HU217024B - Immunogén OspC-antigén vakcinakészítmények a Lyme-kór megelőzésére és kezelésére, valamint eljárások ilyen antigének előállítására - Google Patents
Immunogén OspC-antigén vakcinakészítmények a Lyme-kór megelőzésére és kezelésére, valamint eljárások ilyen antigének előállítására Download PDFInfo
- Publication number
- HU217024B HU217024B HU9502002A HU9502002A HU217024B HU 217024 B HU217024 B HU 217024B HU 9502002 A HU9502002 A HU 9502002A HU 9502002 A HU9502002 A HU 9502002A HU 217024 B HU217024 B HU 217024B
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- ospc
- priority
- antigens
- amendment
- strains
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 139
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 139
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 139
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims abstract description 128
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 70
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 62
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 title claims description 55
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 10
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 title claims description 5
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 title abstract description 14
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 410
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 17
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract 6
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 claims description 46
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims description 44
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 44
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 43
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 35
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 34
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 33
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 26
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 20
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 claims description 18
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 16
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 16
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 15
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims description 14
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 12
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 12
- 238000002649 immunization Methods 0.000 claims description 12
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 11
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 7
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 102000034342 Calnexin Human genes 0.000 claims description 4
- 108010056891 Calnexin Proteins 0.000 claims description 4
- 101150107995 ACA1 gene Proteins 0.000 claims description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical group [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 3
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 2
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 3
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 claims 2
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 claims 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 57
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 abstract description 34
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 abstract 1
- 108700005078 Synthetic Genes Proteins 0.000 abstract 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 abstract 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 abstract 1
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 abstract 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 45
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 44
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 27
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 26
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 25
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 24
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 24
- 101150055083 ospC gene Proteins 0.000 description 22
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 20
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 description 20
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 16
- 241000894007 species Species 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 13
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 description 11
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 11
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 11
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 11
- 238000011161 development Methods 0.000 description 10
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 10
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 10
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 10
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N [CH2]CN(CC)CC Chemical group [CH2]CN(CC)CC MZVQCMJNVPIDEA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 9
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 8
- 238000007621 cluster analysis Methods 0.000 description 8
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 8
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 7
- 206010052057 Neuroborreliosis Diseases 0.000 description 7
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 6
- 101710181478 Envelope glycoprotein GP350 Proteins 0.000 description 6
- 241000700146 Gerbillus Species 0.000 description 6
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 6
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 6
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 6
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 6
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 5
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 5
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- 102000004139 alpha-Amylases Human genes 0.000 description 4
- 108090000637 alpha-Amylases Proteins 0.000 description 4
- 229940024171 alpha-amylase Drugs 0.000 description 4
- -1 aluminum compound Chemical class 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 4
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 4
- 208000017520 skin disease Diseases 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000000022 2-aminoethyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])N([H])[H] 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 3
- 230000003302 anti-idiotype Effects 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 3
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 3
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 3
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N Adamantane Natural products C1C(C2)CC3CC1CC2C3 ORILYTVJVMAKLC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101710194180 Alcohol oxidase 1 Proteins 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 2
- 108091033380 Coding strand Proteins 0.000 description 2
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 2
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 2
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 241001180364 Spirochaetes Species 0.000 description 2
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000012872 hydroxylapatite chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 2
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 2
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 2
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 2
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 5-(piperidin-1-ylmethyl)-3-pyridin-3-yl-5,6-dihydro-2h-1,2,4-oxadiazine Chemical compound C1CCCCN1CC(N=1)CONC=1C1=CC=CN=C1 QWVRTSZDKPRPDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 201000004625 Acrodermatitis Diseases 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 241000193830 Bacillus <bacterium> Species 0.000 description 1
- 241001034584 Borrelia burgdorferi 297 Species 0.000 description 1
- 241000448699 Borrelia burgdorferi ZS7 Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 101150111062 C gene Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 108700010070 Codon Usage Proteins 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 238000007900 DNA-DNA hybridization Methods 0.000 description 1
- 241000620209 Escherichia coli DH5[alpha] Species 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 108010040721 Flagellin Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 101000629361 Homo sapiens Paraplegin Proteins 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 1
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 241001506991 Komagataella phaffii GS115 Species 0.000 description 1
- 229920001491 Lentinan Polymers 0.000 description 1
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 1
- 208000023178 Musculoskeletal disease Diseases 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102100027006 Paraplegin Human genes 0.000 description 1
- 101150005926 Pc gene Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 101100173636 Rattus norvegicus Fhl2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035056 Tick-Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 101000980463 Treponema pallidum (strain Nichols) Chaperonin GroEL Proteins 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 206010000594 acrodermatitis chronica atrophicans Diseases 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000027645 antigenic variation Effects 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N benzenecarboximidamide;hydron;chloride Chemical compound [Cl-].NC(=[NH2+])C1=CC=CC=C1 LZCZIHQBSCVGRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000007434 bsk-medium Substances 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001446 dark-field microscopy Methods 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 229960000633 dextran sulfate Drugs 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 1
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 230000009567 fermentative growth Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 1
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001597 immobilized metal affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 239000002198 insoluble material Substances 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229940115286 lentinan Drugs 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000012569 microbial contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 238000000302 molecular modelling Methods 0.000 description 1
- 229940031348 multivalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 102000014187 peptide receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010011903 peptide receptors Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000447 polyanionic polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000002987 primer (paints) Substances 0.000 description 1
- 238000003906 pulsed field gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 1
- 239000000376 reactant Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000009589 serological test Methods 0.000 description 1
- 238000007390 skin biopsy Methods 0.000 description 1
- 206010040882 skin lesion Diseases 0.000 description 1
- 231100000444 skin lesion Toxicity 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000009987 spinning Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 1
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000000856 sucrose gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000003932 urinary bladder Anatomy 0.000 description 1
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/20—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
A találmány Lyme-kórt őkőzó Bőrrelia bűrgdőrferi törzsekből származóOspC-antigéneket, illetve ezek variánsait vagy űtánzatait tartalmazóimműnőgén készítményekre, ilyen antigéneket kódőló rekőmbináns DNS-szekven- ciákra, ezeket tartalmazó rekőmbináns expressziós vektőrőkra,ezekkel transzfőrmált gazdasejtekre és rekőmbináns útőn termelt OspC-antigénekre, valamint mindezek előállítására vőnatkőzik. Az OspC-antigének szerőlógiai, genőtipikűs és járványtani infőrmációk alapjáncsőpőrtősíthatók. Az imműnőgén készítményekben alkalmazőtt antigéneketúgy választják ki, hőgy azők az említett csőpőrtők reprezentatívmintáját alkőssák, és így a kialakítőtt vakcina a lehető legkevesebbszámú antigén alkalmazásával a legnagyőbb keresztvédettségetbiztősítsa. ŕ
Description
A találmány a Lyme-kór emlősökben való megelőzésére és kezelésére vonatkozik. A találmány tárgya az OspC különböző szerológiai formáit tartalmazó immunogén készítmények a Lyme-kór kialakulásának késleltetéséhez vagy megelőzéséhez. A találmány további tárgya rekombináns eljárások új antigének előállítására.
A Lyme-kór vagy Lyme borreliosis elnevezést a kullancs hordozta Lyme-kór Borrelia által okozott spirocheta-fertőzéssel kapcsolatos különféle klinikai tünetek leírására használják. A Lyme-kór általános megnyilvánulásai közé tartoznak a bőrt [erythema migrans (EM) vagy acrodermatitis chronica atropicans (ACA)], az idegrendszert (neuroborelliosis) és az ízületeket (arthritis) károsító betegségek, de egyéb szervek és szövetek is fertőződhetnek, illetve megbetegedhetnek. A Lymekór világszerte elteqedt, s az Amerikai Egyesült Államokban és Európában ez a leggyakoribb kullancs hordozta betegség. A Lyme-kórral kapcsolatos általános klinikai tünetek skálája Európában szélesebb, mint az Amerikai Egyesült Államokban; a bőrt és idegrendszert érintő rendellenességek Európában általánosak, míg az Amerikai Egyesült Államokban ritkák, ezzel szemben az arthritis az Amerikai Egyesült Államokban gyakoribb, mint Európában. Úgy tűnik, az Észak-Amerikában tapasztalható klinikai tünetek az európaiak alcsoportját képezik.
A Lyme-kórt rendszerint antibiotikumokkal kezelik, a kezelést azonban a gyakori összetett klinikai körkép és a megbízható, hozzáférhető diagnosztikai tesztek hiánya hátráltathatja. Ha a betegséget hagyjuk krónikus stádiumba jutni, az antibiotikumos kezelés bonyolultabb és nem mindig sikeres. Egy hosszabb ideig tartó fertőzés esetén továbbá fokozódik annak valószínűsége, hogy állandó károsodás alakuljon ki. Ezek miatt szükség van a Lyme-kór kialakulását megakadályozó vakcinára.
A Lyme-kórt okozó Borreliában két olyan antigént írtak le, amely a Lyme-kór állatmodelleken végzett vizsgálatai alapján védelmet nyújthat a Borrelia okozta fertőzések és betegségek ellen. Ez a két antigén [OspA és OspC (vagy pC)] ilyenformán jó eséllyel alkalmazható a Lyme-kór ellen kialakított vakcinákban (lásd Simon és munkatársai, 418 827 számú európai szabadalom; Fikrig és munkatársai, Science, 250, 553-556, 1990; PreacMursic és munkatársai, Infection, 20, 342-349, 1992). Az OspA és OspC sok közös jellemzővel rendelkezik. Mindkettő sejtfelületi lipoprotein (Howe és munkatársai, Science, 227, 645-646, 1985; Bergstrom és munkatársai, Mól. Microbiol., 3, 479-486, 1989); mindkettőt plazmid kódolja (Barbour és munkatársai, Science, 23 7, 409-411, 1987; Marconi és munkatársai, J. Bacteriol., 175, 926- 932,1993); génjeik a legtöbb törzsben megtalálhatók (Barbour és munkatársai, J. Infect. Dis., 152, 478-484, 1985; Marconi és munkatársai, J. Bacteriol., 175, 926-932, 1993); és mindkettő több, szerológiailag eltérő alakban létezik (Wilske és munkatársai, 1989).
Ezenkívül S. Jauris-Heipke és munkatársai a Medical Microbiology and Immunology, 182(1), 37-50 (1993) irodalmi helyen Borrelia burgdorferi OspC-jét és flagellinjét kódoló gének genetikus heterogenitását ismertetik, és leírják az OspC Lyme-kór elleni vakcinákban antigénként való alkalmazhatóságát.
A Lyme-kór legtöbb (vagy valamennyi) formája ellen védelmet biztosító OspA- és/vagy OspC-vakcina kifejlesztését gátolja, hogy ezek az antigének több, szerológiailag eltérő alakban léteznek. Például Fikrig és munkatársai (J. Immun., 148, 2256-60, 1992) bebizonyították, hogy az OspA szerológiai alakjával, mint például az N40 törzs rekombináns OspA-antigénjével végzett immunizálás nem jelent védelmet egy eltérő OspA-t expresszáló másik törzs (például a 25 015) ellen. Ennek megfelelőn az antigén (vagyis az OspA és/vagy OspC) különböző változatainak osztályozásához és csoportosításához tipizálási rendszereket kell kifejleszteni, hogy meghatározhassuk az antigén(ek) szerológiailag eltérő alakjainak azon optimális keverékét, amely a széles körű védelem biztosításához szükséges.
Az OspA-antigén számára - tipizálóeszközként korlátozott számú monoklonális antitest felhasználásával szerotipizálási rendszert fejlesztettek ki, s e módszer alkalmazásával meghatározott hét OspA-szerotípust írtak le (Wilske és munkatársai, Ann. N. Y. Acad. Sci., 539, 126-143, 1988). 55 különböző európai és észak-amerikai törzsből származó OspA-gén restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmus (RFLP) analízisével hat különböző genocsoportot azonosítottak (Wallich és munkatársai, Infection and Immunity, 60, 4856-4866, 1992). Az észak-amerikai izolátumokból származó OspA-proteinek meglehetősen egységesnek tűnnek, mivel 14 OspA közül 12 az OspA I típusba, kettő pedig az OspA III típusba tartozott. Ezzel szemben az európai izolátumokból származó OspA-proteinek sokkal heterogénebbek, s az OspA I- (18), OspA II- (17), OspA IV- (4) és OspA V- típus (1) egyaránt képviselve volt. 12 OspAprotein szekvenciaadatai alapján készített filogenetikai származási fa alátámasztja az RFLP-analízis eredményeit, de a hat genocsoportból kettő izolátumainak szekvenciaadatai még mindig hiányoznak. Az OspC-antigénekre jelenleg nem létezik tipizálási rendszer.
Egy másik szempont, amit a vakcinában való alkalmazáshoz megfelelő antigének kiválasztásakor figyelembe kell venni, hogy azok a betegség szempontjából járványtanilag lényeges törzsekből származnak-e. Az 1970-es évek közepén feltételezték, hogy a patogén baktériumok közeli rokonságban álló baktériumok korlátozott számú kiónjaiból alakulnak ki, amelyek a betegség okozását illetően valamilyen módon szelektív előnnyel rendelkeznek. Ezt a klonális hipotézist azóta bebizonyították (Achtman és munkatársai, J. Infect. Dis., 165, 53-68, 1992). A fentiek alapján igen valószínű, hogy a természetben található számos Lymekórt okozó Borrelia törzs között kevés olyan „klón” létezik, amely jól adaptálódott az emlős, és különösen a humán betegségek előidézéséhez. Az emlősökben (és így emberekben) kialakult betegségek elleni vakcinák kifejlesztése szempontjából óriási jelentősége van a betegséggel kapcsolatos kiónok azonosításának, melynek eredményeként a további erőfeszítések ezek ellen irányulhatnak. Ennek megfelelően a Lyme-kórt okozó Borrelia faj populációszerkezetének tisztázására és a
HU 217 024 Β betegséggel kapcsolatos kiónok azonosítására van szükség.
Napjainkig számos eljárást alkalmaztak a Lyme-kórt okozó Borrelia populációszerkezetének meghatározására, köztük a) genom DNS vagy specifikus gének RFLPanalízisét (LeFebvre és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 27,636-639,1989; Marconi és Garon, J. Bacteriol., 174, 241-244, 1992; Postic és munkatársai, Rés. Microbiol., 141, 465-475, 1990; Stahlhammar-Carlemalm és munkatársai, Zbl. Bak., 274, 28-39, 1990; Adam és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2579-2585,1991; Wallich és munkatársai, Infect. Immun., 60, 4856-4866, 1992); b) DNS-DNS hibridizációt (LeFebvre és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 27,636-639,1989; Postic és munkatársai, Rés. Microbiol., 141,465-475,1990); c) 16S rRNSvizsgálatát oligonukleotid-próbákhoz történő hibridizálással (Marconi és munkatársai, J. Clin. Microbiol., 30, 628-632,1992), illetve szekvenálással (Adam és munkatársai, Infect. Immun., 59, 2579-2585, 1991; Marconi és Garon, J. Bacteriol., 174, 241-244, 1992); d) önkényesen kiválasztott primerrel végzett polimeráz láncreakcióval megvalósított fingerprint-analízist (Welsh és munkatársai, Int. J. System. Bacteriol., 42, 370-377, 1992); (E) többlókuszos enzimelektroforézist (Boerlin és munkatársai, Infect. Immun., 60, 1677-1683, 1992); és (F) izolátumok szerotipizálását (Peter és Bretz, Zbl. Baktk., 277, 28-33,1992).
A fenti, különböző eljárásokkal kapott eredmények jó egyezést mutatnak. Általánosan azt mondhatjuk, hogy a Lyme-kórt okozó őorre/za-izolátumok legalább három fő csoportra oszthatók. Néhány kutató úgy tartja, hogy e csoportok tagjai között genetikai különbségek elégségesek ahhoz, hogy három külön fajba soroljuk őket: ezek a szoros értelemben vett B. burgdorferi (B31 típustörzs), a B. garinii új faj (20047-es típustörzs) és a B. afzelii névvel vagy „VS461 őorre/ia-csoport” névvel jelzett faj (lásd Baranton és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 42, 378-383,1992; Marconi és Garon, lásd fentebb).
E különböző csoportok létezésének jelentősége a vakcina kifejlesztése szempontjából tisztázásra vár. Wallich és munkatársai adataiból (Infection & Immunity, 60, 4856-4866, 1992) világos, hogy szoros kapcsolat van a genocsoport (melyhez egy adott izolátum tartozik) és a termelt OspA-típusa között: a B31 törzset magában foglaló csoportból (AAA genocsoport vagy a szoros értelemben vett B. burgdorferi) származó izolátumok közül mind a harminc vizsgált törzs I. típusú OspA-t termel; a 20 047-es törzset magában foglaló csoportból (BBB genocsoport vagy B. garinii sp. nov.) származó izolátumok rendszerint II. típusú OspA-t termelnek (19-ből 17 esetben), de megfigyeltek V. típusba (19ből egy esetben) és VI. típusba (39-ből 3 esetben) tartozó OspA-t is; A BO23 törzset magában foglaló csoportból származó izolátumok (BBA genocsoport vagy VS461 csoport) IV. típusú OspA-t termelnek; a többi két izolátum pedig (Β, B/A, A genocsoport) ΙΠ. típusú OspA-t termel.
Az Észak-Amerikából származó, Lyme-kórt okozó Borre/ia-izolátumok többségükben egy csoporthoz (AAA genocsoport vagy szoros értelemben vett B.
burgdorferi) tartoznak, melyet a B31 törzs képvisel, és ennek megfelelően I. típusú OspA-t termelnek. Ez arra enged következtetni, hogy az I. típusú OspA-t tartalmazó vakcina elégséges lehet az Észak-Amerikában jelenleg Lyme-kórt okozó izolátumok többsége elleni védelem biztosításához. Európában összetettebb a helyzet, mivel mind a három csoport megtalálható, s ennek következtében a termelt OspA-típusok (I., II„ IV., V. és VI. genotípus) fokozott diverzitásban vannak jelen. Ezenkívül európai Lyme-kór kórokozók alkalmazásával végzett két vizsgálatban az OspA nem volt védőhatású, ami szintén az OspC védőhatású antigénként való alkalmasságát bizonyítja (lásd EP-A-0 522 560 számú dokumentum; Preac-Mursic és munkatársai, Infection, 20,342-349, 1992).
Mind ez idáig ismeretlen volt, hogy az OspC a
Lyme-kór kórokozó izolátumok egyes csoportjaira (azaz a szoros értelemben vett B. burgdorferi, a B. garinii új faj vagy a VS461 csoport) korlátozódó specifikus OspCtípusokkal klonálisan öröklődik-e. Mivel az OspC-t plazmid kódolja (Marconi és munkatársai, J. Bacteriol., 175, 926-932, 1993), valószínű volt, hogy a Lyme-kór kórokozó izolátumok különböző fajai között létezik az OspC-gén plazmid közvetítette áramlása. Ebben az esetben a különböző OspC-típusok (melyek létezése ismert, de nincsenek meghatározva) nem szükségszerűen klonálisan öröklődnek.
