DE68919553T2

DE68919553T2 - Rekombinantes Treponema hyodysenteriae-Antigen und seine Verwendungen.

Info

Publication number: DE68919553T2
Application number: DE68919553T
Authority: DE
Inventors: William H Andrews; Elizabeth Dragon; Jeffrey D Gabe; Michael Mccaman
Original assignee: ML Technology Ventures LP
Current assignee: ML Technology Ventures LP
Priority date: 1988-06-29
Filing date: 1989-06-28
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2009-06-29
Also published as: JPH0361488A; EP0350715B1; ES2067501T3; DE68919553D1; ATE114716T1; EP0350715A1; GR3015074T3

Description

Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft T. hyo.-Antigene exprimierende Vehikel, die in Vakzinen gegen Schweinedysenterie verwendbar sind.

Hintergrund der Erfindung

Schweinedysenterie ist eine schwere Infektionskrankheit, die in allen bedeutenden, Schweine züchtenden Ländern vorkommt. Die Symptome der Schweinedysenterie sind durch eine schwere mukohämorrhagische Diarrhoe, Dehydratation und Gewichtsverlust gekennzeichnet.
Schweinedysenterie wird durch Treponema hyodysenteriae verursacht, einem anaeroben, B-hämolytischen Spirochäten. Die Erkrankung wird im allgemeinen durch die Aufnahme von Treponema hyodysenteriae enthaltenden Fäzes aus akut infizierten oder asymptomatischen Trägerschweinen oder durch durch landwirtschaftliche Geräte oder deren Benutzer verbreitete Fäzes verursacht.
Chatfield et al., Infection and Immunity 56(5), 1070-1075 (Mai 1988) offenbaren die Existenz verschiedener Antigene von Treponema hyodysenteriae.

Zusammenfassung der Erfindung

Erfindungsgemäß umfassen die neuen Expressionsvehikel die in den Fig. 3, 4 und 6 gezeigten DNA-Sequenzen oder ein Fragment derselben mit Kodierung für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung eines das 38 kDa, das 60 kDa oder das 39 kDa T. hyo.-Antigen erkennenden Antikörpers. In den beiliegenden Figuren zeigen die Fig. 3 bzw. 6 die Sequenzen der 38 kDa- und 39 kDa-Gene; die Fig. 4 zeigt die DNA- und Aminosäuresequenz der pTrep 103 (60 kDa-Prochymosin)-Genfusion.
Diese Expressionsvehikel sind zur Transformation eines Wirts verwendbar.

