PT100193B - Gene estrutural de proteina pneumococica - Google Patents

Description

DIRECÇÃO DE SERVIÇOS DE PATENTES

FOLHA DO RESUMO

Modalidade e n.° (ô)

T D

Data do pedido: (22)

Classificação Internacional ·( 2 KÁ-flcc i /<

'1

.Λ

Requerente

JA3 rtLoEARCH FOUNDAΓΙΟΝ, norte-americana i Estado

Alaoama). UAt: Sration, Birmingnam. Aiabama 3529-4. tarados Unidos cia A me ri ca

Inventores ($2):

O a. ν i d E... 3 i lies. ...ia i ί γ. i_ . Y c L n e r c Lar ~ v 3 . ί c ú u n ι a 1 .

Estaaos Unidos da América

Reivindicação de prioridade(s) (30)

Figura (para interpretação do resumo)

Data do pedido

Pais de Origem

N.° de pedido

NÃO PREENCHER AS ZONAS SOMBREADAS

Epígrafe: θ

Gene estrutural proteina pneumocócica

Resumo: (máx. 150 palavras) (57) resente invento’ r-efere-sa a uma proteina de superficie p neu mocóc i ca i. PspA) purificada, qu e c o m p r e e n d = u ma f o rm a rruncada cia proteina d'.-- ctue e imunoprotêctora t que contém t·:. spxcoDOS ímunoprotectcres de pspf·). A oro tema fscp e sóiuvei eu: soiução fisiológica e esta desprovida paio menos da região cr:· ancoragem da memorana da célula da proteina completa. A proteina c- rcrmaoa por .0..:..----.-..10-:1.10 1 icação d? mu ::.:tgena:s >.?·ί íumon 1 aç com o o ene pspA e a expressão da proteina truncada no meio de cu l ru ra ..

DSP-4

730

MIS:jc 6102-84

MEMÓRIA DESCRITIVA

CAMPO DO INVENTO

O presente invento refere-se ao desenvolvimento de uma vacina melhorada contra infecçoes pneumocócicas.

REFERÊNCIA A PEDIDOS RELACIONADOS

O presente pedido é uma continuação-em-parte do Pedido de Patente copendente dos E.U.A. n^a. de Série 656 773, depositado em 15 de Fevereiro de 1991.

ANTECEDENTES DO INVENTO

O Streptococcus pneumoniae é uma causa importante da otite média, da meningite, da bacteremia e da pneumonia. Apesar do uso de antibióticos e de vacinas, a prevalência das infecçoes pneumocócicas tem diminuído pouco durante os últimos vinte e cinco anos.

De um modo geral, é aceite que a imunidade em relação ao Streptococcus pneumoniae pode ser mediada por anticorpos específicos contra a cápsula de polissacárido do pneumococcus. Contudo os recém-nascidos e as crianças não conseguem produzir uma imuno-resposta contra os antigénios de polissacárido e podem ter infecçoes repetidas envolvendo o mesmo serotipo capsular.

Uma abordagem à imunização de crianças contra um certo número de bactérias encapsuladas consiste em conjugar os antigénios de polissacárido capsular com proteína para os tornar imunogénicos. Esta abordagem tem sido bem sucedida, por exemplo, com o Haemophilus influenzae b (Ver Patente dos E.U.A. n^fl. 4 496 538 de Gordon e Patente dos E.U.A. n^a. 4 673 574 de Anderson). Contudo, existem mais do que oitenta serotipos capsulares conhecidos de S. pneumoniae dos quais vinte e três são responsáveis pela maior parte das doenças. Para um conjugado polissacárido pneumocócico-proteína ser bem sucedido, os tipos capsulares, responsáveis pela maior parte das infecçoes pneumocócicas, têm de ser tornados imunogénicos, de um modo adequado, esta abordagem pode ser difícil porque os vinte e três polissacáridos

730

MIS:jc 6102-84

incluídos na vacina actualmente disponível não são todos adequadamente imunogénicos, mesmo em adultos.

Uma abordagem alternativa para a protecção de crianças, e também dos mais velhos, contra a infecção pneumocócica seria identificar os antigénios de proteína que podiam induzir imunorespostas protectoras. Estas proteínas podem servir como vacina por si só, podem ser usadas em conjunto com conjugados de polissacárido-proteína bem sucedidos, ou como portadores para polissacáridos.

Em McDaniel et al (I), J. Exp. Med. 160:386-397, 1984, descreve-se a produção de anticorpos de hibridoma que reconhecem polipéptido(s) da superfície celular do S. pneumoniae e a protecção de ratinhos, da infecção com certas estirpes de pneumococci encapsulados, usando estes anticorpos. Este antigénio de proteína de superfície tem sido designada por proteína de superfície pneumocócica A ou PspA como abreviatura.

Em McDaniel et al (II), Microbial Pathogenesis 1:519-531, 1986, descrevem-se estudos sobre a caracterização da PspA. Verificou-se uma diversidade considerável da molécula de PspA em estirpes diferentes, tal como diferenças nos epítopos reconhecidos por anticorpos diferentes.

Em McDaniel et al (III), J. Exp. Med. 165:381-394, 1987, refere-se que a imunização de ratinhos imunodeficientes ligados a X (XID) com pneumococos não encapsulados exprimindo PspA, mas não com pneumococos isogénicos sem PspA, protege os ratinhos da infecção fatal subsequente com pneumococos.

Em McDaniel et al (IV), Infect. Immun., 59:222-228, 1991, descreve-se a imunização de ratinhos com um fragmento recombinante de PspA, a todo o comprimento, que é capaz de induzir a protecção contra estirpes pneumocócicas dos tipos capsulares 6A e 3.

Em Crain et al, Infect. Immun., 56:3293-3299, 1990, descre-

73 730 MIS:jc 6102-84

$ -4- 4^ *

ve-se um antissoro de coelho que detecta a PspA em 100% (n=95) dos isolados, clínicos e de laboratório, de estirpes de S. pneumoniae. Quando se fizeram reagir com sete anticorpos monoclonais em relação ao PspA, cinquenta e sete isolados de S. pneumoniae exibiram trinta e um padrões diferentes de reactividade.

O tipo de proteína PspA é independente do tipo capsular. Parece que a mutação genética ou a modificação do ambiente tem permitido o desenvolvimento de um grande número de estirpes que são altamente diversificadas em relação à cápsula, PspA, e possivelmente em relação a outras moléculas com estruturas variáveis. A variabilidade das PspA de diferentes estirpes é também evidenciada pelas suas massas moleculares, na gama de 67 a 99 kD. As diferenças observadas são herdadas de um modo estável e não resultam da degradação de proteína.

A imunização com uma PspA, parcialmente purificada, de um clone Λ gtll recombinante, induziu protecção contra o desafio com várias estirpes de S. pneumoniae representando diferentes tipos capsulares e de PspA, tal como se descreve em McDaniel et al (IV), Infect. Immun. 59:222-228, 1991. Ainda que se tivessem construído clones, exprimindo PspA, de acordo com esse artigo, o produto era insolúvel e o isolamento a partir dos fragmentos celulares após a lise não era possível.

Enquanto a proteína tem uma estrutura variável para estirpes pneumocócicas diferentes, existem numerosas reacções cruzadas entre todas as PspA, sugerindo que podem estar presentes epítopos comuns suficientes para permitir que uma PspA simples ou, pelo menos, um pequeno número de PspA, induza protecção contra um grande número de estirpes de S. pneumoniae.

Para além da literatura publicada especificamente referida acima, os inventores, em conjunto com os seus colaboradores, têm publicado outros detalhes relativos às Psp, como se segue:

1. Resumos do 89th Annual Meeting of the American Society for Microbiology, pág. 125, item D-257, Maio de 1989;

2. Resumos do 90th Annual Meeting of the American Society

730

MIS:jc 6102-84 for Microbiology, pág. 98, item D-106, Maio de 1990;

3. Resumos do 3rd International ASM Conference on Streptococcal Genetics, pág. 11, item 12, Junho de 1990;

4. Talkington et al, Infect. Immun. 59:1285-1289, 1991;

5. Yother et al, J. Bacteriol. 174:601-609, 1992; e

6. Yother et al, J. Bacteriol. 174:610-618, 1992.

As três últimas publicações ocorreram após o depósito do pedido USSN 656773 anteriormente referido.

Na descrição que se segue e nos desenhos que a acompanham, utilizam-se certas abreviaturas aceites relativamente aos aminoácidos por elas representados. Na Tabela I seguinte identificam-se essas abreviaturas.