A találmány tárgya emlősök Lyme-kór elleni hatásos
OspC-vakcina előállítása, amely valamennyi törzs tekintetében széles körű keresztvédettségi szintet biztosít, melynek során az OspC-készítményeket fenotípusos tipizálással (OspC szerológiaiváltozat-tipizálás) és RFLPtipizálási vizsgálatokkal, valamint a világ különböző helyeiről származó számos sokféle törzs szekvenciaanalízisével választjuk ki.
Felfedeztük továbbá, hogy az OspC-gén klonálisan öröklődik, s ennek folytán lehetőség nyílik az OspC-tipizálási rendszerek eredményeit „közös membránantigén-tipizálási” (CMAT) rendszerből (melyet az alábbiakban mutatunk be) származó járványtani információk alapján értelmezni. A CMAT-rendszer a Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek klonális populációszerkezetének értelmezésére alkalmazható. Ezenkívül szintén lehetőség van a legmegfelelőbb OspC-vakcinakészítmények kiválasztására, akár a) egy meghatározott földrajzi területen uralkodó törzsek elleni védelemhez alkalmas vakcinák tervezése céljából, akár b) specifikus vagy elsősorban a B. burgdorferi járványtanilag fontos, betegséggel kapcsolatos kiónjai vagy klonális klaszterei elleni védelemhez.
Ennek megfelelően a találmány egyik tárgya immunogén készítmény, amely
a) Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lymeborreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból [amely i) a jelenleg ismert, all. ábrán feltüntetett húsz OspCcsaládból tisztított egy vagy több, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigént vagy ii) az említett OspCantigének OspC-változatait, vagy OspC-utánzatait tartalmazza, melyek a védőhatású immunitás indu3
HU 217 024 Β kálása szempontjából az eredeti OspC-antigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek], valamint
b) fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll.
A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint a fenti immunogén készítmény a jelenleg felismert, a 11. ábrán feltüntetett húsz OspC-családból származó egy vagy több, előnyösen két vagy több Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigénből vagy annak ii) pontban meghatározott OspC-változatából vagy OspC-utánzatából és a b) pontban meghatározott fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll.
A találmány egy további tárgya olyan immunogén készítmény, amely a Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lyme-borreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból [amely i) a 19. ábrán feltüntetett OspC-családokból tisztított, az emberi betegséggel kapcsolatos (HDA) egy vagy több klón vagy klonális klaszter által expresszált, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigén közül egyet vagy többet, vagy ii) az említett OspC-antigének OspCváltozatait vagy OspC-utánzatait tartalmazza, melyek a védőhatású immunitás indukálása szempontjából az eredeti OspC-antigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek], valamint fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll.
Egy előnyben részesített megvalósítási módban a fenti immunogén készítmény a 19. ábrán feltüntetett OspC-családokból származó egy vagy több OspC-antigénből vagy annak ii) pontban meghatározott OspCváltozatából vagy OspC-utánzatából, valamint fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll.
A találmány további tárgya egy adott földrajzi területen, mint például Európában vagy Ausztráliában uralkodó, Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek elleni védelemre tervezett immunogén készítmény. A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási módjában az immunogén készítmény kombinált OspA/OspC-vakcina, amely jobb hatású, mint bármelyik, egyetlen antigénnel készített vakcina.
A találmány további tárgya rekombináns eljárások új OspC-antigének előállítására, továbbá DNS-szekvenciák, expressziós vektorok és transzformált gazdasejtek.
A találmány egyéb tárgyai, jellemzői és előnyei a következő, részletes leírásból lesznek érthetők. Tudni kell azonban, hogy a részletes leírást és a specifikus példákat - miközben jelezzük a találmány előnyös megvalósítási módjait - csupán illusztrációként mutatjuk be, mivel a találmány tárgykörébe tartozó különböző változtatások és módosítások lehetségesek.
Az ábrák rövid leírása
Az 1. ábrán 77 Borrelia törzset mutatunk be, melyeket a kísérleti vizsgálathoz használtunk. Feltüntetjük a származási országot és a biológiai forrást, melyből a törzseket izoláltuk (ember, kullancs vagy állat). Szintén feltüntetjük az emberi izolátumok közelebbi származási helyét (bőr, vér, CSF: agy-gerincvelői folyadék stb.) és a betegség tüneteit (ACA: acrodermatitis chronica atrophicans; EM: Erythema migrans). Öt további, kísérletesen nem vizsgált törzs tulajdonságait is felsoroljuk, mivel néhány vizsgálatban felhasználtunk ezen törzsekre vonatkozó, publikált információkat is.
A 2. ábrán a törzseket számunkra biztosítók címét soroljuk fel.
A 3. ábrán a monoklonális antitesteket és általános membránantigén sajátosságaikat soroljuk fel. Az ábrán feltüntetjük a homológ reagálótörzseket és a monoklonális antitestek izotípusát.
A 4. ábrán a CMAT-tipizálási rendszerrel elemzett CMAT-ok egyéni pontértékeit és jellemző törzseit mutatjuk be.
Az 5. ábrán a CMAT-tipizálási adatok alapján végzett klaszteranalízis dendrogramját mutatjuk be. A CMAT-ok tesztelt törzsek közötti előfordulási gyakoriságát szintén feltüntetjük, csakúgy, mint az egyes CMAT-ok CMAT-klaszterekbe (50%-nál nagyobb hasonlóságot mutató CMAT-ok) és CMAT-alcsoportokba (20%-nál nagyobb hasonlóságot mutató CMAT-ok) történő besorolását.
A 6. ábrán 16 OspC-specifikus monoklonális antitest különböző szerológiai változatok típustörzseivel megfigyelt reagálási módját mutatjuk be.
A 7. ábrán a 4. példában leírtak szerint előállított, PCR-technikával amplifikált ospC-gének Dprül, Dde\ és DraX enzimekkel végzett emésztésével kapott restrikciós fragmensek méretét mutatjuk be. A bemutatott adatok a restrikciós fragmensek 35 egyedi mintázatát mutatják (vagyis 35 ospC RFLP-típust), amit a felsorolt 82 törzsből származó restrikciósffagmens-adatok vizsgálatával állapítottunk meg. Az ábrán feltüntetjük az egyes ospC RFLP-típusokat képviselő törzseket is.
A 8. ábrán az 1 -24. ospC RFLP-típusokba tartozó törzsekből kiválasztott 24 ospC-gén egymás alá rendezett (alignment) részleges nukleotidszekvenciáját mutatjuk be.
A 8a. ábrán a 8. ábrán bemutatott új o.vpC-gének teljes szekvenciáját (3’-végükkel együtt), valamint a H13 és 28 691 törzs asjC-génjeinek szekvenciáit mutatjuk be.
A 9. ábrán a 8. ábrán bemutatott nukleotidszekvenciákból leszármaztatott, egymás alá rendezett aminosavszekvenciákat mutatjuk be. A szekvenált régió az érett OspC-protein első 92%-ának felel meg.
A 9a. ábrán a 9. ábrán bemutatott új OspC-antigének C-terminálist is magukban foglaló teljes aminosavszekvenciáját, valamint a Hl 3 és 28691 törzs OspCantigénjeinek szekvenciáját mutatjuk be.
A 10. ábrán a 9. ábrán bemutatott OspC-proteinszekvenciák dendrogramja látható, amivel a szekvenciák közötti filogenetikai rokonságokat és a szekvenciák azonosságának mértékét ábrázoljuk. Ezt a vizsgálatot az OspC-proteinek OspC-családokba sorolásához használtuk. Az egy OspC-családba tartozó proteinek 80%-nál nagyobb azonosságot mutató OspC-szekvenciákkal rendelkeznek. Az is látható, hogy az OspC-proteinek fajspecifikus módon rendeződnek csoportokba, ami azt jelzi, hogy az OspC-protein klonálisan öröklődik.
All. ábrán a 20 OspC-családot és az adott családot képviselő típustörzseket soroljuk fel.
HU 217 024 Β
A 12. ábrán az 1. ábrán bemutatott 82 törzs CMATés OspC-tipizálási analízisének eredményeit foglaljuk össze. Az adatokat OspC-család és RFLP-típus szerint csoportosítottuk, hogy megmutassuk az egyes törzsek adott OspC-családhoz tartozásának gyakoriságát. Az OspC-családba nem sorolt törzseket 99-cel jelöljük. Feltüntetjük a biológiai és földrajzi eredetet is, hogy ezeket összehasonlíthassuk az OspC-családokkal. Öt olyan törzs esetében is kijelöltünk CMAT-értékeket, amelyekről publikált leírással rendelkeztünk (de ezeket nem teszteltük). Ezek a B. burgdorferi, B. afzelii és B. garinii, melyek 1, 3 és 4 CMAT-értékeknek felelnek meg. Az OspC szerológiai változatokat nem határoztuk meg mindegyik törzsnél; öt törzs nem állt rendelkezésünkre (NA), másokat nem teszteltünk (NT), mert a megbízható tipizáláshoz nem tartalmaztak elegendő mennyiségű OspC-t, ismét más törzsek pedig nem voltak reaktívak a monoklonális antitestekkel (NR).
A 13. ábrán a feltérképezett OspC-epitópok szekvenciáit és a vizsgált törzsekben tapasztalható előfordulási gyakoriságukat tüntetjük fel. A táblázat alján a monoklonális antitestek csoportosítását mutatjuk be, amelyet annak alapján készítettünk, hogy a vizsgált 77 törzzsel milyen gyakorisággal reagálnak.
A 14. ábrán az általánosított OspC-protein térképét mutatjuk be, feltüntetve a különböző BBM monoklonális antitest epitópjainak elhelyezkedését (amit az antitestek számával jelölünk).
A 15. ábrán a Gerbillus- (egér) modell alkalmazásával végzett aktív immunizálás eredményeit mutatjuk be. Az állatok csoportjait tisztított OspC-proteinváltozattal immunizáltuk, amely a fertőző Orth törzzsel azonos OspC-családból (H7) vagy más családból (ZS7, PKO és W) származott. Az eredmények azt jelzik, hogy erős keresztvédelem tapasztalható, ha az állatokat a fertőző törzs által expresszálttal megegyező családba tartozó variánssal immunizáljuk, de kismértékű vagy semmilyen védelem nincs, ha az állatokat a fertőző törzstől eltérő OspC-családba tartozó OspC-változattal immunizáljuk.
A 16. ábrán az OspC-tipizálási információkat és a humán izolátumok különböző OspC-típusok közötti megoszlását mutatjuk be. Feltüntetjük a Cseh Köztársaságból származó humán Lyme-kóros szérumban jelen lévő OspC-antitestek specifitását és gyakoriságát is. Az OspC-antitest-specifitást a 16 OspC-családot képviselő 18 különböző Borrelia törzs elleni teszteléssel határoztuk meg.
A 17. ábrán az OspC kódoló szekvenciát a metanollal indukálható AOX-1 promoter transzkripciós szabályozása alatt tartalmazó pPC-PP4 élesztő expressziós vektort mutatjuk be.
A 18. ábrán a Gerbillus-modell alkalmazásával végzett aktív immunizálási kísérletek eredményeit mutatjuk be. Az állatokat a B. burgdorferi Orth törzsből származó, tisztított OspC-proteinnel és a P. pastoris GS115/pPC-PP4-ből rekombináns módszerekkel előállított OspC-proteinnel immunizáltuk. Az eredmények mind a Borrelia, mind az élesztő eredetű OspC-protein esetében erős védőhatást mutatnak.
A 19. ábrán a Lyme-kórt okozó Borrelia specifikus humán betegséggel kapcsolatos kiónjai vagy klonális klaszterei elleni védelem érdekében kialakított OspCvakcinakészítmények példáit mutatjuk be.
A későbbiekben részletesebben leírt szerológiai változatok, restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmus (RFLP) és szekvenálási vizsgálatok alapján felfedeztük, hogy az OspC-proteinek - annak ellenére, hogy a különböző Lyme-kór izolátumokban nagyfokú heterogenitást mutatnak - többek között aminosavszekvenciájuk hasonlóságai alapján korlátozott számú családokba sorolhatók. A találmány értelmében az e felfedezésből következő eredményeket olyan vakcinakészítmények kialakításában használjuk fel, amelyek a különböző törzseket illetően magas szintű keresztvédettséget biztosítanak, s amelyeket korábban nem valósítottak meg.
A keresztvédettség megvalósítása érdekében meg kell tudnunk jósolni az adott vakcina komponenseinek valamennyi lehetséges, betegséget okozó törzs elleni védőhatékonyságát. A találmány értelmében ezt a problémát annak biztosításával küzdjük le, hogy a vakcina védőhatású antigénkomponenseinek heterogenitása optimálisan tükrözze a természetben található heterogenitást. Az OspC-proteinek esetében ezt olyan vakcinák előállításával oldjuk meg, amelyek az itt leírt szekvenciaanalízisekkel kimutatott OspC-családok valamennyi képviselőjét tartalmazzák. Az ilyen készítmények egyik példája egy vakcinában a fentebb említett OspC-családok mindegyikét képviselő húsz OspC-proteint tartalmazza. Egy OspC-család definíció szerint olyan OspCproteinek csoportja, amelyek az érett OspC-protein első 92%-át tekintve [vagyis a 18 aminosavas vezérlőszekvenciát és az utolsó 16 aminosavat figyelmen kívül hagyva (9., 9a. és 10. ábra)] több, mint 80%-os aminosavszekvencia-azonosságot mutatnak.
A találmány egyik tárgya immunogén készítmény, amely az először általunk leírt 20 OspC-család mindegyikéből tisztított egy vagy több OspC-antigént tartalmaz. A például maximálisan húsz antigén alkalmazása javítást jelent ahhoz a lehetőséghez képest, hogy valamennyi, természetben található lehetséges OspC-változatot (vesd össze az itt leírt 35 OspC RFLP-típussal) a készítménybe foglaljuk. A találmány egy másik szempontja értelmében a Lyme-kór elleni vakcinakészítményt úgy egyszerűsítjük még jobban, hogy az OspCtipizálási adatok és járványtant adatok kombinálásával korlátozzuk az antigén hatású komponensek számát, oly módon, hogy ez ne csökkentse a vakcina védőhatékonyságát. E megközelítés (melyet az alábbiakban részletesebben leírunk) példái A) az egy földrajzi területen, például Európában vagy egy konkrét országban, például Ausztriában alkalmazható vakcinakészítmény kialakítása; B) olyan vakcina kialakítása, amellyel specifikusan azon (CMAT-analízissel azonosított) kiónokat célozzuk meg, amelyek emberi betegséggel kapcsolatosak. Az A) pontban említett egyik megvalósítási módban Eszak-Amerikában alkalmazható vakcinát készítünk, amely csak amerikai törzsekben (nevezetesen a 2. és 3. családban; lásd 12. ábra) megfigyelt OspC-családokat képviselő antigéneket tartalmaz.
HU 217 024 Β
Egy másik megvalósítási mód értelmében az említett, Észak-Amerikában alkalmazható vakcina a 2., 3., 18. és 20. családokból származó törzseket tartalmaz.
A Lyme-kórt okozó Borrelia kiónjainak azonosítása érdekében CMAT-analízissel populációszerkezet-vizsgálatot végeztünk. A „CMAT (típus)” definíció szerint egy kilenc számjegyből álló pontszám, amely kilenc közös membránantigén (ezen antigénekre specifikus monoklonális antigének adott készletével kimutatott és néhány esetben megkülönböztetett) molekulatömeg-változatainak összesített pontjaiból származik. A „CMAT-klaszter” CMAT-értékükben legalább 50%-os hasonlóságot mutató rokon CMAT (típusok) csoportja. A „CMATcsoport” kifejezést olyan CMAT-típusokból álló csoport jelölésére használjuk, amely típusok CMAT-pontjaikban 20%-os vagy nagyobb hasonlóságot mutatnak. Következésképpen egy CMAT-csoport több CMAT-klasztert foglalhat magában, amelyek viszont több CMAT-típusból állhatnak.
A „klón” meghatározása szerint olyan CMAT-típus, amely egynél több törzsből áll, vagy másképpen: azonos CMAT-típusú törzsek csoportja, melyet ezáltal azonos őstörzsből származónak tekintünk. A „klonális klaszter” CMAT-klaszter szinten rokon kiónok csoportja (vagyis 50%-nál nagyobb CMAT-típus hasonlóságot mutató kiónok csoportja). Az „emberi betegséggel kapcsolatos klón” olyan klón, amelyről járványtani és klinikai adatok alapján kimutatható, hogy gyakran kapcsolatban áll emberi betegséggel. Hasonlóan a „emberi betegséggel kapcsolatos klonális klaszter” olyan klaszter, amelyről járványtani és klinikai adatok alapján kimutatható, hogy gyakran kapcsolatban áll emberi betegséggel. Ennek megfelelően a fenti B) pontban említett megvalósítási módban az emberi betegséggel kapcsolatos 1.2.4. és 3.2.13. CMAT-klaszterek és a 4.2.17., 4.2.18., 4.2.20. és 4.2.22. klonális klaszterek ellen készítünk OspC-vakcinát.
Az OspC-ről ismert, hogy abban az esetben, ha a fertőző organizmus megegyezik azzal a Lyme-kór kórokozó izolátummal, amelyből az OspC származik, Lyme-kóros állatmodellekben védőhatású immunreakció kiváltására alkalmas immunogén. Az OspC-proteinek Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek közötti szerológiai heterogenitása miatt azt gondoltuk, hogy egy adott törzsből származó OspC-vel végzett immunizálás nem jelenthet védelmet különböző Lyme-kórt okozó Borrelia izolátumok okozta fertőzésekkel szemben, s felismertük, hogy szükség van e feltételezés keresztvédelmi vizsgálatokon alapuló igazolására (6. példa). E vizsgálatok alapján világossá vált, hogy egy OspC-η alapuló vakcinának az OspC több, szerológiailag eltérő formáját kell tartalmaznia. Egy ilyen többértékű OspC-vakcina előállításának előfeltétele az, hogy ismeijük a különböző OspC-alakok közötti diverzitás mértékét és e különböző alakok kapcsolatát. A találmány értelmében ezeket az információkat Lyme-kórt okozó Borrelia elleni új vakcinakészítmények kifejlesztésében használjuk fel.
A kellő információk megszerzésének első lépése a különböző, Lyme-kórt okozó Borrelia törzsekből származó OspC-proteinek karakterizálásához alkalmas, monoklonális antitesteken alapuló tipizálási rendszer kifejlesztése volt (1. példa). Hogy az OspC-proteinek legszélesebb skálájának analizálhatóságát biztosítsuk, különböző földrajzi helyekről származó és emberekből (például bőrből, agy-gerincvelői folyadékból és vérből), állatokból és kullancsokból izolált nagyszámú, Lymekórt okozó Borrelia törzset analizáltunk (az 1. ábrán felsorolt 82 törzs közül 62 törzset választottunk ki, melyek a megbízható karakterizáláshoz elegendő OspC-t termelnek). Az analízis másik kulcsfontosságú vonatkozása a nagyszámú OspC-specifikus monoklonális antitest (a szóban forgó példában 25) felhasználása, melyeket nem egyszerűen egy OspC-protein ellen, hanem hat különböző OspC-protein ellen hoztunk létre, miáltal fokoztuk a felismerhető OspC-epitópok diverzitását, és növeltük a különböző OspC-proteinek megkülönböztethetőségének lehetőségét. Az ezen analízissel kapott adatok világosan mutatták, hogy a különböző forrásokból származó OspC-proteinek között nagyfokú szerológiai heterogenitás létezik. A 16 különböző OspC-típus (vagy szerológiai változat) 13 monoklonális antitest alkalmazásával azonosított reakciómintázatát a 6. ábrán mutatjuk be. 12 törzset nem tudtunk tipizálni, mivel egyik monoklonális antitesttel sem reagáltak.