Beschreibung der Erfindung

Die beiliegenden Zeichnungen (nicht die oben beschriebenen Fig. 3, 4 und 6) zeigen:
Fig. 1 eine Restriktionskarte von pTrep 2;
Fig. 2 die Konstruktion des Expressionsplasmids pTrep 9;
Fig. 5 die Konstruktion von pTrep 103;
Fig. 7 die DNA- und Aminosäuresequenz des Expressionsplasmids pTrep 301; und
Fig. 8 eine Restriktionskarte von pTrep 301.
Die DNA-Sequenz kann für ein Protein kodieren, das ein Fusionsprodukt eines (i) Proteins, das Antikörper bildet, die ein Epitop oder Epitope der angegebenen T. hyo.-Antigene erkennen und (ii) eines anderen Proteins (beispielsweise Chymosin) ist.
Demnach umfaßt der Begriff "DNA-Sequenz mit Kodierung für ein Protein, das Antikörper bildet, die ein Epitop oder Epitope der genannten T. hyo.-Antigene erkennen" DNA-Sequenzen, die in geeigneten transformierten Zellen für Proteine kodieren und/oder Proteine exprimieren, die das geeignete Antigen, Antigenfragment, Antigenderivat oder ein Fusionsprodukt eines derartigen Antigens, Antigenfragments oder Antigenderivats mit einem anderen Protein sein können.
Weiterhin ist zu berücksichtigen, daß die im Vektor vorliegende DNA-Sequenz bei Einführung in eine Zelle nur einen Teil des von einer solchen DNA-Sequenz kodierten Proteins exprimieren kann, und eine solche DNA-Sequenz wird von der angegebenen Terminologie mit umfaßt, vorausgesetzt, daß der exprimierte Proteinanteil Antikörper bildet, die ein Epitop oder Epitope eines oder mehrerer der angegebenen T. hyo.-Antigene erkennen. Beispielsweise kann die DNA-Sequenz für das gesamte Antigen kodieren; das exprimierte Protein ist jedoch ein Fragment des Antigens.
Die geeignete DNA-Sequenz kann in einem beliebigen Vektor oder Plasmid aus einer großen Vielzahl von Vektoren oder Plasmiden aufgenommen werden. Derartige Vektoren umfassen chromosomale, nicht-chromosomale und synthetische DNA-Sequenzen, beispielsweise Derivate von SV40, bakterielle Plasmide, Phagen-DNAs, Hefeplasmide, Vektoren, die aus Kombinationen von Plasmiden und Phagen-DNAs stammen, Virus-DNA wie Vaccinia-, Adenovirus-, Geflügelpockenvirus- und Pseudorabies-DNA.
Die geeignete DNA-Sequenz ist in den Vektor durch eine Vielzahl von Verfahren insertierbar. Im allgemeinen wird die DNA-Sequenz in eine geeignete Restriktionsendonuclease-Stelle oder in geeignete Restriktionsendonuclease-Stellen durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren insertiert. Derartige und andere Verfahren liegen im Bereich des Fachwissens des Fachmanns.
Die DNA-Sequenz im Expressionsvektor ist zur Steuerung der mRNA-Synthese funktionell an eine geeignete Expressionskontrollsequenz oder geeignete Expressionskontrollsequenzen (Promotor) gebunden. Als repräsentative Beispiele für solche Promotoren seien erwähnt: LTR- oder SV40-Promotor, der E. colilac oder -trp-Promotor, der Phage Lambda PL-Promotor und andere bekannte Promotoren zur Expressionsregulation von Genen in prokaryontischen und eukaryontischen Zellen oder ihren Viren. Der Expressionsvektor enthält ebenfalls eine Ribosomenbindungsstelle zur Translationsinitiation und einen Transkriptionsterminator. Der Vektor kann ebenfalls geeignete Sequenzen zur Expressionsamplifizierung umfassen.
Zusätzlich enthalten die Expressionsvektoren bevorzugt ein Gen, um eine Phänotyp-Spur zur Selektion transformierter Wirtszellen bereitzustellen, beispielsweise Dihydrofolatreductase oder Neomycinresistenz bei einer Eukaryonten-Zellkultur oder beispielsweise Tetracyclin- oder Ampicillinresistenz in E. coli.
Der Vektor, der sowohl die oben beschriebene geeignete DNA-Sequenz als auch einen geeigneten Promotor oder eine Kontrollsequenz enthält, ist zum Transformieren eines geeigneten Wirts verwendbar, um dem Wirt die Expression des Proteins zu ermöglichen. Als repräsentative Beispiele für geeignete Wirte seien erwähnt: Bakterienzellen wie E. coli, Salmonella typhimurium; Pilzzellen wie Hefe; tierische Zellen wie CHO oder Bowes-Melanom; Pflanzenzellen, usw . . Die Auswahl eines geeigneten Wirts liegt unter Berücksichtigung der hier offenbarten Lehre im Bereich des Fachwissens des Fachmanns.
Wie oben beschrieben wurde, kann das die geeignete DNA-Sequenz an der ausgewählten Stelle insertiert enthaltende Expressionsvehikel eine DNA- oder eine Gensequenz enthalten, die nicht Teil des Gens ist, das für das Protein kodiert, das zur Bildung von ein Epitop bzw. Epitope des genannten T. hyo.-Antigens bzw. der genannten T. hyo.-Antigene erkennenden Antikörpers in der Lage ist. Beispielsweise kann die gewünschte DNA-Sequenz im gleichen Leserahmen an eine DNA-Sequenz fusioniert sein, die die Expression des geeigneten Proteins unterstützt oder ihre Aufreinigung verbessert oder die Expression des geeigneten Proteins ermöglicht. Wie in repräsentativen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung gezeigt wird, ist die geeignete DNA-Sequenz beispielsweise in einem Vektor im gleichen Leserahmen wie ein für Kalbschymosin kodierendes Gen insertiert, und das gewünschte Protein wird als ein Fusionspeptid mit Kalbschymosin exprimiert.
Bei der Suche nach der Entwicklung einer Vakzine könnten neutralisierende oder schützende Antikörper gegen diskontinuierliche, konformationsabhängige Epitope des nativen Antigens gerichtet werden. Es ist deshalb in Betracht zu ziehen, ob das aus dem rekombinanten Expressionssystem erhaltene Protein eine dreidimensionale Struktur (Konformation) aufweisen könnte, die sich beträchtlich von der des ursprünglichen Proteinmoleküls in seiner natürlichen Umgebung unterscheidet. In Abhängigkeit von den immunogenen Eigenschaften der isolierten Proteine müßte man es demnach renaturieren, um die geeignete Molekülkonformation wiederherzustellen. In der wissenschaftlichen Literatur sind zahlreiche Renaturierungsverfahren für Proteine zu finden; diese umfassen (1) Denaturierung (Entfaltung) falsch gefalteter Proteine unter Verwendung von Mitteln wie Alkalien, Chaotropen, organischen Lösungsmitteln und ionischen Detergenzien und einen nachfolgenden, durch Verdünnung, Dialyse oder pH-Einstellung zur Entfernung des Denaturierungsmittels bewirkten Renaturierungsschritt, und (2) Rekonstitution von Proteinen in einer Lipid-Doppelschicht oder einem Liposom, um für das immunogene Protein wieder eine membranähnliche Umgebung zu schaffen.
Gemäß einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung kann das von einem mit einem Klonierungsvehikel der oben beschriebenen Art transformierten Wirt produzierte Protein in Verbindung mit einem physiologisch annehmbaren Träger verwendet werden, um Schutz gegen Schweinedysenterie und insbesondere gegen durch T. hyo. induzierte Schweinedysenterie zu erhalten. Wie oben beschrieben, kann ein solches Protein Antikörper bilden, die ein Epitop oder Epitope eines oder mehrerer der oben angegebenen T. hyo-Antigene erkennen. Ein derart exprimiertes Protein wird nachfolgend manchmal als "rekombinantes T. hyo.- Antigene" bezeichnet; wie oben angegeben, muß ein solches Protein nicht einem T. hyo.-Antigen entsprechen, d. h. es kann ebenfalls ein Fragment, Derivat oder Fusionsprodukt sein. Der Ausdruck "rekombinantes T. hyo.-Antigen" umfaßt auch Fragmente, Derivate und Fusionsprodukte.
Das rekombinante T. hyo.-Antigen wird in der Vakzine in einer wirksamen Menge verwendet, um einen Schutz gegen Schweinedysenterie zu ermöglichen. Im allgemeinen enthält eine jede Impfdosis wenigstens 5 Mikrogramm, und bevorzugt wenigstens 100 Mikrogramm eines solchen rekombinanten T. hyo.-Antigens. In den meisten Fällen enthält die Vakzine ein solches rekombinantes T. hyo.-Antigen in einer Menge von nicht über 20 mg.
Der Ausdruck "Schutz" oder "schützen", wie er in dieser Anmeldung in bezug auf die Schweinedysenterievakzine verwendet wird, bedeutet, daß die Vakzine Schweinedysenterie verhindert und/oder die Schwere der Schweinedysenterie verringert.
Falls Vielfachdosen verabreicht werden, würden nicht mehr als 3 Dosen über einen Zeitraum von 6 Wochen verabreicht werden.
Der in Verbindung mit dem rekombinanten T. hyo-Antigen verwendete Träger kann ein beliebiger Träger aus einer breiten Vielzahl von Trägern sein. Als repräsentative Beispiele für derartige Träger seien erwähnt: Mineralöl, Alaun, snythetische Polymere usw . . Träger für Vakzinen sind aus dem Stand der Technik gut bekannt, und unter Berücksichtigung der hierin offenbarten Lehre liegt die Auswahl eines geeigneten Trägers im Bereich des Wissens des Fachmanns. Die Auswahl eines geeigneten Trägers hängt ebenfalls von der Art ab, in der die Vakzine verabreicht werden soll. Die Vakzine kann in Form einer injizierbaren Dosis vorliegen und ist intramuskulär, intravenös oder subkutan verabreichbar. Es ist ebenfalls möglich, die Vakzine oral durch Vermischen der aktiven Bestandteile mit Futter oder Wasser zu verabreichen; weiterhin ist sie in Tablettenform usw. verabreichbar.
Für den Fachmann sind andere Mittel zur Verabreichung der Vakzine aufgrund der hier offenbarten Lehre offensichtlich; demnach ist die vorliegende Erfindung nicht auf eine spezielle Verabreichungsform beschränkt.
Es ist weiterhin darauf hinzuweisen, daß die Vakzine neben dem oben beschriebenen rekombinanten T. hyo.-Antigen oder Fragmenten hiervon aktive Bestandteile oder Adjuvanzien enthalten kann.
Die vorliegende Erfindung wird nun unter Bezugnahme auf die nachfolgenden Ausführungsbeispiele weiter beschrieben; der Schutzbereich der Erfindung ist jedoch nicht hierauf beschränkt. Falls nicht anders angegeben, werden in den Beispielen Reinigungen, Verdaus und Legierungen wie in "Molecular Cloning, a laboratory manual" von Maniatis et al., Cold Spring Harbor Laboratory (1982) beschrieben durchgeführt. Falls nicht anders angegeben, werden in den nachfolgenden Beispielen Transformationen durch das von Cohen et al., PNAS 69, 2110 (1973) beschriebene Verfahren durchgeführt.

Beispiel 1

Fermentation

Der virulente Stamm T. hyo. B204 wurde anaerob (Atmosphäre aus 90% N&sub2; und 10% CO&sub2;) in einem 2-Liter-Fermenter kultiviert, in dem ein pH-Wert von 6,8 und eine Temperatur von 37ºC aufrechterhalten wurden. Das Kulturmedium umfaßte Brain-Heart-Infusionslösung, 5% fötales Kälberserum, Dextrose und Spectinomycindihydrochlorid.
Die Kultur wurde bei einer Zelldichte von ungefähr 5 · 10&sup8;/ml geerntet. Die Zellen wurden durch Zentrifugation gesammelt, anschließend in 150 mM KCl enthaltendem 10 mM Acetatpuffer, pH 4,75, gewaschen und erneut zentrifugiert. Der Waschvorgang wurde noch zweimal wiederholt, und das so erhaltene Zellpellet wurde bei -20ºC gelagert.

