeňov, pripravených podľa príkladu 1, sa
SK 279968 Β6 zriedi na 0,1 mg/ml fosforečnanom pufrovaným soľným roztokom (PBS), pH 7,4 a rozdelí sa do jednotlivých jamiek mikrotitrovacich dosiek. Dosky sa nechajú vysušiť pri teplote 37 °C cez noc. Pred použitím sa dosky dvakrát premyjú v PBS, potom sa do každej jamky pridá 50 1 zriedeného roztoku protilátky v PBS obsahujúcom 1 % ľudského albumínu a dosky sa inkubujú hodinu pri teplote 37 °C. Dosky sa potom štyrikrát premyjú pred pridaním protilátky konjugovanej s anti-myšími IgG alkalickými fosfátmi. Tieto dosky sa inkubujú ďalšiu hodinu pri teplote 37 °C, potom sa štyrikrát premyjú, pridá sa substrát, aby sa vyhodnotilo množstvo naviazanej protilátky.
Pôvodne boli všetky kmene testované proti všetkým 25 monoklonálnym protilátkam, aby bolo vidieť, ktoré monoklony boli najvhodnejšie na sérotypizačné účely. Boli robené pokusy, aby sa zistili jednotné pozitívne a negatívne testovacie kritériá. Ukázalo sa však, že to nie je možné pre veľmi rozdielne úrovne expresie OspC antigénov v rôznych kmeňoch. Na prekonanie tohto problému boli membránové frakcie 2 analyzované spôsobom Westemového blotovania, prenesené na nitrocelulózu a zafarbené farbivom Aurogold. Tie kmene, ktoré neexprimovali žiadne alebo exprimovali len malé množstvo OspC proteínu (celkom 15 kmeňov), čo bolo posúdené na základe neprítomnosti hlavného proteínu s molekulovou hmotnosťou v rozpätí 22 000 až 28 000, boli zo štúdie odstránené. Napriek tomu vo viacerých prípadoch (napríklad, ak sa používa BBM 28, 29, 37, 43 a 45), ešte stále nebolo možné pozorovať rozdiely medzi pozitívnymi a negatívnymi výsledkami. Tieto monoklonálne protilátky boli teda považované za nevhodné na typizačné účely. Všetky tieto protilátky rozlišujú známe epitopy a majú teda malú diskriminačnú hodnotu. Na základe údajov pôvodnej analýzy kmeňov bolo tiež zistené, že mnohé monoklonálne protilátky rozlišujú podobné epitopy, napríklad BBM 24, 25 a 27, BBM 38 a 39 a BBM 75, 76 a 77. Preto bol použitý v konečnej sérovarovej typizačnej schéme len jeden z každej skupiny (BBM 24, BBM 39 a BBM 77). Odstránením týchto kmeňov a monoklonálnych protilátok bolo potom možné stanoviť kritériá pozitívnej reakcie, ktorými sú tie, v ktorých získané hodnoty optickej hustoty boli významne (trikrát) vyššie ako hodnota pozadia negatívnych kmeňov. V praxi to znamená, že pozitívny výsledok má hodnota optickej hustoty (OD) väčší ako 0,6. Všetky pozitívne reakcie boli potom potvrdené analýzou Westemovým blotovaním rovnakých membránových prostriedkov. Výsledkom analýzy Westemovým blotovaním bolo zistenie, že BBM 48 silne skrížené reaguje s proteínom s veľkosťou asi 60 000 hmotn. jednotiek a že poskytuje mnohé falošné pozitívne výsledky pri analýze ELISA. BBM 48 bol teda tiež vynechaný zo sérovarovej analýzy. Dôsledkom bolo, že sérovarová analýza bola trocha zjednodušená použitím len 13 z pôvodných 25 dostupných anti-OspC protilátok.
Nasleduje izolácia reakčnej zostavy každého kmeňa s úplným panelom 13 monoklonálnych protilátok. Každá jednotlivá zostava sa označí ako „sérovar“ (pozri obrázok 6). V zbierke konečne analyzovaných 62 kmeňov bolo pozorovaných 16 jedinečných sérovarov, čo ukazuje na veľký stupeň sérologickej heterogenity tohto membránového proteínu. Počet pozorovaných pozitívnych reakcii medzi jednotlivými sérovarmi bol medzi 1 a 7.
Na obrázku 12 je uvedený úplný zoznam sérovarov zistených pre každý kmeň. Ako je vidieť, 12 kmeňov (19 % z analyzovaných kmeňov) nereagovalo so žiadnou z panelu 13 monoklonálnych protilátok (označené „NR“, t. j. nereaktívne) a boli považované za netypizovateľné. Spo ločne s kmeňmi, ktoré boli vynechané pre chýbajúcu alebo nízku expresiu (15 kmeňov), nemohlo byť typizovaných celkom 22 % z dostupných kmeňov. Frekvencia výskytu sérovarov medzi 78 kmeňmi, ktoré mohli byť jednoznačne typizované, boli značne premenné. Bol pozorovaný len jediný reprezentant sérovarov 6, 8 a 9, zatiaľ čo 10 kmeňov malo sérovar 2, najobvyklejší sérovar. Existuje úzky vzájomný vzťah medzi skupinou a genotypom OspC proteínu a jeho sérovaru. Vo väčšine prípadov sa zdá, že pomer je 1 : 1, napríklad v skupinách 1, 2, 4, 5, 7, 9, 10, 14 a 15. Skupiny 3, 12, 13, 17, 18 a 19 buď nemohli byť testované, alebo neboli typizovateľné pri použití bežne dostupných monoklonálnych protilátok. Skupiny 6, 8 a 11 môžu byť ďalej sérologicky rozdelené na 2 alebo 3 sérovary. Je však zaujímavé si všimnúť, že genotypy týchto skupín majú tiež istú rôznorodosť. Jeden sérovar (sérovar 16) bol zistený vo viac ako v jednej skupine (skupina 16 a 20). To môže nastať preto, že v tomto sérovare existujú len dve pozitívne reakcie a teda bežné monoklonálne protilátky neboli schopné rozlíšiť medzi tý mito skupinami.
Príklad 3
Analýza polymorfie dĺžky reštrikčných fragmentov (RFLP) OspC heterogenity
Klonovaný bol gén OspC z kmeňa Orth. Uvedeným spôsobom (US patentová prihláška č. 07/903 580) bola stanovená sekvencia nukleotidov. Oligonukleotidy zodpovedajúce susednému (kódujúci vlákno, ATGAAAA.AGAATACATTAAGTGC, štart kódom podčiarknutý) a vzdialenému (nekódujúci vlákno, TAATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG, stop kodon podčiarknutý) koncu OspC génu z kmeňa Orth boli potom použité na polymerizačnú reťazovú reakciu (pozri príklad 4) na amplifikáciu OspC génov zo 77 kmeňov našej zbierky kultúr. Všetky testované kmene, vrátane 14 kmeňov zo Spojených štátov amerických, dávali PCR fragmenty predpovedanej veľkosti (627 až 642 p. n.), čo ukazuje, že plazmidom kódovaný OspC gén nie je len stabilne udržiavaný, ale prevláda oveľa viac, ako bolo dosiaľ predpokladané. Zlyhanie detekcie OspC antigénu v kultúrach rastúcich in vitro je nepravdepodobné pre neprítomnosť OspC génu, alebo skôr pre neprítomnosť alebo nízku hladinu antigénu, ktorý je exprimovaný.
