NO313999B1 - Strukturelt gen for pnumokokkisk protein - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse angår et renset immunobeskyttende pneumokokkisk overflateprotein A(PspA).

Referanse til relatert søknad

Foreliggende søknad er en delfortsettelse av samtidig US patentsøknad serienr. 656,773, innlevert 15. februar 1991.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Streptococcus pneumoniae er en viktig årsak til otitis media, meningitis, bacteremia og pneumonia. Til tross for bruken av antibiotika og vaksiner har hyppigheten av pneumokokkiske inf eksjoner sunket lite over de siste 25 år.

Det er vanlig akseptert at immunitet mot Streptococcus pneumoniae kan fremskaffes av spesifikke antistoff mot polysakkaridkapselen av denne pneumokokkus. Imidlertid klarer ikke nyfødte og unge barn å danne en immunrespons mot polysakkarid-antigener, og kan ha gjentatte inf eksjoner som involverer den samme kapsulære serotype.

En tilnærming til å immunisere barn mot et antall innkaps-lede bakterier er å konjugere de kapsulære polysakkarid-antigener til protein, og gjøre dem immunogene. Denne metode har vært suksessrik, f eks med Haemophilus influen-zae b (se US patent4,496,538 til Gordon og US patent 4,673,574 til Anderson). Imidlertid eksisterer det over 80 kjente kapsulære serotyper av Streptococcus pneumoniae, hvorav 23 står for mesteparten av sykdommen. For at et pneumokokkisk polysakkaridproteinkonjugat skal være virk-somt, må de kapsulære typer, som er ansvarlig for de fleste pneumokokkiske inf eksjoner, gjøres tilstrekkelig immunogene. Denne metode er vanskelig fordi de 23 polysakkarider, inkludert i den for tiden tilgjengelige vaksine, ikke alle er tilstrekkelig immunogene selv hos voksne.

En alternativ tilnærming for å beskytte barn og også gamle fra pneumokokkisk inf eksjon, ville være å identifisere pro-teinantigener som kunne fremskaffe beskyttende immun-responser. Slike proteiner kan virke som en vaksine i seg selv, kan bli brukt i sammenheng med virksomme polysakka-ridproteinkonjugater eller som bærematerialer for polysakkarider.

I McDaniel et al (I), J.Exp.Med. 160:386-397, 1984, er det beskrevet fremstillingen av hybridome antistoff som gjen-kjenner celleoverflatepolypeptid(er) på S. pneumoniae, og beskyttelse av mus fra inf eksjon med visse stammer av inn-kapslede pneumokokki med slike antistoff. Dette overflate-proteinantigen har blitt betegnet "pneumokokkisk overflateprotein A" eller forkortet PspA.

I McDaniel et al (II), Microbial Pathogenesis 1:519-531, 1986 er det beskrevet studier på karakteriseringen av PspA. Stort mangfold i PspA-molekylet i forskjellige stammer ble funnet, og likeledes ble forskjeller i epitopene gjenkjent av forskjellige antistoff.

I McDaniel et al (III), J.Exp.Med. 165:381-394, 1987 er det beskrevet at immunisering av X-tilknyttede immunodefisiente (XID) mus, med ikke-innkapslet pneumokokki som uttrykker PspA, men ikke isogene pneumokokki som mangler PspA, be-skytter mus fra påfølgende dødelig inf eksjon med pneumokokker.

I McDaniel et al (IV), Infect.Immun., 59:222-228, 1991 er det beskrevet immunisering av mus med et rekombinant fragment av full lengde av PspA, som er i stand til å fremskaffe beskyttelse mot pneumokokkiske stammer av kapsulær type 6A og 3.

I Crain et al, Infect.Immun., 56:3293-3299, 1990, er det beskrevet et kanin-antiserum som påviser PspA i 100% (n = 95) av kliniske og laboratorieisolater av stammer av S. pneumoniae. Når de omsettes med syv monoklonale antistoff mot PspA, oppviste 57 S. pneumoniae-isolater 31 forskjellige reaktivitetsmønstre.