Proteinreinigung

Gefrorene Zellen wurden aufgetaut und dann in 10 mM Kaliumacetat, pH 4,75, resuspendiert, bis man eine optische Dichte von 25-30 (bei 600 nm) erhielt (bestimmt an Lösungsverdünnungen), was typischerweise bei 1/20 des Ausgangskulturvolumens der Fall ist. Anschließend wurde Tween®-20 (ein nicht-ionisches Detergens) zur Zellsuspension zugegeben, um eine Endkonzentration von 0,2% zu erhalten. Nach 10-minütiger vorsichtiger Bewegung wurden die Zellen abzentrifugiert (10.000 · g für 10 Min.). Diese Überstandsfraktion wurde verworfen, und die Zellen wurden in Acetatpuffer resuspendiert und dann mit 2,0% Tween®-20 extrahiert. Nach der Zentrifugation wurde der 2% Tween®-Überstand (in Detergens löslich gemachter Antigenpool) aufgehoben, und das Zellpellet wurde resuspendiert und mit Tween®-20 sequentiell in bis zu 3 zusätzlichen Zyklen mit von Zyklus zu Zyklus zunehmender Konzentration von etwa 2% bis zu etwa 10% reextrahiert. Die in Detergens löslich gemachten Überstandsfraktionen wurden vereinigt. Durch dieses Extraktionsverfahren werden die Oberflächenproteine von T. hyo. selektiv (jedoch nicht quantitativ) löslich gemacht, ohne hierdurch die Bakterien zu lysieren oder aufzubrechen.
Nach einer Hochgeschwindigkeitszentrifugation bei 100.000 x g wurde das Pellet aus mit Tween®-20 löslich gemachten Proteinen durch Ultraschallbehandlung in 1/500stel des Ausgangskulturvolumens an 25 mM Tris-HCl, pH 6,8 (Gesamtproteinkonzentration 20 mg/ml) resuspendiert. Diese Suspension wurde dann mit 3/100stel des Ausgangskulturvolumens des gleichen, 6 M Harnstoff enthaltenden Puffers 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter vorsichtiger Bewegung vermischt. In diesem Schritt werden etwa 80% des Proteins im Ausgangspellet löslich gemacht. Die in Harnstoff unlöslichen Proteine (UPI) wurden durch Ultrazentrifugation bei 100 K · g für 90 Minuten bei 4ºC gesammelt, in 1/500stel des Ausgangskulturvolumens an 25 mM Tris-HCl, pH 6,8 resuspendiert und ein zweites Mal mit 3/100stel des Ausgangskulturvolumens des gleichen, 6 M Harnstoff enthaltenden Puffers 1 Stunde lang bei Raumtemperatur unter vorsichtiger Bewegung extrahiert. Durch diese zweite Harnstoffextraktion wird ein 38 kDa-Protein und das 29 kDa-Protein, das einen Nebenbestandteil von UP2 bildet, löslich gemacht. Andere, durch diese zweite Harnstoffextraktion nicht löslich gemachte Proteine wurden durch Ultrazentrifugation bei 100 K · g für 90 Min. bei 4ºC entfernt. Der Überstand aus der zweiten Harnstoffsolubilisierung (US2) wurde gegen 10 mM NH&sub4;HCO&sub3; zur Entfernung von Harnstoff dialysiert und anschließend lyophilisiert. Dieses Material wurde anschließend in 25 mM Tris-HCl, pH 6,8 löslich gemacht und bei -20ºC gelagert. Aus 10 g Naßgewicht einer T. hyo.-Zellpaste (1,5 l Kultur) werden 4 mg des 38 kDa-Proteins und 0,4 mg des 29 kDa-Proteins in der US2-Fraktion erhalten.

Aminosäuresequenzierung des 38 kDa-Proteins

Die Aminosäuresequenz des Aminoterminus des 38 kDa-Proteins wurde unter Verwendung des sequentiellen Edman-Abbaus in einem automatischen Gasphasen-Proteinsequenziergerät der Fa. Applied Biosystems® bestimmt. Die aus dem 38 kDa-Protein freigesetzten Aminosäuren wurden mit Phenylisothiocyanat (PITC) derivatisiert und dann getrennt und durch HPLC analysiert. Die so bestimmte Identität der ersten 30 Aminosäuren des Proteins wird unten gezeigt:
Die weitere Aminosäuresequenz des 38 kDa-Proteins wurde durch Verdau von 380 ug US2 (1 nMol) mit 8 ug Endoproteinase Lys C für 4 Std. bei 37ºC in 113 ul 50 mM Tris-HCl, pH 6,8 erhalten.
Die aus diesem Verdau erhaltenen Peptidfragmente wurden durch HPLC auf einer C4-Säule unter Verwendung eines Gradienten aus 0-100% Acetonitril : Isopropanol (2 : 1) in 0,1% Trifluoressigsäure getrennt. Die Absorption wurde bei 214 nm und 280 nm kontrolliert. Die die Hauptpeaks enthaltenden Fraktionen wurden lyophilisiert, in 0,1% SDS resuspendiert und wie oben beschrieben sequenziert. Aus zwei internen proteolytischen Fragmenten des 38 kDa-Proteins wurde die unten gezeigte Aminosäuresequenz erhalten:
(Peptid 1)
(Peptid 2)

Präparation von T. hyo.-DNA

Eine 1-l-Kultur des Stammes T. hyo. B204 wurde zentrifugiert, und die Bakterienzellen wurden in 6 ml phosphatgepufferter Saline resuspendiert (dies erbrachte das Gesamtvolumen von 9,5 ml). Dies wurde anschließend mit 10 ml einer Lösung A (113, 6 g CsCl, 87,6 ml TE-Puffer (10 mM Tris/1 mM EDTA, pH 8,0)) vermischt, und es wurden 6,88 ml 20% Sarkosyl®, ein Detergens, zur Lyse der Zellen zugegeben. Anschließend wurden 3,5 ml TE- Puffer und 6,12 ml 10 mg/ml EtBr zugegeben, und die Lösung wurde in einem Sorvall® TV850-Rotor bei 43.000 UpM über Nacht abzentrifugiert. Die Bande mit der genomischen DNA wurde mit einer Spritze der Stärke 18 abgezogen, mit 50% (w/w) CsCl vermischt und in einem Sorvall® TV865-Rotor 7 Std. lang bei 55.000 UpM zentrifugiert. Die genomische DNA wurde wiederum abgezogen und in CsCl in einem TV885-Rotor über Nacht zentrifugiert. Nach dem Abziehen der genomischen DNA wurde das Ethidiumbromid durch Extraktion mit Isopropanol entfernt. Die DNA wurde anschließend extensiv gegen TE dialysiert und bei -20ºC gelagert.

Oligonucleotid-Probe

Für das 38 kDa große T. hyo.-Antigen wurde oben eine Aminosäure-Teilsequenz beschrieben. Es wurden alle möglichen DNA-Sequenzen, die den die ersten sechs Aminosäuren umfassenden Abschnitt des N-Terminus des Proteins kodieren könnten, bestimmt, und es wurde eine Probenmischung hergestellt. Diese Probenmischung stellt einen Sequenzpool dar, der alle möglichen Nucleotidkombinationen umfaßt, die, wie unten beschrieben, die Aminosäuresequenz des Target-Abschnitts kodieren könnten. Eine derartige Probenmischung wird als degeneriert bezeichnet. Jede Probe weist eine Länge von 17 Nucleotiden auf. Demnach ist diese Probe, COD450, 96-fach degeneriert. COD450 wurde auf einem DNA-Synthesegerät hergestellt.

T. hyo.-DNA-Analyse

T. hyo.-DNA des Stamms B204 wurde mit Hind III verdaut und auf einem 1% Agarosegel laufen gelassen. Das Gel wurde dann nach Southern (JMB 98, 503) geblotted und unter Verwendung von COD450 untersucht. Die Hybridisierungsbedingungen waren wie folgt:
Der getrocknete Filter wurde in 0,9 M NaCl, 90 mM Tris-HCl, pH 7,5. 6 mM EDTA erneut angefeuchtet. Die Filter wurden dann in Beutel gegeben, und hierzu wurden 2,5 ml einer Vorhybridisierungslösung/Filter gegeben.
Die Vorhybridisierungs-/Hybridisierungslösung enthielten:
6 · NET
5 · DenhardtVs
0,1 mM rATP
1,0 mM NaPPi
10,0 mM Natriumphosphat, pH 7,5
0,2% SDS
0,1 mg/ml ultraschallbehandelter Heringssperma-DNA
250 ug/ml E. coli-tRNA
Die Vorhybridisierung wurde bei 37ºC 2 1/2 Std. lang durchgeführt.
Die Vorhybridisierungslösung wurde dann aus den Beuteln ablaufen gelassen, und zu jedem Beutel wurden 3 ml einer zweiten Vorhybridisierungslösung zugegeben. Die zweite Vorhybridisierungslösung war mit der ersten identisch, außer daß 1 ml 100 mg/ml Lambda gt11-DNA und 5 ml 362 ug/ml E. coli-DNA pro 50 ml zugegeben wurden. Beide DNAs wurden unmittelbar vor der Verwendung durch Ultraschallbehandlung auf eine Größe von unter 500 bp gebracht, 10 Min. gekocht und rasch abgekühlt. Man ließ die Filter dieser Lösung 2 1/2 Std. lang bei 37ºC vorhybridisieren.
Die Proben wurden wie folgt kinase-behandelt: 6,24 ul COD450 (1,57 OD/ml) unter Verwendung von 37 ul ³²P-ATP (7.000 Ci/mMol) in einer 80 ul-Reaktionsmischung mit 20 Einheiten BMB-Kinase.
Die kinase-behandelte Probe, COD450, wurde zu 30 ml der Vorhybridisierungslösung zugegeben. Die Vorhybridisierungslösung wurde aus den Beuteln abgelassen, und die die Probe enthaltende Hybridisierungslösung wurde zugegeben. Man ließ diese Lösung über Nacht 16 Std. lang bei 37ºC inkubieren.
Der Filter wurde dann 4 · 5 Min. in 1 l 6 · SSC bei Raumtemperatur gewaschen, worauf sich 4 Waschschritte für je 5 Min. in 100 ml 3 M Tetramethylammoniumchlorid, 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM EDTA, 1 mg/ml SDS (TMAC) (DNA, 82, 1585-1588) bei Raumtemperatur anschlossen. Der Filter wurde dann bei 55ºC 5 Min. lang in 400 ml TMAC gewaschen. Der Filter wurde dann in eine Plastikfolie (ohne vorherige Trocknung) eingewickelt und gegen einen Kodak® XAR5-Film 1-1/2 Std. lang mit doppelt-verstärkenden Screens bei -80ºC exponiert.
Die Auswertung der Autoradiographie zeigte, daß zwei DNA-Fragmente mit einer Größe von 3200 bp und 2300 bp mit COD450 hybridisierten.
Der Southern-Blot wurde aus der Kunststoffeinwicklung entfernt und einmal in 400 ml TMAC 5 Min. lang bei 60ºC gewaschen. Er wurde dann nochmals gegen einen XAR5-Film in der oben beschriebenen Weise exponiert, und die Autoradiographie zeigte, daß COD450 sowohl von den 3200- als auch den 2300 bp-DNA-Fragmenten abgeschmolzen war.

