DE69226167T2

DE69226167T2 - Strukturgen von pneumokokken-protein

Info

Publication number: DE69226167T2
Application number: DE69226167T
Authority: DE
Inventors: David E. Birmingham Al 35222 Briles; Larry S. Birmingham Al 35210 Mcdaniel; Janet L. Birmingham Al 35242 Yother
Original assignee: UAB Research Foundation
Current assignee: UAB Research Foundation
Priority date: 1991-02-15
Filing date: 1992-02-12
Publication date: 1998-11-12
Anticipated expiration: 2012-02-13
Also published as: FI933580A; JPH09224680A; ZA921025B; EP0571538A1; AU692678C; AU692678B2; HK1013629A1; JPH06504446A; EP0786521A1; DK0571538T3; CA2104014A1; JP3215109B2; NO932890L; DE69226167D1; JP2001204482A; AU1445392A; IL100946A0; IE20000062A1; DK0571538T5; NO932890D0

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Entwicklung eines verbesserten Impfstoffs gegen Pneumokokken-Infektionen.

Hintergrund der Erfindung

Streptococcus pneumoniae ist eine wichtige Ursache von Mittelohrentzündung, Hirnhautentzündung, Bakterämie und Lungenentzündung. Trotz der Verwendung von Antikörpern und Impfstoffen nahm die Häufigkeit von Pneumokokken- Infektionen in den letzten 25 Jahren nur geringfügig ab.
Es wird allgemein akzeptiert, daß eine Immunität gegen Streptococcus pneumoniae durch spezifische Antikörper gegen die Polysaccharidkapsel von Pneumokokken vermittelt werden kann. Neugeborene und Kleinkinder entwickeln jedoch keine Immunantwort auf Polysaccharidantigene und können wiederholte Infektionen durch den gleichen Kapselserotyp bekommen.
Ein Verfahren zur Immunisierung von Säuglingen gegen eine Reihe von Kapselbakterien ist die Konjugation der Kapselpolysaccharidantigene an ein Protein, um sie immunogen zu machen. Dieses Verfahren war beispielsweise bei Haemophilus influenzae b (vgl. US-Patent Nr. 4,496,538 von Gordon und US-Patent Nr. 4,673,574 von Anderson) erfolgreich. Es gibt jedoch mehr als 80 bekannte Kapselserotypen von S. pneumoniae, von denen 23 für den größten Teil der Krankheiten verantwortlich sind. Damit ein Pneumokokken-Polysaccharid-Protein-Konjugat erfolgreich ist, müßten die für den größten Teil der Pneumokokken-Infektionen verantwortlichen Kapseltypen eine ausreichende Immunogenität erhalten. Dieses Verfahren kann schwierig werden, da die im gegenwärtig verfügbaren Impfstoff enthaltenden 23 Polysaccharide selbst bei Erwachsenen nicht alle ausreichend immunogen sind.
Ein alternatives Verfahren zum Schutz von Kindern sowie Erwachsenen vor einer Pneumokokken-Infektion würde die Identifizierung der protektive Immunantworten hervorrufenden Proteinantigene sein. Diese Proteine können als solche als Impfstoff dienen oder können zusammen mit erfolgreichen Polysaccharid-Protein- Konjugaten oder als Träger für Polysaccharide verwendet werden.
In McDaniel et al., (I), J. Exp. Med. 160 (1984), 386-397, wird die Produktion von ein Zellobertlächenpolypeptid oder Zelloberflächenpolypeptide auf S. pneumoniae erkennenden Hybridomantikörpern und der Schutz von Mäusen vor einer Infektion mit bestimmten Stämmen von Kapsel-Pneumokokken durch diese Antikörper beschrieben. Dieses Oberflächenproteinantigen wurde als "Pneumokokken- Oberflächenprotein A" oder abgekürzt als PspA bezeichnet.
In Mcdaniel et al. (II), Microbial Pathogenesis 1 (1986), 519-513, werden Untersuchungen über die Charakterisierung von PspA beschrieben. Ein beträchtlicher Unterschied des PspA-Moleküls in verschiedenen Stämmen sowie Unterschiede in den von verschiedenen Antikörpern erkannten Epitopen wurden festgestellt.
In Yother et al., Abstracts of the 90th Annual Meeting of the American Society for Microbiology, 13. bis 17. Mai 1990, Seite 98, Abstract Nr. D-106, wird die Produktion von verkürzten von der sie exprimierenden Zelle freigesetzten PspA- Proteinen mit 40 bis 90% des Gesamt-PspA-Molekülargewichts beschrieben. Im Abstract wird jedoch die Produktion dieser Materialien nicht genauer beschrieben.
In Mcdaniel et al. (III), J. Exp. Med. 165 (1987), 381-394, wird beschrieben, daß eine Immunisierung von Mäusen mit X-gebundener Immundefizienz (XID) mit PspA exprimierenden kapselfreien Pneumokokken, jedoch nicht mit isogenen Pneumokokken ohne PspA, Mäuse vor einer anschließenden tödlichen Infektion mit Pneumokokken schützt.
In Mcdaniel et al. (IV), Infect. Immun. 59 (1991), 222-228, wird die Immunisierung von Mäusen mit einem rekombinanten vollständigen Fragment von PspA, das den Schutz vor Pneumokokken-Stämmen der Kapseltypen 6A und 3 hervorrufen kann, beschrieben.
In Crain et al., Infect. Immun. 56 (1990), 3293-3299, wird ein Kaninchen- Antiserum beschrieben, das PspA in 100% (n = 95) der Klinik- und Laborisolate von S. pneumoniae-Stämmen nachweist. Nach der Umsetzung mit sieben monodonalen Antikörpern gegen PspA zeigten 57 S. pneumoniae-Isolate 31 unterschiedliche Reaktivitätsmuster.
Der PspA-Protein-Typ ist unabhängig vom Kapseltyp. Es scheint, daß eine genetische Mutation oder ein Wechsel des Milieus zur Entwicklung eines großen Pools von Stämmen geführt hat, die im Hinblick auf die Kapsel, PspA und möglicherweise andere Moleküle mit variablen Strukturen sehr divers sind. Die Variabilität der PspAs von unterschiedlichen Stämmen geht auch aus ihren von 67 bis 99 kD reichenden Molekülargewichten hervor. Die beobachteten Unterschiede werden stabil vererbt und sind nicht das Ergebnis eines Proteinabbaus.
Die Immunisierung mit einem partiell gereinigten PspA von einem rekombinanten λgt11-Clon rief einen Schutz gegen eine Herausforderung ("challenge") mit mehreren S. pneumoniae-Stämmen, die unterschiedliche Kapsel- und PspA-Typen repräsentieren, hervor, wie von McDaniel et al. (IV), Infect. Immun. 59 (1991), 222-228, beschrieben. Obwohl PspA exprimierende Clone gemäß dieser Veröffentlichung konstruiert wurden, war das Produkt unlöslich und seine Isolierung aus den Zellfragmenten nach der Lyse nicht möglich.
Obwohl die Struktur des Proteins bei verschiedenen Pneumokokken-Stämmen Variationen aufweist, kommen bei allen PspAs zahlreiche Kreuzreaktionen vor, was auf eine ausreichende Zahl von gemeinsamen Epitopen hinweist, um mit einem einzelnen PspA oder mindestens einer kleinen Zahl von PspAs einen Schutz gegen eine große Zahl von S. pneumoniae-Stämmen hervorrufen zu können.
Neben der veröffentlichten Literatur, auf die vorstehend spezifisch Bezug genommen wird, veröffentlichten die Erfinder und ihre Mitarbeiter weitere PspA betreffende Einzelheiten in den nachstehenden Veröffentlichungen:
1. Abstracts of 89th Annual Meeting of the American Society for Microbiology, S. 125, Punkt D-257, Mai 1989;
2. Abstracts of 3rd International ASM Conference on Streptococcal Genetics, S. 11, Punkt 12, Juni 1990;
3. Talkington et al., Infect. Immun. 59 (1991), 1285-1289;
4. Yother et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 601-609, und
5. Yother et al., J. Bacteriol. 174 (1992), 610-618.
Die letzten drei Veröffentlichungen erfolgten nach der Einreichung der Prioritätsanmeldung dieser Anmeldung.
In der nachstehenden Beschreibung und den beigefügten Figuren werden bestimmte anerkannte Abkürzungen im Hinblick auf die von ihnen repräsentierten Aminosäuren verwendet. Die nachstehende Tabelle I definiert diese Abkürzungen. Tabelle I Aminosäureabkürzungen