TABELA I

ABREVIATURAS DE AMINOÁCIDOS

A	=	Ala	=	Alanina	M	=	Met	=	Metionina
C	=	Cys	=	Cisteína	N	=	Asn	=	Asparagina
D	=	Asp	=	Ácido Aspártico	P	=	Pro	=	Prolina
E	=	Glu	=	Ácido Glutâmico	Q	=	Gin	=	Glutamina
F	=	Phe	=	Fenilalanina	R	=	Arg	=	Arginina
G	=	Gly	=	Glicina	S	=	Ser	=	Serina
H	=	His	=	Histidina	T		Thr	=	Treonina
I	=	Ile	=	Isoleucina	V	=	Vai	=	Valina
K		Lys	=	Lisina	w	=	Try	=	Triptofano
L	=	Leu	=	Leucina	Y	=	Tyr	=	Tirosina
SUMÁRIO	DO INVENTO

presente invento refere-se à preparação de mutantes da S. pneumoniae que segregam uma forma imunogénica truncada da proteína PspA, e ao isolamento e purificação da proteína segregada. A forma truncada da proteína PspA é imunoprotectora e contém os epítopos protectores da PspA. A proteína PspA é solúvel em solução fisiológica e pelo menos a região de ancoragem funcional da membrana da célula está ausente.

730

MIS:jc 6102-84

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 é uma representação esquemática dos domínios da

PspA madura;

a Figura 2 é a sequência de aminoácidos N-teriuinal da PspA, na qual as letras maiúsculas carregadas indicam os aminoácidos hidrofílicos carregados, as letras minúsculas designam os resíduos apoiares hidrofóbicos e as letras minúsculas carregadas, sublinhadas indicam os resíduos hidrofílicos polares não carregados;

a Figura 3 é a sequência de ADN do gene pspA com a sequência de aminoácidos deduzida para a proteína PspA;

a Figura 4 ilustra o mapa de restrição do pspA (Figura 4A) e o uso da mutagénese de inserção-duplicação para construir mutações no gene pspA (Figura 4B);

a Figura 5 mostra a sequência de aminoácidos deduzida para a região N-terminal da PspA e a localização geral de epítopos reconhecidos por anticorpos monoclonais;

a Figura 6 mostra a reactividade de anticorpos com fragmen tos de PspA produzidos por vários segmentos do gene pspA; e a Figura 7 mostra a localização em mapa de epítopos nos fragmentos de PspA produzidos pelos diferentes segmentos do gene pspA.

DESCRIÇÃO GERAL DO INVENTO

De acordo com um aspecto do presente invento é proporcionada uma proteína de superfície pneumocócica, imunoprotectora, purificada compreendendo uma forma truncada da PspA que contém os epítopos imunoprotectores da proteína e até cerca de 90% da proteína PspA completa e da qual a região de ancoragem funcional da membrana da célula está ausente.

Pela técnica da mutagénese de inserção-duplicação do gene pspA da estirpe Rxl de Streptococcus pneumoniae. com plasmídeos contendo fragmentos clonados do gene estrutural pspA. tem sido possível produzir fragmentos solúveis de PspA que são segregados por pneumococos.

Deste modo, noutro aspecto, o presente invento proporciona

730

MIS:jc 6102-84 um processo para a formação de uma proteína PspA truncada, imu-7 noprotectora, que compreende efectuar a mutagénese de inserção-duplicação de uma bactéria com um gene pspA, resultando na codificação de uma proteína PspA expressável, truncada, cultivar a bactéria mutada para efectuar a expressão de uma proteína PspA truncada, e isolar a proteína.

tamanho molecular da proteína PspA truncada, purificada, obtida, pode ser variado dirigindo o ponto de inserção, o que determina a terminação da expressão do gene, para pontos diferentes no gene pspA. Por exemplo, tem-se verificado que é útil um fragmento N-terminal com uma massa molecular aparente de 43 kD, constituindo aproximadamente metade da proteína nativa.

O segmento truncado que é produzido por este procedimento é capaz de induzir a protecção em ratinhos contra o desafio fatal com S. pneumoniae do tipo 3, demonstrando pela primeira vez que uma PspA purificada pode conferir protecção e que este segmento truncado da proteína contém os epítopos protectores da PspA.

A informação da sequência de aminoácidos foi obtida a partir de 45 aminoácidos do terminal N do segmento truncado da PspA. Na Figura 2 mostra-se esta sequência. A análise estrutural secundária previsível mostra que esta sequência tem uma formação helicoidal alfa muito forte, sem quaisquer inserções não helicoidais. Cerca de 51% do segmento é composto apenas por dois aminoácidos nomeadamente a lisina, um aminoácido carregado, e a alanina, um aminoácido não polar.

A análise desta sequência de 45 aminoácidos revela também que esta contém uma periodicidade de sete resíduos (ver Figura 2). Na PspA, a periodicidade começa com o resíduo 8 e estende-se ao longo de toda a sequência durante cerca de onze voltas da hélice. As posições a e d estão ocupadas por aminoácidos apoiares e as posições ”b, c e f contêm, geralmente, aminoácidos hidrofílicos. A posição ’’f é predominantemente ocupada por lisina. Tendo em conta estas observações, esta região da PspA está, muito provavelmente, numa configuração enrolada, de

730

MIS:jc 6102-84 enrolamento em hélice alfa.

Na Figura 5 mostra-se a sequência de

-8aminoácidos deduzida para a totalidade da região enrolada de enrolamento em hélice a.

Foi também clonada e sequenciada toda a região de codificação do pspA (ver Figura 3). A sequência de aminoácidos deduzida para a proteína PspA revela três regiões distintas da molécula PspA, que se mostram esquematicamente na Figura 1. Deste modo, num aspecto adicional do presente invento é proporcionada uma molécula de ADN recombinante biologicamente pura codificando a proteína PspA ou suas porções e possuindo uma sequência de codificação incluída na que se apresenta na Figura 3 ou possuindo uma homologia substancial.

A sequência de ADN do gene pspA está contida num fragmento HindIII-Kpnl com um comprimento de cerca de 2086 pares de bases. O próprio gene pspA representa, ele próprio, aproximadamente 1985 pares de bases deste fragmento, e compreende uma região inicial contendo sinais de transcrição e de tradução, iniciandose a tradução no ATG/met (posição de nucleótido 127, posição de codão -31), seguidos por uma sequência de comando que se estende do AAG/met (posição de nucleótido 127, posição de codão -31) até ao CGA/ala (posição de nucleótido 217, codão -1). A PspA madura começa com o aminoácido glu na posição de nucleótido 220 (codão +1) e termina com a paragem de tradução TAA/OCH na posição de nucleótido 1984. Este codão de paragem de tradução é seguido pelos sinais de terminação da.transcrição.

O terminal amino da sequência de proteína, previsto a partir da sequência de ADN da Figura 3, contém uma sequência de comando de 31 aminoácidos e uma sequência de 45 aminoácidos idêntica à sequência de 45 aminoácidos do terminal N da PspA (Figura 2). A extremidade amino da sequência de proteína prevista é altamente carregado e com uma natureza em hélice a. Esta região tem homologia com a tropomiosina ao nível dos aminoácidos (aproximadamente 22% de identidade e 50% de semelhança). Esta homologia é devida em grande parte a uma periodicidade de sete resíduos que se repetem, onde o primeiro e

730

MIS:jc 6102-84

-9o quarto aminoâcidos são hidrofóbicos, os aminoâcidos intervenientes são promotores de hélice e o sétimo aminoácido é carregado. Este padrão é consistente com o de uma molécula de enrolamento enrolado em hélice a e indica que o enrolamento em hélice α se estende desde o terminal N até metade da molécula. Na Figura 5 mostra-se a sequência de aminoâcidos de toda a região de enrolamento em hélice a.

A seguir à região em hélice carregada encontra-se uma região rica em prolina na qual 23 dos 81 aminoâcidos são prolinas. Imediatamente após a extremidade carboxilo da região rica em prolina encontra-se a primeira de dez repetições de vinte aminoâcidos altamente homólogas. A única região significativamente hidrofóbica na porção sequenciada da molécula começa na última repetição. Esta potencial região capaz de transpor a membrana contém vários aminoâcidos carregados precedendo o codão de paragem da tradução.

Os mutantes inactivados por inserção do S. pneumoniae, aos quais faltam as regiões de ancoragem do terminal C, são capazes de crescerem em meio definido quimicamente e segregam a porção N-terminal da proteína PspA para o meio. A região N-terminal da PspA é altamente solúvel no meio de cultura e é muito mais fácil de isolar do que a molécula inteira. As moléculas truncadas so< Λ lúveis têm sido produzidas usando mutagénese de inserção duplicação dirigida pelos fragmentos de ADN de PspA clonados que se mostram na Figura 4. A expressão da mesma construção truncada (com o promotor pneumocócico) em E. coli resulta na segregação do mesmo fragmento de PspA para o periplasma de E. coli. A PspA é separada facilmente do periplasma por lise hipotónica.