Polymorfia medzi OspC génmi z rôznych kmeňov bola stanovená analýzou zostavy reštrikčných fragmentov získaných po štiepení PCR amplifikovaného OspC génu (pripraveného, ako je to opísané) reštrikčnými enzýmami Dpnll, Ddel a Dral. Analýza údajov z 82 kmeňov (t. j. experimentálne údaje zo všetkých 77 kmeňov našej zbierky kultúr + informácie odvodené z 5 publikovaných OspC sekvencii, pozri obrázok 1) potvrdili prítomnosť 35 rôznych RFLP OspC typov. Počet a veľkosť fragmentov experimentálne stanovených štandardnými postupmi bola potvrdená mnohými príkladmi sekvenovania, t. j. pre aspoň jedného reprezentanta RFLP typov 1 až 23 a typu 24 je založená na sekvenčných údajoch Padula a kol. RFLP zostavy súvisiace s každým RFLP typom sú uvedené na obrázku 7. Ak sú dostupné, boli namiesto zmeraných hodnôt výhodne uvedené veľkosti fragmentov odvodené od informácií o sekvencii (RFLP typy 1 až 24). Úplný zoznam RFLP typov pre každý analyzovaný kmeň je uvedený na obrázku 12.
Príklad 4
PCR amplifikácia a sekvenovanie nukleotidov rôznych alel OspC génu a klastTová analýza odvodených aminokyselinových sekvencii
Ako je to opísané v príkladoch 1 a 2 a súhrnne uvedené na obrázku 12, bolo možné roztriediť kmene Borrelia na OspC sérovary a OspC RFLP typy. Boli vybraté kmene predstavujúce OspC RFLP typy 1 až 17 a 19 až 23, OspC gén bol amplifikovaný polymerizačnou reťazovou reakciou a bola stanovená sekvencia nukleotidov a odvodená sekvencia aminokyselín. V niekoľkých prípadoch bol študovaný vzájomný vzťah medzi veľmi príbuznými OspC proteínmi ako ďalšia kontrola platnosti typizačných systémov a ako kontrola na ďalšiu nedetegovanú heterogenitu OspC typov. Celkom bolo PCR ampliftkovaných a sekvenovaných, ako je to uvedené, 27 OspC génov. Informácie o sekvenciách boli použité na klasifikáciu OspC proteínov do OspC skupín.
Materiály a spôsoby
Suspenzia zmrazených zásobných buniek Borrelia bola roztopená a 2 1 (5.106 až 1.108 buniek/ml) tejto suspenzie sa odstreďovalo 5 minút pri najvyššej rýchlosti v mikroodstredivke Heraeus Biofuge A. Peleta buniek bola resuspendovaná v 10 1 1 x TAQ-pufri (Boehringer Mannheim), prevrstvená 50 1 minerálnym olejom (Pharmacia), inkubovaná 8 minút vo vriacom vodnom kúpeli a potom hneď umiestnená na ľad. K bunkovému lyzátu sa pridalo 90 1 zmesi reakčných činidiel [9 1 10 x Tag polymcrizačného pufru, Boehringer Mannheim, 2 1 10 mM dNTP roztoku, Boehringer Mannheim, 5 1 primeru 2 (ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG), 10 mM zásobný roztok, 5 1 primeru 2 (AATTAAGTTTTTTTGGAGTTTCTG), 10 mM zásobný roztok, 0,5 1 Tag polymerázy s koncentráciou 5000 jedn./ml, Boehringer Mannheim, a 68,5 1 vody]. DNA amplifikácia bola uskutočnená v zariadení LKB Thermocycler (95 °C 26 sekúnd, 53 °C 60 sekúnd a 70 °C 84 sekúnd, 30 cyklov). Amplifikácia bola sledovaná analyzovaním 5 1 produktu na 1 % (hmotn. k obj. dielom) agarového gélu v tris-acetátovom pufri (40 mM tris-acetát, 2 mM EDTA, pH 8,0), zafarbením etidiumbromidom a pozorovateľná pod UF svetlom. Amplifikované produkty boli zahustené mikroodstreďujúcou kazetou Špín Bind (FMC). DNA bola izolovaná v 30 1 vody. Izolácia bola sledovaná v 2 1 vyčisteného produktu na agarovom géle, ako je to uvedené.
Amplifikované DNA fragmenty (2 až 7 1) boli na sekvenovanie pripravené na zariadení LKB Thermocycler (25 cyklov: 36 sekúnd pri 95 °C, 30 sekúnd pri 53 °C a 80 sekúnd pri 70 °C) pomocou sekvenančnej súpravy Auto Cycle Sequencing Kit (Pharmacia) s primermi 5'-ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3' a 5'-ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG-3'. Vzorky boli elektroforezované na 6 polyakrylamidovom sekvenančnom géli automatickou sekvenančnou aparatúrou s laserovou fluorescenciou (ALF) (Pharmacia LKB) podľa opisu uvedeného výrobcom. Údaje o sekvenciách nukleotidov z ALF boli zhromaždené a analyzované programom DNASIS, odvodené sekvencie proteínov programom PROSIS (Pharmacia LKB).
Aminokyselinovc sekvencie OspC proteínov z 24 rôznych kmeňov spirochét lymskej choroby (t. j. 22 sekvencii z tejto štúdie a 2 publikované sekvencie pre kmene 2591 a PBI) boli zoradené iýchlou približnou metódou podľa Wilburyho a Lipmana: Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80, 726 (1983). Takto získaný podrobný výsledok bol použitý na skonštruovanie dendrogramu spôsobom UPGMA (forma klastrovej analýzy) podľa Sneatha a Sokala. Tieto analýzy boli uskutočnené programom Clustal, známom z Higgins a Sharp: CABIOS 5, 151 (1989) a Higgins a kol.: CABIOS (1991).
Výsledky a diskusia
Zoradené nukleotidové a odvodené čiastočné aminokyselinové sekvencie OspC génov a proteínov z 24 kmeňov predstavujúcich 24 rôznych RFLP typov sú uvedené na obrázku 8 a 9. Pretože aminokyseliny predchádzajúce prvý cysteínový zvyšok (aminokyselina 19 v Orth sekvencii) v OspC proteíne znamenajú leader sekvenciu a nie sú prítomné v maturovanom proteíne (sekvencia FISC je predpokladaným miestom štiepenia signálnymi peptidmi), neboli zahrnuté na porovnanie sekvencií. Na karboxylovom konci proteínu bolo vynechaných 16 aminokyselín. Tieto aminokyseliny zahrnujú oblasť zodpovedajúcu väzbovému miestu primeru 2 (ekvivalent posledných 7 aminokyselín) a potom medzeru 9 ďalších aminokyselín, pokiaľ sa nezískajú údaje prvej sekvencie. Zdá sa, že táto koncová časť OspC génov je vo veľkej časti zachovaná a má menšiu dôležitosť pri vzniku rozmanitosti pozorovanej medzi OspC proteínmi, ako ukazuje schopnosť amplifikovať a sekvenovať OspC gén vo všetkých testovaných kmeňoch pomocou primeru 2. Navyše, monoklonálne protilátky, ktoré sa viažu na túto oblasť OspC, sú veľmi reaktívne (napríklad BBM 29, 42 a 45 na obrázkoch 13 a 14).
OspC sekvencie sú veľmi variabilné s najvzdialenejšími príbuznými aminokyselinovými sekvenciami (B. burgdorferi kmeň 297 a B. garinii kmeň IP90), pričom majú len 59 % identitu aminokyselinovej sekvencie (80 % podobnosť). Žiadne rozdiely medzi sekvenciami neboli však zistené medzi členmi rovnakého RFLP typu, čo poukazuje na to, že tento typizačný spôsob veľmi presne predstavuje heterogenitu medzi OspC génmi (t. j. OspC sekvencie kmeňov VS215, VS219 a DK7 RFLP typu 1 sú identické so ZS7, kmeňmi IP2 a 26816 RFLP typu 2 sú identické s B31, kmeňmi Hl 5 a ACAI RFLP typu 6 sú rovnaké, kmene PKO a DK62 RFLP typu 7 sú identické s JSB, kmene H4 a W RFLP typu 10 sú rovnaké, kmene 871104 a KL11 RFLP typu 13 sú identické a kmene 20047 a VSI85 RFLP typu 14 sú rovnaké).