Präparation von Target-DNA

145,6 ug genomischer DNA von T. hyo. B204 wurden mit Hind III (BMB) verdaut. 80 ug dieser DNA wurden auf einem 3% Acrylamidgel einer Elektrophorese unterzogen. Unter Verwendung von mit Hind III-verdauter Lambda-DNA als Größenmarker wurde alles im präparativen T. hyo.-Verdau zwischen 2 kb und 3,5 kb aus dem Gel in 0,5 cm großen Stücken herausgeschnitten. Hierdurch erhielt man insgesamt 7 Gelstücke, die je eine unterschiedliche Größenklasse an Hind III-Fragmenten enthielten. Jede Größenfraktion wurde elektroeluiert, mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und in 50 ul Wasser resuspendiert.
5 ul einer jeden Fraktion wurden mit 200 ul 10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 20 ul 3 M NaOH vermischt und bei 65ºC 30 Min. lang inkubiert. Man ließ die Proben dann 15 Min. lang auf Raumtemperatur abkühlen und gab anschließend 200 ul 2M NH&sub4;OAC hinzu. Diese Proben wurden dann unter Verwendung der Vorrichtung und des Protokolls von Schleicher und Schüll einem Slot-Blotting unterzogen. Der Slot-Blot-Filter wurde dann in 6 · NET erneut benetzt und in einen Plastikbeutel gegeben. Wie vorher wurden 5 ml der Vorhybridisierungslösung zugegeben, wobei die Lösung lediglich keine E. coli-tRNA enthielt. Der Filter wurde 5 Std. lang bei 37ºC inkubiert. Weitere COD450 wurde wie oben beschrieben kinase-behandelt. Der Slot-Blot-Filter wurde hybridisiert, gewaschen und in gleicher Weise, wie dies oben für den Southern-Blot beschrieben wurde, gegen einen Film exponiert.
Die Überprüfung der Autoradiographie zeigte, daß die Fraktion 5 das stärkste Hybridisierungssignal ergab. Eine Probe der DNA der Fraktion 5 wies auf einem Agarosegel eine Größe von etwa 2300-2700 bp auf. Die Fraktion 5 wurde als zu klonierende Fraktion ausgewählt.
0,035 ug DNA der Fraktion 5 wurden mit 0,017 ug Hind III verdautem pUC9 ligiert und in kompetente DH5-Zellen (BRL) transformiert. Die Transformation wurde auf 50 ug/ml X-Gal enthaltende Platten plattiert. Die so erhaltenen 206 weißen Kolonien wurden alle kultiviert und einer Miniscreenbehandlung unterzogen.
Aliquots aller 206 Miniscreens wurden mit Hind III verdaut und mit COD450 mit der oben beschriebenen Slot-Blot-Analyse hybridisiert. Es wurden zwei positive Klone, pTrep 2 und pTrep 3, identifiziert.
Zur Restriktionskartierung wurde Plasmid-DNA aus pTrep 2 mit 30 verschiedenen Restriktionsenzymen verdaut. Die Verdaus wurden durch Southern-Blotting gegen COD450 analysiert. In der Fig. 1 ist die so erhaltene Restriktionskarte aufgezeichnet.

Expression des 38 kDa-Antigens in E. coli

Das 38 kDa-Antigen sollte als Fusion an Prochymosin unter Verwendung des Vektors pWHA93 exprimiert werden.
Zunächst war es notwendig, das Hind III-Insert von pTrep 2 zu invertieren, um von den zur Verfügung stehenden Restriktionsstellen am besten Gebrauch machen zu können. PTrep 2 wurde mit Hind III verdaut, ligiert, in E. coli JM83 transformiert und ein Klon, pTrep 7, wurde identifiziert, der das 38 kDa-Gen auf dem Hind III-Fragment in umgekehrter Orientierung zu pTrep 2 trug.
15 ug pTrep 7 wurden mit NdeI verdaut und mit T4-DNA-Polymerase (BRL) behandelt, um den 2-Basen NdeI-Überhang aufzufüllen. Die DNA wurde mit Phenol extrahiert, mit Ethanol präzipitiert und im für den Hind III-Verdau geeigneten Puffer resuspendiert. Nach dem Hind III-Verdau wurde die DNA über ein 5% Acrylamidgel einer Elektrophoresebehandlung unterzogen. Das 1900 bp große Hind III-Ndel-Fragment wurde aus dem Gel ausgeschnitten und elektroeluiert.
Der Expressionsvektor, pWHA93, wurde mit Hind III und Hinc II verdaut, auf einem Gel laufen gelassen, und das 3870 bp-Fragment wurde elektroeluiert. Aliquots des T. hyo.-Fragments und des pWHA93-Vektors wurden ligiert und in JM83 transformiert, wie dies von Kushner, S.R. in "Genetic Engineering", Elsevier/North Holland BioMedical Press 1978, S. 17-23 beschrieben wurde.
Aus dieser Transformation wurde pTrep 9 durch Miniscreen-Analyse identifiziert. Dieses Plasmid wurde sequenziert, und es wurde festgestellt, daß es die richtige Fusion aufwies, um den offenen 38 kDa-Leserahmen in der gleichen Phase wie den offenen Leserahmen des Prochymosins und stromabwärts vom offenen Leserahmen des Prochymosins anzuordnen.
Die Sequenz zur Produktion von pTrep 9 ist in der Fig. 2 schematisch veranschaulicht.
Die Expression und die Wiedergewinnung des Proteins wurde wie nachfolgend für das 39 kDa-Antigen beschrieben durchgeführt (Beispiel 2).
Es wurde beobachtet, daß pTrep 9 in E. coli die Synthese eines 73 kDa-Prochymosin-Fusionspolypeptids steuert, das 32 kDa größer ist als Prochymosin. Durch Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, daß der offene Leserahmen des 38 kDa-Antigen-Gens ein 32 kDa großes Polypeptid zu kodieren scheint.
Dieses Fusionsprotein zeigte eine zum authentischen T. hyo. 38 kDa-Protein äquivalente Immunoreaktivität, wenn man es in Western-Blots mit Seren aus von der Schweinedysenterie genesenen Schweinen oder mit Seren aus mit dem gereinigten 38 kDa T. hyo.-Protein hyperimmunisierten Mäusen reagieren ließ.
Der ausgelöschte Teil der Aminosäuresequenz wurde durch Peptidsequenzierung verifiziert.