A PspA truncada é isolada do meio de cultura de pneumococos mutantes de qualquer modo conveniente, tal como por filtração de fluxo tangencial. Depois efectua-se uma cromatografia de permuta iónica, numa resina aniónica, para purificar a proteína. Neste procedimento, submete-se a solução contendo PspA a diálise a pH6, em solução salina 0,02M, e faz-se passar através da resina. A PspA é eluída de resina com um gradiente de força iónica de

730

MIS:jc 6102-84

0,08 a 2,0M e é recolhida na fracção com uma força iónica entre

0,34 e 0,87M, dependendo da natureza da coluna usada.

A PspA pode ser purificada adicionalmente por electroforese em dodecilsulfato de sódio-gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). A porção do gel contendo PspA é identificada por coloração do gel e a PspA é eluída a partir desta porção.

A purificação por electroforese é conveniente apenas quando se manipulam pequenas quantidades de PspA. Como alternativa, mais adequada para a produção em grande escala, a proteína pode ser purificada por cromatografia de tamanhos num tampão fosfato a pH7.

Uma vez que é possível obter a expressão da forma truncada da PspA para o meio de cultura, em oposição ao seu aprisionamento na parede celular o que torna a sua purificação muito mais complicada, é possível isolar outras proteínas, que foram clonadas no gene pspA truncado, construindo proteínas de fusão entre a PspA e outras proteínas. Uma tal técnica pode ser utilizada para melhorar a imunogenicidade ou conservar a conformação estrutural imunogénica ou a apresentação do produto de gene, para permitir que a proteína de fusão seja usada em imunização, que pode ser sistémica e/ou de mucosa, contra doenças.

Um exemplo de uma tal proteína de fusão é uma proteína de fusão da região N-terminal solúvel da PspA com a subunidade B da toxina da cólera. Também se podem formar proteínas de fusão por ligação química da proteína PspA truncada, com outras proteínas.

Deste modo, num seu outro aspecto, o. presente invento proporciona um processo para a produção de proteínas clonadas, que compreende a fusão de um gene pspA, codificando uma forma truncada da proteína PspA com o gene codificando outra proteína, para formar um clone de proteína de fusão, a transformação de S. pneumoniae, E. coli ou outra bactéria com o clone da proteína de fusão, a cultura da bactéria transformada para efectuar a expressão de uma proteína de fusão, compreendendo a PspA trunca-

730

MIS:jc 6102-84 da e a outra proteína, para o meio de cultura, e o isolamento da proteína de fusão.

-11Usando esta técnica, podem-se produzir proteínas clonadas em bactérias gram positivas tais como pneumococos, por exemplo, S. pneumoniae, e micobactérias, por exemplo, Bacilo de Calmette-Guerin (BCG). Esta abordagem permite resolver os problemas inerentes à produção de proteínas em bactérias gram negativas, tais como E. coli, usualmente usadas para clonação, em particular, a necessidade de purificar as proteínas recombinantes da endotoxina e a toxicidade de muitas sequências de ADN gram positivas em organismos gram negativos.

Para a expressão de uma proteína de fusão compreendendo a região solúvel N-terminal da PspA e a subunidade B da toxina da cólera (CTB), efectua-se uma fusão genética de um gene pspA, que codifica uma forma truncada da proteína PspA, com um gene ctxB codificando a subunidade B da toxina da cólera. Após a expressão da proteína de fusão, a PspA e a CTB podem ser separadas uma da outra, por ácido diluído, numa sequência asparagina-prolina, que se sabe ser lábil em ácido diluído, colocada por engenharia genética no sítio de fusão das duas proteínas.

É conhecido que a CTB é altamente específica para o mono-sinlogangliósido ()* D^este modo, a proteína de fusão PspACTB pode ser isolada do meio de cultura por adsorção a uma coluna de afinidade de Gjjj, a partir da qual a proteína de fusão pode ser subsequentemente eluída a pH baixo.

A proteína de fusão encontra uma utilidade considerável em ensaios de imunoadsorção em fase sólida. Usando a proteína de fusão é possível revestir suportes sólidos, tais como placas de microtitulação, com fragmentos de PspA sem ter de isolar primeiro os fragmentos de PspA. Isto pode ser realizado adicionando extractos bacterianos contendo a proteína de fusão a placas revestidas com G_M1. A proteína de fusão, PspA-CTB, liga-se então ao G_M1 através da porção CTB, revestindo desse modo o suporte sólido com PspA. O produto revestido resultante pode depois ser

730

MIS:jc 6102-84

-12usado num ensaio de imunoadsorção em fase sólida para a detecção de anticorpo anti-PspA ou de antigénio em amostras de teste. Estes ensaios de imunoadsorção constituem um aspecto adicional do presente invento.

A região de ancoragem/fixação da PspA, contendo a região rica em prolina, a região de repetição e/ou o terminal C da PspA, pode ser também utilizada para efectuar a expressão de proteínas heterólogas em pneumococos ou noutras bactérias, gram positivas ou gram negativas, nas quais a região de ancoragem/fixação é funcional. De um modo geral, a expressão é efectuada sobre a membrana bacteriana, as paredes da célula ou as superfícies da célula em bactérias gram positivas e no periplasma em bactérias gram negativas. Um exemplo de uma destas proteínas heterólogas é a subunidade B da toxina da cólera.

Tal como anteriormente se referiu, a forma truncada da PspA aqui proporcionada contém os epítopos imunoprotectores da proteína e, deste modo, é útil numa vacina contra a infecção pneumocócica. Assim, ainda num seu outro aspecto, o presente invento proporciona uma vacina contra a infecção pneumocócica compreendendo, como componente imunologicamente activo, a proteína de superfície pneumocócica, imunoprotectora, purificada, aqui proporcionada. A proteína PspA pode ser utilizada como componenC > te de uma vacina muiti-componente que é eficaz em conferir protecção contra várias infecçoes.

Adicionalmente, podem-se utilizar bactérias gram positivas que foram transformadas para exprimir o gene PspA codificando a proteína PspA truncada, solúvel, numa forma viva atenuada ou ...morta, como componente imunologicamente activo de uma vacina contra a infecção pneumocócica. Na bactéria transformada, este gene pspA pode estar fundido com um gene codificando outra proteína. Deste modo, num aspecto adicional do presente invento é proporcionada uma vacina contra a infecção pneumocócica compreendendo, como componente imunologicamente activo, uma bactéria, viva atenuada ou morta, contendo um gene codificando a forma truncada da PspA.

730

MIS:jc 6102-84

A forma truncada da PspA pode também ser utilizada em conjugados com moléculas que conferem protecção, que normalmente são fracamente imunogénicas ou não imunogénicas, tais como vários polissacáridos, para conseguir a sua potenciação imunogénica. Um aspecto adicional do invento é, deste modo, uma vacina compreendendo, como componente imunologicamente activo, um conjugado da proteína de superfície pneumocócica, imunoprotector purificada, aqui proporcionada, com uma molécula que confere protecção normalmente fracamente imunogénica ou não imunogénica.

As sequências conservadas do pspA, particularmente aquelas nas regiões ricas em prolina e/ou regiões de repetição do gene, podem ser utilizadas como sondas para detectar a presença de pneumococos de várias estirpes, pela detecção de ADN pneumocócico, em tecidos, fluidos corporais e /ou secreções. Similarmente, podem-se usar porções do gene pspA em conjuntos de diagnóstico para a detecção de infecções pneumocócicas.

Adicionalmente, podem-se usar iniciadores, construídos com base em sequências conservadas de pspA, particularmente naquelas das regiões ricas em prolina e/ou de repetições, para determinar a presença de pneumococos em tecidos, fluidos corporais e/ou secreções, pela amplificação de ADN pneumocócico. Em relação a este aspecto, pode-se usar um único par de iniciadores derivado da sequência de nucleótidos do gene pspA do S. pneumoniae num ensaio usando a reacção em cadeia de polimerase (PCR) para a detecção específica do Streptococcus pneumoniae.

Foi conseguida a amplificação específica de um fragmento de ADN, de 678 pares de bases, de S. pneumoniae da estirpe Rxl. Após 30 ciclos de amplificação, o amplímero era detectável por electroforese em gel de agarose. O fragmento foi amplificado com sucesso em todas as 32 estirpes de S. pneumoniae testadas. A amplificação de ADN por PCR foi capaz de detectar menos do que um total estimado de 20 picogramas de ADN genómico pneumocócico.

Os iniciadores LSM1 e LSM2, com a sequência de nucleótidos: LSM1 5·-CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC-3·

730

MIS:jc 6102-84 —14 —

LSM2 5'-GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3' amplificaram o produto de 678 pares de bases do pspA, do nucleótido 1312 a 1990 da sequência pspA Rxl (Figura 3).