Stupeň príbuznosti medzi čiastočnými OspC aminokyselinovými sekvenciami stanovený klastrovou analýzou je reprezentovaný ako dendrogram na obrázku 10. OspC proteíny z kmeňov rovnakého druhu sú príbuznejšie ako OspC proteíny z rôznych druhov. V každom druhu sú však zrejmé značné odlišnosti. Rozdielnosti OspC sekvencie sú zvlášť veľké medzi kmeňmi B. garinii, ako ukazuje hlbšie vetvenie pozorované v tejto časti fylogenetického stromu a väčší počet OspC variantov súvisiacich s B. garinii ako s ďalšími dvomi druhmi Borrelia. Klonálna štruktúra OspC dedičnosti predpokladá, že neexistuje žiadna významná výmena genetického materiálu ani intragénovou rekombináciou, ani horizontálnym prenosom plazmidom kódovaného OspC medzi rôznymi druhmi Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu.
OspC proteíny boli priradené k OspC skupinám. OspC skupina je definovaná ako taká skupina OspC proteínov, ktoré majú vyššiu ako 80 % identitu aminokyselinovej sekvencie oproti predchádzajúceho 92 % maturovaného OspC proteínu, t. j. okrem informácie pre leader sekvenciu s 18 aminokyselinami a poslednými 16 aminokyselinami. Na obrázku 1 je uvedených 18 rôznych OspC skupín, ale dve ďalšie OspC skupiny (19 a 20) boli identifikované z neúplnej informácie o sekvencií OspC proteínov z kmeňov Hl3 a 28691, ktoré neboli zahrnuté v dendrograme.
Napriek veľkej rozmanitosti OspC proteínov je zachovaná prvá tretina maturovaného OspC proteínu (obrázok 10), kmene rovnakého druhu majú 80 až 90 % identitu sekvencií v tejto oblasti. Ale identita sekvencií medzi OspC proteínmi z rôznych kmeňov nie je v tejto časti proteínu tak vysoká vďaka prítomnosti kmeňovo špecifickým sekvenčným motifom na amínovom konci OspC proteínu. Ako bolo uvedené, časť OspC na karboxylovom konci, ktorá nebola uvedená, je zrejme tiež vo vysokom stupni zachovaná. Intervenujúca oblasť (t. j. dolné dva bloky na obrázku 9 medzi aminokyselinovými zvyškami KKI a NS) je veľmi premenná a je hlavným zdrojom rozmanitosti súvisiacej s OspC. Je potrebné očakávať, že sérotypovo špecifické epitopy sú vnútri tejto premenlivej oblasti. Analýza profilov hydrofilnosti sekvencií jednotlivých proteínov spôsobom podľa Hoppa a Woodsa zistila, že najvyššie hydrofilné maximum, veľmi predpovedajúce existenciu epitopu, leží vnútri tejto oblasti. Napriek veľkej premenlivosti medzi OspC sekvenciami v tejto oblasti, predpokladaný epitop nemenne leží medzi zvyškami aminokyselín 120 až 155 maturovaného proteínu. V OspC kmeni Orth sa hydrofilné maximum vyskytuje vo zvyškoch 136 až 141 (DNDSKE), oblasti s vysokou flexibilitou a predpokladanou otáčkou, čo sú parametre, ktoré by tiež naznačovali epitop (analýzy uskutočňované pomocou PC/GENE).
Príklad 5
Mapovanie epitopu anti-OspC monoklonálnych protilátok
Epitopy niektorých anti-OspC monoklonálnych protilátok boli mapované komerčne dostupnou súpravou Custom Designated Epitope Scanning Kit od firmy Cambridge Research Biochemicals Ltd., Gradbrook Park, Northwich, Cheshire, Anglicko. Táto zostava používa alebo spôsob pin technológie opísaný Geysenom a kol. . J. Immunol. Methods 102, 259 (1987), analýzu ELISA s biotinylovaným peptidom alebo spôsob bodového blotovania opísaný výrobcom. Jediným stupňom bolo 2026 syntetizovaných testovaných peptidov, prekrývajúce lOméry sekvencií OspC proteínov sú uvedené na obrázku 9. Do analýzy boli tiež zahrnuté prekrývajúce peptidy sekvencie signálneho proteínu kmeňa Orth a C konce OspC proteínov kmeňov Orth PKO a B31.
Kombinovaná sekvencia sekvenčných peptidov reagujúcich s monoklonálnou protilátkou je opísaná ako „úplná sekvencia epitopu“. Obrázok 13 uvádza úplnú sekvenciu epitopu týchto monoklonálnych protilátok, ktorými sa tieto epitopy mohli rozlišovať. Sekvencia uvedená v hranatých zátvorkách zahrnuje aminokyseliny bežné pre všetky reagujúce peptidy a tvorí teda dôležitú časť epitopu. Umiestnenie každej úplnej sekvencie v generalizovanom OspC proteíne je uvedené na obrázku 14. V jednom prípade je dané (obrázok 13) a uvedené (obrázok 14) číslo epitopov, ktoré by mohli byť rozlíšené, ale len pre prvé, t. j. pre najreaktivnejšie. V prípadoch, keď monoklonálne protilátky reagujú s peptidmi zodpovedajúcimi podobným oblastiam vo viac ako jednom OspC proteíne, je uvedená len monoklonálna látka pre kmeň Orth. Naopak, ak monoklonálna protilátka nereaguje s Orth proteínom (napríklad BBM 43), jc uvedená reagujúca sekvencia pre homológny kmeň (PKO). Dole na obrázku 13 sú monoklonálne protilátky zoradené do kategórií na základe frekvencie výskytu toho epitopu, ktorý rozlišujú, čo je uvedené v hornej časti tohto obrázku. Ako je vidieť, viac ako polovica z nich rozlišuje vysoko špecifické epitopy, v ktorých sa vyskytuje menej ako 10 z analyzovaných kmeňov. Päť z monoklonálnych proti látok rozlišuje epitopy vyskytujúcich sa medziproduktov, zatiaľ čo sedem ostávajúcich je možné považovať za protilátky, ktoré rozlišujú bežné epitopy, pretože sa vyskytujú vo viac ako 25 zo 77 analyzovaných kmeňov. Monoklonálne protilátky, o ktorých bolo zistené, že sú vhodné na sérovarovú analýzu, sú na obrázku 13 označené hviezdičkou. Je zaujímavé poznamenať, že to boli primáme monoklonálne protilátky, ktoré rozlišujú bežné epitopy (BBM 28, 29, 34, 37, 42, 43 a 45), alebo epitopy vyskytujúce sa ako medziprodukty (BBM 22, 35 a 40), ktoré by mohli byť jednoznačne zmapované. V skutočnosti by mohli byť zmapované len 3 monoklonálne protilátky, ktoré by mohli byť považované za typovo špecifické (BBM 38, 39 a 44), t. j. reagujúce s menej ako 10 kmeňmi. Ako BBM 38, tak aj 39 majú rovnakú zostavu reakcií kmeňov a mapovali rovnakú oblasť (aminokyseliny 155 a 170). Na základe hydrofilnosti sekvencie aminokyselín proteínu Orth hydrofilné maximum a predpokladaná -otáčka sa zhoduje s touto oblasťou, parametrami vysoko indikatívnymi pre epitop. Epitop BBM 44 leží medzi aminokyselinami 79 a 90, čo je tiež značne premenná oblasť. Nanešťastie nemohol byť zmapovaný žiadny z epitopov iných typovo špecifických monoklonálnych protilátok, čo poukazuje na to, že sú závislé od konformácie molekuly. Pretože však všetky 3 typovo špecifické protilátky mapujú oblasti, ktoré sú medzi najpremenlivejšími oblasťami proteínu, je veľmi pravdepodobné, že sú tiež v iných typovo špecifických epitopoch. Je zaujímavé, že BBM 28, ktorý reaguje s epitopom vysokej frekvencie, tiež mapuje rovnaké oblasti ako BBM 38 a 39. Dôvody tejto skutočnosti nie sú známe. Môžu tu však existovať malé rozdiely v počte a skutočných aminokyselinách, ktoré sú vo väzbovom mieste, čo je príčinou tejto nejednoznačnosti. Štyri z protilátok (BBM 29, 42,43 a 45), ktoré reagujú s obvyklým epitopom, mapujú proteín na vzdialenom C konci (aminokyseliny 200 až 212), pričom dva ďalšie reagujú blízko N konca tohto proteínu (aminokyseliny 41 až 67), v oblastiach, ktoré sú veľmi konzervatívne. Monoklonálne protilátky rozlišujú epitopy s výskytom medziproduktov mapovaných vnútri polozachovaných oblastí (aminokyseliny 103 až 114 a aminokyseliny 176 až 196) molekuly. Tieto výsledky boli potvrdené tiež ďalším pokusom, v ktorom bolo testované viacmocné králičie sérum špecifické pre membránové frakcie 2 kmeňov, z ktorých každý exprimuje 16 sérovarových variantov OspC proteínu proti 203 prekrývajúcim peptidom Orth proteínu. Boli nájdené skrížené reagujúce epitopy v hore zachovaných a polozachovaných oblastiach. Je zaujímavé, že séra z kmeňov CMAT skupiny 1 (B. burgdorferi sensu stricto) nereagujú skrížené tak často ako séra z kmeňov CMAT skupiny 3 (B. afzelii) a 4 (B. garinii).