PspA-proteintypen er uavhengig av kapsulær type. Det ville synes at genetisk mutasjon eller utbytting i miljøet har tillatt utviklingen av en stor mengde stammer som er meget forskjellige med hensyn til kapsel, PspA, og muligens andre molekyler med variable strukturer. Variabilitet av PspA fra forskjellige stammer er også tydelig fra deres molekylvek-ter som ligger i området fra 67 - 99 kD. De observerte forskjeller blir stabilt arvet, og er ikke resultatet av proteinnedbrytning.

Immunisering med et delvis renset PspA fra en rekombinant gt11 klonen fremskaffet beskyttelse mot inf eksjon med flere S. pneumoniaestammer, som representerer forskjellige kapsulære og PspA-typer som beskrevet i McDaniel et al (IV), Infect.Immun. 59:222-228, 1991. Selv om kloner som uttrykker PspA ble konstruert i henhold til denne artikkel, var produktet uoppløselig og isolering fra cellefragmenter etter lysis var ikke mulig.

Mens proteinet er variabelt i struktur mellom forskjellige pneumokokkiske stammer, eksisterer mange kryssreaksjoner mellom allePspA, noe som antyder at tilstrekkelige felles epitoper kan være tilstede for å tillate et enkelt PspA, eller minst et lite antall PspA, å fremskaffe beskyttelse mot et stort antall av S. pneumoniae-stammer.

I tillegg til den publiserte litteratur, spesielt angitt ovenfor, har oppfinnerne i samarbeid med andre publisert ytterligere detaljer angående PspA som følger: 1. Sammendrag av det 89. årlige møte for the American Society for Microbiology, side 125, punkt D-257, mai 1989; 2. Sammendrag av det 90. årlige møte for the American Society fo Microbiorlogy, side 98, punkt D-106, mai 1990; 3. Sammendrag av det tredje International ASM Conference on Streptococcal Genetics, s. 11, punkt 12, juni 1990;4. Talkington et al, Infect.Immun. 59:1285-1289, 1991;

5.Yother et al, J. Bacteriol. 174:601-609, 1992; og

6. Yother et al, J. Bacteriol. 174:610-618, 1992.

Sistnevnte tre publikasjoner kom ut etter innleveringen av tidligere nevnte USSN 656,773.

I beskrivelsen som følger og tegningene som følger med denne er det anvendt visse aksepterte forkortelser med hensyn til aminosyrene, representert ved disse. Følgende tabell I identifiserer disse forkortelser:

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse angår mutanter av S. pneumoniae ifølge krav 8 og som utskiller en immunogen forkortet form av PspA-proteinet, samt isolering og opprenskning av det utskilte protein ifølge krav 22.. Den avkortede form av PspA-proteinet er immunobeskyttende, og inneholder de beskyttende epitoper til PspA. PspA-proteinet er oppløsning i fysiologisk oppløsning, og mangler minst den funksjonelle cellemembranforankringsregion.

Kort beskrivelse av tegningene

FIGUR 1 er en skjematisk representasjon av domene av ferdigutviklet PspA; FIGUR 2 er den N-terminale aminosyresekvens av PspA, hvor store uthevede bokstaver betegner ladede, hydrofile aminosyrer, små bokstaver betegner apolare, hydrofile residuer og understrekede, uthevede små bokstaver betegner uladede, polare hydrofile residuer; FIGUR 3 er DNA-sekvensen av PspA- genet med uledet aminosyresekvens for PspA-proteinet; FIGUR 4 viser restriksjonskartet til PspA (FIGUR 4A) og bruken av innsetningsduplikasjon-mutagenese for å konstru-ere mutasjoner i PspA- genet (FIGUR 4B). FIGUR 5viser den utlede aminosyresekvens for det N-terminale område av PspA, og den generelle beliggenhet av epitoper gjenkjent av monoklonale antistoff; FIGUR 6 viser antistoffreaktiviteten med PspA-fragmenter, dannet av forskjellige PspA- gensegmenter; og FIGUR 7 viser den kartlagte beliggenhet av epitoper i PspA-fragmentene, dannet av forskjellige PspA- gensegmenter.

Generell beskrivelse av oppfinnelsen

I henhold til et aspekt av foreliggende oppfinnelse, er det fremskaffet et renset immunobeskyttende pneumokokkisk overflateprotein A, omfattende en avkortet form av PspA som inneholder minst en immunobeskyttende epitop av proteinet og opp til ca 90% av det hele PspA-protein, og hvorfra den funksjonelle cellemembranforankringsdel av hele PspA er fraværende.