A análise por PCR, usando os iniciadores que aqui se descrevem, é realizada de acordo com as técnicas de PCR convencionais, tais como as que se descrevem na literatura, por exemplo, como se descreve em Arnhem et al. em C&EN Special Report, 36, 1 de Outubro de 1990. Para efeitos de detecção, o iniciador pode ser marcado ou podem-se incluir mucleótido-trifosfatos marcados na reacção de PCR para marcar o produto de amplificação por PCR.

Os iniciadores de PCR podem ser preparadas por métodos bem conhecidos, por exemplo, por síntese de oligonucleótidos ou por fragmentação de uma sequência de nucleótidos maior usando enzimas de restrição adequadas.

A capacidade para usar um único iniciador capaz de detectar um grande número de estirpes de S. pneumoniae permite a utilização de um conjunto de detecção por PCR universal, que é capaz de diagnosticar a infecção por pneumococos em mamíferos, incluindo humanos, independentemente da estirpe que provocou a doença.

ESTIRPES, PLASMÍDEOS E SONDAS

Nos Exemplos que se seguem, bem como nos desenhos, faz-se referência a certos plasmídeos e a estirpes bacterianas transformadas com estes plasmídeos, bem como a segmentos de ADN de vector, alguns dos quais foram depositados na ATTC sendo todos aqui totalmente descritos. Na Tabela II seguinte apresenta-se um sumário destes materiais.

(Segue Tabela II)

730

MIS:jc 6102-84

-15TABELA II

Identificação JY4313	Tipo Estiroe de E. coli	Descrição ADN de PspA	Depós i to ATCC 68529	Localizaçao Fig. 1
JY2008	EstirDe de S. pneumoniae	Fragmento de PspA de 43 kDa	ATCC 55143	Fig. 1
JY4306	Estirpe de E. coL i	Fragmento de PspA de 43 kDa	ATCC 68522	Fig. 3
JY4310		Fragmento de PspA de 21 kDa	Nenhum	Fig. 7
JY4285		Fragmento de PspA de 18 kDa	Nenhum	Fig. 7
pJY4163	Plasmídeo	Plasmídeo de expressão usado para expressão de proteína de fusão PspA-CTB (29 kDa)	Nenhum	Fig. 6
JY4323	Sonda de ADN	Seçjnento Hindi 11 -Kpal	Nenhum	Fig. 9
JY4306	Sonda de ADN	Segmento Hindi11-Dra-1	Nenhum	Fig. 9
JY4262	Sonda de ADN	Segmento BcII-Bst-NI	Nenhum	Fig. 9

EXEMPLOS

Exemplo 1

Este Exemplo ilustra a preparação e cultura de novas estirpes de S. pneumoniae.

A estirpe Rxl de S. pneumoniae, que é um derivado não encapsulado da estirpe D39 capsular do tipo 2 (National Collection of Type Cultures, Londres, # NCTC 7466), foi submetida a inactivação por inserção (tal como se descreve em McDaniel et al (III) 1987, Crain et al 1990, Talkington et al 1991, com 10 fragmentos clonados diferentes de PspA (ver Figura 4). Todos es73 730

MIS:jc 6102-84

tes fragmentos foram obtidos a partir de digeridos de restrição de ADN de PspA clonado sobre um plasmídeo em E. coli. estirpe JY4313 (depositado na American Type Culture Collection em 31 de Janeiro de 1991, com o número de acesso ATCC 68529). esta mutagénese de duplicação por inserção (ver Figura 4), resulta na terminação da expressão do gene próximo da extremidade 3' do fragmento clonado. Uma das estirpes resultantes, a JY2008, (depositada no American Type Culture Collection em 24 de Janeiro de 1991, com um número de acesso 55143), que foi produzida por um fragmento de ADN codificado no pKSD300 (McDaniel et al., (III) 1987), produz um fragmento de PspA de 27 kDa (massa molecular aparente de 43 kDa). Este fragmento tem aproximadamente 40% do tamanho da proteína nativa de 65 kDa (tamanho aparente de 84 kDa).

O tamanho molecular esperado é baseado na sequência de aminoácidos deduzida e o tamanho molecular aparente é baseado na migração em SDS-PAGE. A diferença entre o tamanho molecular esperado e o aparente é devido à conformação do fragmento de PspA.

As regiões de prolina e de repetições/ancoragem (ver Figura 1) foram submetidos a delecção e, devido à sua ausência, a proteína resultante era incapaz de se ligar à célula. A proteína não ligada pode ser depois isolada a partir dos sobrenadantes de cultura como a seguir se descreve.

Dirigindo a inserção a diferentes partes no gene pspA, podem-se produzir derivados de proteína PspA não ligada, truncada, com diferentes comprimentos, tal como se mostra na Figura 7.

A estirpe pneumocócica JY2008 foi cultivada em 6 litros de um meio definido quimicamente (ver Inf. Imm. 27:444) suplementado com 0,10% de cloreto de colina, 0,075% de hidrocloreto de L-cisteína e 0,25% de NaHCOg. Colheu-se o fluido sobrenadante da cultura de JY2008 na fase semi-logarítmica, usando um filtro de membrana de 0,22 /xm de fluxo tangencial e concentrou-se 60 ve zes .

730

MIS:jc 6102-84

-17Por introdução do plasmídeo pKSD300 na estirpe D39 não modificado, obteve-se, de um modo similar, a proteína PspA truncada de 43 kD. Por introdução do plasmídeo pKSD300 na estirpe WU2 de S. pneumoniae do tipo 3 (proteína Psp com aproximadamente 92 kD) obteve-se, após crescimento do organismo, uma proteína PspA truncada não ligada com um tamanho molecular de aproximadamente 46 kD.

Exemplo 2

Este Exemplo ilustra a purificação da PspA.

O fluido sobrenadante concentrado, produzido como se descreveu no Exemplo 1, foi lavado em PBS O,1M, pH 7,2, e ultra-centrifugado a 196 OOOxg. Diluiu-se o fluido sobrenadante 1:5 em tampão de L-histidina 20 mM-NaCl, ajustou-se o pH a 6,0 e injectou-se numa coluna de permuta iónica com fibra DEAE Isonet-D2.

Aplicou-se à coluna um gradiente em degrau de NaCl, de 80 mM a 2M e recolheram-se as fracções contendo PspA (força iónica de 0,32 a 0,64M) e separaram-se num gel de SDS-poliacrilamida· As proteínas sobre uma secção representativa do gel foram manchadas com azul de comassie R-250 para identificar a PspA. A fracção contendo PspA foi excisada do restante do gel-SDS e electroeluída do gel excisado. Precipitou-se a proteína eluída num solvente de metanol:acetona 50:50 e ressuspendeu-se em PBS. A pureza do produto foi confirmada por coloração com prata e imunotransferência de Western com mAb XÍ126 (IgG 2b, k, ver McDaniel et al (I), supra).

Exemplo 3..... ................

Este Exemplo ilustra o isolamento do PspA a partir do espaço periplasmático de Escherichia coli.

isolamento a partir do espaço periplasmático de E. coli foi realizado por técnicas convencionais. À estirpe de E. coli JY4306 (que produz o fragmento N-terminal de 43 kDa da PspA, cuja sequência de aminoâcidos se mostra na Figura 3; esta estirpe

730

MIS:jc 6102-84

foi depositada na ATCC em 31 de Janeiro de 1991 com o número de acesso 68522) foi lavado em solução salina tamponada, incubada em meio com 20% de sacarose, EDTA 10 mM, Tris 25 mM, pH 7,7, durante 10 minutos a 0°C. As células foram depois agitadas a 400xg durante 10 minutos a 0’C. Removeu-se todo o sobrenadante do sedimento e ressuspendeu-se o sedimento rapidamente em cerca de 100 volumes de água a 4°C. Após 10 minutos, centrifugou-se a suspensão a 4000xg durante 10 minutos a 4’C. Rejeitou-se o sedir mento e guardou-se o sobrenadante que continha a PspA. A concentração do sobrenadante foi realizada por procedimentos convencionais tais como concentração contra sacarose sólida ou ultrafiltração. A purificação da proteína isolada a partir de E. coli foi realizada pelas mesmas técnicas de cromatografia usadas para o isolado da PspA (truncada) de 43 kDa, dos meios de cultura de pneumococos.

Exemplo 4

Este Exemplo ilustra as propriedades imunogénicas da proteína PspA.

Sangraram-se dezasseis ratinhos CBA/N, com 7 semanas de idade, contendo a mutação Xid (Laboratórios Jackson, Bar Harber, ME, E.U.A.) pelo seio periorbital para estabelecer os níveis de pré-exposição de anticorpo à PspA. Emulsionou-se PspA purificada, preparada como se descreveu no Exemplo 2, em adjuvante de Freund completo e injectou-se subcutaneamente nas regiões inguinal e axilar, com aproximadamente 5 μg de proteína por ratinho. Catorze dias mais tarde, injectaram-se os ratinhos intraperitonealmente com 5 μ-g de PspA, preparada como se descreveu no Exemplo 2. Imunizaram-se ratinhos de controlo pelas mesmas vias com tampão de SDS estéril. Sete dias após a última imunização, todos os ratinhos foram sangrados pelo seio periorbital e foram desafiados intravenosamente com 300 CFU da estirpe WU2 do tipo 3, cultivada como se descreveu no Exemplo 1.