Príklad 6
Štúdie skríženej ochrany gerbil
Na zistenie, či je možná skrížená ochrana medzi rôznymi skupinami OspC, boli vyčistené OspC proteiny z B. burgdorferi kmeňa ZS7 (OspC skupina 1), B. afzelii kmeňa PKO (OspC skupina 7) a B. garinii kmeňa W (OspC skupina 10) a použité ako imunogény v modeli lymskej boreliózy gerbil proti stimulácii kmeňom Orth B. afzelii (OspC skupina 5). Na testovanie vnútri skupiny bol ako imunogén proti kmeňu Orth použitý OspC z kmeňa H7 (OspC skupina 5). OspC z kmeňa H7 patrí k rovnakému sérovaru a RFLP typu ako OspC z kmeňa Orth.
Gerbilám bola podaná alebo jedna subkutánna imunizácia vyčisteného OspC (20 g proteínu/200 1) s po mocným činidlom TiterMax # R-l (CytRx), t. j. bola pripravená ako emulzia vody v oleji (skvalen) so syntetickým imunomodulátorom (kopolymér CRL89-41), alebo gerbilám boli podané dve intraperitoneálne injekcie OspC (10 g proteínu/500 1) s hydroxidom hlinitým ako pomocným činidlom. Vyčistené antigény boli pripravené z kmeňov podľa spôsobov opísaných v USA patentovej prihláške č. 07/903 580, ktorej obsah boltu už skôr zahrnutý ako odkaz. Tri a pol týždňa po prvej imunizácii boli z očí a plazmy odobraté vzorky krvi pripravenej tak, aby mohla byť zistená protilátková odpoveď na imunogén v čase stimulácie (podobne bolo postupované s neimunizovanými kontrolnými zvieratami). Po štyroch týždňoch od prvej imunizácie bolo zvieratám podaných intraperitoneálne 104 buniek (ID50 25 až 100) kmeňa Orth, rovnako ako skupine neimunizovaných kontrolných zvierat. Podávaná supenzia bola tiež titrovaná u neimunizovaných gerbíl, aby sa stanovila potrebná dávka na infikovanie 50 % zvierat. Po ďalších dvoch týždňoch boli zvieratá stimulované dávkou 104 zabité a mechúr, srdce, ľadviny a slezina boli kultivované v médiu B SK. Kultúry boli skúmané na prítomnosť spirochét v týždňových intervaloch od druhého do šiesteho týždňa po naočkovaní, mikroskopiou v tmavom poli. Bola tiež odobratá krv a získaná plazma bola analyzovaná Westemovým blotovaním na sérokonverziu, t. j. na vyvinutie protilátok po stimulácii na antigény z kmeňa Orth iných ako imunogén. Bola zistená dobrá zhoda medzi kultivačnými a sérologickými testami použitými na zistenie, ktoré zvieratá boli infikované. Na stanovovanie ID50 bolo použité len sérologické testovanie, ale v tomto prípade zvieratá sa nechali vykrvácať 3 týždne po stimulácii. Ďalší čas bol poskytnutý na to, aby protilátková odpoveď v infikovaných gerbilách bola dostatočne silná a aby mohla byť ľahko zistiteľná.
Medzi druhmi neexistovali žiadne známky skríženej ochrany, t. j. OspC proteíny z OspC skupín 1 (B. burgdorferi) a 10 (B. garinii) boli neúčinné ako imunogény proti podanému kmeňu Orth (B. afzelii). Podobne neexistovala žiadna známka skríženej ochrany medzi rôznymi OspC skupinami rovnakých druhov, t. j. OspC proteín z izolátu OspC skupiny 7 (kmeň PKO B. afzelii) bol neúčinný ako imunogén proti podanému kmeňu Orth, ktorý exprimuje OspC proteín z OspC skupiny 5. Oproti tomu imunizácia OspC protcínom z kmeňa 117 (OspC skupina 5) bola účinná na kmeň Orth (OspC skupina 5). Tieto údaje (obrázok 15) ukazujú, že skrížená ochrana medzi OspC skupinami je nepravdepodobná a že je možná ochrana vnútri jednej skupiny. Na ochranu proti väčšine kmeňov Borrelia spôsobujúcich lymskú chorobu by mala byť účinná násobná vakcína obsahujúca jeden alebo viac typov OspC proteínov z každej OspC skupiny.
Príklad 7
Frekvencia zemepisného rozšírenia rôznych skupín OspC proteínov súvisiacich s ochorením ľudí
Vzhľadom na vysoký stupeň premenlivosti OspC proteínu je mimoriadne náročné navrhnúť vakcínové prostriedky, ktoré poskytujú dobré ochranné krytie a pritom nevyžadujú zahrnutie mimoriadne vysokého počtu variantov na dosiahnutie tohto cieľa. Jedným spôsobom optimalizovania výberu OspC variantov by bolo stanovenie, ktoré OspC varianty súvisia s ochorením ľudí a vyskytujú sa veľmi často. Vzácne OspC varianty alebo OspC varianty vzácne súvisiace s ochorením ľudí by tak boli z akéhokoľvek vakcínového prostriedku vylúčené s minimálnou stratou účinnosti vakcíny. A ďalej, ak je vakcína určená len na použitie v príslušnej zemepisnej oblasti, nebolo by nutné zahrnúť do nej tie OspC varianty, ktoré neprevládajú v Borrelia spôsobujúcej lymskú chorobu v tejto oblasti. Využitím epidemiologických a OspC typizačných informácií o kmeňoch Borrelia použitých v tejto štúdii (obrázok 12) je možné vybrať OspC varianty, ktoré by mali byť vo vakcíne (vakcínach) obsiahnuté.