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von Mutanten von S. pneumoniae, die eine immunogene verkürzte Form des PspA-Proteins sezernieren, und die Isolierung und Reinigung des sezemierten Proteins. Die verkürzte Form des PspA- Proteins ist immunprotektiv und enthält mindestens ein protektives Epitop von PspA. Das PspA-Protein ist in einer physiologischen Lösung löslich und ihm fehlt mindestens der funktionelle Zellmembranankerbereich.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 ist eine schematische Darstellung der Domänen des reifen PspA;
Figur 2 ist die N-terminale Aminosäuresequenz von PspA, wobei die Großbuchstaben geladene hydrophile Aminosäuren zeigen;
Figur 3 ist die DNA-Sequenz des pspA-Gens mit der abgeleiteten Aminosäuresequenz für das PspA-Protein;
Figur 4 zeigt die Restriktionskarte von pspA (Figur 4A) und die Verwendung der Insertions-Duplikationsmutagenese zur Konstruktion von Mutationen im pspA-Gen (Figur 4B);
Figur 5 zeigt die abgeleitete Aminosäuresequenz für den N-terminalen Bereich von PspA und die allgemeine Lage von durch monoclonale Antikörper erkannten Epitopen;
Figur 6 zeigt die Antikörper-Reaktivität gegen von verschiedenen pspA- Genabschnitten produzierte PspA-Fragmente; und
Figur 7 zeigt die Kartierung der Lage von Epitopen in den durch verschiedene pspA-Genabschnitte produzierten PspA-Fragmenten.