Präparation von pWHA93

pWHA93 wurde über eine Reihe von Schritten konstruiert. Das Plasmid pWHA31B (J. Biotech., 2, 177-190, 1986), das die gesamte kodierende Sequenz für Prochymosin enthält, wurde mit der Restriktionsendonuclease BclI verdaut. Das Prochymosingen-Stopcodon, TGA, ist in der Nucleotidsequenz der BclI-Restriktionsendonucleasestelle TGATCA enthalten. Mung Bean-Nuclease (New England Biolabs) wurde anschließend verwendet, um die von BclI erzeugten Enden stumpf zu machen. Diesem Schritt folgte ein Verdau mit EcoRI. Dann wurde das 618 bp große DNA-Fragment, das die kodierende Sequenz für die carboxylterminalen 205 Aminosäuren enthält, isoliert.
pUC18 (New England Biolabs) wurde dann mit der Restriktionsendonuclease KpnI verdaut, mit Mung Bean-Nuclease behandelt, mit EcoRI verdaut, und das 2674 bp große DNA-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment enthält einen Beta-Lactamase-selektierbaren Marker (Ampr-Gen), einen Replikationsursprung, den Lactoseoperon-(lac-)Promotor, einen Polylinker mit Erkennungsstellen für die Restriktionsendonucleasen BamHI, XbaI, SalI, PstI, SphI und Hind III, und die kodierende Sequenz für die aminoterminalen 82 Aminosäuren der Beta-Galactosidase.
Das 2674 bp große DNA-Fragment wurde an das 618 bp große DNA- Fragment ligiert, um pMH22 zu bilden. Dieses Plasmid enthält die kodierende Sequenz für den Carboxylterminus von Prochymosin an ein Ende des Polylinkers fusioniert, während das andere Ende an die kodierende Sequenz für den Aminoterminus der Beta-Galactosidase fusioniert ist. Das Prochymosin-Stopcodon, TGA, wurde mit der Mung Bean-Nuclease zerstört, und die zwei kodierenden Sequenzen sind im gleichen Translations-Leserahmen.
pWHA43 (J. Biotech., 2, 177-190, 1986) wurde ebenfalls verwendet, um pWHA93 zu konstruieren. Dieses Plasmid wurde mit EcoRI verdaut, mit Mung Bean-Nuclease behandelt und mit der Restriktionsendonuclease Hind III verdaut. Das 3654 bp große DNA- Fragment, das die gesamte kodierende Sequenz für Prochymosin, das Ampr-Gen, einen Replikationsursprung und den lac-Promotor enthielt, wurde isoliert.
pDR540 (P-LBiochemicals) wurde mit der Restriktionsendonuclease BamHI verdaut, mit Mung Bean-Nuclease behandelt und mit Hind III verdaut. Das den tac-Promotor enthaltende 92 bp große DNA- Fragment wurde isoliert und an das 3654 bp große DNA-Fragment ligiert, um pWHA49 zu konstruieren. Dieses Plasmid weist die gesamte kodierende Sequenz für Prochymosin unter Kontrolle der lac- und tac-Tandem-Promotoren auf.
pWHA49 wurde mit den Restriktionsendonucleasen NarI und EcoRI verdaut. Das 3049 bp große DNA-Fragment, das die kodierende Sequenz für die aminoterminalen 160 Aminosäuren von Prochymosin, die lac- und tac-Promotoren, das Ampr-Gen und einen Replikationsursprung enthielt, wurde isoliert.
pMH22 wurde mit NarI und EcoRI verdaut, und das 200 bp große DNA-Fragment, das die kodierende Sequenz für die carboxylterminalen 205 Aminosäuren von Prochymosin, den Polylinker und die kodierende Sequenz für die aminoterminalen 52 Aminosäuren von Beta-Galactosidase enthielt, wurde isoliert. Dieses 200 bp große DNA-Fragment wurde an das 3049 bp große DNA-Fragment ligiert, um pWHA93 zu konstruieren, das die gesamte, für Prochymosin kodierende Sequenz, den Polylinker und die kodierende Sequenz für die aminoterminalen 82 Aminosäuren in Phase zusammenfusioniert, unter der Kontrolle der lac- und tac-Promotoren, enthält. Später wurde gefunden, daß der tac-Promotor aus pWHA93 durch ortsspezifische Rekombination und der Verbleib eines intakten lac-Promotors deletiert wurde.

Beispiel 2-39 kDa-Antigen

Die Fermentation und die Proteinreinigung werden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Das durch Zentrifugation der zweiten Harnstoffextraktion erhaltene unlösliche Material enthält einen einzigen Hauptproteinbestandteil von 39 kDa. Dieses unlösliche Protein wurde durch Kochen in 3% SDS, 1 mM EDTA und 70 mM 2-Mercaptoethanol enthaltendem 25 mM Tris-HCl, pH 6,8, löslich gemacht. Diese Lösung wurde einer Gelfiltrationschromatographie über eine 30 cm lange Sepharose® 6B-Säule (von der Fa. BioRad, Richmond, CA) unterzogen. Der 39 kDa-Peak wurde durch Gelelektrophorese der Säuleneluierungsmittel-Fraktionen identifiziert, die geeigneten Fraktionen wurden vereinigt, und das Protein wurde durch Präzipitation mit Aceton konzentriert und durch Zentrifugation gesammelt. Das Pellet wurde in 1,1% SDS aufgelöst und dann mit Chloroform/Methanol behandelt, um SDS-Reste zu entfernen.
Die Aminosäuresequenz des Aminoterminus des oben hergestellten 39 kDa-Proteins wurde durch sequentiellen Edman-Abbau in einem automatischen Gasphasen-Sequenziergerät der Fa. Applied Biosystems bestimmt. Die Identität der so bestimmten ersten 41 Aminosäuren des Proteins ist wie folgt:

Gestaltung der Oligonucleotidproben

Unter Verwendung der oben gezeigten Aminosäurensequenzdaten wurden eine Reihe von DNA-Proben synthetisiert. Jede der Proben umfaßte einen Pool an degenerierten Sequenzen, die alle möglichen Nucleotidkombinationen umfassen, die, wie unten gezeigt, die Aminosäuresequenz des Targetabschnitts kodieren könnten. Jede Probe weist eine Länge von 17 Nucleotiden auf.
Probenname = COD 55
Degeneration = 128-fach (Mischung von 128 Kombinationen)
Probenname = COD 553
Degeneration = 96-fach
Probenname = COD 556
Degeneration = 128-fach

Konstruktion einer genomischen Bibliothek von T. hyo.-DNA

48 ug genomische DNA des Stammes T. hyo. B204 wurden mit 6 Einheiten AluI verdaut. Vor Zugabe des Enzyms wurde die Lösung bei 37ºC 1 Min. lang inkubiert. Die Reaktionsbedingungen entsprachen den von BRL beschriebenen, und das Gesamtvolumen betrug 480 ul. Nach Zugabe des Enzyms wurde die Reaktion bei 37ºC inkubiert. 15 Sek., 2 Min. 11 Sek., 4 Min. 8 Sek., 6 Min. 4 Sek. und 8 Min. nach Enzymzugabe wurden 96 ul Aliquots entnommen. Jedes Aliquot wurde umgehend mit 96 ul Phenol-CHCl&sub3; vermischt, und 4 ul wurden auf einem Agarosegel laufen gelassen. Nach Sichtbarmachung der verdauten DNAs unter UV- Licht zeigte sich, daß die Reaktionen soweit fortgeschritten waren, wie dies aus den vorhergehenden analytischen Verdaus vorausgesagt wurde. Der Rest der wäßrigen Phasen wurde vereinigt, um eine Lösung von 460 ul zu erhalten, die mit Phenol/CHCl&sub3; extrahiert, mit Chloroform re-extrahiert und die DNA mit Ammoniumacetat und Ethanol präzipitiert wurde. Die DNA wurde auf eine Konzentration von 200 ug/ml resuspendiert.