Analýza izolátov B. burgdorferi (CMAT skupina 1 zahrnujúca kmeň 25015, celkom 23 kmeňov) ukazuje, že najviac prevládajúce OspC varianty medzi týmito kmeňmi sú tie, ktoré patria k skupinám 1 a 2. Kmene skupiny 1 sú všetky európskymi izolátmi a môžu spôsobovať ochorenie ľudí, aj keď len 1 z 5 kmeňov bol ľudským izolátom. To môže znamenať, že tieto kmene nie sú vysoko virulentné. Kmene skupiny 2 sú jediným najobvyklejším typom OspC skupiny s 10 členmi. Na rozdiel od kmeňov skupiny 1 sú tieto kmene veľmi rozšírené v izolátoch zo Spojených štátov amerických, Európy a Ruska. Kmene skupiny 2 úzko súvisia s ochorením ľudí, pričom 50 % izolátov sú klinickými vzorkami. Zvyšných 8 testovaných izolátov B. burgdorferi sú všetko izolátmi zo Spojených štátov amerických a sú veľmi rozmanité, pokiaľ ide o OspC, ktoré exprimujú, pretože každý kmeň exprimuje iný ospC RFLP typ. Iba jeden z tý chto kmeňov (kmeň 297, skupina 3) bol izolovaný z prípadu lymskej choroby. Kmene skupiny 2 a 3 patria s výnimkou kmeňa 25015 k jednému z troch hlavných klonov CMAT typu 1.2.4. súvisiacich s ochorením ľudí (obrázok 5).
kmeňov B. afzelii (t j. skupina VS461, CMAT skupina 3) patrí do 6 rôznych skupín: OspC skupín 4 až 8 a skupiny 16 s 5, 4, 6, 2, respektíve so 4 členmi. Okrem jedného japonského izolátu boli všetky tieto kmene z Európy: Rakúsko (14), Česká republika (4), Dánsko (1), Nemecko (2), Taliansko (1), Slovinsko (1), Švédsko (1) a Švajčiarsko (1). 28 % európskych izolátov bolo ľudského pôvodu, z toho 80 % izolátov bolo zo vzoriek pokožky a 8 % zo vzoriek krvi. Tieto údaje dokladujú veľkú súvislosť medzi kmeňmi B. afzelii a vývojom dermatologických foriem lymskej choroby. Ľudské izoláty boli rovnomerne rozšírené i v rôznych OspC skupinách. Rakúske izoláty patrili predovšetkým k skupinám 4 až 6 (86 %), ale jednotliví predstavitelia boli nájdení tiež v skupinách 7 a 8. Nízky výskyt rakúskych izolátov medzi OspC skupinou 7 (t. j. 1/5) a neprítomnosť izolátov zo skupiny 16 (0/4) ukazuje, že vnútri Európy sú zemepisné variácie s prevládaním rôznych B. afzelii OspC skupín, ale kmene B. afzelii z OspC skupín 4 až 8 a 16 sú v Európe veľmi rozšírené. Tieto kmene sú takmer výlučne členmi iného klonu súvisiaceho s ochorením človeka, konkrétne 3.2.13 (obrázok 5).
Tridsať kmeňov B. garinii (t. j. CMAT skupina 4, vylučujúca atypické kmene 19857 a 19952 a CMAT 2 kmene 20047, IP90 a NBS 16) môže byť ďalej rozdelených do 9 OspC skupín a 2 RFLP typov, pre ktoré neexistuje žiadne priradenie do skupín. 53 % testovaných kmeňov B. garinii bolo ľudskými izolátmi a tieto kmene boli rozšírené vo všetkých OspC typoch okrem jedného (RFLP 34). 75 (12/16) z týchto kmeňov B. garinii bolo izolovaných z prípadov neuroboreliózy, ostatné boli izolátmi z pokožky. B. garinii teda primáme súvisí s neuroboreliózou, aj keď sa predpokladá výskyt izolátov z pokožky, pretože poranenie pokožky (EM) je príznakom bežným pre všetky formy lymskej choroby bez ohľadu na príčinné činidlo. Kmene OspC skupiny 13 boli najobvyklejšie izolovanými OspC typmi, 23 % (7/30) bolo B. garinii OspC typov a 25 % (4/16) ľudskými izolátmi. Kmene tejto OspC skupiny sú veľmi rozšírené v Európe
SK 279968 Β6 a zahrnujú izoláty zo šiestich rôznych krajín. OspC skupina 11 je tiež veľmi rozšírená, vyskytuje sa často (17 % alebo 5/30), ale súvislosť s ochorením ľudí je menej jasná, pretože len jeden izolát bol ľudského pôvodu. To ale môže ukazovať na chybu vo vzorke a na malý počet izolovaných kmeňov. Je to možné tiež aplikovať na kmene OspC skupiny 14 (4 kmene, ale len jeden ľudský izolát). Izoláty z iných OspC skupín (9,10, 12, 15, 17, 19 a RFLP typy 33 a 34) boli nájdené menej často. Na vakcínu proti rakúskej B. garinii by však mali byť ďalej uvažované OspC skupiny 10 a 19, pretože všetky štyri izoláty B. garinii z Rakúska patria k týmto 2 OspC skupinám.
Okrem priamej analýzy kmeňov Borrelia, ako je to uvedené, je možné stanoviť tiež prevládajúce z rôznych OspC variantov a ich súvislosť s ľudskou boreliózou nepriamo. To sa uskutočňuje testovaním špecifickosti OspC protilátok v sére od pacientov s lymskou chorobou. Na protilátky na OspC bolo testovaných 50 sér odobratých pacientom v oblasti Prahy (Česká republika), z ktorých malo EM (15), ACA (15), neurologické poruchy (10) a príznaky súvisiace s kĺbmi a svalmi (10). Pri testovaní proti panelu 18 kmeňov bolo zistené, že 17 vzoriek sér (34 %) (3 EM, 10 ACA, 3 lymská artritída a 1 neuroborelióza) reaguje s jednou alebo s viacerými zo 16 testovaných OspC skupín (obrázok 16). 12 sér reagovalo špecificky práve s jednou OspC skupinou [skupina 5 (4 x), skupina 7 (3 X), skupina 6 (2 x), skupina 8, 13 a 14 (1 x)]. Tri séra reagovali aj so skupinou 4, aj so skupinou 6, zatiaľ čo 2 ďalšie séra boli široko skrížené reaktívne reagujúce so 6 a 8 z testovaných skupín. V Českej republike sú teda prítomné kmene Borrelia exprimujúce OspC varianty z OspC skupín 5 až 17, 13, 14 a možno aj 4. Tieto sérologické údaje sú v súlade a teda podporujú výsledky získané analýzou kmeňov v susednej krajine - v Rakúsku.
Na základe opísaných výsledkov boli pripravené vakcíny na použitie v:
1) Spojených štátoch amerických: OspC z OspC skupín 2 a 3,
2) Európe: 14 OspC variantov z OspC skupín 2, 4 až 7, 9, 10, 12, 13, 14, 15 až 17 a 19 a
3) Rakúsku: 8 alebo viac OspC z OspC skupín 2, 4 až 7, 10,13a 19.
Príklad 8
Expresia rekombinantného OspC v P. pastoris Konštrukcia Pichia pastoris OspC expresného vektora Rekombinantný P. pastoris/ E. coli vektor pre viac hostiteľov pHIL-Al (získaný od Phillips Petroleum) bol použitý na klonovanie OspC kódujúcej sekvencie B. burgdorferi. Zvolený bol panel kmeňov obsahujúcich jeden alebo viac predstaviteľov z každej skupiny. OspC gén bol amplifikovaný polymerázovou reťazovou reakciou. Kódujúce sekvencie maturovaného OspC proteinu začínajúce prvou aminokyselinou cysteínom (aminokyselina 19 v sekvencii OspC proteinu z kmeňa Orth) bola amplifíkovaná použitím primerov špecifických pre kmeň odvodený od OspC nukleotidových sekvencii, ako je to opísané v USA patentovej prihláške 07/903 580 (európsky patent 0 522 560).
Na vytvorenie 5' a 3' konca B. burgdorferi Orth OspC génu bola uskutočnená polymerázová reťazová reakcia (PCR) v podstate tak, ako je to opísané v príklade 4 s použitím aminokoncového primeru PC-F so sekvenciou 5'-AAATGTGTAATAATTCAGGAAAGG-3' a primeru PC-B na karboxylovom konci so sekvenciou 5-ATTAAGGTTT. TTTGGAGTTTCTG-3'. Podčiarknutá sekvencia v prímerí PC-F je identická s translač ným štartovacím kodónom maturovaného OspC proteinu a v primeri PC-B s translačným stop kodónom.
Stratégia klonovania (reštrikčné miesto vo vektore a v primeroch použitých na PCR) na vloženie OspC kódujúcej sekvencie B. burgdorferi kmeň B31, PKO, ZS7, KL10 a E61 do pHIL-Al je súhrnne uvedená v tabuľke I.