Allgemeine Beschreibung der Erfindung

Gemäß einem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt wird ein gereinigtes immunprotektives Pneumokokken-Oberflächenprotein bereitgestellt, umfassend eine verkürzte Form von PspA, die mindestens ein immunprotektives Epitop des Proteins und bis etwa 90% des Gesamt-PspA-Proteins enthält und der der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt.
Durch das Verfahren der Insertions-Duplikationsmutagenese des pspA-Gens des Stamms Rx1 von Streptococcus pneumoniae mit clonierte Fragmente des pspA- Strukturgens enthaltenden Plasmiden konnten durch Pneumokokken sezernierte lösliche Fragmente von PspA produziert werden.
Daher wird in einem anderen erfindungsgemäßen Gesichtspunkt ein Verfahren zur Herstellung eines immunprotektiven verkürzten PspA-Proteins bereitgestellt, gekennzeichnet durch:
(a) Herbeiführung einer Insertion-Duplikationsmutagenese eines Bakteriums mit einem pspA-Gen, was zu der Codierung eines verkürzten exprimierbaren Pneumokokken-Oberflächenproteins (PspA) führt, dem der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt, oder
(b) Fusion eines pspA-Gens, das eine verkürzte Form eines PspA-Proteins codiert, dem der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt, mit einem ein anderes Protein codierenden Gen zur Erzeugung eines Fusionsproteindons und Transformation eines Bakteriums mit dem Fusionsproteindon,
Züchtung des Bakteriums zur Herbeiführung der Expression eines verkürzten PspA-Proteins oder eines das verkürzte PspA und das andere Protein enthaltenden Fusionsproteins und
Isolierung des exprimierten Proteins.
Die molekülare Größe des erhaltenen gereinigten verkürzten PspA-Proteins kann durch Verschiebung des die Termination der Genexpression festlegenden Insertionsortes an verschiedene Stellen im pspA-Gen variiert werden. Es wurde beispielsweise festgestellt, daß ein N-terminales Fragment mit einem apparenten Molekülargewicht von 43 kD, das etwa der Hälfte des nativen Proteins ausmacht, nützlich war.
Der durch dieses Verfahren produzierte verkürzte Abschnitt kann einen Schutz in Mäusen vor einer tödlichen Herausforderung mit Typ 3-S. pneumoniae hervorrufen, was zum ersten Mal zeigt, daß ein gereinigtes PspA einen Schutz hervorrufen kann und daß dieser verkürzte Abschnitt des Proteins protektive Epitope von PspA enthält.
Die Aminosäuresequenzinformation wurde auf den N-terminalen 45 Aminosäuren des verkürzten Abschnitts von PspA erhalten. Diese Sequenz ist in Figur 2 dargestellt. Die vorhersagende Sekündärstrukturanalyse zeigt, daß diese Sequenz eine sehr starke alpha-helikale Struktur ohne nicht-helikale Insertionen aufweist. Etwa 51 % des Abschnitts bestehen nur aus zwei Aminosäuren, d. h. aus Lysin, einer geladenen Aminosäure, und Alanin, einer unpolaren Aminosäure.
Die Analyse dieser Sequenz aus 45 Aminosäuren zeigt auch, daß sie eine Periodizität von 7 Resten enthält (vgl. Figur 2). In PspA beginnt die Periodizität mit Rest 8 und erstreckt sich durch die ganze Sequenz über fast 11 Windungen der Helix. Die Positionen "a" und "d" sind durch apolare Aminosäuren besetzt, und die Positionen "b", "c" und " f" enthalten allgemein hydrophile Aminosäuren. Die Position "f" ist überwiegend mit Lysin besetzt. Unter Berücksichtigung dieser Beobachtungen weist dieser Bereich von PspA sehr wahrscheinlich eine alpha-helikale, in sich verknäulte Knäuelkonfiguration auf. Die abgeleitete Aminosäuresequenz des ganzen α-helikalen, in sich verknäulten Knäuelbereichs ist in Figur 5 dargestellt.
Es wurde der vollständige codierende Bereich von pspA cloniert und sequenziert (vgl. Figur 3). Die abgeleitete Aminosäuresequenz des PspA-Proteins zeigt drei unterschiedliche in Figur 1 schematisch dargestellte Bereiche des PspA-Moleküls. Daher wird in einem weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt ein biologisch reines rekombinantes DNA-Molekül bereitgestellt, das diese verkürzte Form des PspA-Proteins codiert und eine codierende Sequenz aufweist, die in der in Figur 3 dargestellten Sequenz enthalten ist.
Die DNA-Sequenz des pspA-Gens liegt auf einem 2 086 Basenpaare langen HindIII-KpnI-Fragment. Das pspA-Gen selbst stellt etwa 1 985 Basenpaare dieses Fragments dar und umfaßt einen Anfangsbereich, der die Transkriptions- und Translationssignale umfaßt, wobei die Translation am ATG/met (Nucleotidposition 127, Codonposition -31) beginnt, mit einer anschließenden Leadersequenz, die sich vom ATG/met (Nucleotidposition 127, Codonposition -31) zum CGA/ala (Nucleotidposition 127, Codon -1) erstreckt. Reifes PspA beginnt mit der Glu-Aminosäure an der Nucleotidposition 220 (Codon +1) und endet am Translationsstop TAA/OCH an der Nucleotidposition 1984. Diesem translationalen Stopcodon folgen Transkriptionsterminationssignale.
Der von der DNA-Sequenz in Figur 3 vorhergesagte Aminoterminus der Proteinsequenz enthält eine Leadersequenz aus 31 Aminosäuren und eine Sequenz aus 45 Aminosäuren, die mit der Sequenz aus 45 Aminosäuren des N-Terminus von PspA identisch ist (Figur 2). Das Aminoende der vorhergesagten Proteinsequenz ist stark geladen und von Natur aus α-helikal. Dieser Bereich ist auf der Aminosäureebene zu Tropomyosin homolog (etwa 22% Identität und 50% Ähnlichkeit). Diese Homologie ist im wesentlich auf eine sich wiederholende Periodizität von sieben Resten zurückzuführen, wobei die erste und vierte Aminosäure hydrophob sind, die dazwischenliegenden Aminosäuren die Helixbildung fördern und die siebte Aminosäure geladen ist. Dieses Muster stimmt mit dem eines α-helikalen, in sich verknäulten Knäuel-Moleküls überein und zeigt, daß der α-helikale Knäuel sich über die N-terminale Hälfte des Moleküls erstreckt. Die Aminosäuresequenz des gesamten α-helikalen Knäuel-Bereichs ist in Figur 5 dargestellt.
Auf den geladenen helikalen Bereich folgt ein prolin-reicher Bereich, in dem 23 von 81 Aminosäuren Proline sind. Unmittelbar anschließend an den prolinreichen Bereich auf der Carboxyseite liegt die erste von zehn hoch homologen Wiederholungen von 20 Aminosäuren. Der einzige signifikant hydrophobe Bereich im sequenzierten Teil des Moleküls beginnt an der letzten Wiederholung. Dieser potentielle Membran-überspannende Bereich enthält mehrere geladene Aminosäuren, die dem translationalen Stopcodon vorrausgehen.
Die durch Insertion inaktivitierten Mutanten von S. pneumoniae, denen die C- terminalen Ankerbereiche fehlen, können in einem chemisch definierten Medium wachsen und den N-terminalen Bereich des PspA-Proteins in das Medium sezernieren. Der N-terminale Bereich von PspA ist in dem Kulturmedium stark löslich und kann leichter als das vollständige Molekül isoliert werden. Lösliche verkürzte Moleküle wurden unter Verwendung der Insertion-Duplikationsmutagenese produziert, die durch die in Figur 4 dargestellten donierten PspA-DNA-Fragmente gesteuert wurde. Die Expression des gleichen verkürzten Konstrukts (mit dem Pneumokokken-Promotor) in E. coli führt dazu, daß das gleiche PspA-Fragment in das Periplasma von E. coli sezerniert wird. PspA wird aus dem Periplasma durch hypertone Lyse leicht freigesetzt.
Verkuirztes PspA wird aus dem Kulturmedium von mutanten Pneumokokken auf einfache Weise, beispielsweise durch tangentiale Fließfiltration, isoliert. Anschließend wird eine Ionenaustauschchromatographie auf einem anionischen Harz zur Reinigung des Proteins durchgeführt. In diesem Verfahren wird die das PspA enthaltende Lösung bis zu einem pH-Wert von 6 in einer 0,02 M Salzlösung dialysiert und über das Harz geleitet. Das PspA wird von dem Harz mit einem Gradienten von 0,08 bis 2,0 M Ionenstärke eluiert und in der Fraktion zwischen 0,34 und 0,87 M Ionenstärke je nach der Natur der verwendeten Säule gesammelt.
Das PspA kann durch Natriumdodecylsulfatpolyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) weiter gereinigt werden. Der das PspA enthaltende Teil des Gels wird durch Färbung des Gels identifiziert, und PspA wird aus diesem Teil elektroeluiert.
Die elektrophoretische Reinigung ist einfach, wenn nur kleine Mengen PspA verwendet werden. Als Alternative, die für eine Produktion in großem Maßstab besser geeignet ist, kann das Protein durch Chromatographie nach Größe in einem Phosphatpuffer bei einem pH-Wert von 7 gereinigt werden.
Aufgrund der Möglichkeit der Expression der verkürzten Form des PspA in das Kulturmedium, im Gegensatz zu seinem Eingeschlossensein innerhalb der Zellwände und einer dadurch viel komplizierteren Reinigung, können weitere Proteine, die in das verkürzte pspA-Gen cloniert wurden, durch Herstellung von Fusionsproteinen zwischen PspA und anderen Proteinen isoliert werden. Dieses Verfahren kann zur Erhöhung der Immunogenität oder zur Bewahrung der immunogenen strukturellen Konformation oder der Präsentation des Genproduktes verwendet werden, damit das Fusionsprotein zur Immunisierung, die systemisch und/oder mucosal sein kann, gegen Erkrankungen verwendet werden kann.