Az OspC szerológiai módszerekkel végzett tipizálása azonban (annak ellenére, hogy igen hatékony) korántsem volt teljes, mivel ehhez a tipizáláshoz egyrészt az szükséges, hogy az OspC főproteinként expresszálódjon, másrészt, hogy széles körű specifitással rendelkező antitestek sorozata álljon rendelkezésre. A szerológiai változat analíziseredményeiből világos volt, hogy a monoklonális antitestek alkalmazásával az antigéndiverzitás teljes spektruma nem mutatható ki, még akkor sem, ha az antitesteket úgy választjuk ki, hogy ezt a problémát minimálisra csökkentsük. Következésképpen az OspC heterogenitását az o.sy?C-génck között előforduló restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmus (RFLP) analízisével tovább tanulmányoztuk (3. példa). 82 törzs adataival (azaz a tenyészeti gyűjteményünk mind a 77 törzsének adatai, valamint 5 publikált ospC-szekvenciából levezetett adatok) vizsgálatával kimutattuk, hogy 35 eltérő RFLP ospC-típus létezik. Bár ez az eljárás több variációt mutat ki, mint amennyi a szerológiaiváltozat-tipizálásból következik, a két eljárással kapott eredmények igen jó egyezést mutatnak (12. ábra).
A Borrelia törzsek OspC-protein (vagy génje) alapján szerológiai változatokba és RFLP-típusokba történő besorolása lehetővé tette, hogy a részletesebb karakterizáláshoz korlátozott számú OspC-változatokat válasszunk ki, melyek a populáció egészére jellemzőek. Ennek megfelelően 29 törzset választottunk ki, amelyek az egyes legelterjedtebb OspC-típusok egy vagy több képviselőjét tartalmazzák, az OspC-gént PCR-technikával amplifikáltuk, s meghatároztuk a nukleotidszekvenciát és az abból leszármaztatott aminosavszekvenciát (lásd 4. példa). A különböző OspC szerológiai változatokba, illetve RFLP-típusokba tartozó OspC-proteinek közötti kapcsolatok meghatározásához az érett OspCprotein aminosavszekvenciáját (a 19. aminosavtól; lásd
HU 217 024 Β
EP-A-0 522 560 számú dokumentumot) az utolsó 16 aminosav nélkül alkalmaztuk.
Az egyazon OspC-típusba tartozó, közeli rokonságban álló OspC-proteinek közötti kapcsolatot a tipizálási rendszerek elfogadhatóságának újabb ellenőrzése és annak megállapítása érdekében vizsgáltuk, hogy egy adott OspC-típuson belül létezik-e további heterogenitás. A 24 törzsből származó OspC-proteinek nukleotidszekvenciáját és ebből leszármaztatott aminosavszekvenciáját (azaz a vizsgálatainkból származó 22 szekvenciát és a 2591-es és PBI törzsek két publikált szekvenciáját) a 8., illetve 9. ábrán mutatjuk be. Az OspC-proteinek közötti filogenetikai kapcsolatokat ábrázoló dendrogramot a 10. ábrán mutatjuk be.
A találmány szerinti, OspC-antigénen alapuló immunogén készítmény a természetesen előforduló OspC-protein különböző szerológiai alakjainak keverékéből állhat. A találmány egy másik megvalósítási módjában az immunogén készítmény az OspC-antigének OspC-változatait vagy OspC-utánzatait tartalmazza. Ennek megfelelőn a Lyme-kórt okozó őorre/za-scjtekből nyert OspCproteinen kívül a természetben előforduló molekula rekombináns OspC-változatai („OspC-változatok”) és „-utánzatai” (az OspC-epitópot utánzó mimotópokkal rendelkező vegyületek) is alkalmazhatók.
Az OspC-változat kategóriába tartoznak például az OspC-molekula immunogén részeinek, valamint az (1) VKLSESSVASLSKAA;
(3) KELTSPWAETPKKP;
(5) YAISTLITEKLKAL;
(7) ASANSVKELTSPW;
(9) GKKIQQNNGLGA;
illetve tartalmazhatja a fenti epitópszekvenciák változatait vagy utánzatait.
Az előnyben részesített megvalósítási módban a vakcina a találmányban leírt OspC-családokba tartozó egy vagy több OspC-proteinből kiválasztott szerotípusspecifikus epitópoknak megfelelő peptideket tartalmazhat. A keresztvédelmi vizsgálatok (6. példa) azt mutatják, hogy a védőhatású immunitást a szerotípus-specifikus epitópok indukálják. A szerotípus-specifikus epitópok egyik példája az Orth törzsből származó 2. szekvencia (lásd fentebb), amelyet az 5. OspC-családba (4. szerológiai változat) tartozó OspC-proteinekre specifikus BBM38 és BBM39 monoklonális antitestek ismernek fel. Ez az epitóp az Orth OspC hidrofilitási vizsgálata alapján megjósolt, feltételezett epitópnak (DNDSKE) felel meg. A potenciális szerotípus-specifikus epitópokról hasonlóan megjósolható, hogy az egyéb OspC-családok 120-155. aminosavgyökei között (az első ciszteíngyökkel kezdődően) helyezkednek el (4. példa). Az ilyen vakcina a fentebb leírtak szerint a peptidszekvenciák változatait vagy utánzatait is tartalmazhatja. Az ilyen típusú hasonlóság antitestek esetében kompetitív gátlási vizsgálattal vagy T-sejt-proliferációval vizsgálható.
A találmány értelmében a fenti kritériumok alapján OspC-változatoknak minősülő polipeptidek hagyomáOspC-molekula bármilyen, nem proteinszerű immunogén részeinek megfelelő oligopeptidek és polipeptidek. A változaton tehát olyan polipeptidet értünk, amely az OspC-molekulával homológ, és rendelkezik annak kiemelkedő immunológiai sajátosságaival. Két szekvencia közötti „homológia” ebben a vonatkozásban az azonosság hiányában olyan valószínűséget jelent, ami arra utal, hogy egy adott szekvencia egy másik szekvenciából származik. Például egy polipeptid akkor homológ az OspC-vel, ha olyan aminosavszekvenciát tartalmaz, amely megfelel egy OspC-specifikus antitestek vagy T-sejtek által felismert epitópnak. Egy ilyen szekvencia csak néhány aminosavhosszúságú lineáris determináns lehet, vagy olyan szekvencia, amely akkor jön létre, amikor egy lineáris szekvencia elkülönült részeinek aminosavai a protein redős szerkezetének kialakulásakor vagy kovalens kötéssel történő módosítással térbelileg egymás mellé kerülnek. A találmány céljaira megfelelő antigéndeterminánsként funkcionáló aminosavszekvenciákat például a tudományban ismert monoklonális térképező analízissel határozhatjuk meg (lásd Regenmortel, Immunology Today, 10, 266-272, 1989; Berzofsky és munkatársai, Immunological Reviews, 98, 9-52, 1987). Találmányunkban az OspC-antigén például az alábbi aminosavszekvenciák közül egyet vagy többet tartalmaz (13. ábra):
(2) TDNDSKEAILKTNGT;
(4) FVLAVKEVETL;
(6) PNLTEISKKITDSNA;
(8) SPVVAETPKKP;
(10) SPVVAESPKK, nyos fordított genetikai technikákkal (azaz aminosavszekvencia alapján génszekvencia kialakításával) vagy hagyományos genetikai splicing technikákkal állíthatók elő. Például OspC-változatokat helyre irányuló vagy oligonukleotidra irányuló mutagenezist magában foglaló módszerekkel állíthatunk elő (lásd például „Mutagenesis of Cloned DNA”, Current Protocols in Molecular Biology 8.0. 3 et seq., szerkesztő: Ausubel és munkatársai, 1989).
A találmány tárgyát képező egyéb OspC-változatok olyan molekulák, amelyek az OspC egy részének felelnek meg, vagy amelyek az OspC egy részét tartalmazzák, de nem egyeznek meg a természetes molekulával, s amelyek önmagukban vagy hordozóhoz kapcsolva történő prezentálásukkor az OspC immunogén hatását mutatják. Az ilyen OspC-változat a természetes molekula egy valódi fragmensét képviselheti, vagy lehet egy de novo vagy rekombináns módon szintetizált polipeptid.
Az OspC vagy OspC-változat rekombináns expreszszálásához alkalmazandó, ilyen molekulát kódoló polinukleotid előnyösen a kívánt aminosavszekvenciának megfelelő nukleotidszekvenciával rendelkezik, amely a kodonfelhasználást, a transzláció indítását és az OspC vagy a kívánt OspC-változat szokásosan hasznos menynyiségeinek expresszálását tekintve a kiválasztott gazdaszervezetben optimális. A kiválasztott gazdaszervezet
HU 217 024 Β említett polinukleotiddal való transzformálásához kiválasztott vektornak biztosítania kell a polipeptidet kódoló szekvencia hatásos fenntartását és transzkripcióját. A kódolópolinukleotid kódolhat kiméra proteint, azaz olyan, OspC-molekula immunogén részét kódoló nukleotidszekvenciával rendelkezhet, amely működőképesen kapcsolódik egy nem OspC-molekulát (például a gazdasejt szignálpeptidjét) kódoló szekvenciához.
Egy OspC-molekulát kódoló DNS-szakasz izolálása érdekében leírt eljárások szerint teljes Lyme-kór Borrelia DNS-t készítünk (lásd például Maniatis és munkatársai, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, NY., 1982; Baess, Acta Pathol. Microbiol. Scand. (B szakasz), 82, 780-784, 1974). Az így kapott DNS-t restrikciós enzimmel részlegesen emészthetjük, hogy a genomfragmensek több-kevesebb véletlenszerű sorozatát kapjuk. E célra négynukleotidos felismerőhellyel rendelkező enzim alkalmas, mint például az Sau3A (Mbol). A részleges emésztéssel kapott fragmensek ezután például szacharóz-gradiens centrifugálással (lásd Maniatis, fentebb) vagy pulzáló erőterű gélelektroforézissel (lásd Anal. Trends in Genetics, 278-283. oldal, 1986. november) méret szerint frakcionálhatók, hogy az OspCmolekulát kódoló DNS-sel azonos hosszúságú fragmenseket kapjunk.
A kiválasztott fragmensek jól ismert eljárásokkal (például Ausubel, 5.0.1 és az utána következők) alkalmas klónozóvektorba klónozhatok. Egy fenti módon kapott DNS-t például a pUC18 klónozóvektor BamHI helyére inszertálhatunk. A méret szerint kiválasztott fragmensek klónozóvektorba történő ligálásával előállított (többek között) kiméra plazmidokat vagy fágokat E. coliba vagy más gazdaszervezetbe transzformálhatjuk, melyeket a kódolt protein expresszálására screenelhetünk. A könyvtárak OspC-gént tartalmazó klón azonosítása érdekében végzett screeneléséhez számos eljárás alkalmazható, mint például az OspC-re specifikus hibridizációs próbával (például oligonukleotid-próbával) végzett screenelés vagy az OspC-specifikus immunológiai reagens alkalmazásával OspC-antigén-expresszióra végzett screenelés. Az utóbbit például a DNS-könyvtár antiOspC monoklonális antitestekkel vagy tisztított OspCvel immunizált állatokból készített specifikus poliklonális antitestekkel végzett immunbiot analízisével valósíthatjuk meg. Ha a DNS-könyvtárban OspC-t kódoló DNS-t tartalmazó kiónt azonosítunk, izolálhatjuk a DNS-t, karakterizálhatjuk az OspC-proteint kódoló régiót (szekvenálással), majd a DNS-t OspC-aktív protein termeléséhez alkalmas OspC expressziós vektorok előállításához használhatjuk fel.
Amint korábban említettük, ahhoz, hogy hatásos immunogént kapjunk, a rekombináns technikával expresszált pC-proteinnek megfelelő mértékben hasonlónak kell lennie a természetes (nem denaturált) OspC-proteinhez, hogy a protein védőhatású antigének termelődését indukálja. Ennek érdekében előnyös az OspC-t kódoló DNS-t úgy expresszálni, hogy az expresszált termék intracelluláris proteolízise és aggregációja (denaturált alakban) ne következzen be. E problémák megoldásának egyik módja, hogy a pC-proteint rekombináns módon olyan gazdavektor-rendszerben állítjuk elő, amely biztosítja a pC gazdasejtből történő kiválasztódását, előnyösen közvetlenül a tenyésztő tápközegbe. Az egyik ilyen rendszer a Bacillus subtilis. Bacillus subtilishez alkalmas szekréciós vektort úgy készíthetünk, hogy a B. amyloliguefaciens alfa-amiláz-jelzőszekvenciát (Young és munkatársai, Nucleic Acid Rés., 11,237-249, 1983) a pUBl 10 Bacillus plazmidvektorhoz kapcsoljuk (Ulmanen és munkatársai, J. Bacteriol., 162, 176-182, 1985). E megoldás szerint az idegen protein kódolószekvenciáját az alfa-amiláz promoterétől, riboszómakötő helyétől és jelzőszekvenciájától downstream irányban klónozzuk. Az OspC transzkripciója és transzlációja ebben a konstrukcióban az alfa-amiláz promotere és transzlációs gépezete szabályozása alatt áll, a pC gazdasejtből való kiválasztódását pedig az alfa-amiláz jelzőszekvenciája biztosítja. Találmányunk olyan expressziós vektorokat foglal magában, amelyek prokariótákban és eukariótákban egyaránt működőképesek. Élesztőben való alkalmazáshoz hasonló vektorokat írtak le, és az OspC élesztőben való expresszálása és szekréciója e vektorok alkalmazásával valósítható meg. Alkalmas expressziós vektort készíthetünk, ha élesztő replikációs plazmidban az OspC kódolószekvenciáját indukálható promoterhez kapcsoljuk. E megközelítés szerint az idegen protein kódolószekvenciáját például az AOX-1 promotertől downstream irányban klónozzuk, s a transzkripció és transzláció a tenyésztő tápközeghez metanolt adva indukálható. Az idegen protein expressziója vagy szekréciója (az érett protein kódolószekvenciájához jelzőszekvenciát kapcsolva) egyaránt megvalósítható. Előnyös élesztőtörzs a Pichia pastoris. Élesztőkben, különösen P. pastorisban nagy hozamú expressziós termékeket állítottunk elő.
Az OspC proteolízist, aggregációt és denaturálódást megakadályozó gazdavektorrendszerben való expreszszálásának egy másik lehetősége vektorként vacciniavírus alkalmazása, amely különböző, vacciniafertőzésre fogékony emlőssejtekben képes expresszálódni. E megoldás szerint olyan rekombináns vacciniavírus eredetű vektort készítünk, amelyben a pC-gént transzlációs és szekréciós jelekkel együtt egy promoter szabályozása alá helyezzük, amely alkalmas az OspC-protein vacciniavírussal fertőzött gazdaszervezetben való expresszálásához. A plazmid (a transzkripciós szabályozórégióktól 5’-irányban és a 3’ terminációs és poliadenilációs jelektől 3’-irányban) tartalmazhat még szegélyezőszekvenciákat, amelyek elősegítik a vad típusú vaccinia genomba történő homológ rekombinációt (lásd 4 603 112 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalom, melyet hivatkozásul említünk). Az ilyen konstrukciót vacciniavírussal fertőzött gazdasejtbe juttatva, a szegélyezőszekvenciák irányítják a plazmidvektor és a vacciniavírus közötti rekombinációt, miáltal a klónozott strukturális szekvencia (esetünkben az OspC-t kódoló szekvencia) a vacciniavírus részévé válik, azzal együtt szaporodik és expresszálódik. A szegélyezőszekvenciák közötti régió előnyösen szelektálható markert is tartalmaz, hogy szelektáló tápközegben csak a rekombináns vacciniavírust
HU 217 024 Β (és esetünkben az OspC-aktív polipeptidet kódoló szekvenciát) tartalmazó sejtek maradjanak életben.
Az így előállított rekombináns vacciniatörzs nagy sűrűségben végzett fermentatív növesztéshez alkalmas emlőssejtek, például Vero-sejtek vagy CV1 sejtek fertőzéséhez alkalmazható. A fermentáció során e sejtekben expresszált OspC-aktív protein a fermentációs tápközegbe szekretálható, melyből hagyományos eljárással tisztítható.
A természetes OspC-n és OspC-változatokon kívül találmányunk tárgykörébe tartoznak az olyan vegyületek („utánzatok”) is, amelyek OspC-epitópokat utánoznak („mímotópok”). Az utánzatok egyik példája egy antiidiotípusos antitest, azaz olyan antitest, amelyet úgy állítottunk elő, hogy egy állatot egy antigén epitópjához specifikusan kötődő antitesttel immunizálunk. Az antiidiotípusos antitest felismeri az első antitesten lévő kötőhelyet, és illik hozzá, így kötőhelyének alakja nagyon hasonlít arra az epitópra, amely az első antitest kötőhelyéhez illik. Mivel az antiidiotípusos antitest olyan kötőhellyel rendelkezik, amelynek alakja az eredeti antigént utánozza, az eredeti antigénnel reagáló antitestek kialakításához vakcinaként alkalmazható (lásd Fineberg és Érti, CRC Critical Reviews in Immunology, 7, 269-284, 1987). Az alkalmas utánzatok OspC-antitesttel végzett szűréssel (screening) azonosíthatók, hogy kimutassuk, mely vegyületek kötődnek hozzájuk, illetve molekuláris modellezéssel melyek állíthatók elő (lásd Morgan és munkatársai, „Approaches to the Discovery of Non-Peptide Ligands fór Peptide Receptors and Peptidases”, Annual Reports in Medicinái Chemistry, a 243. oldaltól, Academic Press, 1989).
A találmány szerinti vakcinát Lyme-kórra fogékony emlős (beleértve az embert is) Lyme-kór elleni immunizálásához szánjuk. Az „immunogén” kifejezés olyan antigént jelent, amely (esetünkben Rorre/ia-fertőzés ellen) humorális vagy sejt közvetítette immunitást eredményező specifikus immunreakciót vált ki. Az „immunitás” az egyed azon képességét jelenti, mellyel egy fertőzésnek könnyebben tud ellenállni vagy azt leküzdeni, mint a nem immunizált egyedek, illetve klinikai beavatkozás nélkül tolerálni képes a fertőzést.
A találmány szerinti immunogén készítmény fiziológiailag elfogadható hordozót is tartalmazhat. Az ilyen hordozók jól ismertek, s közéjük tartoznak a makromolekuláris vivőanyagok. Az emlősökben alkalmas vivőanyagok példái a tuberkulin PPD, szarvasmarha-szérumalbumin, olvabumin vagy keyhole limplet hemocianin. A hordozó előnyösen nem lehet toxikus és allergén.