Vektor pHIL-Al sa rozštiepi pôsobením Sful. Prečnievajúce konce sa doplnia Klenowovou polymerázou za vzniku zarovnaných koncov. Vyčistený PCR fragment obsahujúci sekvenciu kódujúcu OspC sa cez noc liguje s vektorom. Táto ligačná zmes sa použije na transformáciu príslušnej E. coli DH5. Na ďalšiu amplifikáciu plazmidu sa vyberú na LB-Amp doskách kolónie rezistentné na ampicilin. Minipreparácia (Maniatis a kol., 1982) sa testujú a analyzujú podľa dĺžky reštrikčného fragmentu. Plazmid, ktorý má OspC gén, sa označí pPC-PP4 (obrázok 17). Pripraví sa vyčistená pPC-PP4 DNA. Sekvencie sa potvrdia sekvenovaním DNA. Vyčistený plazmid pPC-PP4 sa prenesie do P. pastoris kmeňa GS115 NRRL-Y 11430 (Gregg a kol.: Mol. Celí. Biol. 5, 3376 (1985)) spôsobom, ktorý opísal Dohmen a kol. (Yeast 7, 691) a na MD doskách sa vyberú transformanty.
| kmeň B. burgdorferi | primer | vektor pHIL-Al rozštiepený |
| Orth | 5-AA ACG ATG TNI AAT AAT TCA GGG AAA-3’ 5'-GGATTAAGGTTTTTTTGGTTTCTG-3’ | Sful/Klenow |
| KL10 | 5'-GGGACTTCGAAACGA ATG TGTAATAATTCA-3' S'-GGTGGG GGA ATT CAT TAA GGT TTT-3' S’-TTT GGA-3' | SfuI/EcoRJ |
| ZS7 | 5’-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3* 5'-TAATTCAGGGAAG GGA AAT CAT TAA-3' 5'-GGT TTT TTT GGA-3 | SfuI/EcoRI |
| B31 | 5’-CGGA,AAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5-TAATTCAGGGAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5-GGTTTT TTTGGA-3' | SfuI/EcoRI |
| E6I | 5'-CGGP.AAAAP AACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5’-TAATTCAGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5-GGTTTT TTTGGA-31 | SfuI/EcoRI |
| PKO | 5-CGGAAAAAAAAPACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3' 5-TAATTCAGGGAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5-GGT TTT TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
Tabuľka I uvádza oligonukleotidové primery použité na PCR amplifikáciu kódujúcu sekvencie maturovaného OspC proteinu rôznych kmeňov Borrelia lymskej choroby. Sú uvedené tiež reštrikčné enzýmy použité na vloženie sekvencie kódujúcej OspC do vektora pHIL-Al.
Expresia rekombinantného OspC v P. pastoris
Z MD dosiek boli odobraté P. pastoris GS115/pPCPP4 transformanty a nechali sa rásť v 3 ml MG médiu pri teplote 30 °C za stáleho miešania do optickej hustoty (OD 600) 2 až 10. Na indukciu OspC syntézy sa 1 ml kultúry odstreďuje, premyje sa raz MM, nesuspenduje sa v 3 ml MM alebo v MMYl-médiu a inkubuje sa 2 dni pri 30 °C za stáleho miešania. Expresia OspC sa indukuje prítomnosťou metanolu v rastovom médiu. Podiely kultúry sa odoberajú a lyzáty sa analyzujú Westemovým blotovaním pomocou OspC špecifickej monoklonálnej protilátky BBM 45.
[! všetko v nasledujúcich médiách je vyjadrené ako množstvo/1
MD: kvasinková dusíková báza (YNB, 13,4 g), síran amónny (5 g), biotín (400 mg), glukóza (2 %)
MG: YNB, síran amónny, biotín, glycerol (10 ml/1), fosforečnan draselný (100 mM)
MMY: MM, kvasinkový extrakt (10 g), kazeín (20 g)].
Čistenie rekombinantného OspC
P. pastoris GS115/pPC-PP4 bunky boli izolované odstreďovaním (3000 x G, 5 minút, 4 °C). Premyté bunky sa resuspendujú v 150 mM tris/HCl pufri, pH 7,4 a táto suspenzia sa pridá k skleneným perličkám. Bunky sa potom lyžujú vytrepávaním zmesi v bunkovom mlyne Vibrogen(R) (model V14, Búhler). Lyzát sa potom odfiltruje na filtri zo sintrovaného skla, aby sa odstránili sklenené perličky. Lyzát sa odstreďuje 5 minút pri 3000 x G a pri teplote 4 °C. Supematant sa potom ďalej odstreďuje hodinu pri 100 000 x G a teplote 4 °C. „Supematant získaný pri vysokej rýchlosti“ sa použije na ďalšie čistenie OspC antigénu.
OspC antigény sa frakcionujú DEAE-chromatografiou, ktorých príklad je uvedený.
kolóna: Proteín-PAK DEAE 5PW od firmy Waters vzorka: 45 ml dialyzovaného antigénového prostriedku rovnovážny pufor (A): 10 mM tris/HCl, pH 7,5 elučný pufor (B): 10 mM tris/HCl, 1 M NaCI, pH 7,5 prietok: 4 ml/min.
stupeň: 0 % B 70 minút, 0 až 100 % 50 minút.
Kolóna sa ekvilibruje pufrom A. Antigény sa eluujú zvyšujúcimi sa množstvami NaCI. Na identifikáciu frakcií, ktoré obsahujú príslušný antigén, sa časti frakcií vyzrážajú acetónom a pelety sa analyzujú SDS-PAGE a/alebo imunoblotovaním. Frakcie z delenia DEAE ionexovou chromatografiou obohatené OspC antigénom sa ďalej čistia afinitnou chromatografiou na imobilizovanom kove, ako je to opísané v európskom patente 0 522 560.
Príprava OspC proteínu vo veľkej mierke vo fermentore
Príprava OspC bola skúmaná v kontinuálnom fermentačnom cykle. Každý cyklus bol uskutočnený s fermentorom opatreným monitormi a kontrolami pre pH, rozpustený kyslík, rýchlosť miešania, teplotu, prietok vzduchu a prietok kyslíka. Teplota bola udržiavaná na 30 °C. Výťažok buniek bol stanovovaný z mokrej hmotnosti premytých buniek.
Očká na fermentačné cykly sa nechali rásť v 2 1 Erlenmeyerových bankách obsahujúcich 500 ml modifikovaného FM21 média, ako je to opísané v európskom patente 0 263 311. Fermantačné kultúry vyrastené po dávkach boli množené s glycerolom, ako jediným zdrojom uhlíka a energie. Kontinuálne kultúry mali stály prívod glycerolu, pokiaľ koncentrácia biomasy nedosiahla 500 až 700 g hmotnosti vlhkých buniek na liter. Sotva sa odoberú kontrolné vzorky, do kultúry sa pridáva metanol ako napájanie zmesou metanol-soli-biotín počas niekoľkých dní tak, aby sa koncentrácia metanolu udržiavala medzi 0,05 a 1,5 % hmotn. Produkovaná biohmota sa každý deň odstraňuje. P. pastoris bunky sa izolujú odstreďovaním a resuspendujú sa v pufri (150 mM tris/HCl, 3 mM EDTA, lmM hydrochlorid bezamidínu, 0,01 % hmotn. NaN3, pH 7,4). Na francúzskom lise sa získajú bunkové lyzáty. Koncentrácia OspC proteínu bola stanovená spôsobom podľa Bradforda. Predbežné výsledky ukázali, že došlo k asi 100-násobne zvýšenému výťažku OspC antigénu (na objemovú jednotku kultúry) v P. pastoris v porovnaní s výťažkami získanými v kmeňoch B. burgdorferi.