Ein Beispiel für ein solches Fusionsprotein ist eine Fusion des löslichen N- terminalen Bereichs von PspA und der B-Untereinheit des Choleratoxins. Die Fusionsproteine können auch durch chemische Verknüpfung des verkürzten PspA- Proteins mit anderen Proteinen hergestellt werden.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft daher die Bereitstellung eines Verfahrens zur Herstellung von donierten Proteinen, umfassend die Fusion eines eine verkürzte Form eines PspA-Proteins codierenden pspA-Gens mit dem ein anderes Protein codierenden Gen zur Erzeugung eines Fusionsproteinclons, die Transformation von S. pneumoniae, E. coli oder anderen Bakterien mit dem Fusionsproteindon, die Züchtung des transformierten Bakteriums zur Herbeiführung der Expression eines Fusionsproteins, das das verkürzte PspA und das andere Protein umfaßt, in das Kulturmedium und die Isolierung des Fusionsproteins.
Unter Verwendung dieses Verfahrens können donierte Proteine in gram-positiven Bakterien wie Pneumokokken, beispielsweise S. pneumoniae, und Mycobakterien, beispielsweise Bacille Calmette-Guerin (BCG), hergestellt werden. Dieses Verfahren beseitigt die Probleme, die der Produktion von Proteinen in üblicherweise zur Clonierung verwendeten gram-negativen Bakterien wie E. coli innewohnen, insbesondere die Notwendigkeit der Reinigung der rekombinanten Proteine von Endotoxin und die Toxizität von vielen gram-positiven DNA-Sequenzen in gram-negativen Organismen.
Zur Expression eines Fusionsproteins, das den löslichen N-terminalen Bereich von PspA und die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) umfaßt, wird eine Genfüsion eines eine verkürzte Form des PspA-Proteins codierenden pspA-Gens mit einem die B- Untereinheit des Choleratoxins codierenden ctxB-Gen durchgeführt. Nach der Expression des Fusionsproteins können PspA und CTB durch verdünnte Säure an einer Asparagin-Prolin-Sequenz, die bekanntermaßen gegen verdünnte Säure labil ist und an der Fusionsstelle der beiden Proteine eingebaut wurde, voneinander gespalten werden.
Von CTB ist bekannt, daß es für Monosialogangliosid (GM1) hochspezifisch ist. Daher kann das Fusions-PspA-CTB-Protein aus dem Kulturmedium durch Adsorption an eine GM1-Affinitätssäule isoliert werden, von der das Fusionsprotein anschließend bei einem niedrigen pH-Wert eluiert werden kann.
Das PspA-CTB-Fusionsprotein ist in Festphasen-Immunadsorptionstests besonders nützlich. Unter Verwendung des Fusionsproteins können feste Träger wie Mikrotiterplatten mit PspA-Fragmenten ohne vorherige Isolierung der PspA-Fragmente beschichtet werden. Dies kann durch Zugabe des das Fusionsprotein enthaltenden bakteriellen Extrakts zu mit GM1 beschichteten Platten durchgeführt werden. Das PspA- CTB-Fusionsprotein bindet anschließend über die CTB-Einheit an GM1, wodurch der feste Träger mit PspA beschichtet wird. Das erhaltene beschichtete Produkt kann anschließend in einem Festphasen-Immunadsorptionstest zum Nachweis des PspA- Antikörpers und/oder -Antigens in Testproben verwendet werden. Diese Immunadsorptionstests stellen einen weiteren erfindungsgemäßen Gesichtspunkt dar.
Der PspA-Bindungs/Ankerbereich, der den prolinreichen Bereich, den Wiederholungsbereich und/oder den C-Terminus von PspA enthält, kann auch verwendet werden, um die Expression von heterologen Proteinen in Pneumokokken oder anderen gram-positiven oder gram-negativen Bakterien, in denen der Bindungs/Ankerbereich funktional ist, herbeizuführen. Üblicherweise erfolgt die Expression auf der bakteriellen Membran, den Zellwänden oder Zelloberflächen in gram-positiven Bakterien und im Periplasma von gram-negativen Bakterien. Ein Beispiel für ein solches heterologes Protein ist die B-Untereinheit des Choleratoxins.
Wie vorstehend beschrieben, enthält die hier bereitgestellte verkürzte Form von PspA die immunprotektiven Epitope des Proteins und ist daher in einem Impfstoff gegen eine Pneumokokken-Infektion nützlich. Daher betrifft ein noch weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt die Bereitstellung eines Impfstoffs gegen eine Pneumokokken-Infektion, der als einen immunogenaktiven Bestandteil das hier bereitgestellte, gereinigte, immunprotektive Pneumokokken-Oberflächenprotein umfaßt. Das PspA-Protein kann als ein Bestandteil eines Multikomponentenimpfstoffs, der zur Erzeugung eines Schutzes vor einer Reihe von Infektionen effektiv ist, verwendet werden.
Ferner können gram-positive Bakterien, die zur Expression des das verkürzte lösliche PspA-Protein codierenden pspA-Gens transformiert wurden, in einer lebendenattenuierten oder abgetöteten Form als ein immunologisch aktiver Bestandteil eines Impfstoffs gegen eine Pneumokokken-Infektion verwendet werden. Im transformierten Bakterium kann dieses pspA-Gen an ein ein anderes Protein codierendes Gen fusioniert werden. Daher liefert ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt einen Impfstoff gegen eine Pneumokokken-Infektion, der als einen immunologisch aktiven Bestandteil lebende-attenuierte oder abgetötete Bakterien, die ein eine verkürzte Form von PspA codierendes Gen enthalten, umfaßt.
Die verkürzte Form von PspA kann ferner in Konjugaten mit normalen schwach immunogenen oder nicht-immunogenen, Schutz hervorrufenden Molekülen wie verschiedenen Polysacchariden verwendet werden, um bei diesen eine Steigerung der Immunogenität zu erreichen. Ein weiterer erfindungsgemäßer Gesichtspunkt betrifft daher die Bereitstellung eines Impfstoffs, der als immunogen aktiven Bestandteil ein Konjugat des hier bereitgestellten gereinigten immunprotektiven Pneumokokken- Oberflächenproteins und eines normalerweise schwach immunogenen oder nichtimmunogenen, Schutz hervorrufenden Moleküls umfaßt.
Die konservierten Sequenzen von pspA, besonders die in prolinreichen und/oder Wiederholungsbereichen des Gens, können als Sonden zum Nachweis der Gegenwart von Pneumokokken von verschiedenen Stämmen durch Nachweis von Pneumokokken-DNA in Geweben, Körperflüssigkeiten und/oder Sekreten verwendet werden. In ähnlicher Weise können Teile des pspA-Gens in diagnostischen Kits zum Nachweis von Pneumokokken-Infektionen verwendet werden.
Ferner können die auf der Grundlage von konservierten Sequenzen von pspA, besonders der prolinreichen und/oder Wiederholungsbereiche, produzierten Primer zum Testen auf die Gegenwart von Pneumokokken in Geweben, Körperflüssigkeiten und/oder Sekreten durch Amplifikation von Pneumokokken-DNA verwendet werden. In dieser Hinsicht kann ein einzelnes Primerpaar, das von der Nucleotidsequenz des pspA- Gens von S. pneumoniae abgeleitet ist, in einem Test unter Verwendung der Polymerasekettenreaktion (PCR) zum spezifischen Nachweis von Streptococcus pneumoniae verwendet werden.
Die spezifische Amplifikation wurde von einem 678 Basenpaar-DNA- Fragment vom S. pneumoniae-Stamm Rx1 erreicht. Nach 30 Amplifikationszyklen war das Amplimer durch Agarosegelelektrophorese nachweisbar. Das Fragment wurde in allen 32 getesteten Stammen von S. pneumoniae erfolgreich amplifiziert. Die DNA- Amplifikation durch PCR konnte weniger als geschätzte 20 Picogramm genomische Pneumokokken-Gesamt-DNA nachweisen.
Die Primer LSM1 und LSM2 mit den Nucleotidsequenzen
LSM1 5'-CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC-3' und
LSM2 5'-GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3'
amplifizierten das 678 Basenpaarprodukt von pspA von den Nucleotiden 1 312 bis 1 990 der Rx1 pspA-Sequenz (Figur 3).
Die PCR-Analyse unter Verwendung der hier beschriebenen Primer wird gemäß üblichen PCR-Verfahren, wie in der Literatur, beispielsweise in Arnhem et al., C & EN Special Report 36, 1. Oktober 1990, beschrieben, durchgeführt. Zum Zweck des Nachweises kann der Primer markiert werden, oder es können markierte Nucleotidtriphosphate in die PCR-Reaktion zur Markierung des PCR-Amplifikationsproduktes eingeschlossen werden.
Die PCR-Primer können durch gut bekannte Verfahren, beispielsweise durch Oligonucleotidsynthese oder Fragmentierung einer größeren Nucleotidsequenz unter Verwendung von geeigneten Restriktionsenzymen, hergestellt werden.
Die Fähigkeit zur Verwendung eines einzelnen Primers, der eine große Zahl von S. pneumoniae-Stammen nachweisen kann, ermöglicht die Bereitstellung eines universellen PCR-Nachweiskits, der Pneumokokken-Infektionen in Säugern, einschließlich Menschen, unabhängig von dem die Krankheit verursachenden Stamm diagnostizieren kann.