Az immunogén készítmény tartalmazhat továbbá adjuvánst, például alumíniumvegyületet, vizes és növényi- vagy ásványiolaj-emulziókat (például Freund-féle adjuvánst), liposzómákat, ISCOM-ot (immunstimuláló komplex), vízüvegeket, polianionokat (például poli A:U, dextrán-szulfát vagy lentinán), nem toxikus lipopoliszacharid-analógokat, muramil-dipeptidet és immunmodulátor anyagokat (például interleukin 1 és 2) vagy ezek kombinációit. Az előnyös adjuváns az alumíniumhidroxid. Az immunogenitás olyan emlősökben is fokozható, amelyeknek OspC-aktív polipeptidet expreszszáló, élő, legyengített bakteriális vektorokat (például Salmonella vagy Mycobacteria') vagy vírusvektorokat (mint például vaccinia) adtunk.
Az ilyen immunogén készítmények előállítási eljárásai jól ismertek. A találmány szerinti immunogén például liofilizálható, amely azután fiziológiailag elfogadható vivőanyagban, például sóoldatban vagy más fiziológiai oldatban újrahidratálható. A találmány szerinti vakcinát minden esetben úgy állítjuk elő, hogy az OspC immunológiailag hatásos mennyiségét olyan mennyiségű vivőanyaggal keverjük, amely a vakcina immunogén szempontból hatásos komponensének kívánt koncentrációját eredményezi. A vakcinában az immunogén szempontból hatásos komponens mennyisége az immunizálandó emlőstől, annak életkorától és tömegétől, valamint a vakcinában jelen lévő immunogén komponens immunogenitásától függ. Az esetek többségében a vakcina immunogén komponensének tömege dózisonként az egyes antigénekre vonatkoztatva 1-100 mikrogramm, előnyösen dózisonként az egyes antigénekre vonatkoztatva 10-50 mikrogramm.
A találmány egy további megvalósítási módjában az immunogén készítmény egy vagy több OspC-antigénből, OspC-változatból vagy OspC-utánzatból, vagy az emberi betegséggel kapcsolatos kiónok, vagy klonális klaszterek által expresszált, all. ábrán felsorolt valamennyi OspC-családból tisztított OspC-antigénekből áll (1. példa).
Ilyenformán a találmány tárgya a Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigénjeiből készített immunogén készítmények, amelyek all. ábrán bemutatott 20, jelenleg ismert OspC-család mindegyikének egy vagy több, előnyösen két vagy több OspC-antigénjét vagy all. ábrán bemutatott 20, jelenleg ismert OspC-család mindegyikének egy vagy több OspC-antigénjét tartalmazzák. A fenti OspC-antigének helyett ezen antigének OspC-változataiból vagy OspC-utánzataiból álló kombinációk is alkalmazhatók, melyekben az említett OspC-változatok vagy OspC-utánzatok a természetes OspC-hez (a védőhatású antitestek kialakulásának indukálása szempontjából) megfelelő mértékben hasonló szerkezettel rendelkeznek.
All. ábrán a kulcsfontosságú epitópok szekvenciáit mutatjuk be. A találmány tárgyát képezik azon OspCantigének, amelyek egy vagy több ilyen epitópot tartalmaznak. Következésképpen e találmány szerinti antigének vagy polipeptidek legalább a 13. ábrán látható epitópszekvenciát tartalmazzák. Ez az epitópszekvencia olyan rövid lehet, mint a 13. ábrán zárójelben feltüntetett aminosavszekvencia.
A találmány további tárgya olyan immunogén készítmények, amelyek a 19. ábrán bemutatott OspC-családok egy vagy több, előnyösen két vagy több OspC-antigénjét vagy a 19. ábrán bemutatott OspC-családok mindegyikének egy vagy több OspC-antigénjét tartalmazzák.
Egy másik megvalósítási módban az immunogén készítményt egy adott földrajzi területre uralkodóan jellemző, Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek elleni védelem kialakítása érdekében állítjuk elő. Ennek megfele9
HU 217 024 Β lően az egyik megvalósítási módban olyan vakcinát készítünk, amely elsősorban az Észak-Amerikában leggyakoribb Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek ellen védőhatású. Egy másik megvalósítási módban az Európában leggyakoribb Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek elleni vakcinát készítünk. Egy harmadik megvalósítási módban Ausztriában leggyakoribb Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek elleni vakcinát készítünk. Az egyes földrajzi területen való alkalmazáshoz kialakított vakcinakészítményeket a 7. ábrán mutatjuk be.
Az OspC-vakcinakészítményeken kívül hasznos lehet egy kombinált OspA/OspC-vakcina alkalmazása, mivel ez a csak egyik antigént tartalmazó vakcinánál előnyösebb lehet, mert először is, a Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek nem mindig expresszálhatják ezen antigének egyikét vagy másikát, de mindig expresszálják vagy az OspA-t, vagy az OspC-t;
másodszor, beszámoltak arról, hogy e két antigén esetében reciprok szabályozás érvényesül, vagyis ha az egyik expressziója alulszabályozott (például immunreakció hatására), a másik expressziója fokozódik;
harmadszor (legalábbis az OspA in vitro vizsgálataiban), kimutatták, hogy olyan mutánsok alakulhatnak ki, amelyekre nem hat a vakcina, s ezt egy második antigén alkalmazásával lehet kiküszöbölni, mivel két külön antigénben a kettős mutációs esemény nagyon valószínűtlen;
negyedszer, a vakcinák egy adott antigén elleni immunreakciói nem egyformák; ha két antigént alkalmazunk, fokozzuk annak valószínűségét, hogy az OspA-ra vagy OspC-re gyengén reagáló személy a másik antigénre védő hatású immunreakció kialakításával mégis védhető legyen.
Végül, várható, hogy az OspA-t és OspC-t tartalmazó vakcina szinergikus hatású, és alkalmazásával erősebb immunitás alakítható ki.
Az egyik megvalósítási módban az 1-20. OspCcsaládokból származó egy vagy több OspC-proteint a B31, Orth, H4 és KL11 Borrelia törzs által expresszált egy vagy több OspA-proteinnel kombinálhatjuk.
Egy másik megvalósítási módban egy Egyesült Államokban alkalmazandó kombinált OspA/OspC-vakcina a 2. és 3. OspC-családból származó OspC-t a B31 törzs által expresszált OspA-val együtt tartalmazza. Egy további megvalósítási módban egy Európában alkalmazandó, kombinált OspA/OspC-vakcina a 2., 4-7., 9., 10., 12., 13., 14., 15-17. és 19. családból származó 14 OspC-antigént a B31, Orth, H4 és K.L11 Borrelia törzs által expresszált OspA-antigénekkel együtt tartalmazza. Egy másik megvalósítási módban egy Ausztriában alkalmazandó, kombinált OspA/OspC-vakcina a 2.,
4-7., 10., 13. és 19. családból származó OspC-antigéneket tartalmaz.
A találmány további tárgya a fentebb leírt immunogén készítményekbe foglalt antigének kombinációjának alkalmazása a Lyme-borreliosis emlősökben való kezelésére vagy megelőzésére szolgáló vakcina előállításában. Egy előnyben részesített megvalósítási módban ez a vakcina emberek immunizálásához alkalmas.
A találmány szerinti vakcinák előállítási eljárásait úgy terveztük, hogy biztosítsuk a specifikus molekulák azonosságának és immunológiai hatékonyságának fennmaradását, s hogy nem kívánt mikrobiális szennyezések ne kerüljenek a készítménybe. A végtermékeket szétosztjuk és aszeptikus körülmények között tároljuk. Egy emlős Lyme-kór elleni immunizálása során az emlősnek a fentebb leírt immunogén hatásos mennyiségét adjuk be. A beadás bármely ismert módon történhet. Például egy alkalmas beadási stratégia szerint a fentebb leírt vakcinát olyan emlősöknek, melyekről tudjuk, hogy Lyme-kórt okozó Borreliát hordozó kullancsok fertőző hatásának lesznek kitéve, ennek várt idejétől számítva hozzávetőleg 6-12 hónappal korábban adjuk be. A találmány értelmében bármely olyan immunizálási mód alkalmazható, amellyel megfelelő immunreakció alakítható ki, de a parenterális beadást részesítjük előnyben. Az alkalmas beadási formák közé tartoznak a szubkután, intrakután vagy intramuszkuláris injekciók, valamint az orális, nazális vagy rektális beadáshoz való készítmények.
A „lényegében tisztított” kifejezésen olyan homogén proteint értünk, amely mindenféle toxikus anyagtól mentes, ami csökkenti a zavaró mellékhatások valószínűségét. A „homogén” kifejezés azt jelenti, hogy a protein legalább 80%-a (m/V) teljes mértékben intakt OspC, míg a maradékot majdnem kizárólag az OspC bomlástermékei képezik, így a tápközeg alkotóelemei és az egyéb őorre/za-proteinek alkotta szennyezések csak nyomnyi mennyiségben vannak jelen (ha vannak egyáltalán). A homogén OspC az OspC egynél több szerológiai alakját tartalmazhatja.
Találmányunk gyakorlati megvalósításával lehetővé válik a nemkívánatos, potenciálisan immunogén proteinek eltávolítása, amelyek az immunizált emlősben autoantitestek kialakulását indukálhatják, és ártalmas autoimmunreakciókat okozhatnak. A fentebb leírt tisztítási eljárás ezenfelül a vakcina előállítása során tételenkénti reprodukálhatóságot is eredményez.
Az előnyös tisztítási eljárás során az alábbi lépéseket végezzük:
a) feltárjuk a Lyme-kórt okozó Borre/ía-sejteket és centrifugálással „membrán” és „citoplazmikus” komponensekre választjuk szét;
b) a membránfrakciót nem denaturáló hatású detergenssel extraháljuk, majd centrifugáljuk, hogy szolubilizált proteint tartalmazó felülúszót kapjunk, és hogy az oldhatatlan anyagot üledékként eltávolítsuk;
c) a szolubilizált antigéneket ioncserélő kromatográfiával (dietil-amino-etil; DEAE) ffakcionáljuk, melynek során az oszlopon adszorbeálódott antigéneket NaClgradienssel eluáljuk.
A tisztítási eljárás magában foglalhatja az antigének bekoncentrálását és további tisztítását, melyet
a) hidroxil-apatit-kromatográfiával (melynek során az adszorbeált antigéneket a puffer foszfátkoncentrációjának fokozásával eluáljuk); és/vagy
b) rögzített fémaffinitás-kromatográfíával (melynek során az adszorbeált antigéneket imidazollal eluáljuk) végzünk.
HU 217 024 Β
A tudományban ismert egyéb eluálási eljárások közé tartoznak a pH csökkentésével vagy növekvő koncentrációjú ammónium-klorid-oldattal, hisztidinnel vagy más, a kelátosodott fémhez affinitást mutató anyaggal végzett eluálások.
A sejtfeltárást a szuszpenzióban lévő sejtek apró üveggyöngyöket tartalmazó sejtaprítóban történő rázatásával, hangkezeléssel vagy French-présben végezhetjük. Más módon, az antigének közvetlenül az organizmusok sejtfelületéről is kivonhatok, melynek során a sejteket detergenssel kezeljük vagy változtatjuk a sejtek környezetének ionerősségét, vagy némileg megváltoztatjuk a hőmérsékletet. Más lehetőség szerint a sejtekről leváló membránhólyagokból álló kiindulási anyag is alkalmazható.
A membránfrakciót olyan detergenssel extrahálhatjuk, amely előnyösen jó szolubilizálóhatással rendelkezik, nem denaturálóhatású és kompatíbilis az ioncserélő kromatográfiával. Az előnyös detergens a 3-14 ikerionos detergens (Calbiochem), de bármilyen detergens vagy szerves oldószer alkalmazható, amely a fenti tulajdonságokkal rendelkezik. A detergenst jellemzően 1% (m/V) koncentrációban alkalmazzuk, de hatásos lehet a koncentráció 0,01% (m/V) és 10% (m/V) közötti tartományban végzett változtatása. A detergenssel az extrakciót 0-60 °C hőmérséklet-tartományban, előnyösen 37 °C-on 10 perc és 8 óra közötti időtartamban, előnyösen egy óra hosszat végezzük. A szolubilizálási folyamat javítása érdekében a detergens mellett kaotropikus szereket, mint például karbamidot is alkalmazhatunk.
A detergenssel szolubilizált antigéneket ezután DEAE-kromatográfiával ffakcionáljuk. Előnyösen DEAE ioncserélő gyantát alkalmazunk, de ehelyett, illetve egymással kombinálva más anion- vagy kationcserélő gyanták is alkalmazhatók. A találmány értelmében az ioncserélő gyanta oldhatatlan anyagot tartalmaz, amelyhez töltéssel rendelkező csoportok kapcsolódnak. Az anioncserélő gyantákhoz alkalmazott funkciós csoportok közé tartoznak az amino-etil- (AE), dietil-amino-etil- (DEAE) és a kvatemer amino-etil-csoportok (QAE). A kationcserélő gyanták karboxi-metil- (CM), foszfo- vagy szulfopropil- (SP) csoportokat tartalmazhatnak. Annak ellenére, hogy a mintákat 3-14-es ikerionos detergenst (1%) tartalmazó Tris-pufferben visszük fel az oszlopra, és az antigéneket NaCl-gradienssel eluáljuk, más készítmények ugyanilyen hatásosak lehetnek.
Az antigéneket a tudományban jól ismert eljárások szerint hidroxil-apatithoz kapcsolva koncentrálhatjuk be. Az antigének további koncentrálásának/tisztításának egy másik egyenértékű módszere a rögzített fémaffmitáskromatográfia. Ez a módszer az OspC tisztításához a hidroxil-apatit-kromatográfiánál előnyösebb, mivel ezen antigén OspA- és OspB-antigénektől való eredményesebb elválasztása érhető el.
A fenti, nem denaturálóhatású tisztítási eljárások előnye, hogy megmarad a protein háromdimenziós konformációja, megőrizve az eredeti proteinen található valamennyi antitestkötődési helyet, köztük a védőhatás kialakításában szerepet játszókat is. Ha egy protein denaturálódik, kötési helyei részlegesen vagy teljesen megszűnhetnek, s ennek megfelelően csökken az antigén azon képessége, hogy az antigénhatású helyek elleni antitesteket indukáljon. Az így megváltozott proteinek ezáltal nemkívánatosak a vakcinákban való alkalmazás szempontjából.
A találmány további tárgya a 9a. ábra szerinti új OspC-antigének rekombináns módszerekkel történő előállítása, valamint a 9a. ábra szerinti OspC-antigéneket kódoló új DNS-szekvenciák. A találmány további tárgya azon DNS-szekvenciák, amelyek a 8a. ábrán bemutatott szekvenciák bármelyikével legalább 80%-os homológiát mutatnak.
A találmány további tárgya prokarióta vagy eukarióta gazdasejtekben alkalmazható rekombináns expressziós vektorok, különösen az élesztőkben, előnyösen Pichia pastorisban alkalmazható expressziós vektorok. A találmány egyik előnyben részesített megvalósítási módja értelmében az expressziós vektor metanollal indukálható.
A találmány további tárgya új OspC-antigének i), melyeket a 8a. ábrán bemutatott szekvenciák valamelyike kódol, illetve ii) amelyek a 9a. ábrán bemutatott aminosavszekvenciák bármelyikével legalább 80%-os homológiát mutatnak.
A találmányt a következő példákban mutatjuk be részletesebben, melyeket a találmány illusztrálására, és semmiképpen nem tárgykörének korlátozásaként írunk le.
1. példa
Borrelia burgdorferi törzsek CMAT-tipizálása és az eredmények klaszteranalízise, amely lehetővé teszi a CMA T-klaszterek, CMA T-családok, emberi betegséggel kapcsolatos klánok és klonális klaszterek értelmezését
A 2. ábrában felsorolt számos különböző forrásból 77 törzset izoláltunk (lásd 1. ábra). Figyelmet fordítottunk arra, hogy nagyon különböző földrajzi területekről származó törzseket gyűjtsünk össze, és annyi különböző járványtani és klinikai esetből, amennyi csak lehetséges.
Az alábbiak szerint valamennyi törzsből membránfrakciót készítettünk. A Lyme-kórt okozó Borrelia-sC}teket centrifugálással (7000 χ g, 20 perc, 4 °C) gyűjtöttünk össze, a sejtüledéket 5 mM MgCl2-ot tartalmazó PBS-ben kétszer mostuk, s megmértük a sejtek nedvestömegét. A mosott sejteket az elegy Vibrinogen sejtaprító készülékben (Model VI4, Buhler) végzett rázatásával lizáltuk. A rázatást háromperces ciklusokkal, hűtés közben (4 °C) addig folytattuk, míg 99%-osnál nagyobb mértékű lízist nem értünk el (amit sötét látóterű mikroszkópiával határoztunk meg). A lizátumot ezután az üveggyöngyök eltávolítása érdekében zsugorított üvegszűrőn szűrtük, majd az üveggyöngyöket a szűrletben lévő bakterális antigének hozamának fokozása érdekében pufferrel mostuk. A lizátumot 4 °C-on 20 percig 7500 g-vel centrifugáltuk, miáltal nyers membránffakciót kaptunk, melyet a 2. membránfrakciónak vagy „lsp” (kis sebességgel végzett centrifugálással kapott üledék; low speed pellet) frakciónak neveztünk el. A felülúszót 4 °C-on 30 percig 100 000 χ g-vel tovább centrifugáltuk,
HU 217 024 Β miáltal nagyobb tisztaságú membránfrakciót kaptunk, melyet 1. membránfrakciónak vagy „hsp” (nagy sebességgel végzett centrifugálással kapott üledék; high speed pellet) frakciónak neveztünk. Mindkét membránfrakciót az eredeti centrifugálási feltételek alkalmazásával 100 mM Tris-HCl pufferben (pH=7,4) kétszer mostuk. A 2. membránfrakciót tipizálási célokra használtuk, az
1. membránfrakciót pedig az antigéntisztításhoz tettük félre.
Ezután az egyes törzsek 2. membránfrakciójában lévő membránproteineket Laemmli leírása szerint [U. K., Natúré (London), 227, 680-685, 1970] SDS-PAGE analízissel vizsgáltuk. A molekulatömeg-változatokat a vizsgálathoz alkalmazott valamennyi membránantigénmarker teljes molekulatömeg-tartományát lefedő standard proteinkészlet elektroforetikus mobilitása alapján határoztuk meg.
Az antigéneket nitro-cellulóz-filterekre visszük és monoklonális antitestek alkalmazásával azonosítjuk, például a tudományban jól ismert immunbiot eljárással (Ausubel és munkatársai, Current Protocols in Molecular Biology, 10.8.1 és az utána következők, 1992). A monoklonális antitesteket a jól ismert hibridómatechnikával állítjuk elő (Kohler és Millstein, Natúré, 256, 495-497, 1975). A találmány előnyös megvalósítási módjában az 1. ábrán felsorolt törzseket vizsgáljuk. A vizsgálathoz egy adott membránantigént általában annak alapján választunk ki, hogy a) a kérdéses antigén kimutatásához és a baktériumtörzsek SDS-PAGE membránantigén-profiljában jelen lévő számos egyéb antigéntől való megkülönböztetéséhez rendelkezésre állnak-e monoklonális antitestek; b) a kérdéses antigén a vizsgált törzsek jelentős hányadában jelen van-e (vagyis közös antigén-e); c) ugyanazon törzs külön-külön előállított több membránfrakciójában reprodukálhatóan kimutatható-e (azaz, hogy az adott antigén törzsön belül ne legyen variábilis); d) az antigénmarker több tenyésztés és passzálás után, illetve jelentős idejű tárolás után (maximum két évig) ugyanazon izolátumban stabilan expresszálódik-e; és e) a publikált tudományos irodalomban ne legyen bizonyítéka a markereket kódoló gének extrakromoszomális öröklődésének, vagy annak, hogy az antigének változatai törzsön belüli variációt eredményező specifikus antigénvariációs mechanizmus hatására jöttek létre.