III. Linkerzugabe

Phosphorylierte EcoRI-Linker: 5' pd [GGAATTCC] 3' wurden von der Fa. Pharmacia bezogen und auf 1 mg/ml in Wasser verdünnt. 0,2 ug des Linkers wurden mit ³²P-ATP nach Standardverfahren enzymatisch kinase-behandelt.
Nach der Kinase-Behandlung wurde diese Reaktion bei 90ºC 10 Min. lang inkubiert, in einem Rotovac-Verdampfer zur Trockne eingedampft und in 20 ul 1 mg/ml nichtradioaktiv markiertem, phosphoryliertem EcoRI-Linker resuspendiert.
Die EcoRI-Linkermischung wurde dann mit T. hyo.-DNA, die teilweise mit AluI verdaut war, (vgl. oben) bei einer Linkerkonzentration von 100 ug/ml und einer T. hyo.-DNA-Konzentration von 133 ug/ml unter Verwendung von BMB-Ligase bei einer Konzentration von 50 Einheiten/ml ligiert. Das Gesamtvolumen der Reaktion betrug 150 ul. Man ließ die Ligation über Nacht (16 Std.) bei Raumtemperatur inkubieren und verstärkte sie dann mit 3 ul Ligase (1 Einheit/ul). Dies wurde 2 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde dann wiederum durch Zugabe von 5 ul an frischem 10 mM rATP und 3 ul Ligase verstärkt und 2 Std. lang bei Raumtemperatur inkubiert. Die Ligase wurde dann hitzeinaktiviert. Anschließend wurde die Ligationsmischung mit 500 Einheiten/ml EcoRI 2 Std. lang bei 37ºC verdaut (Anmerkung: Treponema hyodysenteriae-DNA widersteht wahrscheinlich deshalb einem EcoRI-Verdau, weil die EcoRI-Stellen methyliert vorliegen). Die Reaktionsmischung wurde dann mit Phenol extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Die präzipitierte DNA wurde in 100 ul H&sub2;O resuspendiert.
Die DNA wurde auf einer 5-200 (Pharmacia)-Säule unter Verwendung von 0,3 M NaCl, 0,05 M Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA, 0,06% Natriumazid als Säulenpuffer aufgetrennt. Achtzig 100 ul Aliquots wurden gesammelt und in einem Szintillationszähler gezählt. Der erste Peak wurde in den Fraktionen 21-33 (T. hyo.- DNA) und der zweite Peak in den Fraktionen 38-80 (freie Linker und freies ATP) beobachtet. Die Fraktionen 21-33 wurden vereinigt und mit Ethanol präzipitiert. Die DNA wurde in 40,35 ul H&sub2;O resuspendiert, um die Konzentration auf 200 ug/ml zu bringen.
Dephosphorylierte Lambda-gt11-EcoRI-Arme wurden von der Fa. Promega Biotec mit einer Konzentration von 500 ug/ml bezogen. Die T. hyo.-DNA wurde an Lambda mit einer T. hyo.-DNA-Konzentration von 80 ug/ml und einer Lambda-gt11-Konzentration von 200 ug/ml in einem Gesamtvolumen von 6,25 ul unter Verwendung von BMB-Ligase bei einer Konzentration von 100 Einheiten/ml ligiert. Man ließ die Ligation 2 Std. lang bei Raumtemperatur inkubieren. 4 ul der Ligation wurden dann in Lambda-Bakteriophagenteilchen unter Verwendung des von der Fa. Stratagene (San Diego, CA) bezogenen in vitro-Verpackungskits "Gigapack®" verpackt. Der Phage wurde dann auf einer stationären Phagenkultur des E. coli-Stammes Y1090r&supmin; (Promega Biotec) titriert. Die Phagenanzahl, blaue (Nicht-Rekombinanten) und weiße (Rekombinanten), wurde bestimmt; es zeigte sich, daß der Ausgangs-Phagenansatz 1,4 · 10&sup7; pfu/ml in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml (in dem 91% Rekombinanten waren) enthielt.
Die Genbibliothek wurde durch Miniscreening von 12 zufällig ausgewählten weißen Plaques charakterisiert (Helms, C. et al., DNA 4, 39-49 (1985)). Alle 12 wiesen Inserts mit einer durchschnittlichen Insertgröße von 1325 bp auf.

Identifizierung eines rekombinanten Phagen

Bei der Durchführung des Mischoligonucleotid-Screenings auf das 39 kDa-Gen wurden die nachfolgenden Verfahren verwendet:
1. Es wurde die Lambda-gt11 (AluI-teilverdaut)-Bibliothek verwendet. Ungefähr 10.000 Plaques/150 mm Petrischale wurden auf Y1090r&supmin;-Zellen plattiert. Sechs Platten wurden verwendet, und vier Nitrucellulosefilter wurden von jeder Platte abgenommen (Verfahren nach W.D. Benton & R.W. Davis, Science 196, 180 (1977)
2. Die Mischoligonucleotid-Proben wurden auf eine spezifische Aktivität von 4-10 · 10&sup5; cpm/ng kinase-behandelt. Zweifach-Filter wurden mit jeder Probe hybridisiert; jeder Filter wurde mit ungefähr 10&sup6; cpm (1-2 ng Probe/Filter) untersucht.
3. Die Hybridisierungslösung bestand aus:
5 · Denhardt's
0,1 uM rATP
250 ug/ml E. coli-tRNA
6 · NET (1 x NET = 0,15 M NaCl, 15 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA)
0,5% NP40
1 mM Natriumpyrophosphat.
4. Die Filter (wie in 1. oben beschrieben) wurden vor der Hybridisierung wie folgt vorbehandelt:
1. Sie wurden 2 Std. lang bei 37ºC in 50 mM Tris-HCl, pH 8, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0,1% SDS gewaschen;
2. Vorhybridisierung: 2 Std. bei 37ºC in Hybridisierungspuffer (wie in 3 oben beschrieben).
5. Hybridisierung über Nacht bei 37ºC.
6. Die Filterwaschung nach der Hybridisierung wurde wie folgt durchgeführt:
Die Filter wurden zweimal bei Raumtemperatur (20 Min./Waschung) in 6 · NET, 0,1% SDS (2 l/Waschung) gewaschen;
zweimal (20 Min./Waschung) bei 37ºC in 6 · NET, 0,1% SDS; einmal (20 Min./Waschung) bei 37ºC in 6 · NET.
7. Die Filter wurden anschließend luftgetrocknet, an der Rückseite mit einem Band versehen und gegen einen Kodak® XAR5-Röntgenfilm unter Verwendung von 2 Intensivierungsscreens exponiert.
8. Geeignete Plaques, die gegen beide Proben hybridisierten, wurden ausgewählt, aufgenommen und mit beiden Oligonucleotidproben erneut getestet.
9. Nach 3 Runden Plaquereinigung wurde der Phage 3-5C1 als rekombinanter 39 kDa-Prototyp-Phage ausgewählt.
10. Die Hybridisierung von Proben gegen genomische T. hyo.- DNA, Phagen-DNA und/oder Plasmid-DNA wurde nach dem Southern-Verfahren durchgeführt (J. Mol. Biol. 94, 203 [1975])
11. Phagen-DNA wurde unter Verwendung der von C. Helms, et al. (DNA 4, 39-49, [1985]) beschriebenen Verfahren isoliert. Diese DNA wurde nach Verdau mit EcoRI untersucht; es wurde gefunden, daß sie 1 6 kb-Insert enthält, das mit den Oligonucleotiden COD 553 und 555 hybridisierte und damit die gewünschte T. hyo.-DNA enthielt, die für das 39 kDa Treponema-Antigen kodieren sollte.