Gjennom teknikken av innsetningduplikasjonsmutagenese av PspA- genet fra stammen Rxl av S. pneumoniae med plasmider inneholdende klonede fragmenter av det PspA-strukturelle gen, har det vært mulig å danne oppløselige fragmenter av PspA som blir utskilt av pneumokokker.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er det følge-lig fremskaffet en fremgangsmåte for å danne et immunobeskyttende, avkortet PspA-protein som omfatter å utføre inn-se tningsduplikasjonsmutagene se av et bakterium med et PspA-gen, som resulterer i kodingen av et avkortet uttrykkbart PspA-protein, dyrkning av den muterte bakterium for å fremskaffe ekspresjon av et avkortet PspA-protein og isolering av proteinet.

Molekylstørrelsen til det rensede, avkortede PspA-protein som erholdes, kan bli variert ved å dirigere innsetnings-punktet som bestemmer avslutningen av genekspresjonen til forskjellige punkter i PspA- genet. F eks har et N-terminalt fragment med observert molekylvekt på 43 kD, som utgjør omkring halvparten av det native protein, blitt funnet anvendelig.

Den avkortede segment som blir fremstilt ved denne fremgangsmåte er i stand til å fremskaffe beskyttelse hos mus fra dødelig smitte med type 3 S. pneumoniae, noe som viser for første gang at et renset PspA kan fremskaffe beskyttelse, og at dette avkortede segment av proteinet inneholder beskyttende epitoper av PspA.

Aminosyresekvensinformasjonen ble erholdt på de N-terminale 45 aminosyrer av det avkortede segment av PspA. Denne sekvens er vist i FIGUR 2. Forutsigende sekundær struktu-rell analyse viser at denne sekvens har en meget sterk alfahelisk form uten noen ikke-heliske innskudd. Omkring 51% av segmentet består kun av to aminosyrer, nemlig lysin, en ladet aminosyre, og alanin, en ikke-polar aminosyre. Analyse av denne 45-aminosyresekvens viser også at den inneholder en syv-residuum periodisitet (se FIGUR 2) . I PspA starter periodisiteten med residuum 8 og strekker seg gjennom hele sekvensen i nesten 11 omdreininger av spira-len. Posisjon "a" og "d" er opptatt av apolare aminosyrer og posisjon "b", "c" og "f" inneholder generelt hydrofile aminosyrer. Posisjon "f" er i hovedsak opptatt av lysin. Med hensyn til disse observasjoner er dette området av PspA meget sannsynlig i en alfahelisk kveilet konfigurasjon. Den avledede aminosyresekvens for alt av den alfaheliske kveilede region er vist i FIGUR 5.

Søker har også klonet og sekvensert den fullstendige kodende region av PspA (se FIGUR 3). Den utledede aminosyresekvens for PspA-proteinet viser tre distingte områder hos PspA-molekylet, vist skjematisk i FIGUR l. Følgelig er det i et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse fremskaffet et biologisk rent, rekombinant DNA-molekyl som koder for PspA-proteinet eller deler derav, og som har en kodende sekvens innebefattet i seg angitt i FIGUR 3 eller som har i hovedsak homologi til dette.

DNA-sekvensen av pspA- genet finnes på Hindlll-Kpjil-fragmentet som er 2086 basepar i lengde. pspA- genet i seg selv representerer omkring 1985 basepar av dette fragment, og omfatter et initielt område inneholdende transkripsjons- og translasjonssignaler, hvor translasjon starter av ATG/met (nukleotidposisjon 127, kodonposisjon -31), fulgt av en ledersekvens som strekker seg fra AAG/met (nukleotid 127, kodonposisjon -31) til CGA/ala (nukleotidposisjon 217, kodon -1). Ferdigutviklet PspA starter med glu aminosyren ved nukleotidposisjon 220 (kondon +1) og slutter ved det translasjonene stoppsignal TAA/OCH ved nukleotidposisjonen 1984. Dette translasjonene stoppkodon er fulgt av tran-skripsjonsavslutningssignaler.