A 3. ábrán feltüntetjük a vizsgálatban alkalmazott 9 közös membránantigén (E90, E60, E59, E43, Fia, E29, E22 antigének, az E18+E20 kombináció és az E10 antigén) azonosításához alkalmazott monoklonális antitesteket. Az antigéneket a növekvő molekulatömeg szerint, abban az esetben pedig, ha egynél több monoklonális antitest létezik, ezen monoklonális antitestekkel mutatott reakciójuk szerint meghatározott, némileg eltérő reaktivitásuk alapján pontozzuk (például E60 és E43).
A 4. ábrán felsoroljuk a vizsgált törzsek esetében talált 9 pontos egyedi kombinációk mindegyikét, melyeket kilencjegyű számként mutatunk be. Ezt a kilencjegyű számot az adott törzs közös membránantigén típusának (CMAT) jelölésére alkalmazzuk. Ezután a kapott CMAT-ok közötti kapcsolat megállapítása érdekében klaszteranalízist végeztünk, melynek során meghatároztuk az egyes antigének genetikai diverzitását, és az egyes CMAT-ok adataiból számított súlyozatlan különbözőségi mátrixot állapítottunk meg. Egy általános antigén pontjának hiányát úgy kezeltük, mintha hiányzó adat lenne. A kialakított mátrixszal IBM-kompatibilis személyi számítógépen (CSS Statistica StatSoft software) számtani középértékek (Sneath és Sokai, lásd fentebb) alkalmazásával súlyozott párcsoportmódszerrel kapcsoltsági klaszteranalízist végeztünk.
A klaszteranalízissel kapott dendrogramokat az 5. ábrán mutatjuk be. A dendrogram általánosságban azt jelzi, hogy a Lyme-kórt okozó Borre/w-populáció valójában jól strukturált. Azon sajátértékek grafikus ábrázolásával, melyeknél valamennyi csoportosítási (clustering) lépés előfordul, lehetőség nyílik a baktériumok kategorizálásához legalkalmasabb szint kiválasztására.
A felosztás legalkalmasabb helyeit a görbe azon pontjai képviselik, ahol az egymást követő csoportosítási (clustering) lépésekhez tartozó sajátértékek legnagyobb ugrásai találhatók. Amint az 5. ábrán bemutatott dendrogramon látható, ez azon a szinten található, ahol a CMAT-pontok között 68-88%-os különbség van. Ez a felosztás a populációt négy fő csoportra osztja, melyeket CMAT-csoportoknak nevezünk. Az egymást követő csoportosítási (clustering) lépésekhez tartozó sajátértékek második fő ugrása azon a szinten közvetkezik be, ahol a CMAT-pontok között 40-52%-os különbség figyelhető meg. Ez az egyes CMAT-csoportokat két vagy három CMAT-klaszterre osztja. Az egyszerűség kedvéért a pontok közötti 80%-os különbséget tekintettük a CMAT-csoportokba történő besorolás szintjének, a pontok közötti 50%-os különbséget pedig a CMATklaszterekbe való besorolás szintjének.
A fentiekből nyilvánvaló, hogy a B. burgdorferi négy fő CMAT-csoportba sorolható, melyek mindegyike két vagy három CMAT-klaszterből áll. Valamennyi CMAT-klaszter 1-5 külön CMAT-ból áll. Ezen eredményeket más populációszerkezeti taxonómiai vizsgálatok (Marconi és Garon, J. Bacteriol., 174, 241-244, 1992; Boerlin és munkatársai, Infect. Immun., 60, 1677-1683, 1992; Baranton és munkatársai, Int. J. Syst. Bacteriol., 42, 378-383, 1992) eredményeivel összehasonlítva megállapítható, hogy az 1. CMAT-csoport a szoros értelemben vett Borrelia burgdorferi genospeciesnek, a 3. CMAT-csoport a Borrelia ajzeliinek (VS461 csoportként is ismert), a 2. és 4. CMAT-csoport pedig a B. garinii új fajnak felel meg. Nem világos, hogy a CMAT-analízis a B. garinii genospeciest miért osztotta két CMAT-csoportra, de ez feltételezhetően annak köszönhető, hogy kevesebb markert használtunk, mint a többlókuszos izoenzimelektroforézis-vizsgálatban (Boerlin és munkatársai, Infect. Immun., 60, 1677-1683, 1992).
A különböző törzsek egyes CMAT-okon belüli előfordulását (5. ábra) vizsgálva látható, hogy 7 CMAT egynél több képviselővel rendelkezik, s így ezek kiónoknak tekinthetők, azaz olyan törzseknek, amelyek közös
HU 217 024 Β eredetűek. Valójában az összes törzs 67%-a három külön CMAT-klónba tartozik; például a 4. CMAT (1:2:4 klón) 12 törzsből, a 13. CMAT (3:2:13 klón) 23 törzsből, a 18. CMAT (4:2:18 klón) pedig 15 törzsből áll. A vizsgált humán izolátumok jelentős része, 71%-a (41ből 31) e három fő klón valamelyikéhez tartozott. Sőt, ha a 17., 18., 20. és 22. CMAT-ot együtt egy rokon klonális klaszter részének, a 4.2 CMAT-klaszterhez tartozónak tekintjük, úgy az emberi betegséggel való kapcsolat 87%-ig emelkedik. Az emberi betegséggel való ilyen szoros kapcsolatnak köszönhetően ezek „emberi betegséggel kapcsolatos” (HDA; humán disease associated) kiónoknak vagy klonális klasztereknek tekinthetők (a kiónok és klonális klaszterek definícióit lásd fentebb). Ha megvizsgáljuk e három fő kiónban talált izolátumok típusát, nyilvánvalóvá válik, hogy a 13. CMAT például az ACA krónikus bőrbetegséggel (5 törzs) áll összefüggésben, és általában ez a klón bőrbetegségekkel kapcsolatos (19-ből 17). Ezzel szemben a másik két HDA-klón, úgy tűnik, gyakoribb a disszeminált betegségek esetében; ezeket neuroborreliosis-ban vagy Lyme arthritisben szenvedő páciensek véréből és agy-gerincvelői folyadékából (CSF) izoláltuk. A 4.2 CMAT-klaszter (azaz a 17., 18., 20. és 22. CMAT-ok) esetében a járványtani adatok a neuroborreliosis betegséggel mutatnak szoros kapcsolatot. A tíz humán izolátumból hatot gerinc-agyvelői folyadékból (CSF) vagy neuroborreliosisban szenvedő páciensekből, négyet pedig ECM-es (rendszerint akut betegséggel kapcsolatos tünet, amely neuroborreliosisszal is kapcsolatban állhat) páciensekből izoláltunk. A CMAT 4 törzsek tünetekkel való kapcsolata nem ilyen egyértelmű, mivel a humán izolátumok közül kettőt vérből, hármat CSF-ből, egyet pedig erythema migransban (EM) szenvedő páciensből izoláltunk.
A különböző törzsekre vonatkozó járványtani adatok újabb vizsgálata azt mutatja, hogy a három fő klón vagy klonális klaszter jellegzetes földrajzi megoszlást mutat, ez a sajátosság pedig összefüggést mutat a Lyme-kór ezen régiókban tapasztalt primer tüneteinek különbségeivel. Például a 4. CMAT az Eszak-Amerikában (ahol az ízületi gyulladásos tünetek az elterjedtek) megfigyelt leggyakoribb CMAT. A 13. és 18. CMAT elsősorban Észak-Közép-Európában található, ahol a neurológiai és krónikusbőrbetegség-tünetek a leggyakoribbak. A három fő klón közül csak a 4. CMAT található meg Észak-Amerikában és Európában (Franciaországban, Ausztriában és Oroszországban) is, ami azt jelenti, hogy mindkét kontinensen széles elterjedést mutat. Érdekes, hogy Közép-Európa bizonyos területein, elsősorban Ausztriában és Svájcban, ahol a Lyme-kór endemikus, mind a három, emberi betegséggel kapcsolatos klón együttesen létezik. Annak felismerése, hogy az emberi betegséget zömében csak egy, az 1. CMATcsoportba (a szoros értelemben vett Borrelia burgdorferí) tartozó klón (4. CMAT) és egy, a 3. CMAT-csoportba (Borrelia afzelii) tartozó klón (18. CMAT), valamint a 4. CMAT-csoportba (B. garinii, új faj) tartozó, egy klonális klaszter (4.2 CMAT-klaszter) okozza, lehetőséget nyújt arra, hogy az e kiónok és klonális klaszterek elleni specifikus védelmet biztosító vakcinák (mint például az OspC vagy a kombinált OspC/OspA vakcina) kialakítása érdekében e kiónokra, illetve klonális klaszterekre összpontosítsuk figyelmünket. Ezek a vakcinák azokon a földrajzi területeken alkalmazhatók, ahol ezen kiónok rendkívül gyakoriak. A különböző klónokkal kapcsolatos különböző klinikai tünetek miatt e kiónok elleni vakcinákat hozhatunk létre, miáltal specifikus tünetek ellen védelmet biztosító vakcinákat alakítunk ki.
2. példa
OspC szerológiaiváltozat-tipizálási rendszer kifejlesztése a Lyme-kórt okozó Borrelia szerológiai változatainak vizsgálatához
Anti-OspC-antitestek előállítása
Az alábbi proteinek ellen 25 monoklonális antitestből álló sorozatot készítettünk:
a) az (1) osztrák Orth törzsből (BBM34-39); (2) a német PKO törzsből (BBM42-45); (3) a Csehszlovák E61 törzsből (BBM46, 47 és 49) és (4) a Csehszlovák KL10 törzsből (BBM40-41) származó négy tisztított OspC-protein ellen;
b) az osztrák W törzsből (BBM22, 24, 25, 27, 28 és 29) származó antigénekből készített, növelt OspCtartalmú elegy ellen; és
c) az M57 törzsből (BBM75-77) származó 2. membránfrakció ellen.
Az anti-OspC-protein különböző monoklonális antitestekre vonatkozó specifítását a BBM22, 24,25, 27-29, illetve BBM75-77 antitestek esetén a W és M57 törzs membránfrakciójával szembeni surfbiot analízissel, a többi antitest esetében pedig a megfelelő tisztított protein elleni line-blot analízissel igazoltuk.
Membrán ELISA-eljárás
Az OspC-proteinek szerotipizálását standard membrán ELISA-vizsgálattal végeztük. Valamennyi törzs 1. példában leírtak szerint előállított 2. membránfrakcióját foszfátpufferrelt sóoldatban (PBS) (pH=7,4) 0,1 mg/ml koncentrációra hígítottuk, majd mikrotiterlemezen külön üregekbe helyeztük. A lemezeket 37 °C-on egy éjszakán keresztül szárítottuk. A felhasználás előtt a lemezeket PBS-sel kétszer mostuk, majd mindegyik üreghez 1% humán albumint tartalmazó 50 ml, PBSben hígított antitestoldatot adtunk, és a lemezeket 37 °C-on egy óra hosszat inkubáltuk, majd négyszer mostuk, s ezután lúgos foszfatázzal konjugált anti-egér IgG antitestet adtunk hozzájuk. A lemezeket 37 °C-on újabb egy órán át inkubáltuk, a szubsztrát hozzáadása előtt négyszer mostuk, és meghatároztuk a kötött antitestek mennyiségét.
Eredetileg valamennyi törzset mind a 25 monoklonális antitest ellen teszteltük, hogy megállapítsuk, melyik antitestek a legalkalmasabbak a szerotipizáláshoz. Megpróbáltunk egységes pozitív és negatív tesztkritériumokat kialakítani, azonban világossá vált, hogy ez az OspC-antigének különböző törzsekben tapasztalható, nagyon eltérő expressziós szintjei miatt lehetetlen. E nehézség kiküszöbölése érdekében a 2. membránfrakciókat Western biot módszerrel analizáltuk, nitro-cellulóz-filtereken másolatokat készítettünk, és ezeket Auro13
HU 217 024 Β gold alkalmazásával megfestettük. Azokat a törzseket, amelyek egyáltalán nem vagy csak kevés OspC-proteint expresszáltak (amit a 22-28 kD-os molekulatömeg-tartományban a főprotein hiánya szerint állapítottunk meg) (összesen 15 törzs), kihagytuk a vizsgálatból. Ennek ellenére számos esetben (például a BBM28, BBM29, BBM37, BBM43 és BBM45 alkalmazása esetén) még mindig nem volt könnyű különbséget tenni a pozitív és negatív eredmények között, így ezeket a monoklonális antitesteket tipizálási célokra alkalmatlannak ítéltük. Ezen antitestek mindegyike közös epitópokat ismer fel, így csekély megkülönböztető értékkel rendelkeznek. A kezdeti vizsgálatban a törzsek átfedési adatai alapján több olyan monoklonális antitestet is találtunk, amelyek hasonló epitópokat ismernek fel, mint például a BBM24, BBM25 és BBM37; a BBM38 és BBM39; illetve a BBM75, BBM76 és BBM77, így az egyes csoportokból csak egy antitestet (a BBM24-et, BBM39-et, illetve BBM77-et) használtunk a szerotipizálási rendszerhez. Az említett törzsek és monoklonális antitestek kihagyásával lehetővé vált a pozitív reakció kritériumának megállapítása, miszerint a pozitív törzsek optikai denzitása lényegesen (háromszor) nagyobb volt, mint a negatív törzsek háttérszintje. A gyakorlatban ez azt jelenti, hogy a pozitív eredmény optikaidenzitás- (OD) értéke 0,6-nál nagyobb. Valamennyi pozitív reakciót ugyanazon membránkészítménnyel végzett Western biot analízissel is igazoltuk. A Western biot analízis eredményeként felfedeztük, hogy a BBM48 monoklonális antitest erősen keresztreaktív egy hozzávetőleg 60 kDos proteinnel, s az ELISA-vizsgálatban számos hamis pozitív eredményt idéz elő. Ilyenformán a BBM48 antitestet szintén kivontuk a szerológiaiváltozat-analízisből. Ennek megfelelően a szerotipizálási vizsgálat némileg egyszerűsödött, mivel a kezdeti 25 anti-OspC-antitest közül csak 13-at használtunk.
Az egyes törzsek mind a 13 monoklonális antitesttel megfigyelt reakciómintázatát összegyűjtöttük, és minden egyes mintázatot egy szerológiai változatként („serovar”) jelöltünk (lásd a 6. táblázat). A 62 vizsgált törzs között 16 külön szerológiai változatot figyeltünk meg, bizonyítva ezáltal az e membránprotein által mutatott, hatalmas mértékű szerológiai heterogenitást. Az egyes szerológiai változatok pozitív reakcióinak száma 1-től 7-ig teijedt.
Az egyes törzsekben talált szerológiai változatok teljes felsorolását a 12. ábrán mutatjuk be. Látható, hogy 12 törzs (a vizsgált törzsek 19%-a) a 13 monoklonális antitest egyikével sem reagált [ezeket NR-rel (nem reagáló) jelöltük], s így e törzseket tipizálhatatlannak ítéltük. A kísérletből az expresszió hiánya vagy alacsony volta miatt kihagyott 15 törzzsel együtt a rendelkezésre álló törzsek összesen 22%-át nem tudtuk tipizálni. A törzsek 78%-ában, melyeket egyértelműen tudtunk tipizálni, a szerológiai változatok előfordulási gyakorisága nagyon változékony volt. A 6., 8. és 9. szerológiai változatnak csak egy-egy képviselője volt, míg a legáltalánosabb 2. szerológiai változatba 10 törzs tartozott. Az OspC-protein családja és genotípusa, valamint a között, hogy melyik szerológiai változatba tartozott, szoros összefüggés mutatkozott. Valójában a legtöbb esetben közvetlen kapcsolatot figyeltünk meg, például az 1., 2., 4., 5., 7., 9., 10., 14. és 15. család esetében. A 3., 12., 13., 17., 18. és 19. családot vagy nem tudtuk tesztelni, vagy a rendelkezésre álló monoklonális antitestekkel nem voltak tipizálhatók. A 6., 8. és 11. család szerológiailag két vagy három szerológiai változatra osztható tovább, azonban érdekességként megemlíthető, hogy e családok genotípusai szintén mutattak némi diverzitást. A 16. szerológiai változatot a 16. és 20. családban is megfigyeltük. Ez valószínűleg úgy fordulhatott elő, hogy e szérumváltozat esetében csak két pozitív reakció létezik, s a jelenleg rendelkezésre álló monoklonális antitestek nem tudtak különbséget tenni a két család között.
3. példa
Az ospC heterogenitásának restrikciós fragmenshosszúság-polimorfizmus (RFLP) analízise Az Orth törzsből származó ospC-génl klónoztuk, és nukleotidszekvenciáját korábbi leírás szerint meghatároztuk (EP-A-0 522 560 számú dokumentum). Az Orth törzsből származó ospC-gén proximális (kódolószál, ATGAAAAAGAATACATTAAGTGC; a startkodont aláhúzással jelöltük) és disztális (nem kódoló szál, aláhúzással jelöltük) végét polimeráz láncreakcióban alkalmaztuk (lásd 4. példa), hogy a tenyészeti gyűjteményünk 77 törzsének ospC-génjeit amplifikáljuk. Valamennyi tesztelt törzs, köztük az Egyesült Államokból származó 14 törzs, az előre megjósolt méretű (627-642 bp) PCR-ffagmenseket eredményezett, ami azt jelzi, hogy a plazmid kódolta ospC-gén nemcsak hogy stabilan fennmarad, hanem sokkal elterjedtebb is, mint azt korábban feltételeztük. Az OspC-antigén in vitro tenyészetekben történő kimutatásának sikertelensége valószínűleg nem az ospC-gén hiányának, hanem az expresszálódó antigén hiányának vagy alacsony szintjének köszönhető.
A különböző törzsekből származó ospC-gének közötti polimorfizmust a PCR-ral amplifikált ospC-gén (melyet a fentebb leírtak szerint állítottunk elő) Dpnl 1, Ddel és Dral restrikciós enzimekkel végzett emésztése után kapott restrikciósfragmens-mintázat analízisével határoztuk meg. A 82 törzsből származó adatok (azaz a tenyészeti gyűjteményünk 77 törzséből származó kísérleti adatok, valamint az 5 publikált ospC-szekvencia alapján leszármaztatott információk; lásd 1. ábra) analízisével 35 különböző ospC RFLP-típus létezését mutattuk ki. A fragmensek standard eljárásokkal kísérletileg meghatározott számát és méretét sok esetben legalább az 1-23. RFLP-típusok egy-egy képviselőjének szekvenálásával igazoltuk; a 24. típus Padula és munkatársai szekvenciaadatain alapul. Az egyes RFLP-típusokkal kapcsolatos RFLP-mintázatokat a 7. ábrán mutatjuk be. Ahol rendelkezésre állnak, a mért értékek helyett a szekvenciainformációkból levezetett ffagmensméreteket mutatjuk be (1-24. típus). Az egyes törzsek RFLP-típusainak teljes felsorolását a 12. ábrán mutatjuk be.