Stämme, Plasmide und Sonden

In den nachstehenden Beispielen sowie in den angefügten Figuren wird auf bestimmte Plasmide und mit diesen Plasmiden sowie Vektor-DNA-Abschnitten transformierte bakterielle Stamme, von denen einige bei der ATCC hinterlegt wurden und die hier alle vollständig beschrieben werden, Bezug genommen. Die nachstehende Tabelle II liefert eine Zusammenfassung dieser Materialien. Tabelle II

Beispiele

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Herstellung und das Wachstum von neuen Stämmen von S. pneumoniae.
Der Stamm S. pneumoniae Rx1, der ein kapselloses Derivat des Kapseltyp 2- Stamms D39 (National Collection of Type Cultures, London, NCTC #7466) ist, wurde einer Insertionsinaktivierung (wie von McDaniel et al. (III) 1987, Crain et al. 1990, Talkington et al. 1991) mit 10 verschiedenen clonierten Fragmenten von PspA (vgl. Figur 4) unterzogen. Diese Fragmente wurden alle durch Restriktionsspaltung von clonierter PspA-DNA auf einem Plasmid im E. coli-Stamm JY4313 (bei der American Type Culture Collection am 31. Januar 1991 unter der ATCC-Hinterlegungsnummer 68529 hinterlegt) erhalten. Diese Insertions-Duplikationsmutagenese (vgl. Figur 4) bewirkt die Termination der Genexpression in der Nähe des 3'-Endes des clonierten Fragments.
Einer der erhaltenen Stämme, JY2008 (bei der American Type Culture Collection am 24. Januar 1991 unter der Hinterlegungsnummer 55143 hinterlegt), der durch ein in pKSD300 (McDaniel et al. (III) 1987) codiertes DNA-Fragment hergestellt wurde, produziert ein PspA-Fragment von 27 kD (apparentes Molekülargewicht von 43 kD). Dieses Fragment hat etwa 40% der Größe des nativen 65 kD (apparente Größe von 84 kD)-Proteins.
Die erwartete Molekülgröße beruht auf der abgeleiteten Aminosäuresequenz und die apparente Molekülgröße auf der Wanderung in der SDS-PAGE. Der Unterschied zwischen der erwarteten und apparenten Molekülgröße geht auf die Konformation des PspA-Fragments zurück.
Die Prolin- und Wiederholungs/Ankerbereiche (vgl. Figur 1) waren deletiert und das erhaltene Protein konnte aufgrund ihrer Abwesenheit nicht mehr an Zellen binden. Das nicht gebundene Protein kann anschließend aus den Kulturüberständen, wie nachstehend beschrieben, isoliert werden.
Durch Verschieben der Insertion an verschiedene Stellen im pspA-Gen können verschiedene Längen von verkürzten nicht-gebundenen PSPA-Proteinderivaten, wie in Figur 7 dargestellt, produziert werden.
Der Pneumokokken-Stamm JY2008 wurde in 6 Litern eines chemisch definierten Mediums (vgl. Inf. Imm. 27, 444), das mit 0,10% Cholinchlorid, 0,075% L- Cysteinhydrochlorid und 0,25% NaHCO&sub3; versetzt war, gezüchtet. Die Überstandsflüssigkeit der JY2008-Kultur in der mittleren log-Phase wurde unter Verwendung eines 0,22 um-Membran-Tangentialfließfilters geerntet und 60fach konzentriert.
Die Einführung des Plasmids pKSD300 in den nicht modifizierten D39- Stamm lieferte in ähnlicher Weise das verkürzte 43 kD-PspA-Protein. Die Einführung des Plasmids pKSD300 in den Typ 3-S. pneumoniae-Stamm WU2 (ein PspA-Protein von etwa 92 kD) lieferte nach der Züchtung des Organismus ein nicht-gebundenes verkürztes PspA-Protein mit einer Molekülgröße von etwa 46 kD.

Beispiel 2

Dieses Beispiel erläutert die Reinigung von PspA.
Die konzentrierte Überstandsflüssigkeit, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, produziert wurde, wurde in 0,1 M PBS, pH 7,2, gewaschen und bei 196 000 x g ultrazentrifügiert. Die Überstandsflüssigkeit wurde 1:5 in 20 mM L-Histidinpuffer-NaCl verdünnt, der pH-Wert auf 6,0 eingestellt und in eine DEAE-Faser-Isonet-D2 - Ionenaustauschersäule injiziert.
Ein schrittweiser NaCl-Gradient von 80 mM bis 2 M wurde auf die Säule aufgetragen und die PspA-enthaltenden Fraktionen (0,32 bis 0,64 M Ionenstärke) wurden gepoolt und auf einem SDS-Polyacrylamidgel getrennt. Die Proteine auf einem repräsentativen Abschnitt des Gels wurden zur Identifizierung von PspA mit Comassie Blau R-250 gefärbt. Die PspA enthaltende Fraktion wurde vom Rest des SDS-Gels ausgeschnitten und aus dem ausgeschnittenen Gel elektroeluiert. Das eluierte Protein wurde in einem 50:50 Methanol:Aceton-Lösungsmittel ausgefällt und in PBS resuspendiert. Die Reinheit des Produkts wurde durch Silberanfärbung und Western-Immunblot- Verfahren mit dem mAb Xi126 (IgG 2b, k, vgl. McDaniel et al. (I), a.a.O.) besiätigt.

Beispiel 3

Dieses Beispiel erläutert die Isolierung von PspA aus dem bakteriellen penplasmatischen Raum.
Die Isolierung aus dem periplasmatischen Raum wurde durch Standardverfahren erreicht. Stamm JY4306 (der das N-terminale 43 kD-Fragment von PspA, dessen Aminosäuresequenz in Figur 3 dargestellt ist, produziert. Dieser Stamm wurde bei der ATCC am 31. Januar 1991 unter der Hinterlegungsnummer 68522 hinterlegt) wurde in gepufferter Salzlösung gewaschen und in 20% Saccharose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl, pH 7,7, 10 Minuten bei 0ºC inkubiert. Die Zellen wurden anschließend 10 Minuten bei 0ºC bei 400 x g zentrifugiert. Alle Überstände wurden vom Pellet entfernt und das Pellet schnell in etwa 100 Volumina Wasser bei 4ºC resuspendiert. Nach 10 Minuten wurde die Suspension 10 Minuten bei 4ºC bei 4 000 x g zentrifugiert. Das Pellet wurde verworfen und der PspA-enthaltende Überstand gewonnen. Die Konzentrierung des Überstandes erfolgte durch Standardverfahren wie eine Konzentrierung gegen feste Saccharose oder Ultrafiltration. Die Reinigung des aus E. coli isolierten Proteins wurde gemäß den gleichen Chromatographieverfahren, die zur Isolierung des (verkürzten) 43 kD-PspA aus den Medien von wachsenden Pneumokokken verwendet wurden, durchgeführt.

Beispiel 4

Dieses Beispiel erläutert die immunogenen Eigenschaften des PspA-Proteins.
16 CBA/N-Mäusen im Alter von 7 Wochen, die die Xid-Mutation (Jackson Laboratories, Bar Harber, ME) trugen, wurde zur Ermittlung der Antikörperspiegel gegen PspA vor der Exposition am periorbitalen Sinus Blut entnommen. Gereinigtes PspA, das, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, wurde in komplettem Freundschem-Adjuvans emulgiert und subcutan in Leisten- und Ersatzgegend injiziert, wobei etwa 5 ug Protein pro Maus verabreicht wurden. Nach 14 Tagen wurden den Mäusen 5 ug PspA, das, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, intraperitoneal injiziert. Kontrollmäuse wurden auf den gleichen Wegen mit sterilem SDS-Puffer immunisiert. 7 Tage nach der letzten Immunisierung wurde allen Mäusen am periorbitalen Sinus Blut entnommen, und alle Mäuse wurden mit 300 CFU des Typ 3-Stamms WU2, der wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet wurde, intravenös herausgefordert ("challenged").
Die Seren der vorherigen Immunisierung und Herausforderung wurden durch Western-Immunblots analysiert, um die Basislinie und Nachimmunisierungsantwort auf das verkürzte Protein festzulegen. Das PspA von Stamm WU2 wurde einer Elektrophorese unterzogen und auf Nitrocellulosemembranen transferiert. Die Membranen wurden in Streifen zerlegt und mit den geeigneten Mausantiseren als Sonden bei einer 1:50-Verdünnung 2 Stunden abgesucht, mit biotinyliertem Ziegen-anti- Maus-Immunglobulin 1 Stunde inkubiert, gewaschen und mit Streptavidin-konjugierter Phosphatase inkubiert. Die Membranen wurden mit 5-Brom-4-chlor-3-indolylphosphattoluidinsalz mit 0,01 % in blaues Tetrazolium entwickelt.
Von den 8 mit dem gereinigten PspA-Fragment immunisierten CBA/N- Mäusen lebten alle noch 14 Tage nach der Herausforderung mit dem Stamm WU2, und keine zeigte irgendwelche Anzeichen einer Erkrankung nach der Herausforderung. Von den 8 mit Pufferkontrollen immunisierten Mäusen waren 6 2 Tage nach der Herausforderung tot, während die verbliebenen beiden Kontrollmäuse mit ihrem zerzausten Fell, gekrümmten Rücken und ihrer eingeschränkten Beweglichkeit zwei bis drei Tage nach der Herausforderung sehr krank wirkten, jedoch überlebten. Die Chi- Quadrat-Analyse zeigte, daß es einen signifikanten Unterschied (P < 0,003) im Überleben zwischen der immunisierten und der Kontrollgruppe gab.
Die Seren der vorherigen Immunisierung und Herausforderung wurden durch Western-Immunblot-Verfahren analysiert. Keines der Vorimmunusierungsseren enthielt einen Antikörper gegen das verkürzte PspA. Die Nachimmunisierungsseren von 8 von 8 Mäusen enthielten nachweisbare Antikörper gegen PspA und 6 Mäuse zeigten sehr starke anti-PspA-Reaktionen. Wenn der herausfordernde Stamm WU2 mit Antiseren als Sonden abgesucht wurde, wiesen alle immunisierten Mäuse Antikörper auf, die mit den WU2-PspA-Epitopen stark kreuzreaktiv waren. Keine der Kontrollmäuse entwickelte Antikörper gegen PspA.
Die Immunisierungsdaten sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengefaßt: Tabelle III
Wie den Daten in Tabelle III zu entnehmen ist, rief die Immunisierung mit zwei 5 ug-Dosen des gereinigten PspA-Moleküls einen Schutz vor einer tödlichen Infektion von CBA/N-Mäusen und Antikörper, die mit dem PspA des herausfordernden Stamms reagierten, hervor.