Analisaram-se os soros de pré-imunização e de pré-desafio por imunotransferência de Western para estabelecer a linha de base e a resposta pós-imunização à proteína truncada.

730

MIS:jc 6102-84

Submeteu-se a PspA da estirpe WU2 a electroforese e transferiu-se para membranas de nitrocelulose. Separaram-se as membranas em tiras e sondaram-se com os anti-soros de ratinho apropriados numa diluição de 1:50 durante 2 horas, incubaram-se com imunoglobulina de cabra anti-ratinho biotinilada durante 1 hora, lavaram-se e incubaram-se com fosfatase conjugada com Strepavidina. As membranas foram reveladas com sal de toludina de fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indoílo com 0,01% em azul de tetrazolio.

Dos oito ratinhos CBA/N imunizados com o fragmento de PspA purificado estavam todos vivos 14 dias após o desafio com estirpe WU2 e nenhum mostrou quaisquer sinais de doença após o desafio. Dos oito ratinhos imunizados com controlos de tampão, seis morreram dois dias após o desafio, enquanto que os dois ratinhos de controlo restantes apareceram muito doentes, com o pêlo eriçado, dorso arqueado e movimentos reduzidos dois a três dias após o desafio, mas sobreviveram. A análise do Qui-quadrado indicou que existia uma diferença significativa (p < 0,003) em sobrevivência entre os grupos imunizados e de controlo.

Os soros de pré-imunização e de pré-desafio foram analisados por imunotransferência de Western. Nenhum dos soros de pré-imunização continha anticorpo em relação à PspA truncada. Os soros de pós-imunização de todos os oito ratinhos continham anticorpos detectáveis em relação ao PspA enquanto que seis deles tenham reacções anti-PspA muito fortes. Quando a estirpe WU2 de desafio foi sondada com os antissoros, todos os ratinhos imunizados tinham anticorpos que eram muito reactivos de um modo cruzado, com os epítopos de PspA de WU2. Nenhum dos ratinhos de controlo desenvolveu anticorpos em relação à PspA.

Na Tabela III seguinte resumem-se os resultados obtidos nos testes de imunização:

(Segue Tabela III)

730

MIS:jc 6102-84

-20Tabela III

Imunogénio	Detecção de	Vivos 2	Vivos 14
	anticorpo em	dias após	dias após
	relação à PspA	o desafio	o desafio

PspA isolada (Exemplo 2) SDS estéril (Controlo)

8/8

0/8

8/8 8/8

2/8 2/8

Como se pode observar pelos valores na Tabela III, a imunização com duas doses de 5 pg da molécula de PspA purificada conferiu protecção contra a infecção fatal de ratinhos CBA/N e induziram a formação de anticorpos reactivos com a PspA da estirpe de desafio.

Exemplo 5

Este Exemplo ilustra a sequenciação da proteína PspA.

A PspA purificada preparada como se descreveu no Exemplo 2, foi submetida a electroforese, através de geles de resolução a 9% contendo SDS recristalizado, com sistema de tampão de Laemmli (Nature 227:680). Os geles foram lavados duas vezes numa solução 10 mM de ácido 3-(ciclo-hexilamino)-1-propanossulfónico, pH 11,0, contendo 10% de metanol, durante 10 minutos. Submergiu-se totalmente, durante vários segundos, em metanol a 100%, uma membrana de difluoreto de polivinilideno e, depois, lavou-se em tampão CAPS durante 10 minutos. A PspA foi electrotransferido para a membrana de PVDF em tampão CAPS a 0,5 A durante 1 h. Após a transferência, a membrana foi lavada duas vezes em água desionizada durante 5 minutos e corada com 0,1% de Azul de Comassie R-250 em metanol a 50% durante 20 minutos. A secção da membrana contendo PspA foi excisada e descolorada em metanol a 40% e ácido acético a 10% durante 5 minutos. A membrana foi cortada em pequenos segmentos que foram armazenados em tubos Eppendorf esterilizados até à sequenciação.

730

MIS:jc 6102-84

-21A PspA isolada foi sequenciada directamente a partir das membranas de PVDF. Na Figura 2 representa-se a sequência de aminoácidos de 45 resíduos do terminal N e na Figura 5 representa-se a sequência de aminoácidos para a região em hélice alfa inteira. A sequência de ADN do gene pspA inteiro e a sequência de aminoácidos deduzida para a proteína PspA estão representadas na Figura 3.

Exemplo 6

Este Exemplo ilustra o uso da sequência 5' do pspA e/ou da região N-terminal da PspA para servir como uma sequência de expressão e uma sequência de comando para a expressão e/ou excreção/secreção de proteínas heterólogas de S. pneumoniae e E. coli. Neste exemplo descreve-se a expressão do terminal N da proteína PspA fundida com a subunidade B da toxina da cólera (CTB) através de uma fusão genética e a excreção da proteína fundida de pneumococos e a sua secreção para o espaço periplasmático de E. coli.

Construiu-se uma proteína de fusão consistindo de CTB e da metade N-terminal da PspA e exprimiu-se em E. coli. O fragmento HindiIIZDral do gene pspA usado continha todos os sinais de iniciação da tradução e a sequência de comando do péptido de sinal da PspA para o transporte através da membrana celular. Prevê-se que a PspA madura codificada por este fragmento seja um produto de 29 kDa (massa molecular observada de 42 kDa), contendo mais do que 90% do domínio de enrolamento em hélice α enrolado. O fragmento de'CTB usado não possuía os sinais de iniciação da transcrição e tradução. A expressão do promotor do pspA através do pspA e depois a leitura com tradução no quadro do gene codificando o gene ctxB codificando a CTB resultou na produção de um produto de CTB de 12 kDa fundido com o produto PspA a montante. A proteína de fusão PspA-CTB era expressa de um modo estável em ambos os plasmídeos de número de cópias alto e baixo (pUC18, mais do que 100 cópias/célula; pJY4163, cerca de 15 a 30 copias/célula) em E. coli.

Os produtos de fusão tinham o tamanho esperado (cerca de 54

730

MIS:jc 6102-84

kDa) e reagiram com ambos os anticorpos de PspA e de CTB. O facto de o produto de CTB ter mantido a sua funcionalidade foi demonstrado pela capacidade da proteína de fusão em se ligar ao gangliósido , uma propriedade da CTB.

O nível elevado de expressão do produto de fusão resultou aparentemente numa velocidade reduzida de processamento e/ou de modificações conformacionais que impediam que a proteína fosse completamente transportada para o periplasma. Contudo, na construção com número de cópias mais baixo, cerca de 60% da proteína de fusão estava localizada no periplasma, a partir do qual se libertaram facilmente grandes quantidades em E. coli por choque osmótico.

Para além da expressão em E. coli, a proteína de fusão foi também expressa em S. pneumoniae por transformação da construção de número de cópias baixo no S. pneumoniae Rxl avirulento para gerar um mutante de inserção-duplicação. Desta forma, o gene codificando a proteína de fusão foi integrado no cromossoma do S. pneumoniae a partir do qual foi expressa de um modo estável. Como no caso do Exemplo 1, a molécula de PspA truncada, da qual estão ausentes a região de fixação/ancoragem, desta vez na forma de uma proteína de fusão PspA-CTB, foi excretada para o sobrenadante de cultura. O produto de proteína de fusão tinha o tamanho molecular esperado (54 kDa), reagia com os anticorpos em relação à PspA e à CTB, e ligava-se ao G_M1·

Exemplo 7

Este Exemplo ilustra o uso da região de fixação ou de ancoragem da PspA para permitir a expressão de proteínas heterólogas sobre a superfície de S. pneumoniae ou de outras bactérias, nas quais a sequência de fixação/ancoragem é funcional, em particular, a expressão de uma proteína de fusão PspA-CTB (subunidade B da toxina da Cólera), expressa sobre a superfície de pneumococos.

A região de codificação N-terminal da PspA, incluindo os seus sinais de iniciação de transcrição e de tradução e a sua

730

MIS:jc 6102-84

sequência de comando do péptido de sinal, está ligada, através de uma fusão genética com tradução no quadro, ao fragmento ctxB codificando a CTB, ao qual faltam os sinais de início de transcrição e tradução e de terminação. Esta sequência é seguida no quadro pelo domínio de fixação/ancoragem da PspA, incluindo parte ou a totalidade dos domínios de prolina, de repetição e C-terminal. A proteína de fusão resultante é dirigida para o exterior de célula pela sequência de comando de PspA, que é limpa após o transporte através da membrana, e depois ligada à célula pela sequência de fixação/ancoragem de PspA. A proteína heteróloga, localizada entre os dois fragmentos de PspA é expressa sobre a superfície exterior da membrana e, no 5. pneumoniae, sobre a superfície de célula.