Štúdie imunizácie a stimulácie (ochrany) OspC antigénu odvodeného od P. pastoris
Štúdie ochrany boli uskutočňované na gerbilách, ako je to opísané v príklade 5. Na ochrannú účinnosť bola testované 25 mg množstva OspC z P. pastoris (klonované z kmeňa Orth) alebo Borrelia kmeňa Orth, ako to ukazuje obrázok 18. Všetky gerbily imunizované OspC odvodeným od P. pastoris boli chránené proti homológnemu kmeňu Orth. Výsledky sú porovnateľné so štúdiami ochrany získanými s OspC antigénom odvodeným od Borrelia.
Claims (36)
1. VKLSESVASLSKAA,
1. Imunogénny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby v podstate vyčistených z každej z 20 bežne rozlišovaných OspC skupín na obrázku 11, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
2. TDNDSKEAILKTNGT,
2. Imunogénny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) takc množstvo materiálu obsahujúceho i) dva alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby z 20 bežne rozlišovaných OspC skupín na obrázku 11, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
3. KELTSPWAETPKKP,
3. Imunogénny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby v podstate vyčistených z každej z OspC skupiny na obrázku 19 exprimovanej jedným alebo viacerými klonmi a klonovými klastrami súvisiacimi s ochorením ľudí (HDA), alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému ospC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
4. FVLAVKEVETL,
4. Imunogénny prostriedok, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) dva alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby z OspC skupín na obrázku 19 exprimovaných jedným alebo viacerými klonmi alebo klonovými klastrami súvisiacimi s ochorením ľudí (HDA), alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
5. YAISTLITEKLKAL,
5. Imunogénny prostriedok podľa nároku 1 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že je určený na ochranu proti kmeňom B. burgdorferi prevládajúcich v príslušnej zemepisnej oblasti.
6. PNLTEISKKITDSNA,
6. Imunogénny prostriedok podľa nároku 7 na použitie v Severnej Amerike, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby v podstate vyčistených z každej z OspC skupiny 2 a 3, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou chorobou.
Ί. Imunogénny prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž 6, vyznačujúci sa tým, že tento materiál ďalej obsahuje OspA antigén z B. burgdorferi B31.
7. ASANSVKELTSPW,
8. SPWAETPKKP,
8. Imunogénny prostriedok podľa nároku 5 na použitie v Európe, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby v podstate vyčistených z každej OspC skupiny 2, 4 až 7, 9, 10, 12 až 17 a 19, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
9. GKKIQQNNGLGA a
9. Imunogénny prostriedok podľa nároku 7 na použitie v Rakúsku, vyznačujúci sa tým, že obsahuje:
a) také množstvo materiálu obsahujúceho i) jeden alebo viac OspC antigénov Borrelia lymskej choroby v podstate vyčistených z každej OspC skupiny 2, 4 až 7, 9, 10, 12 až 17 a 19, alebo ii) OspC varianty alebo OspC mimetiká uvedených OspC antigénov, pričom tieto OspC varianty alebo OspC mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému OspC, aby indukovali ochrannú imunitu, a
b) fyziologicky prijateľný nosič, ktorý je dostatočný na vyvolanie, u cicavcov, ktorí sú citliví na lymskú boreliózu, imunitnej odpovede, ktorá ich chráni pred lymskou boreliózou.
10. SPWAESPKK, alebo varianty alebo mimetiká týchto epitopov, pričom tieto varianty alebo mimetiká majú takú štruktúru, ktorá je dostatočne podobná prírodnému epitopu, aby indukovali ochrannú imunitu.
10. Imunogénny prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov 8 alebo 9, vyznačujúci sa tým, že tento materiál obsahuje antigény z OspA antigénov z Borrelia kmeňov B31, Orth, H4 a K.L10.
11. Imunogénny prostriedok podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že tento materiál obsahuje antigény zo skupiny i) alebo ii), ktoré sú vyčistené z celých buniek Borrelia lymskej choroby.
12. Imunogénny prostriedok podľa nároku 1 alebo 3, vyznačujúci sa tým, že tento materiál obsahuje antigény zo skupiny i) alebo ii), ktoré sú produkované rekombinantnými technikami v eukaryotickom hostiteľovi a sú vyčistené.
13. Imunogénny prostriedok podľa nároku 12, vyznačujúci sa tým, že hostiteľom je kvasinka.
14. Imunogénny prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že hostiteľom je P. pastoris.
15. Imunogénny prostriedok podľa nároku 1 alebo 4, vyznačujúci sa tým, že antigény obsahujú jeden alebo viac epitopov so sekvenciou aminokyselín, ktorá je vybratá zo skupiny pozostávajúcej z:
16. Imunogénny prostriedok podľa nároku 15, vyznačujúci sa tým, že obsahuje každý z epitopov 1) až 10).
17. Imunogénny prostriedok podľa nároku 15 alebo 16, vyznačujúci sa tým, že ďalej obsahuje pomocné činidlo.
18. Imunogénny prostriedok podľa nároku 17, vyznačujúci sa tým, že pomocným činidlom je hydroxid hlinitý.
19. Imunogénny prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov lažl8, vyznačujúci sa tým, že ochranným množstvom je množstvo od 1 do 100 g na antigén na dávku.
20. Imunogénny prostriedok podľa nároku 19, vyznačujúci sa tým, že ochranným množstvom je množstvo od 10 do 50 g na antigén na dávku.
21. Imunogénny prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž20, vyznačujúci sa tým, že cicavcom je človek.
22. Imunogénny prostriedok podľa ktoréhokoľvek z nárokov laž25, vyznačujúci sa tým, že ochranným množstvom je také množstvo, ktoré je preventívne pre lymskú boreliózu alebo ktoré zlepšuje lymskú boreliózu.
23. Sekvencia rekombinantnej DNA, ktorá obsahuje sekvenciu nukleotidov ktorejkoľvek sekvencie OspC génu z kmeňov 28691, 25015, SZ7, 297, ŠIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS23a, 20047, KL10, IP90, NBS1AB, KL11 a H13 podľa obrázku 8a.
24. Sekvencia rekombinantnej DNA kódujúca OspC antigény kmeňov 28691, 25015, SZ7, 297, ŠIMON, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NBS23a, 20047, KL10, IP90, NBS1AB, BITS, KL11 a H13 podľa obrázku 9a.
25. Sekvencia rekombinantnej DNA podľa nároku 23, pričom táto DNA sekvencia je aspoň z 80 % homológna s ktoroukoľvek sekvenciou OspC génu podľa obrázku 8 a.
26. Rekombinantný expresný vektor obsahujúci sekvenciu kódujúcu OspC antigén ktoréhokoľvek z 20 bežne rozlišujúcich OspC skupín podľa obrázku 11.
27. Rekombinantný expresný vektor podľa nároku 26, ktorý obsahuje sekvenciu rekombinantnej DNA podľa nárokov 23 až 25.
28. Expresný vektor podľa nároku 26 alebo 27, ktorý znamená vektor pre viac hostiteľov pre eurokaryotické/prokaryotické bunky hostiteľa.
29. Expresný vektor podľa nároku 28, ktorý sa replikuje v kvasinkách, výhodne v P. pastoris a v E. coli.
30. Expresný vektor podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 29, pričom expresia OspC génu je transkripčne kontrolovaná indukovateľným promótorom.
31. Expresný vektor podľa nároku 30, pričom expresia sekvencie kódujúcej OspC je indukovateľná metanolom.
32. Hostiteľská bunka, vyznačujúca sa tým, že je transformovaná expresným vektorom podľa ktoréhokoľvek z nárokov 26 až 31.
33. OspC antigén, ktorý
i) je kódovaný ktoroukoľvek sekvenciou podľa nárokov 23 až 25, alebo ii) má aspoň 80 % homológie.
34. Použitie kombinácie antigénov, ktoré sú obsiahnuté v imunogénnom prostriedku podľa ktoréhokoľvek z nárokov 1 až 33 na výrobu vakcíny na liečenie alebo predchádzanie lymskej boreliózy u cicavca.