Beispiel 5

Dieses Beispiel erläutert die Sequenzierung des PspA-Proteins.
Das gereinigte PspA, das, wie in Beispiel 2 beschrieben, hergestellt wurde, wurde durch 9% Trenngele, die umkristallisiertes SDS enthielten, mit dem Laemmli- Puffersystem einer Elektrophorese unterzogen (Nature 227, 680). Die Gele wurden zweimal in 10 mM 3-(Cyclohexylamino)-1-propansulfonsäure, pH 11,0, die 10% Methanol enthielt, 10 Minuten eingeweicht. Eine Polyvinylidendifluoridmembran (PVDF) wurde vollständig über mehrere Sekünden in 100% Methanol benetzt und anschließend in CAPS-Puffer 10 min gewaschen. PspA wurde auf die PVDF-Membran in CAPS-Puffer 1 Std. bei 0,5 A elektrotransferiert. Nach dem Transfer wurde die Membran zweimal in entionisiertem Wasser 5 min gewaschen und mit 0,1 % Coomassie Blau R-250 in 50% Methanol 20 Minuten gefärbt. Der das PspA enthaltende Abschnitt der Membran wurde ausgeschnitten und in 40% Methanol und 10% Essigsäure 5 min entfärbt. Die Membran wurde in kleine Abschnitte geschnitten und in sterilen Eppendorf -Röhren bis zur Sequenzierung aufbewahrt.
Das isolierte PspA wurde direkt von den PVDF-Membranen sequenziert. Figur 2 zeigt die N-terminale Aminosäuresequenz von 45 Resten und Figur 5 zeigt die Aminosäuresequenz für den gesamten alpha-helikalen Bereich. Die DNA-Sequenz des Gesamt-pspA-Gens und die abgeleitete Aminosäuresequenz für das PspA-Protein sind in Figur 3 dargestellt.

Beispiel 6

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung der 5'-Sequenz von pspA und/oder des N-terminalen Bereichs von PspA, um als Expressions- und Leadersequenz zur Expression und/oder Exkretion/Sekretion heterologer Proteine von S. pneumoniae und E. coli zu dienen. In diesem Beispiel wird die Expression des N-Terminus des PspA- Proteins beschrieben, das mit der B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) durch eine genetische Fusion fusioniert ist, und die Exkretion des fusionierten Proteins aus Pneumokokken und seine Sekretion in den periplasmatischen Raum von E. coli.
Ein Fusionsprotein, das aus CTB und der N-terminalen Hälfte von PspA bestand, wurde konstruiert und in E. coli exprimiert. Das verwendete HindIII/DraI pspA- Genfragment enthielt alle pspA-Transkriptions- und Translationsinitiationssignale und die PspA-Signalpeptidleadersequenz zum Transport durch die Zellmembran. Das von diesem Fragment codierte reife PspA wird als ein Produkt von 29 kD (mit einem beobachteten Molekülargewicht von 42 kD), das mehr als 90% der α-helikalen, in sich verknäulten Knäuel-Domäne umfaßt, vorhergesagt. Dem verwendeten CTB-Fragment fehlten die Transkriptions- und Translationsinitiationssignale. Die Expression vom pspA-Promotor durch pspA und das anschließende translationale Weiterlesen im Leserahmen in das CTB-codierende Gen ctxB bewirkte die Produktion eines 12 kD- CTB-Produktes, das mit dem stromaufwärts liegenden PspA-Produkt fusioniert war. Das PspA-CTB-Fusionsprotein wurde sowohl in Plasmiden mit hoher als auch niedriger Kopienzahl (pUC18. mehr als 100 Kopien/Zelle und pJY4163, etwa 15 bis 30 Kopien/Zelle) in E. coli stabil exprimiert.
Die Fusionsprodukte hatten die erwartete Größe (etwa 54 kD) und reagierten sowohl mit dem Antikörper gegen PspA als auch mit dem gegen CTB. Das Bestehen der Funktionalität des CTH-Produkts wurde durch die Fähigkeit des Fusionsproteins zur Bindung an das Gangliosid GM1, einer Eigenschaft von CTB, gezeigt.
Das hohe Expressionsniveau des Fusionsprodukts bewirkte anscheinend eine reduzierte Rate von Prozessierungs- und/oder Konformationsveränderungen, die verhinderte, daß das Protein vollständig in das Periplasma transportiert wurde. Im Konstrukt mit geringer Kopienzahl waren jedoch etwa 60% des Fusionsproteins im Periplasma lokalisiert, von dem große Mengen durch osmotischen Schock leicht aus E. coli freigesetzt wurden.
Zusätzlich zur Expression in E. coli wurde das Fusionsprotein auch in S. pneumoniae durch Transformation des Konstrukts mit geringer Kopienzahl in das avirulente S. pneumoniae Rx1 zur Erzeugung einer Insertion-Duplikationsmutante exprimiert. So wurde das das Fusionsprotein codierende Gen in das S. pneumoniae-Chromosom integriert, von dem es stabil exprimiert wurde. Wie in Beispiel 1 wurde das verkürzte PspA-Molekül, dem der Bindungs/Ankerbereich fehlt, diesmal in Form eines PspA- CTB-Fusionsproteins, in den Kulturüberstand ausgeschieden. Das Fusionsproteinprodukt hatte die erwartete Molekülgröße (54 kD), reagierte mit dem Antikörper gegen PspA und CTB und band an GM1.