Exemplo 8

Este Exemplo ilustra a expressão de PspA, truncada e a todo o comprimento, pela estirpe de Mvcobacterium tuberculosis, Bacilo Calmette-Guerin (BCG).

O BCG foi modificado cromossomicamente para incorporar o gene pspA codificando a proteína PspA truncada. A proteína PspA truncada de 43 kDa foi expressa, a partir do BCG modificado, numa percentagem de aproximadamente 15% da proteína de BCG total. este resultado foi conseguido com uma construção de vector de expressão, contendo o segmento do gene pspA codificando a região de 43 kDa, sem o seu sinal de secreção 5'. A expressão foi de apenas cerca de 1% da proteína de BCG quando se incluíram as sequências de sinal de PspA ou de micobactéria. Em qualquer dos casos foi excretado para o meio uma porção significativa da PspA expressa. A expressão da proteína PspA de 43 kDa numa fusão com a sequência de sinal de lipoproteína micobacteriana resultou na expressão da PspA recombinante na fracção da membrana do BCG.

Este último resultado sugeriu que a fusão da sequência de sinal de lipoproteína resultou na acilação da PspA recombinante. A selecção de células activadas fluorescentes com anticorpos monoclonais em relação à PspA, conjugados com fluorocromo, demonstrou a expressão da PspA sobre a superfície destas bactérias.

730

MIS:jc 6102-84

-24Exemplo 9

Este Exemplo ilustra a homologia próxima de porções do gene pspA de entre diferentes estirpes de pneumococos, e o potencial que esta homologia pode ter para abordagens moleculares (ADN) para detectar pneumococos em tecidos, fluidos corporais e/ou secreções e para identificar o crescimento de pneumococos em amostras de pacientes.

Utilizaram-se três sondas de ADN, nomeadamente, pspA a todo o comprimento, JY4323 (HindIII N-terminal até Kpnl C-terminal), a metade N-terminal de pspA JY4306 (HindIII N-terminal até Dral na posição 996 (ver Figura 3)) e a maior parte das regiões de prolina e de repetição, JY4262 (Bcll na posição 1221 até BstNI na posição 1823). Sob condições de rigor requerendo 95% de identidade, as sondas JY4323 e JY4262 reagiram com células de mais do que 200 isolados independentes de S. pneumoniae, tal como foi determinado por transferência de Southern.

Quando se cortou o ADN cromossómico com HindIII, de um modo

geral, observou-se que cada uma destas sondas detectou duas bandas discretas cujo tamanho exacto dependia da estirpe examinada. Para o pneumococos Rxl as duas bandas tinham 4,0 e 9,1 kb. A banda de 4,0 kb correspondia ao pspA e estava alterada ou ausente em mutantes de pspA. As outras bandas partilham alguma homologia com as regiões de codificação para ambas as metades N-terminal e C-terminal da PspA não sendo afectadas pelas mutações de pspA. As sondas JY4323 e JY4262 não conseguiram reagir com uma outra bactéria gram positiva, o Streptococcus pyoqenes e com uma bactéria gram negativa, a Salmonella typhimurium. A sonda N-terminal, JY4306 reconheceu cerca de um terço das estirpes de pneumococos testadas.......

Estes resultados indicam que uma sequência incluída na região de prolina/repetições é partilhada por todas as estirpes de pneumococcos e, aparentemente, não por outras espécies bacterianas. As sequências na metade N-terminal da molécula parecem ser mais variáveis.

730

MIS:jc 6102-84

-25Exemplo 10

Este Exemplo ilustra a detecção e a determinação da localização de epitopos na região N-terminal em hélice a da PspA.

Usaram-se anticorpos monoclonais, protectores contra a infecção pneumocócica num modelo de ratinho, indicados com um asterisco nas Figuras 5, 6 e 7, para determinar a localização de epitopos para cada anticorpo na região N-terminal em hélice α da PspA. Os sítios foram localizados em fragmentos de PspA. Nas Figuras 5 a 7, ilustram-se os resultados, mostrando-se na Figura 5, a sequência de aminoácidos deduzida para a região N-terminal da PspA e a localização geral de epitopos reconhecidos por anticorpos monoclonais, na Figura 6, a reactividade de anticorpos com os fragmentos de PspA produzidos por vários segmentos do gene pspA e, na Figura 7, a localização em mapa de epitopos nos fragmentos de PspA produzidos pelos diferentes segmentos do gene pspA.

Os números 138, 193 e 261 na Figura 5 indicam as posições de quebra nos fragmentos de PspA usados para determinar a localização dos epitopos detectados pelos anticorpos monoclonais XÍ1526, XÍ126, XÍR35, XÍR38, XÍR1224, XÍR16, XÍ64, XÍR278, XÍ1325 e XÍ1323. O asterisco (*) a seguir a alguns dos anticorpos indica aqueles que são capazes de conferir protecção contra a infecção pneumocócica fatal com pneumococos da estirpe WU2.

Adicionalmente, as linhas verticais à direita da Figura indicam aquelas áreas que se' prevê terem uma estrutura de enrolamento em hélice a enrolada. As divisões à direita da Figura indicam o mapa de localização dos epitopos para cada anticorpo.

SUMÁRIO DA DESCRIÇÃO

Como sumário da presente descrição, o presente invento refere-se a uma molécula de PspA truncada capaz de induzir uma resposta imunoprotectora e deste modo contendo os epitopos protectores da proteína PspA. São possíveis modificações dentro do âmbito do invento.

Claims (45)

1. REIVINDICAÇÕES

   1 - Proteína de superfície pneumocócica (PspA) imunoprotectora purificada, caracterizada por compreender uma forma truncada de PspA que contém os epítopos imunoprotectores da proteína e até cerca de 90% da proteína PspA completa e da qual a região de ancoragem funcional da membrana da célula está ausente.
2. 2 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por conter aproximadamente 50% da proteína PspA completa, da qual a região de ancoragem da membrana da célula, a região de repetição e a região de prolina estão ausentes.
3. 3 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender, pelo menos, a região N-terminal, contendo o epitopo protector, da proteína PspA.
4. 4 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender, pelo menos, a região N-terminal, contendo o epitopo protector, da proteína PspA, possuindo os seguintes domínios:

   65,380 Da

   C a u ri a ^H2^N^lo-J1RFC,Y»/itEIJCOIDAL |pROLINAs| REPETIÇÕES

   664 pb 243 pb 606 pb 51 pb

   32,137 Da 8,799 Da 22,632 Da ΙΘ64 Da
5. 5 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender uma região N-terminal, de enrolamento em hélice α da proteína PspA completa.
6. 6 - Proteína de acordo com a reivindicação 5, caracterizada por a região de enrolamento em hélice α ter uma peridiocidade de sete aminoácidos.

   73 730

   MIS:jc 6102-84 —27—
7. 7 - Proteína de acordo com a reivindicação 1, caracterizada por compreender a região N-terminal de 43 kD (tamanho molecular aparente) de uma proteína PspA de 84 kD.
8. 8 - Molécula de ADN recombinante biologicamente pura, caracterizada por codificar pelo menos uma porção da proteína e possuir uma sequência de codificação incluída na seguinte sequência:

   1 A AG / CCT 1 ATG ATA TAG AAA TTT GTA ACA AAA 31 A Τυ / T A A 11 TAT AAA ACA CTT GAC AAA TAT TTA .61 / 21 91 / 31 CGG AGG AGG CTT ata CTT A A Γ ATA AGT A TA GTC TGA AAA TGA CTA TCA GAA AAG AGG TAA 121 / 41 151 / SI ATT T A G ATG AAT AAG AAA AAA ATG ATT TTA ACA AGT CTA GCC AGC GTC GCT ATC TTA GGG met asn lya lys lyi met lia leu thr aar lau ala aer ral ala lia leu gly !9I / 61 211 / 71 GCT GGT' TTT GT7 GCG TCT CAG CCT ACT GTT GTA A G A GCA GAA GAA TCT CCC GTa GCC AGT âld gly 3 n a «al ala ser gin pro thr vai ral arg ela glu glu tar pro v al ala ser 24) / 61 271 / 91 CAG TCT AA A GCT GAG AAA GAC TAT GAT GCA GCG AAG AAA GAT GCT AAG AAT GCG AAA AAA gin ser ly» ala glu lys asp tyr asp ale ala lys lyi e>P ata lyi asn ala lys lys 30) / 101 331 1 111 GCA gta GAA G A i GCT CAA A A G GCT TTA G A T GAT GCA AAA GCT GCT CAG AAA AAA TAT GAC a (a al glu 5Í·? ale j In lys ala leu eip asp ala lys ela ala gin lyi lu· tyr aap 361 / 121 391 / 131 GAG GAT CAG A A G AAA ACT GAG GAG AAA GCC GCG CTA GAA AAA GCA GCG TCT GAA GAG ATG glu esp gin lyi lys tnr glu glu lys ala ala lau glu >u» ala ala ser glu glu mat 421 / Ml 451 l 151 GAT AAG GCA GTG GCA GCA GTT CAA CAA GCG TAT CTA GCC TAT CAA CAA GCT ACA CAC AAA 819 lys ala vai ala ala vai gin gin ala tyr leu ala tyr ;ln gin ala thr asp lu» 461 / 161 511 / 171 GCC GCA AAA GAC GCA GCA GAT AAG ATG ATA GAT GAA GCT AAG AAA CGC GAA GAA GAG GCA ale 541 ala / lyi iai asp ala ala asp lys met Ile aap 571 glu / ala 191 lys 'u« arg glu glu glu ala A AA ACT AAA TTT AAT ACT GTT CGA GCA ATG GTA GTT CCT GAG CCA GAG CAG TTG GCT GAG iys tnr lyi phe asn thr vai arg ala met «al ral pro glu pro glu gin lau ala glu 601 / 201 631 / 211 ACT AAG AAA AAA TCA GAA GAA GCT AAA CAA AAA GCA CCA GAA CTT ACT AAA AAA CTA GAA thr lys Igs lyS ser glu glu ala lyi Qln lys ala pro glu leu thr lyi tys leu glu 65: / 221 691 / 231 GA A GCT AAA GCA AAA TTA GAA GAG GCT GAG AAA AAA GCT ACT GAA GCC AAA C A A AAA GTG g:u ala lys ala lys leu glu glu ele giu igs lys ala tnr glu ala lys g In iys ral 721 / 241 751 / 251 GAT GCT G A A GAA GTC GCT CCT CAA GCT AAA ATC GCT GAA TTG GAA AAT CAA GTT CAT AGA asp ala glu glu vai e la pro gin ala lys Ile ala glu lau glu asn gin vai hls arg 761 / 261 ati / 271 CTA Ga A CAA GAG CTC AAA G A G ATT GAT GAG TCT GAA TCA GAA CAT TAT GCT AAA GAA GGT ;eu g lu gin glu leu lys glu Ile asp g lu ser glu ser glu asp tyr ala lys glu giy 641 / 2dl 871 / 291 TTC CCT GCT CCT CTT CAA TCT AAA TTG GAT GCG AAA AAA GCT AAA CTA TCA AAA CTT GAA pna arg ale pro lau gin ser lys 'lau asp ala lys lys ala lys leu ser lys leu glu 901 / 301 931 / 311 CAG TTA AGT GAT AAG ATT GAT GAG TTA GAC GCT GAA ATT GCA AAA CTT GAA GAT CAA CTT g lu leu ser asp lys ile asp glu leu asp ala glu Ile ala lys leu glu asp gin leu 961 / 321 991 / 331 A AA GCT GCT GAA GAA AAC AAT AAT GTA GAA GAC TAC TTT AAA GAA GGT TTA GAG AAA ACT lys ala ala glu glu asn asn asn vai glu aso tyr phe lys glu giu leu glu iys thr 1021 / 341 1051 / 351 ATT . GCT GCT AAA AAA GCT GAA TTA GAA AAA ACT GAA GCT GAC CTT AAG AAA GCA GTT AAT Ile ala ala lys lys ala glu leu glu lus tnr glu ela asp leu lys lys ala vai asn 1061 / 361 nu / 371 GAG CCA G A A AAA CCA GCT CCA GCT CCA b A A ACT CCA GCC CCA GAA CCA CCA GCT GAA CAA glu pro giu lys pro ele pro ale pro glu Inr pro ele pro glu ala pro ala glu gin 1141 / 381 1171 / 391 CCA A AA CCA GCG CCG GCT CCT CAA CCA GCT CCC GCA CCA AAA CCA GAG AAG CCA GCT GAA pro lys pro a la pro ala pro gin pro ala pro ale pro lys pro glu lys pro ela glu 1201 / 401 1231 / 411 CAA CCA AAA CCA CAA AAA ACA GAT GAT CAA CAA CCT GAA GAA GAC TAT GCT CGT AGA TCA gin pro lys pro glu lys thr asp asp gin gin ala GLU glu asp tyr ala arg arg ser 1251 / 421 1291 / 431 GA A G A A GAA TAT AAT GGC TTG ACT CAA CAG CAA CCG CCA AAA CTT CAA AAA CCA GCT CCT glu glu glu tyr asn erg leu thr gin gin gin pro pro lys ala glu tu» pro ala pro 1321 / 441 1351 / 451 GCA CCA CCA ACA GGC TGG AAA CAA GAA AAC GGT ATG TGG TAC TTC TAC AAT ACT GAT GGT ais pro lys thr glg trp lys gin giu asn gly met trp tyr phe tyr asn thr asp gly

   73 730

   MIS:jc 6102-84

   1381 / 461 1411 / 471 TCA A T G GCG A C A G 3 A TGG CTC C A A AAC AAC GGT TCA TGG TAC TAC CTC AAC· AGC AAT GGT sar mel ala thr giy trp leu Gin asn asn giy ser trp tyr tyr 1011 asn ser asn giy 1441 / 481 1471 / 491 GCT A TG GCT ACA G3T TGG CTC C A A TAC AAT GGT TCA TGG TAT TAC CTC AAC GCT AAC GGC ela mel ala th r giy tr? leu gin tyr asn giy sar trp tyr tyr leu asn ala asn giy 1501 / 501 1531 / 511 GCT ATG GC A ACA GGT TGG GCT A A A GTC AAC GGT TCA TGG TAC TAC CTC AAC GCT A A T GGT a la mel ala th r gly tr? ala l'_as vai asn giy ser trp tyr tyr leu asn ala asn giy 1561 / 521 1591 / 531 GCT ATG GCT ACA GGT TGG CTC C A A TAC AAC GGT TCA TGG TAT TAC CTC AAC GCT AAC GGC ala met a la thr giy tr? leu gin tyr asn giy ser trp tyr tyr ie u esn ala asn giy 1621 / 541 1651 / 551 GCT ATG GCA ACA GGT TGG GCT A A A GTC AAC GGT TCA TGG TAC TAC CTC A A C GCT AAT GGT ala met ala thr gly tr? a ia lys vai asn giy sar trp tyr tyr leu asn ala asn gly 1661 / 561 1711 / 571 GCT ATG GCT ACA GGT TGG CTC CAA TAC AAC GGT TCA TGG TAC TAC crc AAC GCT AAC 3 G a la mel ala tnr gly trp leu gin tyr asn giy ser trp tyr tyr leu asn ela asn gly 1741 / 581 1771 / 591 GCT ATG GCT ACA GGT TGG GCT A AA GTC AAC GGT TCA TGG TAC TAC CTC AAC GCT AAT GG ala mel ala thr giy trp ala lys vai asn giy ser trp tyr tyr leu asn ala asn gly 1801 / 601 1831 / 611 GCT ATG GCA ACA GGT TGG GTG A A A GAT GGA GAT ACC TGG TAC TAT CTT GAA GCA TCA GGT ala mst ale thr giy trp vai iys asp gly asp ser trp tyr tyr leu glu ala ser giy 1861 / 621 1891 / 631 GCT ATG A A A GCA AGC CA A TGG TTC A AA GTA TCA GAT A A A TGG TAC TAT GTC AAT GGT TTA ala met lys ala ser gin trp pna lys vai ser asp iys trp tyr tyr vai esn s!y leu 1921 / 641 1951 / 651 GCT GCC CTT GCA GTC AAC ACA ACT GTA GAT GGC TAT AAA. GTC AAT GCC AAT GGT GAA TGG giy ala teu ela vai a sn thr thr vai asp giy tyr lys vai asn ala asn giy giu trp 1981 / 661 2011 / 671 GTT TAA GCC GAT TAA att A AA GCA TGT TAA GA A CAT TTG ACA TT T TAA TTT TGA AAC AAA vai OCH ale a s p OCH Ile lys ala cys OCH glu h Is leu thr phe OCH phe . OPA asn iys 2041 / 681 2071 / 691 GAT A AG CTT cga TTG AAT AGA TTT ATG TTC GTA TTC TTT AGG TAC as? lys vai org leu asn arg pne met pne vai phe pne tyr tyr

   ou possuindo uma homologia substancial.
9. 9 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por codificar, pelo menos, parte de uma região de enrolamento enrolada em hélice a da proteína PspA.
10. 10 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por codificar pelo menos uma parte de uma região rica em prolina da proteína PspA.
11. 11 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 8, caracterizada por codificar pelo menos uma parte de uma região de repetição da proteína PspA.
12. 12 - Molécula de ADN recombinante biologicamente pura, caracterizada por codificar uma forma truncada da proteína PspA que contém os epítopos imunoprotectores da proteína e contém até cerca de 90% da proteína PspA completa da qual está ausente a região de ancoragem da membrana da célula, possuindo a referida