Subklonierung und Expression des Gens für das 39 kDa-Antigen

1. Das EcoRI-flankierte, 1,6 kb große DNA-Segment aus dem Phagen 3-5C1 wurde durch Elektroelution aus einem Acrylamidgel isoliert und dann an das durch Verdau mit EcoRI linearisierte Plasmid pUC19 ligiert. Diese DNAs wurden zusammen ligiert, in E. coli transformiert, und ein das rekombinante Plasmid pTrep 106 (Fig. 6) enthaltender Klon wurde durch Analyse oder Restriktionsverdaus der Plasmid-DNA identifiziert.
2. Das Plasmid pTrep 106 wurde zur Steuerung der Proteinsynthese in einem ³&sup5;S-Methionin enthaltenden, gekoppelten in vitro-Transkriptions-Translations-System verwendet. Die SDS-Gelelektrophorese der Proteinprodukte dieses Systems zeigte eine 39 kDa-Proteinspezies, die mit dem das T. hyo.-DNA-Insert nicht aufweisenden Elternplasmid nicht sichtbar war. Dies legt nahe, daß die klonierte DNA die vollständige kodierende Sequenz für das 39 kDa große T. hyo.-Antigen enthält, und daß E. coli den Treponema- Promotor und die Ribosomen-Bindungsstelle erkennen und die Synthese für dieses Fremdprotein steuern kann.
3. Mit dem Plasmid pTrep 106 transformierte E. coli-Stämme produzierten keine signifikanten Mengen des gewünschten 39 kDa großen T. hyo.-Antigens. Deshalb wurde eine Plasmidkonstruktion zur Expression des rekombinanten Antigens in hohen Menge wie folgt hergestellt: Das EcoRI-flankierte, 1,6 kb-Fragment von pTrep 106 wurde an das durch mit EcoRI-Verdau linearisierte Plasmid pUC 18 ligiert. Das so erstandene Plasmid, pTrep 112, wurde dann mit PstI und BamHI geschnitten und mit Exonuclease III verdaut, um (in einer Richtung) die nicht-kodierende DNA-Sequenz stromaufwärts vom vorhergesagten ATG-Startcodon des 39 kDa großen T. hyo.-Antigens zu entfernen. Zu verschiedenen Zeiten während dieses Verdaus wurden DNA-Aliquots entnommen, die Exonuclease III durch Phenolextraktion inaktiviert, die verbleibende DNA durch Verdau mit Nuclease S1 am Ende stumpf gemacht, und diese DNA wurde dann religiert und zur Transformation von E. coli verwendet. Die Nucleotidsequenzierung der Plasmid-DNA eines derartigen neuen Klons, pTrep 112-1, zeigte, daß eine das reife T. hyo. 39 kDa-Protein kodierende angrenzende Sequenz von 372 Codons und 7 Aminosäuren von der Signalsequenz stromabwärts von der Hind III-Stelle des pUC 18-Elternplasmids fusioniert hatten. Die Fusion lag in einem Leserahmen, um ein Fusionsprotein zu kodieren, dessen Expression durch diesen lac-Promotor reguliert werden würde, nachdem die Orientierung des klonierten Fragments durch Klonierung in pUC 9 von der Hind III zur EcoRI-Stelle invertiert war. Mit dem entstandenen Plasmid, Trep 301, (Fig. 7 und 8) transformierte E. coli produzierten ein unlösliches 40 kDa-Antigen, das mit Seren aus Schweinen (sowohl solchen, die von S.D. genesen waren, als auch Tiere, die mit dem aus T. hyo. gereinigten 39 kDa-Protein immunisiert waren) sowohl in einem Immunoblot als auch einem ELISA-Plattentest reagierte.

Expression der rekombinanten Form des 39 kDa-Antigens

Der das Plasmid pTrep 301 enthaltende E. coli-Stamm JM83 wurde in 250 ml 200 ug/ml Ampicillin enthaltender Luria-Nährlösung gezogen. Man ließ die Kultur 18 Std. lang bei 32-37ºC wachsen. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgeerntet, dann in 1/20stel ihres Ausgangsvolumens in einem 1 mg/ml Lysozym enthaltendem Puffer aus 25 mM Tris, 10 mM EDTA bei pH 8,0 resuspendiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur waren die Zellen lysiert und wurden dann durch Ultraschallbehandlung weiter aufgebrochen. Das nichtionische Detergens Triton® X-100 wurde auf eine Endkonzentration von 2% zugegeben, das Zell-Lysat wurde 1 Std. lang bei Raumtemperatur vermischt und dann bei 10.000 · g zentrifugiert. Nach diesen Schritten wurde die unlösliche Pelletfraktion aufgehoben. Die Hauptproteinkomponente dieser Fraktion wies ein Molekulargewicht von etwa 40 kDa auf, was durch Commassie-Blaufärbung der Proben nach SDS-Gelelektrophorese abgeschätzt wurde. Dieser gleiche Proteinbestandteil wurde in einer Western-Blotanalyse von Schweine- und Mäuseantiseren erkannt, die gegen das aus der UP2-Fraktion erhaltene authentische 39 kDa große T. hyo.-Protein gerichtet waren. Dieses rekombinante Protein wurde ebenfalls in Immunoblots erkannt, die mit Seren aus Schweinen untersucht wurden, die natürlicherweise von der Schweinedysenterie genesen waren.
Das in diesem Beispiel erhaltene rekombinante 39 kDa-Antigen ist eng mit dem 39 kDa-Antigen der UP2-Fraktion von T. hyo. verwandt, jedoch mit diesem nicht identisch; sie weisen jedoch untereinander gemeinsame Epitope auf, die in einem einzigen Serum erkannt werden.

Beispiel 3 - 60 kDa-Antigen

Zellen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben gezogen, abgeerntet und anfangs verarbeitet.
Der im Detergens löslich gemachte Pool wurde bei 100.000 · g 90 Min. lang zentrifugiert, und die Überstandsfraktion wurde auf eine DEAE-Sephacel®-Ionenaustauschchromatographieharz-Säule aufgebracht. Das Protein wurde an die Säule gebunden, und überschüssiges Tween®-20-Detergens wurde mit 25 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 0,1% Tween®, 10 mM NaCl durchgewaschen. Das Protein wurde dann schnell mit 1 M NaCl in dem Tris/Tween®-Puffer eluiert. Der Protein-Peak wurde gesammelt, gegen den Niedersalzpuffer dialysiert und dann auf einer DEAE-Sephacel®-Säule wiederum einer Chromatographie unterzogen. Diesmal wurde das Protein mit einem linearen Zwei-Komponenten-Gradienten von 10 mM bis 300 mM NaCl und 0-2% Zwittergent 3-12 (Cal-Biochem) im Tris-Tween®- Puffer eluiert. Die Proben wurden durch SDS-Gelelektrophorese analysiert, und die das 60 kDa-Protein enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt. Das Protein wurde mit 9 Volumen an kaltem Aceton präzipitiert, durch Zentrifugation gesammelt und durch Kochen in 1% SDS, 14 mM 2-Mercaptoethanol in 25 mM Tris-Puffer, pH 6,8, 5 mM EDTA löslich gemacht. Das lösliche Protein wurde dann durch Molekularsieb-Chromatographie auf einer Sepharose® 6B-Säule fraktioniert. Die das 60 kDa-Antigen enthaltenden Fraktionen wurden vereinigt, durch Aceton-Präzipitation konzentriert und auf eine Konzentration von 250 ug/ml in 1% SDS gebracht. Es bleibt anzumerken, daß in dieser Präparation ein Satz von 3 Proteinen vorliegt, die sich in ihrem Molekulargewicht nur leicht unterscheiden (weniger als 2000) und die alle mit Seren aus von Schweinedysenterie genesenen Schweinen reagieren.

Immunisierung einer Maus und eines Kaninchens

Eine braune CB6-F1-Maus wurde mit 12 ug des oben beschriebenen 60 kDa-Antigenpools immunisiert. Das Protein wurde in 100 ul Wasser verdünnt, mit 100 ul vollständigem Freund's Adjuvans umfassend vermischt und intraperitoneal injiziert. Nach 2 Wochen wurden der Maus 12 ug Antigen in unvollständigem Freund's Adjuvans injiziert. Es wurde Serum erhalten und in einem Immunoblot-Assay verwendet, um seine Spezifität gegen das 60 kDa- Antigen zu zeigen. Ein weißes Neuseeland-Kaninchen wurde zweimal mit 25 ug des 60 kDa-Antigens unter Verwendung von vollständigem Freund's Adjuvans und dann unter Verwendung von unvollständigem Freund's Adjuvans in einem Abstand von 3 Wochen geimpft. Das aus dem Kaninchen erhaltene Serum wurde ebenfalls in einem Immunoblot-Assay verwendet.