Beispiel 7

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung des PspA-Bindungs- oder Ankerbereichs zur Expression von heterologen Proteinen auf der Oberfläche von S. pneumoniae oder anderen Bakterien, in denen die Bindungs/Ankersequenz funktional ist, insbesondere die Expression einer PspA-CTB (Choleratoxin B-Untereinheit)-Fusion, die auf der Oberfläche von Pneumokokken exprimiert wird.
Der den N-Terminus codierende Bereich von PspA, einschließlich seiner Transkriptions- und Translationsinitiationssignale und seiner Signalpeptidleadersequenz, ist über eine translational im Leserahmen liegende genetische Fusion an das CTB-codierende ctxB-Fragment, dem die Transkriptions- und Translationsinitiationssignale und -terminationssignale fehlen, gebunden. Dieser Sequenz folgt im Leserahmen die PspA- Bindungs/Ankerdomäne, einschließlich eines Teils der oder der gesamten Prolin-, Wiederholungs- und C-terminalen Domäne. Das erhaltene Fusionsprotein wird durch die PspA-Leadersequenz aus der Zelle herausdirigiert, die nach dem Transport durch die Membran abgeschnitten wird, und anschließend durch die PspA-Bindungs/Ankersequenz an die Zelle gebunden. Das heterologe Protein, das zwischen den beiden PspA- Fragmenten liegt, wird auf der äußeren Oberfläche der Membran und in S. pneumoniae auf der Oberfläche der Zelle exprimiert.

Beispiel 8

Dieses Beispiel erläutert die Expression des verkürzten und vollständigen PspA durch den Mycobacterium tuberculosis-Stamm Bacille Calmette-Guerin (BCG).
BCG wurde chromosomal modifiziert, wobei das das verkürzte PspA-Protein codierende pspA-Gen eingebaut wurde. Das verkürzte 43 kD-PspA-Protein wurde vom modifizierten BCG bis etwa zu 15 % des Gesamt-BCG-Proteins exprimiert. Dieses Ergebnis wurde mit einem Expressionsvektorkonstrukt erreicht, das den pspA- Genabschnitt, der den 43 kD-Bereich ohne das 5'-Sekretionssignal codierte, trug. Die Expression war nur etwa 1 % des BCG-Proteins, wenn das PspA oder die mycobakteriellen Signalsequenzen eingeschlossen waren. In jedem Fall wurde ein signifikanter Teil des exprimierten PspA in das Medium ausgeschieden. Die Expression des 43 kD-PspA- Proteins in einer Fusion mit der mykobakteriellen Lipoproteinsignalsequenz bewirkte die Expression des rekombinanten PspA in der Membranfraktion von BCG.
Dieses letztere Ergebnis läßt darauf schließen, daß die Fusion der Lipoproteinsignalsequenz eine Acylierung des rekombinanten PspA bewirkte. Eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung mit Fluorochrom-konjugierten monodonalen Antikörpern gegen PspA zeigte die Expression von PspA auf der Oberfläche dieser Bakterien.

Beispiel 9

Dieses Beispiel erläutert die enge Homologie von Teilen des pspA-Gens bei verschiedenen Stämmen von Pneumokokken und die Möglichkeit, daß diese Homologie für molekülare (DNA)-Verfahren zum Nachweis von Pneumokokken in Geweben, Körperflüssigkeiten und/oder Sekreten und zur Identifizierung von von Patientenproben gezüchteten Pneumokokken verwendet werden kann.
Drei DNA-Sonden wurden verwendet, d. h. vollständiges pspA, JY4323 (N- terminale HindIII- bis C-terminale KpnI-Stelle), die N-terminale Hälfte von pspA, JY4306 (N-terminale HindIII- bis DraI-Stelle in Position 996 (vgl. Figur 3) und die meisten Prolin- und Wiederholungsbereiche, JY4262 (BclI-Stelle an Position 1221 bis BstNI-Stelle an Position 1832). Unter stringenten Bedingungen, die eine Identität von 95 % erfordern, reagierten die Sonden JY4323 und JY4262 mit Zellen von mehr als 200 unabhängigen Isolaten von S. pneumoniae beim Southern-Blot-Verfahren.
Bei einer Spaltung der chromosomalen DNA mit HindIII wurde üblicherweise beobachtet, daß jede dieser Sonden zwei diskrete Banden nachwies, deren genaue Größe vom untersuchten Stamm abhängig war. In Rx1-Pneumokokken waren die beiden Banden 4,0 und 9,1 kb. Die 4,0 kb-Bande entsprach pspA und war in pspA-Mutanten verändert oder abwesend. Die andere Bande teilt eine gewisse Homologie mit den codierenden Bereichen sowohl für die N-terminale als auch C-terminale Hälfte von PspA, wird jedoch durch pspA-Mutationen nicht beeinflußt. Die JY4323- und JY4262-Sonden reagierten nicht mit einem anderen gram-positiven Bakterium, Streptococcus pyogenes, und einem gram-negativen Bakterium, Salmonella typhimurium. Die N-terminale Sonde JY4306 erkannte etwa ein Drittel der getesteten Pneumokokken-Stämme.
Diese Ergebnisse zeigen, daß eine Sequenz, die in den Prolin/Wiederholungsbereich eingeschlossen ist, von allen Pneumokokken-Stammen und anscheinend nicht von anderen Bakterienarten geteilt wird. Die Sequenzen in der N-terminalen Hälfte des Moleküls sind anscheinend variabler.

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert den Nachweis und die Ermittlung der Lage von Epitopen im α-helikalen, N-terminalen Bereich von PspA.
Vor einer Pneumokken-Infektion in einem Mausmodell schützende monoclonale Antikörper, die durch ein Sternchen in den Figuren 5, 6 und 7 gekennzeichnet sind, wurden zur Ermittlung der Lage der Epitope für jeden Antikörper im α-helikalen, N- terminalen Bereich von PspA verwendet. Die Stellen wurden den PspA-Fragmenten zugeordnet. Die Ergebnisse sind in den Figuren 5 bis 7 erläutert, wobei Figur 5 die abgeleitete Aminosäuresequenz des N-terminalen Bereichs von PspA und die allgemeine Lage der von den monodonalen Antikörpern erkannten Epitope zeigt, Figur 6 die Reaktivität der Antikörper mit von verschiedenen pspA-Genabschnitten produzierten PspA-Fragmenten zeigt und Figur 7 die kartierte Lage der Epitope in den von verschiedenen pspA-Genabschnitten produzierten PspA-Fragmenten zeigt.
Die Zahlen 138, 193 und 261 in Figur 5 zeigen Spaltstellen in den PspA- Fragmenten, die zur Kartierung der Lage der von den monoclonalen Antikörpern Xi1526, Xi126, XiR35, XiR38, XiR1224, XiR16, Xi64, Xi178, Xi1325 und Xi1323 nachgewiesenen Epitope verwendet werden. Das Sternchen (*) nach einigen der Antikörper bezeichnet die Antikörper, die vor einer tödlichen Pneumokokken-Infektion mit dem Pneumokokken-Stamm WU2 schützen können.
Ferner zeigen die vertikalen Linien auf der rechten Seite der Figur die Bereiche, die voraussichtlich eine α-helikale, in sich verknäulte Knäuelstruktur aufweisen. Die Teilstriche auf der linken Seite der Figur zeigen die kartierte Lage der Epitope jedes Antikörpers.

Zusammenfassung der Beschreibung

Die vorliegende Erfindung betrifft zusammengefaßt ein verkürztes PspA- Molekül, das eine immunprotektive Antwort hervorrufen kann und daher die protektiven Epitope des PspA-Proteins enthält. Modifikationen sind im Schutzbereich dieser Erfindung möglich.

Claims

1. Gereinigtes immunprotektives Pneumokokken-Oberflächenprotein (PspA), umfassend eine verkürzte Form von PspA, die mindestens ein immunprotektives Epitop des Proteins und bis zu 90 % des Gesamt-PspA-Proteins enthält und der der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt.

2. Protein nach Anspruch 1, umfassend etwa 50 % des Gesamt- PspA-Proteins, dem der Zellmembranankerbereich, der Wiederholungsbereich und der Prolinbereich fehlen und das den N-terminalen Bereich von 43 kD (apparentes Molekulargewicht) eines PspA-Proteins von 84 kD umfaßt.