Aminoterminalen av proteinsekvensen, forutsagt fra DNA-sekvensen i FIGUR 3, inneholder en 31 aminosyrers ledersekvens og en 45 aminosyrers sekvens, identisk med den 45 aminosyrer lange sekvens til N-terminalen PspA (FIGUR 2). Aminoenden av den forutsagte proteinsekvens er sterkt ladet og alfa-helisk i natur. Dette område har homologi med tropomyosin ved aminosyrenivået (omkring 22% identitet og 50% likhet). Denne homologi er i stor grad grunnet en repeterende syv-residuers periodisitet, hvor de første og fjerde aminosyrer er hydrofobe, de mellomliggende aminosyrer er heliks-fremmende og den syvende aminosyre er ladet. Dette mønster er konsistent med det til et alfa-helisk kveilet molekyl, og indikerer at den alfa-heliske kveil strekker seg gjennom den N-terminale halvdel av molekylet. Aminosyresekvens av det hele av det alfa-heliske kveilede område er vist i FIGUR 5.

Etter den ladede heliske region er en prolinrik region, hvor 23 av 81 aminosyrer er proliner. Umiddelbart nærlig-genede karboksyrettet til det prolinrike område er de første av 10 sterkt homologe 2 0 aminosyregjentagelser. Den eneste signifikante hydrofobe region i den sekvenserte del av molekylet starter ved siste gjentagelse. Denne poten-sielt membrangjennomløpende region inneholder flere ladede aminosyrer som går foran det translasjonene stoppkodon.

De innsetningsmessig inaktiverte mutanter av S. pneumoniae som mangler de C-terminale forankringsområder er i stand til vekst i kjemisk definerte media, og utskiller den N-terminale del av PspA-proteinet i mediet. Den N-terminale del av PspA er meget oppløselig i kulturmediet, og er mye lettere å isolere enn det fullstendige molekyl. Oppløsbare avkortede molekyler har blitt fremstilt ved å bruke innsetningsmessig dupliseringsmutagenese, dirigert av de klonede PspA DNA-fragmenter vist i FIGUR 4. Ekspresjon av den samme avkortede konstruksjon (med den pneumokokkiske promotor) i E. coli, resulterer i at samme PspA-fragment blir utskilt i periplasma hos E. coli. PspA blir lett frigjort fra periplasma ved hypoton lysis.

Avkortet PspA isoleres fra kulturmediet til muterte pneumokokker på enhver passende måte, så som ved tangensiell strømningsfiltrering. Ionebytterkromatografi blir så utført på et anionisk resin for å rense proteinet. 1 denne fremgangsmåte blir oppløsningen inneholdende PspA dialysert til pH6 i 0,02 M saltoppløsning og passert over resinet. PspA elueres fra resinet med en gradient på 0,08 - 2,0 M ionestyrke, og samles opp i fraksjonen mellom 0,34 og 0,87 M ionestyrke, avhengig av naturen til den anvendte kolonne.

PspA kan bli videre renset med natriumdodecylsulfatpoly-akrylamid gel (SDS-PAGE) elektroforese. Den PspA-inneholdende del av gelen blir identifisert ved å farge gelen og PspA elektroelueres fra denne del.

Elektroforeseopprenskningen er hensiktsmessig når kun små mengder PspA blir behandlet. Som et alternativ, mer egnet for produksjon i stor skala, kan proteinet bli renset ved størrelseskromatografi i en pH7 fosfatbuffer.

Siden det er mulig å erholde ekspresjon av den avkortede form av PspA i kulturmediet, i motsetning til at det er fanget inne i celleveggen og gjør opprenskning mye mer kom-plisert, er det mulig å isolere andre proteiner som har blitt klonet inn i det avkortede pspA- gen ved å danne fusjonsproteiner mellom PspA og andre proteiner. En slik teknikk kan bli anvendt for å øke immunogeniteten eller beholde den immunogene strukturelle konformasjon eller presentasjon av genproduktet, for å tillate fusjonsproteinet å bli brukt i immunisering som kan være systemisk og/eller mukosal mot sykdom.

Et eksempel på et slik fusjonsprotein er en fusjon mellom den oppløselige N-terminale del av PspA og B-subenheten av koleratoksin. Fusjonsproteiner kan også bli dannet ved kjemisk binding av det avkortede PspA-protein til andre proteiner.