HU 217 024 Β
4. példa
Az ospC-gén különböző alléljainak PCRamplifikálása és szekvenálása, valamint a leszármaztatott aminosavszekvenciák klaszteranalizise Amint az 1. és 2. példában leírtuk és a 12. ábrán összefoglaltuk, a Borrelia törzseket OspC szerológiai változatokba és ospC RFLP-típusokba tudtuk sorolni. Kiválasztottuk az 1-17. és 19-23. ospC RFLP-típusokat képviselő törzseket, majd az ospC-gérA polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk és meghatároztuk nukleotidszekvenciáját, melyből aminosavszekvenciát származtattunk. A tipizálási rendszerek érvényességének további ellenőrzéseként, illetve az OspC-típusokon belüli kimutatlan heterogenitás felfedése érdekében több esetben megvizsgáltuk a közeli rokonságban álló OspC-proteinek közötti kapcsolatot. PCR-ral összesen 27 o.ypC-gént amplifikáltunk és szekvenáltunk, amint azt fentebb leírtuk. A szekvenciákról szerzett információk alapján az OspC-proteineket OspC-családokba soroltuk.
Fagyasztott Borrelia törzs-sejtszuszpenziót felolvasztottunk, és a szuszpenzió 2 μΐ-ét (5χ106-1χ108 sejt/ml) Heraeus Biofuge A mikrocentrifugában 5 percig maximális fordulattal centrifugáltuk. A sejtüledéket 10 μΐ 1 xTAq-pufferben (Boehringer Mannheim) újraszuszpendáltuk, 50 μΐ ásványi olajjal (Pharmacia) felülrétegeztük, majd fonó vízfürdőben 8 percig inkubáltuk és azonnal jégre tettük. A sejtlizátumhoz 90 μΐ reagenselegyet [9 μΐ lOxTAq-polimeráz puffer (Boehringer Mannheim); 2 μΐ 10 mM dNTP-oldat (Boehringer Mannheim); 5 μΐ 1. prímért (ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG), 10 mM; 5 μΐ
2. prímért (ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG), 10 mM; 0,5 μΐ 5000 egység/ml koncentrációjú TAqpolimeráz (Boehringer-Mannheím); 68,5 μΐ víz] adtunk. A DNS-amplifikálást LKB Thermocycler készülékben végeztük (95 °C-on 36 másodperc, 53 °C-on 60 másodperc, 70 °C-on 84 másodperc, 30 ciklus). Az amplifikációt úgy ellenőriztük, hogy a termék 5 μΐ-ét 1% (m/V) agarózgélen Tris-acetát-pufferben (40 mM Tris-acetát, 2 mM EDTA, pH=8,0) futtattuk, etídiumbromiddal festettük és UV-fénnyel láthatóvá téve vizsgáltuk. Az amplifikált termékeket Spin Bind mikrocentrifugáló kazetták alkalmazásával (FMC) bekoncentráltuk. A DNS-t ezután 30 μΐ vízben összegyűjtöttük, és a kivonás eredményességét úgy ellenőriztük, hogy a tisztított termék 2 μΐ-ét az előzőek szerint agarózgélen futtattuk.
A szekvenálásához a fluoreszceinnel jelölt 5 ’ -ATGAAAAAGAATACATTAAGTGCG-3’ és 5 ’ -ATTAAGGTTTTTTTGGAGTTTCTG-3 ’ primerekkel Autó Cycle Sequencing készletet (Pharmacia) alkalmazva LKB Thermocycler készülékben amplifikált DNS-fragmenseket (2-7 μΐ) állítottunk elő (25 ciklus; 95 °C-on 36 másodperc; 53 °C-on 30 másodperc; 70 °C-on 80 másodperc). 6%-os poliakrilamid szekvenálógélen automata lézersugaras (ALF; automated laser fluorescent) szekvenálókészülék (Pharmacia LKB) alkalmazásával a gyártó útmutatásai szerint mintákat elektroforizáltunk. Az ALF-fel kapott nukleotidszekvencia-adatokat összegyűjtöttük és DNASIS szoftvercsomag alkalmazásával, a leszármaztatott proteinszekvenciákat pedig PROSIS szoftvercsomag alkalmazásával vizsgáltuk (Pharmacia LKB).
A Lyme-kórt okozó spirochaeták 24 különböző törzséből származó OspC-proteinek aminosavszekvenciáját (azaz a fenti vizsgálattal meghatározott 22 szekvenciát, továbbá a 2591-es és PBI törzs publikált szekvenciáját) Wilbur és Lipman gyors és közelítő módszerével (PNA USA, 80, 7226-7300, 1983) egymás alá rendeztük (allignment), s az így kapott hasonlósági pontokat dendrogram készítéséhez alkalmaztuk [melyet Sneath és Sokai (lásd fentebb) UPGMA-módszerével végeztünk, amely egyfajta klaszteranalízis]. Ezeket az analíziseket a Clustal V szoftvercsomag (Higgins és Sharp, CABIOS, 5, 151-153, 1989; Higgins és munkatársai, CABIOS, 1991) alkalmazásával végeztük.
A 24 különböző RFLP-típust reprezentáló 24 különböző törzsből származó ospC-gének és proteinek egymás alá rendezett nukleotid-, illetve leszármaztatott részleges aminosavszekvenciáját a 8. és 9. ábrán mutatjuk be. Mivel az első ciszteingyök (az Orth-szekvencia 19. aminosava) előtt álló aminosavak az OspC-proteinben vezetőszekvenciát alkotnak, s az érett szekvenciában nincsenek jelen (a FISC-szekvencia egy feltételezett jelzőpeptidáz-hasítási hely), ezeket az aminosavakat kihagytuk a szekvenciák összehasonlítási vizsgálatából. A protein C-terminális végén az utolsó 16 aminosavat hagytuk ki. Ez a 16 aminosavas szakasz a 2. primer kötőhelyének megfelelő régiót (7 aminosav) és egy 9 további aminosavból álló részt foglal magában. Az OspCgének e terminális szakasza nagymértékben konzerváltnak tűnik, és az OspC-proteinek között megfigyelt diverzitás kialakításában csekély jelentőségű, amit az jelez, hogy valamennyi tesztelt törzs ospC-génjét a 2. primer alkalmazásával képesek voltunk amplifikálni és szekvenálni. Ezenkívül az OspC e régiójához kötődő monoklonális antitestek széles körben reaktívak (például a BBM29, BBM42 és BBM45; 13. és 14. ábra).
Az OspC-szekvenciák nagyon változékonyak; a legtávolabbi rokonságban álló aminosavszekvenciák (a 297-es B. burgdorferi törzs és az IP90 B. garinii törzs) csak 59%-os aminosavazonosságot mutatnak (80%-os hasonlóság). Az egy RFLP-típusba tartozó proteinek szekvenciája között azonban nem mutattunk ki különbséget, ami arra utal, hogy ez a tipizálási módszer nagyon pontosan jelzi az ospC-gének heterogenitását (az
1. RFLP-típusba tartozó VS215, VS219 és DK7 törzs OspC-szekvenciája megegyezik a ZS7 törzsével; a 2. RFLP-típusba tartozó IP2 és 27816-os törzs azonos a B31-gyel; a 6. RFLP-típusba tartozó Hl5 és ACA1 törzsek azonosak; a 7. RFLP-típusba tartozó PKO és DK26 törzs megegyezik a JSB-vel; a 10. RFLP-típusba tartozó H4 és W törzs azonos; a 13. RFLP-típusba tartozó 871 104-es és KL11 törzs azonos; a 14. RFLP-típusba tartozó 20047-es és VS185 törzs megegyezik).
A részleges OspC aminosavszekvenciák közötti rokonság klaszteranalízissel meghatározott fokát a 10. ábrán látható dendrogram alapján mutatjuk be. Az egy fajba tartozó törzsek OspC-proteinjei közelebbi rokon15
HU 217 024 Β ságban állnak egymással, mint a különböző fajokból származó OspC-proteinek. Mindazonáltal még egy fajon belül is láthatóan jelentős változékonyság létezik. Az OspC-szekvencia diverzitása különösen nagy a B. garinii törzsek között, amit a filogenetikai fa e részén látható mélyebb elágazások jeleznek, valamint az a tény, hogy a B. garinii faj több OspC-változattal rendelkezik, mint a másik két Borrelia faj. Az ospC-öröklődés klonális szerkezete azt sugallja, hogy a genetikai anyagban lényeges kicserélődés nem történt, sem a plazmid kódolta o.vpC-géncn belüli rekombinációjával, sem annak különböző, Lyme-kórt okozó Borrelia fajok közötti horizontális átadódásával.
Az OspC-proteineket OspC-családokba soroltuk; egy OspC-család definíció szerint olyan OspC-proteinek csoportja, amelyek az érett OspC-protein első 92%-át (azaz a 18 aminosavas vezérlőszekvencia és az utolsó 16 aminosav nélküli proteint) tekintve 80%-nál nagyobb azonosságot mutatnak. A 10. ábrán 18 különböző OspCcsaládot tüntetünk fel, de a H13 és 28691-es törzsből származó OspC-proteinekre vonatkozó, nem teljes szekvenciaadatok alapján két további OspC-családot azonosítottunk (19. és 20. család), melyeket a dendrogramon nem tüntetünk fel.
Az OspC-proteinek közötti nagy diverzitás ellenére az azonos fajba tartozó törzseket tekintve az OspC-protein első harmada konzervált (10. ábra) (e törzsek az érett OspC-protein e régiójában körülbelül 80-90%-os szekvenciaazonosságot mutatnak). A különböző fajokból származó OspC-proteinek szekvenciaazonossága a protein e részében azonban nem ilyen nagy, köszönhetően az OspC-protein N-terminális végén lévő fajspecifikus szekvenciamotívumoknak. Amint fentebb jeleztük, az OspC be nem mutatott C-terminális része szintén nyilvánvalóan nagymértékben konzervált. A közbeeső régió (azaz a 9. ábra utolsó két lapján a KKI és NS aminosavak közötti régió) nagymértékben variábilis, és ez a szakasz az OspC-vel kapcsolatos diverzitás fő forrása. Várható, hogy a szerotípus-specifikus epitópok e variábilis régión belül helyezkednek el. Az egyes proteinszekvenciák hidrofilitási profiljainak Hopp és Woods eljárása szerint végzett vizsgálatával azt találtuk, hogy a legmagasabb hidrofilitási csúcs, amely igen erősen egy epitóp létezésére utal, e régión belül helyezkedik el. Közelebbről, az OspC-szekvenciák e régióban megfigyelhető nagy variábilitása ellenére egy feltételezett epitóp változások nélkül az érett protein 120-155. aminosavgyökei között helyezkedik el. Az Orth törzs OspC-proteinjében a hidrofilitási csúcs a 136-141. aminosavaknál (DNDSKE) helyezkedik el, amely régió nagy flexibilitással rendelkezik és előre megjósolt β-redőt képez; ezek az ismérvek szintén egy epitóp létezésére utalhatnak (az analízist PC/GENE alkalmazásával végeztük).
5. példa
Az anti-OspC monoklonális antitest epitóp-térképezése
Bizonyos anti-OspC monoklonális antitestek epitópjait a Cambridge Research Biochemicals Ltd.-től (Gradbrook Park, Northwich, Cheshire, Anglia) beszerezhető Custom Designated Epitope Scanning készlet alkalmazásával térképeztük, melynek során a Geysen és munkatársai által leírt „tűtechnológiát” (J. Immunoi. Methods., 102, 259-274, 1987) vagy a gyártó által leírt biotinilált peptid ELISA- vagy dot-blot eljárást alkalmaztuk. Az általunk tesztelt, rendelésre szintetizált 2026 darab peptid a 9. ábrán bemutatott OspC-proteinek átfedő 10-mere volt. Az Orth törzs jelzőpeptidszekvenciájának, valamint az Orth PKO és B31 törzs OspC-proteinjei C-terminális végének átfedő peptidjeit szintén bevontuk a vizsgálatba.
Az egymást követő, monoklonális antitesttel reagáló peptidek kombinált szekvenciáját „teljes epitópszekvenciaként” írjuk le. A 13. ábrán azon monoklonális antitestek teljes epitópszekvenciáit soroljuk fel, amelyekhez epitópok ismerhetők fel. A szögletes zárójelben szereplő szekvencia az összes reagáló peptidre általánosan jellemző aminosavakat foglalja magában, melyek ilyenformán az epitóp fontos részét képezik. Az egyes, teljes szekvenciák általánosított OspC-proteinen belüli elhelyezkedését a 14. ábrán mutatjuk be. Egy esetben számos epitóp különböztethető meg, azonban csak a primer epitóp (azaz a legreaktívabb epitóp) szekvenciáját adjuk meg (13. ábra) és mutatjuk be (14. ábra). Olyan esetekben, amikor a monoklonális antitest egynél több OspC-proteinben hasonló régióknak megfelelő pepiiddel reagált, csak az Orth törzs proteinjének peptidjét adjuk meg. Ezzel szemben, ha a monoklonális antitest nem reagál az Orth proteinnel (például a BBM43), úgy a homológ törzs (PKO) reagáló szekvenciáját adjuk meg. A 13. ábra alján a monoklonális antitesteket az általuk felismert epitópok (melyeket az ábra felső részében mutatunk be) előfordulási gyakorisága alapján osztályozzuk. Amint látható, az antitestek több, mint fele igen specifikus epitópokat ismer fel, amelyek a vizsgált törzsek között tíznél kevesebb alkalommal fordulnak elő. Öt monoklonális antitest közepes előfordulási gyakoriságú epitopot ismer fel, míg a fennmaradó hét antitest közös (általános) epitópokat ismert fel, mivel ezek az epitópok a vizsgált 77 törzs között huszonötnél több alkalommal fordulnak elő. A 13. ábrán csillaggal jelöljük azokat a monoklonális antitesteket, amelyeket alkalmasnak találtunk a szerológiai változatok analíziséhez. Érdekes megjegyezni, hogy elsősorban azok a monoklonális antitestek voltak egyértelműen térképezhetők, amelyek az általános epitópokat, illetve a közepes előfordulási gyakoriságú epitópokat ismerik fel (BBM28, BBM29, BBM34, BBM37, BBM42, BBM43 és BBM45; illetve BBM22, BBM35 és BBM40). Valójában csak három típusspecifikusnak ítélhető (azaz kevesebb, mint 10 törzzsel reagáló) monoklonális antitest (BBM38, BBM39 és BBM44) volt térképezhető. A BBM38 és BBM39 a törzsekkel azonos reakciómintázatot mutatott, és ugyanahhoz a régióhoz kötődött (155. és 170. aminosav). Az Orth protein hidrofilitási görbéje alapján a hidrofilitási csúcs és a megjósolt β-redő e régióval esik egybe, ami igen erősen epitóp jelenlétére vall. A BBM44 epitópja a 79. és 90. aminosav között helyezkedik el, ami szintén igen variá16
HU 217 024 Β bilis terület. A többi típusspecifikus monoklonális antitest epitópját sajnos nem sikerült térképezni, ami azt sugallja, hogy ezek a molekula igazolásától függnek. Mivel mind a három típusspecifikus monoklonális antitest a protein legvariábilisabb részei közé tartozó régióhoz kötődik, igen valószínű, hogy ezek egyéb típusspecifikus epitópok esetében is szerepet játszanak. Érdekes, hogy a BBM28, amely nagyon gyakori epitóppal reagál, ugyanazokkal a régiókkal térképezhető, mint a BBM38 és BBM39. Ennek oka ismeretlen, bár létezhetnek a kötőhelyben szereplő aminosavak számában és minőségében csekély különbségek, amelyek ezt a bizonytalanságot okozzák.
A közös epitópokkal reagáló antitestek közül négy (BBM29, BBM42, BBM43 és BBM45) a protein disztális C-terminális végéhez kötődik (200-212. aminosavak), míg két másik a protein N-terminális végének közelében lévő régióval (41-67. aminosavak) reagál. Ezekről a régiókról kimutattuk, hogy nagymértékben konzerváltak. A közepes előfordulási gyakoriságú epitópokat felismerő monoklonális antitestek a molekula félig konzervált régióihoz kötődnek (103-114. és 176-196. aminosavak).
Ezeket az eredményeket egy másik kísérletben is bebizonyítottuk, amelyben az OspC-protein mind a 16 szerológiai változatát expresszáló törzsek 2. membránffakcióira specifikus polivalens nyúlszérumot az Orth protein 203 átfedő peptidjével szemben vizsgáltuk. Valamennyi közös keresztreaktív epitopot a fentebb vázolt, konzervált és félig konzervált régiókon belül figyeltük meg. Érdekes módon az 1. CMAT-csoport (a szoros értelemben vett B. burgdorferi) törzseiből származó szérumok nem mutatnak olyan gyakori keresztreaktivitást, mint a 3. CMAT-csoportból (B. afzelii) és a 4. CMATcsoportból (B. garinii) származó szérumok.
6. példa
Keresztvédelmi vizsgálatok Gerbillus egerekben
Hogy megbizonyosodjunk arról, hogy a különböző OspC-családok között lehetséges-e keresztvédelem, a ZS7 B. burgdorferi törzsből (1. OspC-család), a PKO B. afzelii törzsből (7. OspC-család) és a W B. garinii törzsből (10. OspC-család) OspC-proteineket tisztítottunk, és ezeket a Lyme-borelliosis Gerbillus modelljében az Orth B. afzelii törzs (5. OspC-család) okozta fertőzés elleni immunogénként alkalmaztuk. A családon belül védőhatás tesztelése érdekében Orth törzs elleni immunogénként a H7 törzsből származó OspC-t (5. OspC-család) alkalmaztuk. A H7 törzsből származó OspC ugyanabba a szerológiai változatba és RFLP-típusba tartozik, mint az Orth törzsből származó OspC.
A Gerbillus egereket egy alkalommal szubkután, „víz az olajban” (szkvalén) típusú emulzióként szintetikus immunmodulátorral (CRL89-41 kopolimer) készített, tisztított OspC-vel [20 pg protein/200 μΐ, TiterMax #R-1 (CytRx) adjuvánssal] vagy két alkalommal intraperitoneális OspC-injekcióval (10 pg protein/500 pl) (alumínium-hidroxid-adjuvánssal) immunizáltuk. A törzsekből a tisztított antigéneket az EP-A-0 522 560 számú dokumentumban leírt eljárással készítettük. Az első immunizálás után három és fél héttel az állatok szeméből vért vettünk, és vérplazmát készítettünk, hogy ellenőrizni tudjuk az immunpróba (fertőzés) idején az immunogénre adott antitestreakciót (az immunizálatlan kontrollállatokat hasonlóan kezeltük). Az első immunizálás után négy héttel az állatokat (a kontrollt is) intraperitoneálisan 104 Orth törzsbe tartozó sejttel (25-100 ID50) fertőztük. A fertőző szuszpenzió mennyiségét az állatok 50%-ának megfertőzéséhez szükséges dózis meghatározása érdekében immunizálatlan egerekben is vizsgáltuk. Újabb két hét elteltével a 104 sejtdózíssal fertőzött egereket leöltük, és húgyhólyagukat, szívüket, veséiket és lépjeiket BSK tápközegben inkubáltuk. A tenyészeteket az oltás utáni második héttől a hatodik hétig sötét látóterű mikroszkóppal hetente spirochaeták jelenlétére vizsgáltuk. Vért is vettünk, és a vérplazmát Western biot analízissel szerológiai átalakulásra, vagyis az immunogéntől eltérő, Orth törzsből származó, fertőzés utáni antigének elleni antitestek kifejlődésére vizsgáltuk. Az állatok fertőzöttségének megállapítására használt tenyészeti és szerológiai tesztek hasonló eredményeket mutattak. Az ID50 meghatározásához csak szerológiai tesztelést alkalmaztunk, de ebben az esetben az állatoktól a fertőzés (immunpróba) után három héttel vettünk vért, hogy biztosítsuk a fertőzött egerekben a kellőképpen erős és könnyen kimutatható antitestreakciók kialakulását.