3. Protein nach Anspruch 1 oder 2, das mindestens den N- terminalen, protektiven Epitop-enthaltenden Bereich des PspA-Proteins umfaßt.

4. Protein nach einem der Ansprüche 1 bis 3, das mindestens den N-terminalen, α-helikalen, protektiven Epitop-enthaltenden Bereich des PspA-Proteins umfaßt und eine Periodizität von 7 Resten aufweist.

5. Biologisch reines rekombinantes DNA-Molekül, das eine verkürzte Form von PspA codiert, die bis zu 90 % des Gesamt-PspA-Proteins enthält und der der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt, wobei das DNA-Molekül eine in der nachstehend dargelegten Sequenz eingeschlossene codierende Sequenz aufweist:

16. DNA-Molekül nach Anspruch 5, das mindestens einen Teil eines α-helikalen, in sich verknäulten Knäuel-Bereichs des PspA-Proteins, mindestens einen Teil eines prolinreichen Bereichs des PspA-Proteins oder mindestens einen Teil eines Wiederholungsbereichs des PspA-Proteins codiert.

7. DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6 in Form einer DNA- Sonde zum Nachweis von Pneumokokken-DNA in einer Probe, das durch eine konservierte Sequenz des PspA-Gens gekennzeichnet ist, die eine einen prolinreichen Bereich von PspA codierende Nucleinsäure, eine einen Wiederholungsbereich von PspA codierende Nucleinsäure oder eine einen prolinreichen Bereich und einen Wiederholungsbereich von PspA codierende Nucleinsäure ist.

8. DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 6 in Form eines DNA- Primers zur Durchführung einer Polymerasekettenreaktion bei Pneumokokken-DNA, das durch eine konservierte Sequenz des PspA-Gens gekennzeichnet ist.

9. DNA-Molekül nach Anspruch 8, in dem die konservierte Sequenz in dem prolinreichen Bereich des Gens, in dem Wiederholungsbereich des Gens oder in beiden liegt.

10. DNA-Molekül nach Anspruch 7, das die aus den Basen 1221 bis 1832 der in Anspruch 5 gezeigten Sequenz bestehende DNA-Sonde JY4262 ist.

11. DNA-Molekül nach Anspruch 8 in Form eines DNA-Primers, wobei der Primer die folgende Nucleotidsequenz aufweist:

12. DNA-Molekül nach Anspruch 5, das eine verkürzte Form des PspA-Proteins codiert, die etwa 50 % des Gesamt-PspA- Proteins enthält und der der Zellmembranankerbereich, der Wiederholungsbereich und der Prolinbereich fehlen.

13. DNA-Molekül nach Anspruch 5 oder 12, das mit einem ein anderes Protein codierenden Gen durch eine die Translation im Leserahmen ermöglichende genetische Fusion verknüpft ist.

14. DNA-Molekül nach Anspruch 13, in dem das ein anderes Protein codierende Gen ein ctxB-Gen ist.

15. Verfahren zur Erzeugung eines immunprotektiven verkürzten PspA-Proteins, gekennzeichnet durch:

(a) Herbeiführung einer Insertion-Duplikationsmutagenese eines Bakteriums mit einem pspA-Gen, was zu der Codierung eines verkürzten exprimierbaren Pneumokokkenoberflächenproteins (PspA) führt, dem der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt, oder

(b) Fusion eines pspA-Gens, das eine verkürzte Form eines PspA-Proteins codiert, dem der funktionelle Zellmembranankerbereich fehlt, mit einem ein anderes Protein codierenden Gen zur Erzeugung eines Fusionsproteinclons und Transformation eines Bakteriums mit dem Fusionsproteinclon,

Züchtung des Bakteriums zur Herbeiführung der Expression eines verkürzten PspA-Proteins oder eines das verkürzte PspA und das andere Protein enthalten den Fusionsproteins und

Isolierung des exprimierten Proteins.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das Bakterium ein S. pneumoniae-Stamm, ein E. coli-Stamm oder ein Mycobacterium-Stamm ist.

17. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das Bakterium der S. pneumoniae-Stamm JY2008 (ATCC 55143) ist oder ein S. pneumoniae-Stamm, der ein verkürztes PspA-Protein, das einem N-terminalen Teil eines PspA-Proteins mit einem Molekulargewicht von 21 kDa entspricht, oder ein verkürztes PspA-Protein, das einem N-terminalen Teil eines PspA-Proteins mit einem Molekulargewicht von 18 kDa entspricht, produziert, oder Stamm JY4306 (ATCC 68522) oder BCG.

18. Verfahren nach Anspruch 15 oder 16, wobei das ein anderes Protein codierende Gen das ctxB-Gen ist, das die B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) codiert.

19. Verfahren nach Anspruch 18, wobei das Fusionsprotein eine säurelabile Sequenz enthält, die die verkürzte Form des PspA-Proteins und CTB verbindet, und wobei das PspA- Protein und CTB durch eine Behandlung mit verdünnter Säure voneinander getrennt werden.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 17, wobei das Fusionsprotein aus dem Kulturmedium durch Adsorption an eine GM1-Affinitätssäule isoliert wird, von der das Fusionsprotein eluiert wird.

21. Mutierter Streptococcus pneumoniae-, Escherichia coli- oder Mycobacterium-Stamm, der durch ein pspA-Gen gekennzeichnet ist, das ein verkürztes exprimierbares Pneumokokken-Oberflächenprotein (PspA) codiert, dem der Zell membranankerbereich fehlt.

22. Stamm nach Anspruch 21, der der JY2008 (ATCC 55143)- Stamm von S. pneumoniae ist, oder ein S.pneumoniae- Stamm, der ein verkürztes PspA-Protein, das einem N-terminalen Bereich des PspA-Proteins mit einem Molekulargewicht von 21 kDa entspricht, oder ein verkürztes PspA- Protein, das einem N-terminalen Bereich des PspA-Proteins mit einem Molekulargewicht von 18 kDa entspricht, produziert, oder der Stamm JY4306 (ATCC 68522) oder ein mutierter BCG.

23. Stamm nach Anspruch 21 oder 22, wobei das ein verkürztes PspA-Protein codierende pspA-Gen mit einem ein anderes Protein codierenden Gen verknüpft ist.

24. Stamm nach Anspruch 23, wobei das ein anderes Protein codierende Gen das ctxB-Gen ist, das die B-Untereinheit des Choleratoxins codiert.

25. Impfstoff gegen eine Pneumokokken-Infektion, gekennzeichnet durch das Protein gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4, das Expressionsprodukt eines DNA- Moleküls gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5, 6, 12, 13 oder 14, ein lebendes-attenuiertes oder abgetötetes gram-positives Bakterium, das ein das Protein gemäß der Definition in einem der Ansprüche 1 bis 4 codierendes Gen oder ein DNA-Molekül gemäß der Definition in einem der Ansprüche 5, 6, 12, 13 oder 14 enthält, oder das Protein, das durch das Verfahren nach einem der Ansprüche 15 bis 20 produziert wird, als immunologisch aktiver Bestandteil.

26. Impfstoff nach Anspruch 25, wobei das Protein mit einem normalerweise schwach immunogenen oder nicht-immunogenen, Schutz hervorrufenden Molekül konjugiert ist.

27. Impfstoff nach Anspruch 25, wobei das gram-positive Bakterium Streptococcus pneumoniae oder Mycobacterium tuberculosis ist.

28. Festphasen-Immunadsorptions-Test, gekennzeichnet durch die Beschichtung eines Festsubstrates mit einer verkürzten Form des PspA-Proteins nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das PspA-Protein mit der B-Untereinheit des Choleratoxins (CTB) fusioniert ist, die an das Festsubstrat beschichtendes Monosialogangliosid (GM1) gebunden ist.