35. Použitie kombinácie antigénov podľa nároku 34, pričom efektívnym množstvom je od 1 do 100 g na antigén na dávku.
36. Použitie antigénov podľa nároku 35, pričom efektívnvm množstvom je od 1 do 50 g na antigén na dávku.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5386393A | 1993-04-29 | 1993-04-29 | |
| PCT/EP1994/001365 WO1994025596A2 (en) | 1993-04-29 | 1994-04-29 | IMMUNOGENIC FORMULATION OF OspC ANTIGEN VACCINES FOR THE PREVENTION AND TREATMENT OF LYME DISEASE AND RECOMBINANT METHODS FOR THE PREPARATION OF SUCH ANTIGENS |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| SK134195A3 SK134195A3 (en) | 1996-05-08 |
| SK279968B6 true SK279968B6 (sk) | 1999-06-11 |
Family
ID=21987063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| SK1341-95A SK279968B6 (sk) | 1993-04-29 | 1994-04-29 | Imunogénny prostriedok, sekvencia rekombinantnej d |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0701612B1 (sk) |
| JP (1) | JPH08509371A (sk) |
| AT (1) | ATE162550T1 (sk) |
| AU (1) | AU683260B2 (sk) |
| CA (1) | CA2161534A1 (sk) |
| CZ (1) | CZ289212B6 (sk) |
| DE (1) | DE69408135T2 (sk) |
| DK (1) | DK0701612T3 (sk) |
| ES (1) | ES2114687T3 (sk) |
| FI (1) | FI955150A (sk) |
| HR (1) | HRP940279B1 (sk) |
| HU (1) | HU217024B (sk) |
| NO (1) | NO954318L (sk) |
| PL (1) | PL178775B1 (sk) |
| SK (1) | SK279968B6 (sk) |
| WO (1) | WO1994025596A2 (sk) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5915049A (en) * | 1992-02-25 | 1999-06-22 | Pfu Limited | Binarization system for an image scanner |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| US6716574B2 (en) | 1996-05-02 | 2004-04-06 | Dako A/S | Osp-C derived peptide fragments |
| DE896583T1 (de) * | 1996-05-02 | 2000-03-09 | Statens Seruminstitut | Neue osp-c abgeleitete peptidefragmente |
| US5846946A (en) * | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
| AT405940B (de) * | 1996-06-21 | 1999-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein |
| DE19629543C2 (de) * | 1996-07-22 | 1999-02-11 | Immuno Ag | Immunassay zum Nachweis von anti-B. burgdorferi Antikörpern und Verfahren zur Serodiagnose bei Lyme Borreliose, diagnostische Mittel und Testkits zur Durchführung der Verfahren |
| DE19740735A1 (de) | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| WO2000006745A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
| AU5751000A (en) * | 1999-06-18 | 2001-01-09 | Brook Biotechnologies, Inc. | Groups of borrelia burgdorferi and borrelia afzelii that cause lyme disease in humans |
| ES2298249T3 (es) | 2000-08-18 | 2008-05-16 | Research Foundation Of State University Of New York | Ospa modificada de borrelia burgdorferi. |
| GB2414667A (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-07 | Isis Innovation | Vaccine compositions of N. meningitidis PorA and FetA antigens |
| US7794727B2 (en) * | 2005-11-29 | 2010-09-14 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric OspC vaccinogen and diagnostic antigen |
| SG176451A1 (en) * | 2006-11-03 | 2011-12-29 | Schering Plough Ltd | Canine lyme disease vaccine |
| CZ301244B6 (cs) * | 2007-11-14 | 2009-12-16 | Bioveta, A.S. | Univerzální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a zpusob její výroby |
| CZ301548B6 (cs) * | 2008-08-20 | 2010-04-14 | Bittner@Libor | Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a lécbe Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, zpusob jeho výroby a použití |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
-
1994
- 1994-04-29 EP EP94915562A patent/EP0701612B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-29 HR HR940279A patent/HRP940279B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 DK DK94915562T patent/DK0701612T3/da active
- 1994-04-29 AU AU67229/94A patent/AU683260B2/en not_active Ceased
- 1994-04-29 ES ES94915562T patent/ES2114687T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-29 HU HU9502002A patent/HU217024B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 JP JP6523899A patent/JPH08509371A/ja not_active Ceased
- 1994-04-29 DE DE69408135T patent/DE69408135T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-29 SK SK1341-95A patent/SK279968B6/sk unknown
- 1994-04-29 PL PL94311301A patent/PL178775B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 WO PCT/EP1994/001365 patent/WO1994025596A2/en active IP Right Grant
- 1994-04-29 AT AT94915562T patent/ATE162550T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 CZ CZ19952839A patent/CZ289212B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 CA CA002161534A patent/CA2161534A1/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-10-27 NO NO954318A patent/NO954318L/no not_active Application Discontinuation
- 1995-10-27 FI FI955150A patent/FI955150A/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0701612B1 (en) | 1998-01-21 |
| WO1994025596A3 (en) | 1994-12-22 |
| ATE162550T1 (de) | 1998-02-15 |
| HU9502002D0 (en) | 1995-08-28 |
| DE69408135D1 (de) | 1998-02-26 |
| EP0701612A1 (en) | 1996-03-20 |
| JPH08509371A (ja) | 1996-10-08 |
| NO954318L (no) | 1995-12-29 |
| WO1994025596A2 (en) | 1994-11-10 |
| NO954318D0 (no) | 1995-10-27 |
| DK0701612T3 (da) | 1998-09-21 |
| AU683260B2 (en) | 1997-11-06 |
| PL178775B1 (pl) | 2000-06-30 |
| CZ289212B6 (cs) | 2001-12-12 |
| HU217024B (hu) | 1999-11-29 |
| FI955150A (fi) | 1995-12-28 |
| DE69408135T2 (de) | 1998-06-10 |
| HUT72923A (en) | 1996-06-28 |
| SK134195A3 (en) | 1996-05-08 |
| AU6722994A (en) | 1994-11-21 |
| FI955150A0 (fi) | 1995-10-27 |
| ES2114687T3 (es) | 1998-06-01 |
| PL311301A1 (en) | 1996-02-05 |
| HRP940279A2 (en) | 1997-10-31 |
| HRP940279B1 (en) | 2000-12-31 |
| CA2161534A1 (en) | 1994-11-10 |
| CZ283995A3 (en) | 1996-03-13 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5747294A (en) | Compositions and methods for the prevention and diagnosis of lyme disease | |
| EP0650527B1 (en) | Improvement in borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis | |
| US6486130B1 (en) | Immunogenic formulation of OSPC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens | |
| CA2294701C (en) | Surface antigens and proteins useful in compositions for the diagnosis and prevention of lyme disease | |
| CZ280743B6 (cs) | Imunogen proti lymské boreliose savců | |
| SK279968B6 (sk) | Imunogénny prostriedok, sekvencia rekombinantnej d | |
| EP1123403A1 (en) | OMP85 PROTEINS OF $i(NEISSERIA GONORRHOEAE) AND $i(NEISSERIA MENINGITIDIS), COMPOSITIONS CONTAINING SAME AND METHODS OF USE THEREOF | |
| US5777095A (en) | Osp A and B Sequence of Borrelia burgdonferi strains ACA1 and IP90 | |
| US5324630A (en) | Methods and compositions for diagnosing lyme disease | |
| Layh-Schmitt et al. | Localization and biochemical characterization of the ORF6 gene product of the Mycoplasma pneumoniae P1 operon | |
| CA2077434C (en) | Antigenic proteins of borrelia burgdorferi | |
| US7169393B2 (en) | Antigenic peptide fragments of VapA protein, and uses thereof | |
| AU712882B2 (en) | Leptospira membrane proteins | |
| WO1994020536A1 (en) | Methods, compositions, and kits for diagnosing lyme disease | |
| AU704821B2 (en) | New 17-KDA brucella abortus antigen, recombinant polypeptides, nucleic acids coding for the same and use thereof in diagnostic and prophylactic methods and kits | |
| AU645078C (en) | Antigenic proteins of (borrelia burgdorferi) |