Herstellung einer genomischen Bibliothek

Eine genomische Bibliothek wurde wie in Beispiel 2 beschrieben hergestellt.
Identifizierung eines rekombinanten Klons durch Immunoscreening unter Verwendung eines von Young, R.A. und Davis, R.W. (1983), PNAS 80, 1194 beschriebenen Verfahrens
Es wurde ein Agarplattensatz hergestellt, der in der Top-Agarschicht den E. coli-Stamm LE392 mit einem Aliquot des Bakteriophagen Lambda-gt11 vermischt enthielt, der die genomische Bibliothek von T. hyo. trägt. Die Phagenplaques wurden auf Nitrocellulose übertragen und dann mit einer die 60-2-Maus-Seren, verdünnt 1 Teil in 1000 Teilen phosphatgepuffertem Salinepuffer, der 0,05% Tween®-20 enthielt (PBST), enthaltenden Lösung umgesetzt. Die Filter wurden dann mit dem ersten Antikörperpuffer (10 mM Tris, pH 7,2, 0,9% NaCl, 0,5% Natriumazid und 3% Rinderserumalbumin, Fraktion V) gewaschen und dann mit einem iodinierten, mit 1125 markierten zweiten Schaf-Anti-Maus-Antikörper (Amersham) umgesetzt. Die Filter wurden in einem zweiten Antikörperpuffer (Tris-gepufferte Saline wie oben, kein Azid und 1% Gelatine anstatt Rinderserumalbumin) gewaschen und dann gegen einen Kodak®-Röntgenfilm exponiert, und positive Klone (Phagenplaques, die ein Protein produziert hatten, das vom gegen das 60 kDa-Antigen gerichteten Mäuseserum erkannt wurden) wurden als belichtete Flecken erkannt. Die Filmflecken wurden in Übereinstimmung gebracht, so daß der Phage in diesem Klon aufgenommen und noch zweimal rekultiviert (plaquegereinigt) werden konnte, um einen reinen Phagenstamm von Klonen zu erhalten. Der gereinigte rekombinante Phage wurde dann auf E. coli replattiert, und die Plaques wurden wiederum sowohl gegen die 60-20 Maus-Seren und die Anti-60 kDa-Kaninchenseren getestet. Beide Seren ergaben durch Immunoblotting unter Verwendung eines zweiten peroxidase-gekoppelten Antikörpers eine stark positive Reaktion und eine Farbreaktion (Reagenzien von Vector Labs).
Der Phage wurde dann im E. coli-Stamm Y1089 lysogenisiert, und ein Zell-Lysat dieses rekombinanten Stammes wurde durch Gelelektrophorese und nach nachfolgender Übertragung auf Nitrocellulose (Western-Blot) analysiert. Die Reaktion mit dem 60-20 Mausserum zeigte wie erwartet eine immunoreaktive Bande von der Größe der E. coli-Beta-Galactosidase (120 kDa), wenn die kodierende Sequenz eines Teils des T. hyo.-Gens mit dem im Lambda-Phagenvektor vorliegende Galactosidase-Gen fusioniert hatte.
Es wurde ein Phagenlysat hergestellt, um die DNA des rekombinanten Klons zu erhalten, und ein 2 kbp EcoRI-Fragment wurde isoliert und in den Plasmidvektor pUC 19 rekloniert, um das Plasmid pTREP 101 zu erhalten. Die Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren hergestellt, und die Nucleotidsequenz der terminalen Abschnitte des klonierten Segments wurde bestimmt. Es wurde ein offener Leserahmen über die EcoRI-Stelle und in das T. hyo.-DNA-Segment gefunden, der mit dem der Galactosidase im Phagenvektor übereinstimmte und weiterhin zeigte, daß der EcoRI-Linker and die Alu1-Stellen der T. hyo.-DNA angelagert war (in Übereinstimmung mit dem Herstellungsverfahren der genomischen Bibliothek). Dieser offene Leserahmen der T. hyo.-DNA kodiert für ein 10 kDa-Peptid und terminiert mit einem TGA-Stopcodon, das wahrscheinlich das C-terminale Segment des 60 kDa-Proteins von T. hyo. ist.
Eine einzelne Hind III-Stelle wurde 41 bp stromabwärts von der EcoRI-Stelle im klonierten Segment gefunden. Das Plasmid pTrep 101 mwurde mit Hind III verdaut, wodurch ein 1700 bp-Fragment freigesetzt wurde, das dann in die einzelne Hind III-Stelle des Expressionsplasmids pWHA93 kloniert wurde, um eine Fusion des offenen Leserahmens von T. hyo. mit dem von Prochymosin im pWHA93-Vektor zu ermöglichen. Es wurde festgestellt, daß das so erhaltene Plasmid, pTrep 103, (Fig. 4), die Synthese großer Mengen eines unlöslichen Proteins in E. coli steuert, das Prochymosin, fusioniert an das T. hyo.-Proteinsegment enthält. Die Expression und Wiedergewinnung des Proteins wurde in gleicher Weise durchgeführt wie dies für das 39 kDa-Protein beschrieben wurde. Durch Gelelektrophorese wurde gezeigt, daß dieses Protein eine Größe von 50 kDa (40 kDa Prochymosin + 10 kDa T. hyo.-Proteinsegment) aufwies. Dieses unlösliche Protein wird in Immunoblots von Mäuse- und Kaninchenseren erkannt, die gegen das aus T. hyo. gereinigte 60 kDa-Protein gerichtet sind. Das pTrep 103-Produkt wird ebenfalls durch Seren von Schweinen erkannt, die von Schweinedysenterie genesen sind.
Die Sequenz zur Herstellung von pTrep 103 ist schematisch in der Fig. 5 dargestellt.

Beispiel 4

Test auf Subunit-Vakzinematerialien in Tierversuchen

Testbedingungen:
Schweine mit einem Gewicht von 18,14 kg (40 lbs) wurden zunächst geimpft und dann 5 Wochen nach der ersten Injektion erneut geimpft.
Das Impfvolumen von 2 ml wurde mit 0,5 ml eines Mineralöl-Adjuvans vermischt und durch intramuskuläre Injektion verabreicht.
Die Tiere wurden 3 Wochen nach der zweiten Impfung durch orale Gabe einer Aufschlämmung aus in Nährmedium und Agar gezogenen Organismen mit T. hyo.-Kulturen infiziert. Jedes Tier erhielt 10&sup9; Organismen. Vakzine-Antigen Jede Dosis der kranken Schweine Gesamtzahl Tage nach Auftreten der Erkrankung Gewichtszunahme 5 Wo. vor Infektion bis 7 Wo. nach Infektion Kontrollen nicht geimpft Rekombinantes pTrep 9-Fusionsprotein gereinigt und löslich gemacht in 0,5% SDS Beispiel
* Mittelwert (Standardabweichung)
Obwohl die Erfindung insbesondere im Hinblick auf die Verwendung des exprimierten Proteins zur Herstellung einer Vakzine beschrieben wurde, kann davon ausgegangen werden, daß das exprimierte Protein ebenfalls als Diagnostikmittel zur Bestimmung von T. hyo.-Antikörpern verwendbar ist. In einer weiteren Ausführungsform ist das exprimierte Protein zur Bildung von Antikörpern verwendbar, und die gebildeten Antikörper sind als Vakzine verwendbar.

Claims

1. Expressionsvehikel, umfassend die in Fig. 3 dargestellte DNA-Sequenz oder ein Fragment derselben mit Kodierung für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung eines das 38 kDa T. hyo.-Antigen erkennenden Antikörpers.

2. Expressionsvehikel, umfassend die in Fig. 6 dargestellte DNA-Sequenz oder ein Fragment derselben mit Kodierung für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung eines das 39 kDa T. hyo.-Antigen erkennenden Antikörpers.

3. Expressionsvehikel, umfassend die in Fig. 4 dargestellte DNA-Sequenz oder ein Fragment derselben mit Kodierung für ein Protein mit der Fähigkeit zur Bildung eines das 60 kDa T. hyo.-Antigen erkennenden Antikörpers.

4. Mit dem Expressionsvehikel nach einem der Ansprüche 1 bis 3 transformierter Wirt.