    73 730

    MIS:jc 6102-84 molécula de ADN uma sequência de codificação incluída na sequência apresentada na reivindicação 8 ou possuindo uma homologia substancial.
13. 13 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por codificar uma forma truncada da proteína PspA que contém aproximadamente 50% da proteína PspA completa, da qual a região de ancoragem da membrana da célula, a região de repetição e a região de prolina estão ausentes.
14. 14 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 12, caracterizada por estar ligada, por uma fusão genética em estrutura traducional, a um gene que codifica outra proteína.
15. 15 - Molécula de ADN de acordo com a reivindicação 14, caracterizada por o referido gene que codifica outra proteína ser um gene ctxB.
16. 16 - Processo para formar uma proteína PspA imunoprotectora truncada caracterizado por compreender:

    efectuar uma mutagénese de inserção—duplicação de uma bactéria com um gene pspA resultando na codificação de uma proteína PspA truncada, expressável, cultivar a referida bactéria mutada para efectuar a expressão de uma proteína PspA truncada, e isolar a referida proteína.
17. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida bactéria ser de uma estirpe S. pneumoniae, a referida estirpe mutada ser cultivada num meio definido para efectuar a expressão da proteína PspA truncada no referido meio e a proteína ser isolada do meio.
18. 18 - Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado por a referida estirpe mutada ser a estirpe S. pneumoniae JY2008.

    Processo de acordo com a reivindicação 16, /7

    73 730

    MIS:jc 6102-84 —30 — caracterizado por a referida bactéria ser de uma estirpe E.

    coli, sendo a referida estirpe mutada cultivada num meio definido para efectuar a expressão da proteína PspA truncada no periplasma da referida estirpe mutada e sendo a proteína isolada do periplasma da referida proteína mutada.
19. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 19, caracterizado por a referida estirpe mutada ser a estirpe E. coli JY4306.

    Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a Mvcobacteria.

    referida bactéria ser de uma estirpe

    Processo de acordo com a reivindicação caracterizado por a referida estirpe mutada ser BCG mutado.
20. 23 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida proteína isolada ser purificada por cromatografia de permuta iónica.
21. 24 - Estirpe mutada de Streptococcus pneumoniae, caracterizada por compreender um gene pspA que codifica uma proteína PspA expressável, truncada.

    25 Estirpe de acordo com a reivindicação 24 , caracterizada por ser a estirpe JY2008 de S. pneumoniae. 26 - Estirpe de acordo com a reivindicação 24 , caracterizada por ser a estirpe JY4310 de S. pneumoniae. 27 Estirpe de acordo com a reivindicação 24 , caracterizada por ser a estirpe JY4285 de S. pneumoniae. 28 - Estirpe de acordo com a reivindicação 24 ,

    caracterizada por possuir um gene pspA que codifica uma proteína PspA truncada, ligada a um gene que codifica outra proteína.

    73 730

    MIS:jc 6102-84
22. 29 - Estirpe de acordo com a reivindicação 28, caracterizada por o referido gene que codifica outra proteína ser o gene ctxB que codifica a subunidade B da toxina da cólera.
23. 30 - Estirpe de acordo com a reivindicação 29, caracterizada por ser a estirpe JY2182 de S. pneumoniae.
24. 31 - Estirpe mutada de Mvcobacterium, caracterizada por compreender um gene pspA que codifica uma proteína PspA expressável, truncada.
25. 32 - Estirpe de acordo com a reivindicação 31, caracterizada por ser BCG mutado.
26. 33 - Estirpe mutada de Escherichia, caracterizada por possuir um gene pspA que codifica uma proteína PspA expressável, truncada.

    34 - Estirpe de acordo com a reivindicação 33 caracterizada por ser a estirpe JY4306 de E.coli. 35 - Estirpe de acordo com a reivindicação 33 caracterizada por ser a estirpe JY4353 de E.coli.
27. 36 - Processo para a produção de proteínas clonadas, caracterizado por compreender:

    fundir um gene pspA que codifica uma forma truncada da proteína PspA com o gene que codifica outra proteína, para formar um clone da proteína de fusão, transformar uma bactéria com o referido clone da proteína de fusão, cultivar a bactéria transformada para efectuar a expressão de uma proteína de fusão compreendendo PspA truncada e a outra proteína referida, e isolar a referida proteína de fusão.
28. 37 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por a referida bactéria ser uma bactéria gram

    73 730

    MIS:jc 6102-84 positiva, a bactéria gram positiva transformada ser cultivada num meio definido para efectuar a expressão da proteína de fusão no referido meio e a proteína de fusão ser isolada do meio.
29. 38 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracterizado por a referida bactéria gram positiva ser uma estirpe de S. pneumoniae.

    39 - Processo de acordo com a reivindicação 37, caracteri- zado por a referida bactéria gram positiva ser uma estirpe de Mvcobacterium. 40 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracteri-

    zado por a referida bactéria ser uma bactéria gram negativa, a bactéria gram negativa transformada ser cultivada num meio definido para efectuar a expressão da proteína de fusão no periplasma da referida bactéria e a proteína de fusão ser isolada do referido periplasma.
30. 41 - Processo de acordo com a reivindicação 40, caracterizado por a referida bactéria gram negativa ser uma estirpe de E.coli.
31. 42 - Processo de acordo com a reivindicação 36, caracterizado por o referido gene que codifica outra proteína ser um gene que codifica a subunidade B da toxina da cólera (CTB).
32. 43 - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por a proteína de fusão compreender uma sequência lábil a ácidos que liga a referida forma truncada da proteína PspA e CTB e por a referida proteína PspA e CTB serem separadas uma da outra por tratamento com ácido diluído.
33. 44 - Processo de acordo com a reivindicação 42, caracterizado por a proteína de fusão ser isolada do meio de cultura por adsorção a uma coluna de afinidade G_M1, da qual a proteína de fusão é eluída.

    73 730

    MIS:jc 6102-84
34. 45 - Vacina contra infecções pneumocócicas, caracterizada por compreender, como um componente imunogenicamente activo, a proteína definida na reivindicação 1.
35. 46 - Vacina de acordo com a reivindicação 45, caracterizada por a referida proteína ser conjugada com molécula eliciadora de protecção fracamente imunogénica ou não imunogénica.
36. 47 - Vacina contra infecções pneumocócicas, caracterizada por compreender, como um componente imunologicamente activado, uma bactéria gram positiva viva atenuada ou morta contendo um gene que codifica a proteína definida na reivindicação 1.

    acordo com a reivindicação positiva ser caracteriVacina pneumoniae.

    Streptococcus acordo comreivindicação positiva ser

    Vacina caracteriMvcobacterium
37. 50 - Sonda de ADN para a detecção de ADN pneumocócico numa amostra, caracterizada por compreender uma sequência conservada do gene pspA.
38. 51 - Sonda de ADN de acordo com a reivindicação 50, caracterizada por a referida sequência conservada estar localizada na região rica em prolina do gene, na região de repetição do gene ou em ambas.
39. 52 - Sonda de ADN, caracterizada por ser JY4262.
40. 53 - Sonda de ADN, caracterizada por ser JY4323.
41. 54 - Iniciador de ADN para efectuar a reacção em cadeia de polimerase de ADN pneumocócico, caracterizado por compreender uma sequência conservada do gene pspA para analisar uma amostra relativamente à presença de pneumococos.

    73 730

    MIS:jc 6102-84
42. 55 - Iniciador de ADN de acordo com a reivindicação 54, caracterizado por a referida sequência conservada estar localizada na região rica em prolina do gene, na região de repetição do gene ou em ambas.
43. 56 - Iniciador de ADN de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por a referida sequência conservada compreender um fragmento com 678 pares de bases da estirpe Rxl de S. pneumoniae que se estende desde o nucleótido 1312 ao 1990 da sequência de pspA apresentada na reivindicação 8.
44. 57 - Iniciador de ADN de acordo com a reivindicação 55, caracterizado por o referido iniciador ter a sequência nucleotídica:

    5'-CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC-3’ (LSM1) ou

    5 ^r-GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3· (LSM2)
45. 58 - Ensaio imunoabsorvente em fase sólida, caracterizado por compreender o revestimento de uma forma truncada de proteína PspA sobre um substrato sólido , estando a referida proteína PspA fundida com a subunidade B da toxina da cólera (CTB) que está ligada ao monosinlogangliósido (G^-^) que reveste o referido substrato sólido.