A fajok között keresztvédelemre utaló jeleket nem észleltünk, vagyis az 1. OspC-családból (B. burgdorferi) és a 10. OspC-családból (B. garinii) származó OspC-proteinek az Orth törzzsel (B. afzelii) végzett fertőzés (immunpróba) ellen immunogénként hatástalanok voltak. Hasonlóképpen, az egy fajba tartozó különböző OspC-családok között sem tapasztaltunk keresztvédelmet, vagyis a 7. OspC-családból (ő. afzelii PKO törzs) származó OspC-protein immunogénként hatástalan volt az 5. OspC-családba tartozó OspC-proteint expresszáló Orth törzzsel végzett fertőzés ellen. Ezzel szemben a H7 törzsből származó OspC-proteinnel (5. OspC-család) végzett immunizálás hatásos volt az Orth törzzsel (5. OspC-család) végzett fertőzés ellen. Ezek az adatok (15. ábra) azt jelzik, hogy az OspC-családok közötti keresztvédettség valószínűtlen, a családon belüli védettség azonban lehetséges. A legtöbb Lyme-kórt okozó Borrelia törzs elleni védettség kialakításához elégséges lehet olyan multivalens vakcina, amely valamennyi OspC-családból egy vagy több OspC-típust tartalmaz.
7. példa
Az emberi betegséggel kapcsolatos különböző
OspC-proteincsaládok földrajzi megoszlása és előfordulási gyakorisága
Az OspC-protein nagyfokú variabilitásának köszönhetően nagyon nehéz jó védettséget biztosító vakcinakészítményt kialakítani, azonban ennek megvalósításához még sincs szükség túlzottan nagy mennyiségű proteinváltozat bevonására. Az OspC-változatok kiválasztásának egyik előnyös módja az lehet, hogy meghatározzuk, mely OspC-változatok kapcsolatosak emberi betegséggel és melyek fordulnak elő gyakran. A ritka OspCváltozatok, illetve a humán betegséggel ritkán összefiig17
HU 217 024 Β gő OspC-változatok így kihagyhatok a vakcinakészítményből, miközben a vakcina hatékonysága alig csökken. Ha a vakcinát kizárólag egy adott földrajzi területen belüli alkalmazáshoz tervezzük, szükségtelen azokat az OspC-változatokat is bevonni a készítménybe, amelyek azon a bizonyos területen a Lyme-kórt okozó Borrelia törzsekben nem gyakoriak. A Borrelia törzsek járványtan! és OspC-tipizálási adatainak (12. ábra) felhasználásával kiválaszthatók azok az OspC-változatok, amelyeket az OspC-vakciná(k)ban alkalmazni kell.
A B. burgdorferi izolátumok (a 25 015-ös törzset magában foglaló 1. CMAT-csoport; összesen 23 törzs) vizsgálata azt mutatja, hogy e törzsekben a leggyakoribb OspC-változatok az 1. és 2. családba tartozók. Az
1. családba tartozó törzsek kivétel nélkül európai izolátumok, és emberi betegséget okozhatnak, bár az öt törzs közül csak egy volt humán izolátum, ami azt jelentheti, hogy ezek a törzsek nem túlságosan virulensek. A 2. családba tartozó törzsek az OspC-család legáltalánosabb típusát képviselik, összesen 10 taggal. Az 1. családba tartozó törzsektől eltérően széles körben elterjedtek; az Egyesült Államokból, Európából és Oroszországból származó izolátumokban egyaránt megtalálhatók. A 2. családba tartozó törzsek egyértelműen kapcsolatosak emberi betegséggel - az izolátumok 50%-a klinikai példány. A fennmaradó nyolc tesztelt B. burgdorferi izolátum mindegyike egyesült államokbeli izolátum, s az expresszált OspC-t tekintve nagyon eltérőek, mivel mindegyik törzs különböző OspC RFLP-típust expresszál. E törzsek közül csak egyet (297-es törzs, 3. család) izoláltunk Lyme-kóros páciensből. A 2. és 3. család - a 25 015-ös törzs kivételével - a három fő, emberi betegséggel kapcsolatos klón egyikébe, az 1.2.4. CMAT-típusba tartozik (5. ábra). A B. afzelii (VS461 csoport, 3. CMAT-csoport) 26 törzse hat különálló családba sorolható; a 4-8. és a 16. családba, melyek 5, 4, 6, 2, illetve 4 tagból állnak. Egy japán izolátum kivételével valamennyi törzs Európából származott: Ausztriából (14), a Cseh Köztársaságból (4), Dániából (1), Németországból (2), Olaszországból (1), Szlovéniából (1), Svédországból (1) és Svájcból (1). Az európai izolátumok 88%-a humán eredetű volt, melyek közül 80% bőrbiopsziákból, 8% pedig vérmintákból származott. Ez a B. afzelii törzsek és a Lyme-kór dermatológiai formáinak kifejlődése közötti szoros összefüggésre utal. A humán izolátumok egyenlő mértékben oszlanak meg a különböző OspC-családok között. Az osztrák izolátumok döntően a 4-6. családba tartoznak (86%), de a 7. és 8. családba is tartozott egy-egy izolátum. Az a tény, hogy az osztrák izolátumok közül a 7. OspC-családba kevés (öt közül egy), a 16. családba pedig egy sem (négy közül egy sem) tartozott, azt sugallja, hogy a különböző B. afzelii OspC törzsek elteqedtségében Európán belül földrajzi változatok léteznek. Mindazonáltal a 4-8. és 16. családba tartozó B. afzelii törzsek egész Európában elteijedtek. Ezek a törzsek egy másik emberi betegséggel kapcsolatos klón, nevezetesen a 3.2.13. klón jóformán kizárólagos tagjai (5. ábra).
A harminc B. garinii törzs (azaz a 4. CMAT-csoport a 19857-es és 19952-es altípusos törzsek és a 20047-es,
IP90 és NBS162. CMAT törzsek kivételével) 9 OspCcsaládba és 2 RFLP-típusba sorolható, mely utóbbiak nem tartoznak egy családba sem. A tesztelt B. garinii törzsek 53%-a humán izolátum volt, melyek széles körű eloszlást mutattak, de csak egy OspC-típusba (RFLP 34) tartoztak. Ε B. garinii törzsek 77%-a (16-ból 12-t) neuroborreliosisban szenvedő páciensből származott, míg a többi bőrből származó izolátum volt. A B. garinii ennek megfelelően elsősorban a neuroborreliosisszal kapcsolatos, bár a bőrizolátumok előfordulása is várható, mivel bőrsérülések (EM) kifejlődése a Lyme-kór valamennyi fajtájára (függetlenül az okozójától) általánosan jellemző megnyilvánulás. A 13. OspC-családba tartozó törzsek képezték a legáltalánosabban izolált OspC-típust; ezek tették ki az összes B. garinii OspC-típus 23%-át (30-ból 7) és a humán izolátumok 25%-át (16-ból 4). Ezen OspC-család törzsei Európában széleskörűen elterjedtek, s hat országból származó izolátumokat foglalnak magukban. All. OspC-család szintén széles körű elterjedést mutat, és igen gyakori előfordulású (17% vagy 30-ból 5), de az emberi betegséggel való kapcsolata kevésbé tisztázott, mivel csak egy izolátum származott emberből, ami mintavételi hibát és a vizsgált törzsek kis számát is tükrözheti. Ezen utóbbi magyarázatok alkalmazhatók a 14. OspC-család törzsei esetében is (négy törzsből csak az egyik humán izolátum). A többi OspC-családba tartozó izolátumok (9., 10., 12., 15., 17., 19.; valamint a 33. és 34. RFLP-tipus) kisebb gyakoriságot mutatnak. Meg kell fontolni a 10. és 19. OspC-családba tartozó osztrák B. garinii törzsek elleni vakcina kialakítását is, mivel mind a négy Ausztriából származó B. garinii izolátum e két OspC-családba tartozott.
A Borrelia törzsek fentiekben leírt közvetlen analízise mellett a különböző OspC-változatok elteqedtségét és humán borreliosisszal való kapcsolatukat közvetett módon is meghatározhatjuk. Ezt Lyme-kórban szenvedő páciensek szérumából származó OspC-antitestek specifitásának tesztelésével valósíthatjuk meg. A Cseh Köztársaságban Prága környékén élő páciensektől vett 50 szérummintát (15 EM-ben szenvedő, 15 ACA-ban szenvedő, 10 idegrendszeri betegségben szenvedő, illetve 10 ízülettel és izommal kapcsolatos betegségben szenvedő pácienstől vett szérumminták) OspC elleni antitestek jelenétére teszteltünk. 18 törzsből álló sorozattal szemben tesztelve 17 szérumminta (34%) (3 EM, 10 ACA, 3 Lyme arthritis és 1 neuroborreliosis) a 16 tesztelt OspCcsaládból eggyel vagy többel reagált (16. ábra). 20 szérumminta specifikusan csak egy OspC-családdal reagált [5. család (4), 7. család (3), 6. család (2), 8. család (1), 13. család (1) és 14. család (1)]. Három szérumminta a 4. és 6. családdal egyaránt reagált, míg két másik szérumminta a tesztelt családok közül hattal, illetve nyolccal reagálva széles körű keresztreaktivítást mutatott. Következésképpen a Cseh Köztársaságban az 5-7., 13., 14. és valószínűleg a 4. OspC-családból származó OspC-változatokat expresszáló Borrelia törzsek vannak jelen. Ezek a szerológiai adatok megegyeznek a szomszédos Ausztriában végzett törzsanalízis eredményeivel, s így igazolják is azokat.
HU 217 024 Β
A fentebb leírt eredmények alapján az alábbi földrajzi területeken alkalmazható vakcinákat készítettünk:
1. Egyesült Államok; a 2. és 3. OspC-családból származó OspC-proteinek;
2. Európa; a 2., 4-7., 9., 10., 12., 13., 14., 15-17. és
19. OspC-családból származó 14 OspC-változat;
3. Ausztria; a 2., 4-7., 10., 13. és 19. OspC-családból származó 8 vagy több OspC-protein.
8. példa
Rekombináns OspC expresszálása P. pastorisban
Pichia pastoris OspC expressziós vektor előállítása
A B. burgdorferi OspC kódolószekvenciájának klónozásához a pHIL-Al rekombináns P. pastoris/E. coli ingázóvektort (mely beszerezhető a Phillips Petroleum Co.-tól) alkalmaztuk. Az egyes törzsek egy vagy több képviselőjéből álló törzssorozatot választottunk ki, és az OspC-gént polimeráz láncreakcióval amplifikáltuk. Az első ciszteinaminosavval (az Orth törzsbe tartozó OspC-proteinszekvencia 19. aminosava) kezdődő érett OspC-protein kódolószekvenciáját az OspC nukleotidszekvenciákból leszármaztatott törzsspecifikus primerek alkalmazásával amplifikáltuk (lásd EP 0 522 560).
A B. burgdorferi Orth OspC-gén 5’- és 3’-végének kialakítása érdekében az 5’-AAATGTGTAATAATTCAGGGAAAGG-3’ szekvenciával rendelkező N-terminális PC-F prímért és az 5 ’ - ATT AAGGTTTTTT TGGAGTTTCTG-3’ szekvenciával rendelkező PC-B C-terminális prímért alkalmazva, lényegében a 4. példában leírtak szerint polimeráz láncreakciót (PCR) végeztünk. A PC-F primer szekvenciájában aláhúzott aminosavak megegyeznek az érett OspC-protein transzlációs startkodonjával, a PC-B primer szekvenciájában aláhúzott aminosavak pedig a transzlációs stopkodonnal azonosak.
A B31, PKO, ZS7, KL10 és E61 B. burgdorferi törzs OspC kódoló szekvenciájának inszertálásához alkalmazott klónozási stratégiákat (restrikciós hely a vek10 torban és a PCR-hoz alkalmazott primerek) az alábbi 1. táblázatban foglaljuk össze. A pHIL-Al vektort Sful restrikciós enzimmel emésztettük, és a túlnyúló végeket Klenow-polimerázzal feltöltöttük, hogy tompa végeket alakítsunk ki. Az OspC-kódolószekvenciát tartalmazó tisztított PCR-ffagmenst egy éjszakán át ligái tűk a vektorral. A ligálóeleggyel kompetens E. coli DH5alfa törzset transzformáltunk, és a plazmid további amplifikálásához LB-Amp lemezeken ampicillinrezisztens telepeket szelektáltunk. Restrikciósfragmens-hosszúság alapján minipreparátumokat (Maniatis és munkatársai, 1982) screeneltünk és analizáltunk, és az OspC-gént tartalmazó plazmidot pPC-PP4-nek neveztük el (17. ábra). Tisztított pPC-PP4 DNS-t készítettünk, és a szekvenciát DNS-szekvenálással ellenőriztük. A tisz25 tított pPC-PP4-plazmidot Dohmen és munkatársai által 1991-ben leírt eljárással (Yeast, 7, 691-692) GS115 NRRL-Y 11430 P. pastoris törzsbe (Cregg és munkatársai, Mól. Cell. Bioi., 5, 3376-3385, 1985) transzformáltuk, és a transzformánsokat MD lemezeken szelektáltuk.
1. táblázat
| B. burgdorferi törzs | Primer | A pHIL-ΑΙ vektor emésztése |
| Orth | 5’-AA ACG ATG TGT AAT AAT TCA GGG AAA-3’ 5 ’ -GGATTAAGGTTTTTTTGGTTTCTG-3 ’ | Sful/Klenow |
| KL10 | 5’-GGGACTTCGAAACGA ATG TGTAATAATTCA-3’ 5’-GGTGGG GGA ATT CAT TAA GGT TTT-3’ 5’-TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
| ZS7 | 5’-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3’ 5’-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5’-GGT TTT TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
| B31 | 5’-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3’ 5’-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5’-GGT TTT TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
| E61 | 5’-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3’ 5’-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5’-GGT TTT TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
| PKO | 5’-CGGAAAAAAAACTTCGAAACGA ATG TGTAA-3’ 5’-TAATTCAGGGAAAG GGA AAT CAT TAA-3’ 5’-GGT TTT TTT GGA-3’ | SfuI/EcoRI |
Az 1. táblázatban a különböző, Lyme-kórt okozó Borrelia törzsek érett OspC-proteinje kódolószekvenciájának PCR-amplifikálásához alkalmazott oligonukleotid primereket mutatjuk be. A táblázatban megadjuk az OspC-kódolószekvencia pHIL-Al vektorba való inszertálásához alkalmazott restrikciós enzimeket is.
Rekombináns OspC expresszálása P. pastorisban
MD lemezekről vett GS115/pPC-PP4 P. pastoris transzformánsokat 30 °C-on állandó keverés mellett 2-10 optikai denzitás (OD600) érték eléréséig 3 ml MG tápközegben növesztettünk. Az OspC-szintézis induká60 lásához a tenyészet egy ml-ét lecentrifugáltuk, MM táp19
HU 217 024 Β közeggel egyszer mostuk, 3 ml MM vagy MMY1 tápközegben újraszuszpendáltuk, és 30 °C-on 2 napig állandó keverés mellett inkubáltuk. Az OspC expreszszióját a tápközeghez metanolt adva indukáltuk. A tenyészetből alikvotokat vettünk, és a lizátumokat BBM 45 OspC-specifikus monoklonális antitest alkalmazásával, Western biot analízissel vizsgáltuk.
[' Az alábbi tápközegek összetételét egy liter térfogatra vonatkoztatva adjuk meg:
MD: élesztő nitrogénbázis (YNB, 13,4 g), ammónium-szulfát (5 g), biotin (400 mg), glükóz (2%);
MG: YNB, ammónium-szulfát, biotin, glicerin (10 ml/1), kálium-foszfát (100 mM);
MM: YNB, ammónium-szulfát, biotin, metanol (5 ml), kálium-foszfát (100 mM);
MMY: MM, élesztőkivonat (10 g), kazein (20 g).]
A rekombináns OspC tisztítása
A GS115/pPC-PP4 P. pastoris sejteket 4 °C-on 3000 χ g-vel 5 percig végzett centrifúgálással összegyűjtöttük. A mosott sejteket 150 mM Tris/HCl pufferben (pH=7,4) újraszuszpendáltuk, és a szuszpenziót üveggyöngyökre öntöttük. A sejteket ezután az elegy Vibrogen® sejtaprítóban (Model V14, Bühler) végzett keverésével lizáltuk. A lizátumot az üveggyöngyök eltávolítása érdekében színtereit üvegszűrőn szűrtük, majd 4 °Con 3000] χ. g-vel 5 percig centrifugáltuk. A felülúszót 4 °C-on 100 000 g-vel egy óra hosszat ismét centrifugáltuk. A nagy fordulattal centrifugált felülúszót használtuk az OspC-antigén további tisztításához.
Az OspC-antigéneket DEAE-kromatográfiával az alábbiak szerint frakcionáltuk:
Oszlop: protein-PAK DEAE 5PW (Waters);
Minta: 45 ml dializált antigénkészítmény;
Ekvilibrálópuffer a): 10 mM Tris/HCl (pH=7,5);
Eluálópuffer b): 10 mM Tris/HCl, 1 M NaCl (pH=7,5);
Átfolyási sebesség: 4 ml/perc;
Gradiens: 70percig0% B puffer, 50percig0-100%.
Az oszlopot az A pufferrel ekvilibráltuk, majd az antigéneket növekvő koncentrációjú NaCI-oldattal eluáltuk. A szóban forgó antigént tartalmazó frakciók azonosítása érdekében a frakciók részleteit acetonnal kicsaptuk, és az üledéket SDS-PAGE analízissel és/vagy immunblot analízissel vizsgáltuk. A DEAE ioncserélő kromatográfiából származó, növelt OspC-antigéntartalmú frakciókat immobilizált fémaffinitás-kromatográfiával tovább tisztítottuk (lásd EP 0552560 számú szabadalom).
Az OspC-protein nagyüzemi előállítása fermentorban
Az OspC termelését folyamatos fermentációs rendszerben vizsgáltuk. Az egyes fermentációs folyamatokat a pH, oldott oxigén, keverési sebesség, hőmérséklet, levegőáramlás és oxigénáramlás ellenőrző és szabályozóberendezéseivel felszerelt fermentorban végeztük. A hőmérsékletet 30 °C-on tartottuk. A sejthozamot a mosott sejtek nedves tömegéből határoztuk meg.
A fermentációs folyamatokból vett oltómintákat 500 ml módosított FM21 tápközeget tartalmazó 2 literes Erlenmeyer-lombikokban növesztettük (lásd EP
263 311). A szakaszos módszerrel növesztett fermentációs tenyészeteket kizárólagos szén- és energiaforrásként glicerinnel tenyésztettük. A folyamatos tenyészeteket 500-700 g nedves sejttömeg/liter biomassza-koncentráció eléréséig állandó glicerinbetöltéssel alakítottuk ki. A nullpontkontrollminták vételekor a tenyészethez metanol/sók/biotin betáplálás formájában több napon keresztül metanolt adtunk, hogy a metanolkoncentrációt 0,05% és 1,5% között tartsuk. A termelt biomasszát naponta eltávolítottuk. A P. pastoris sejteket centrifugálással távolítottuk el, és pufferben [150 mM Tris/HCl, 2 mM EDTA, 1 mM benzamidin-hidroklorid, 0,1% NaN3 (pH=7,4)] újraszuszpendáltuk. A sejtlizátumokat French-prés alkalmazásával készítettük. Az OspC-proteinkoncentrációt Bradford módszerével határoztuk meg. Az előzetes eredmények azt mutatták, hogy a P. pastoris-ból származó OspC-antigén hozama (a tenyészet egységnyi térfogatára vonatkoztatva) százszoros a B. burgdorferi törzsekből nyert hozamokhoz képest.
A P. pastorisból származó OspC-antigén immunizálási és immunpróba (védelmi) vizsgálatai
A védelmi vizsgálatokat az 5. példában leírtak szerint Gerbillus egerekkel végeztük. A P. pastorisból származó (Orth törzsből klónozott) OspC, illetve az Orth Borrelia törzsből származó OspC 20 mikrogrammját védelmi hatékonyságára teszteltük (lásd 18. ábra). A P. pastorisból származó OspC-vel immunizált valamennyi egér védett volt a homológ Orth törzzsel végzett fertőzéssel szemben, és az eredmények hasonlóak a Borrelia eredetű OspC-antigénnel végzett védelmi vizsgálatok eredményeihez.
Claims (33)
- (1) VKLSESVASLSKAA;1. Immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogya) Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lymeborreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból, amelyi) a jelenleg ismert, all. ábrán feltüntetett húsz OspC-család mindegyikéből egy vagy több tisztított, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigént tartalmaz, vagy ii) az említett OspC-antigének OspC-változatait - amelyek a 9a. ábrán feltüntetett aminosavszekvenciákkal legalább 80%-os homológiát mutatnak - vagy az említett OspC-antigének OspC-utánzatait tartalmazza, ahol az OspC-változatok és OspC-utánzatok a védőhatású immunitás indukálása szempontjából a natív OspCantigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek; valamintb) fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- (2) TDNDSKEAILKTNGT;2. Immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy a) Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lyme-borreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból, amelyi) a 19. ábrán feltüntetett OspC-családok mindegyikéből egy vagy több tisztított, az emberi betegség20HU 217 024 Β gél kapcsolatos (HDA) kiónok vagy klonális klaszterek közül egy vagy több által expresszált, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigént tartalmaz, vagy ii) az említett OspC-antigének OspC-változatait- amelyek a 9a. ábrán feltüntetett aminosavszekvenciákkal legalább 80%-os homológiát mutatnak - vagy az említett OspC-antigének OspC-utánzatait tartalmazza, ahol az OspC-változatok és OspC-utánzatok a védőhatású immunitás indukálása szempontjából a natív OspCantigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek; valamintb) fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- (3) KELTSPWAETPKKP;3. Immunogén készítmény Európában történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogya) Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lyme-borreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból, amelyi) a 2., 4-7., 9., 10., 12-17. és 19. OspC-család mindegyikéből egy vagy több tisztított, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigént tartalmaz, vagy ii) az említett OspC-antigének OspC-változatait- amelyek a 9. ábrán feltüntetett aminosavszekvenciákkal legalább 80%-os homológiát mutatnak - vagy az említett OspC-antigének OspC-utánzatait tartalmazza, ahol az OspC-változatok és OspC-utánzatok a védőhatású immunitás indukálása szempontjából az eredeti OspCantigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek; valamintb) fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- (4) FVLAVKEVETL;4. Immunogén készítmény Ausztriában történő felhasználásra, azzal jellemezve, hogya) Lyme-borreliosisra fogékony emlősben a Lymeborreliosis ellen védő hatású immunreakció kiváltásához elégséges mennyiségű anyagból, amelyi) a 2., 4-7., 10., 13. és 19. OspC-család mindegyikéből egy vagy több tisztított, Lyme-kórt okozó Borrelia OspC-antigént tartalmaz, vagy ii) az említett OspC-antigének OspC-változatait- amelyek a 9. ábrán feltüntetett aminosavszekvenciákkal legalább 80%-os homológiát mutatnak - vagy az említett OspC-antigének OspCutánzatait tartalmazza, ahol az OspC-változatok és OspC-utánzatok a védőhatású immunitás indukálása szempontjából az eredeti OspC-antigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek; valamintb) fiziológiailag elfogadható vivőanyagból áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- (5) YAISTLITEKLKAL;5. A 3. vagy 4. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett anyag a B31, Orth, H4 és KL11 Borrelia törzsekből származó OspA-antigéneket is tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- (6) PNLTEISKKITDSNA;6. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett anyag az i) és ii) pontokban meghatározott antigénként Lyme-kórt okozó Borrelia teljes sejtekből tisztított antigéneket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- (7) ASANSVKELTSPVV;7. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett anyag az i) és ii) pontokban meghatározott antigénként eukarióta gazdasejtekben rekombináns módszerrel előállított antigéneket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- (8) SWAETPKKP;8. A 7. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejtként élesztősejtben előállított antigéneket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- (9) GKKIQQNNGLGA és (10) SPVVAESPKK, ahol a változatok és utánzatok a védőhatású immunitás indukálása szempontjából a natív OspC-antigén szerkezetéhez kellőképpen hasonló szerkezetűek. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)9. A 7. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett gazdasejtként P. pastorisban előállított antigéneket tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 10. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett antigének az alábbi aminosavszekvenciák valamelyikével rendelkező egy vagy több epitopot vagy ezen epitópok változatait vagy utánzatait tartalmazzák:
- 11. A 10. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az (1)—(10) epitópok mindegyikét tartalmazza. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 12. A 10. vagy 11. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy tartalmaz még adjuvánst is. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 13. A 12. igénypont szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy adjuvánsként alumínium-hidroxidot tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 14. Az 1 — 13. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett védőhatású mennyiség dózisonként és antigénenként 1-100 pg. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 15. A 1-14. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említett védőhatású mennyiség dózisonként és antigénenként 10-50 pg. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07. 01.)
- 16. Az 1-15. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy ember immunizálásához elengedő mennyiségű immunogén anyagot tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 17. Az 1-16. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmény, azzal jellemezve, hogy az említettHU 217 024 Β védőhatású mennyiség a Lyme-borreliosist illetően megelőző vagy enyhítő hatású. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 18. Eljárás vakcina előállítására, azzal jellemezve, hogy az 1-17. igénypontok bármelyike szerinti immunogén készítmények antigénjeit emlősök Lyme-borreliosis betegségének kezelésére és megelőzésére szolgáló vakcinában alkalmas vivőanyaggal kombináljuk. (Elsőbbsége: 1993.04.29.)
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy ember betegségének kezelésére szolgáló vakcinát állítunk elő. (Elsőbbsége: 1993. 04. 29.)
- 20. A 18. vagy 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dózisonként és antigénenként 1-100pg hatóanyagot alkalmazunk. (Elsőbbsége:1993. 04. 29.)
- 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy dózisonként és antigénenként 10-50 pg hatóanyagot alkalmazunk. (Elsőbbsége: 1993. 04. 29.)
- 22. A 18-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a hatóanyagot a Lyme-borreliosist illetően megelőző vagy enyhítő hatású mennyiségben alkalmazzuk. (Elsőbbsége: 1993. 04.29.)
- 23. Rekombináns DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a következő törzsek 8a. ábrán bemutatott bármely OspC-génszekvenciájának nukleotidszekvenciáját tartalmazza: 28 691, 25 015, ZS7, 297, Simon, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NSB23a, 20047, KL10, IP90, NBS1AB, BITS, KL11, H13. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 24. Rekombináns DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a következő törzsek 9a. ábrán bemutatott OspC-antigénjét kódolja: 28 691, 25 015, ZS7, 297, Simon, E61, ACA1, H9, Jl, VS461, M57, W, VSDA, NSB23a, 20 047, KL10, IP90, NBS1AB, BITS, KL11, H13. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 25. A 23. igénypont szerinti rekombináns DNS-szekvencia, azzal jellemezve, hogy a 8 a. ábrán bemutatott OspC-génszekvenciák bármelyikével legalább 80%os homológiát mutat. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 26. Rekombináns expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy valamely, a 23-25. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns DNS-szekvenciát tartalmaz. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 27. A 26. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy eukarióta és prokarióta gazdasejtekhez alkalmazható ingázóvektor. (Módosítási elsőbbsége: 1994.07.01.)
- 28. A 27. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy élesztőkben, elsősorban P. Pastorísban és E. coliban replikálódik. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
- 29. A 26-28. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az OspC-gén expressziója egy indukálható promoter transzkripciós szabályozása alatt áll. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 30. A 29. igénypont szerinti expressziós vektor, azzal jellemezve, hogy az OspC-kódolószekvencia metanollal indukálható. (Módosítási elsőbbsége: 1994. 07.01.)
- 31. Gazdasejt, azzal jellemezve, hogy valamely, a 26-30. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral van transzformálva. (Módosítási elsőbbsége:1994. 07.01.)
- 32. Eljárás OspC-antigén rekombináns módszerekkel történő előállítására, azzal jellemezve, hogya) egy eukarióta élesztősejtet egy, a 26-30. igénypontok bármelyike szerinti expressziós vektorral transzformálunk;b) az említett élesztősejtet tenyésztjük;c) adott esetben az OspC-gén expresszióját metanollal indukáljuk;d) a sejtek által termelt OspC-antigént elválasztjuk és tisztítjuk.(Elsőbbsége: 1993.04.29.)
- 33. OspC-antigén, azzal jellemezve, hogyi) egy, a 23-25. igénypontok bármelyike szerinti szekvencia kódolja, vagy ii) a 8a. ábrán feltüntetett OspC-génszekvenciák bármelyikével legalább 80%-os homológiát mutat.(Módosítási elsőbbsége: 1994. 07. 01.)
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US5386393A | 1993-04-29 | 1993-04-29 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9502002D0 HU9502002D0 (en) | 1995-08-28 |
| HUT72923A HUT72923A (en) | 1996-06-28 |
| HU217024B true HU217024B (hu) | 1999-11-29 |
Family
ID=21987063
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9502002A HU217024B (hu) | 1993-04-29 | 1994-04-29 | Immunogén OspC-antigén vakcinakészítmények a Lyme-kór megelőzésére és kezelésére, valamint eljárások ilyen antigének előállítására |
Country Status (16)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0701612B1 (hu) |
| JP (1) | JPH08509371A (hu) |
| AT (1) | ATE162550T1 (hu) |
| AU (1) | AU683260B2 (hu) |
| CA (1) | CA2161534A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ289212B6 (hu) |
| DE (1) | DE69408135T2 (hu) |
| DK (1) | DK0701612T3 (hu) |
| ES (1) | ES2114687T3 (hu) |
| FI (1) | FI955150A (hu) |
| HR (1) | HRP940279B1 (hu) |
| HU (1) | HU217024B (hu) |
| NO (1) | NO954318L (hu) |
| PL (1) | PL178775B1 (hu) |
| SK (1) | SK279968B6 (hu) |
| WO (1) | WO1994025596A2 (hu) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5915049A (en) * | 1992-02-25 | 1999-06-22 | Pfu Limited | Binarization system for an image scanner |
| US7008625B2 (en) | 1993-11-01 | 2006-03-07 | Research Foundation Of The State University Of New York | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi |
| DK0896583T3 (da) * | 1996-05-02 | 2003-05-26 | Dako As | Anvendelse af peptidfragmenter fra OspC til diagnostiske metoder |
| US6716574B2 (en) | 1996-05-02 | 2004-04-06 | Dako A/S | Osp-C derived peptide fragments |
| US5846946A (en) * | 1996-06-14 | 1998-12-08 | Pasteur Merieux Serums Et Vaccins | Compositions and methods for administering Borrelia DNA |
| AT405940B (de) * | 1996-06-21 | 1999-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur gewinnung und reinigung von rekombinantem, nicht-lipidiertem osp-protein |
| DE19629543C2 (de) * | 1996-07-22 | 1999-02-11 | Immuno Ag | Immunassay zum Nachweis von anti-B. burgdorferi Antikörpern und Verfahren zur Serodiagnose bei Lyme Borreliose, diagnostische Mittel und Testkits zur Durchführung der Verfahren |
| DE19740735A1 (de) | 1997-09-16 | 1999-03-18 | Max Planck Gesellschaft | Arzneimittel zur Therapie einer manifesten Lyme-Borreliose |
| WO2000006745A1 (en) * | 1998-07-31 | 2000-02-10 | Gundersen Lutheran Medical Foundation, Inc. | Uses of the borreliacidal epitope(s) of borrelia burgdorferi outer surface protein c (ospc) as vaccine |
| US7060281B1 (en) | 1999-06-18 | 2006-06-13 | Research Foundation Of The State University Of New York | Groups of barrelia burgdorferi and borrelia afzelii that cause lyme disease in humans |
| WO2002016421A2 (en) | 2000-08-18 | 2002-02-28 | Research Foundation Of The State University Of New York | Altered ospa of borrelia burgdorferi |
| GB2414667A (en) * | 2004-06-03 | 2005-12-07 | Isis Innovation | Vaccine compositions of N. meningitidis PorA and FetA antigens |
| CA2631733C (en) * | 2005-11-29 | 2017-08-01 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric ospc vaccinogen and diagnostic antigen |
| UA99719C2 (ru) * | 2006-11-03 | 2012-09-25 | Шеринг-Плау Лтд. | Вакцина для собак против болезни лайма |
| CZ301244B6 (cs) * | 2007-11-14 | 2009-12-16 | Bioveta, A.S. | Univerzální vakcína k lécbe a prevenci Lymeské borreliózy pro humánní a veterinární použití a zpusob její výroby |
| CZ301548B6 (cs) * | 2008-08-20 | 2010-04-14 | Bittner@Libor | Univerzální preparát ke zvýšení obranyschopnosti, prevenci, profylaxi a lécbe Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, zpusob jeho výroby a použití |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6221363B1 (en) * | 1991-07-11 | 2001-04-24 | Baxter Aktiengesellschaft | Vaccine for the prevention of lyme disease |
-
1994
- 1994-04-29 PL PL94311301A patent/PL178775B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 ES ES94915562T patent/ES2114687T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-29 DE DE69408135T patent/DE69408135T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1994-04-29 SK SK1341-95A patent/SK279968B6/sk unknown
- 1994-04-29 AU AU67229/94A patent/AU683260B2/en not_active Ceased
- 1994-04-29 HU HU9502002A patent/HU217024B/hu not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 AT AT94915562T patent/ATE162550T1/de not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 EP EP94915562A patent/EP0701612B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1994-04-29 CA CA002161534A patent/CA2161534A1/en not_active Abandoned
- 1994-04-29 WO PCT/EP1994/001365 patent/WO1994025596A2/en active IP Right Grant
- 1994-04-29 CZ CZ19952839A patent/CZ289212B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 HR HR940279A patent/HRP940279B1/xx not_active IP Right Cessation
- 1994-04-29 JP JP6523899A patent/JPH08509371A/ja not_active Ceased
- 1994-04-29 DK DK94915562T patent/DK0701612T3/da active
-
1995
- 1995-10-27 FI FI955150A patent/FI955150A/fi not_active IP Right Cessation
- 1995-10-27 NO NO954318A patent/NO954318L/no not_active Application Discontinuation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL178775B1 (pl) | 2000-06-30 |
| CZ289212B6 (cs) | 2001-12-12 |
| FI955150A (fi) | 1995-12-28 |
| AU683260B2 (en) | 1997-11-06 |
| ES2114687T3 (es) | 1998-06-01 |
| PL311301A1 (en) | 1996-02-05 |
| AU6722994A (en) | 1994-11-21 |
| WO1994025596A2 (en) | 1994-11-10 |
| ATE162550T1 (de) | 1998-02-15 |
| EP0701612A1 (en) | 1996-03-20 |
| DE69408135D1 (de) | 1998-02-26 |
| HUT72923A (en) | 1996-06-28 |
| CZ283995A3 (en) | 1996-03-13 |
| HRP940279B1 (en) | 2000-12-31 |
| EP0701612B1 (en) | 1998-01-21 |
| SK279968B6 (sk) | 1999-06-11 |
| HRP940279A2 (en) | 1997-10-31 |
| FI955150A0 (fi) | 1995-10-27 |
| NO954318D0 (no) | 1995-10-27 |
| HU9502002D0 (en) | 1995-08-28 |
| DK0701612T3 (da) | 1998-09-21 |
| SK134195A3 (en) | 1996-05-08 |
| NO954318L (no) | 1995-12-29 |
| WO1994025596A3 (en) | 1994-12-22 |
| CA2161534A1 (en) | 1994-11-10 |
| DE69408135T2 (de) | 1998-06-10 |
| JPH08509371A (ja) | 1996-10-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6221363B1 (en) | Vaccine for the prevention of lyme disease | |
| Lindler et al. | Cloning of a Brucella melitensis group 3 antigen gene encoding Omp28, a protein recognized by the humoral immune response during human brucellosis | |
| US7179448B2 (en) | Recombinant constructs of Borrelia burgdorferi | |
| US6872550B1 (en) | Immunogenic formulation of OspC antigen vaccines for the prevention and treatment of lyme disease and recombinant methods for the preparation of such antigens | |
| US8992936B2 (en) | Altered OspA of Borrelia burgdorferi | |
| EP0540457A1 (en) | Improvements in Borrelia burgdorferi diagnosis and prophylaxis | |
| HU217024B (hu) | Immunogén OspC-antigén vakcinakészítmények a Lyme-kór megelőzésére és kezelésére, valamint eljárások ilyen antigének előállítására | |
| WO1990004411A1 (en) | Immunogenically active fractions of borrelia burgdorferi | |
| DK2450054T3 (en) | New virulence factors of Streptococcus pneumoniae | |
| US5324630A (en) | Methods and compositions for diagnosing lyme disease | |
| EP0617128A1 (en) | Recombinant vaccine for porcine pleuropneumonia | |
| WO1994020536A1 (en) | Methods, compositions, and kits for diagnosing lyme disease | |
| JP2001504335A (ja) | ストレプトコッカス・ユベリスのラクトフェリン結合タンパク質 | |
| US6689364B2 (en) | Borrelia burgdorferi polypeptides and uses thereof | |
| US20110305688A1 (en) | New virulence factors of streptococcus pneumoniae | |
| MXPA97001224A (en) | Vaccines against borrelia burgdorferi o |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| HMM4 | Cancellation of final prot. due to non-payment of fee | ||
| MM4A | Lapse of definitive patent protection due to non-payment of fees |