Et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse fremskaffer følgelig en fremgangsmåte for å fremstille klonede proteiner, hvilken omfatter å fusere et pspA- gen som koder for en avkortet form av PspA-protein med genet som koder for et annet protein for å danne en fusjonsproteinklon, transformere S. pneumoniae, E. coli eller andre bakterier med fusjonsproteinklonen, styrke det transformerte bakterium for å fremskaffe ekspresjon av et fusjonsprotein, omfattende avkortet PspA og det andre protein inn i kulturmediet og isolere fusjonsproteinet.

Ved å bruke denne teknikk kan det bli fremstilt klonede proteiner i grampositive bakterier, så som pneumokokker, f eks S. pneumoniae, og mykobakterier, f eks Bacille Calmette-Guerin (BCG). Denne tilnærming overvinner problemene som er iboende i fremstillingen av proteiner i gramnegative bak-terier, så som E. coli som vanligvis brukes for klo-ning, spesielt behovet for å rense de rekombinante proteiner fra endotoksin og toksisiteten av mange gram ositive DNA-sekvenser i gramnegative organismer.

For ekspresjonen av et fusjonsprotein omfattende den opp-løselige N-terminale del av PspA og B-subenheten av koleratoksin (CTB), blir en genfusjon av en PspA- gen som koder for en avkortet form av PspA-protein med et ctxB-gen som koder for B-subenheten av koleratoksin utført. Etter ekspresjon av fusjonsproteinet kan PspA og CTB bli spaltet fra hverandre med fortynnet syre ved en asparaginpolin-sekvens, som er kjent for å være labil i fortynnet syre, dannet ved fusjonssetet mellom de to proteiner.

CTB er kjent for å være meget spesifikk for monosinlogangliosid (Gmi) . Følgelig kan PspA-CTB-fusjonsproteinet bli isolert fra kulturmediet ved absorbsjon til en Gm affinitetskolonne, hvorfra fusjonsproteinet derpå kan bli eluert ved lav pH.

PspA-CTB fusjonsproteinet finner stor anvendelighet i fastfase immunoadsorbantassays. Ved å bruke fusjonsproteinet er det mulig å belegge faste støttematerialer, så som mikro-titreringsplater med PspA-fragmenter uten først å måtte iso-lere PspA-fragmentene. Dette kan bli foretatt ved å tilsette bakterielt ektrakt inneholdende fusjonsproteinet til plater belagt med Gm. PspA-CTB-fusjonsproteinet vinner så til Ghi via CTB-enheten for derved å belegge det faste støttemateriale med PspA. Det resulterende belagte produkt kan så bli brukt i et fastfase immuniabsorbentassay for påvisningen av PspA-antistoff og/eller antigen i forsøks-prøver.

PspA feste/forankringsregionen, inneholdende den prolinrike region, den gjentagende region og/eller C-terminalen til PspA, kan også bli anvendt for å fremskaffe eksepisjon av heterologe proteiner i penumokokker eller andre grampositive eller gramnegative bakterier, hvori festet/forank-ringsregionen er funksjonell. Generelt fremskaffes ekspresjon på bakteriell membran, cellevegger eller celleover-flater i gram positive bakterier og periplasma hos gram negative bakterier. Et eksempel på et slikt heterologt protein er B-subenheten fra koleratoksin.

Som nevnt ovenfor inneholder den avkortede form av PspA, fremstilt heri, immunobeskyttende epitoper hos proteinet og er således anvendelig i en vaksine mot pneumokokkisk infeksjon. Følgelig fremskaffer enda et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse en vaksine mot pneumokokkisk inf eksjon, omfattende som en immunogen aktiv komponent, det rensede immunobeskyttende pneumokokkiske overflateprotein fremstilt heri. PspA-proteinet kan bli anvendt som en komponent av en multikomponentvaksine som er effektiv til å fremskaffe beskyttelse mot en mengde inf eksjoner.

I tillegg kan gram positive bakterier, som har blitt transformert til å uttrykke pspA- genet som koder for det avkortede, oppløselige PspA-protein, bli anvendt i en levende og hemmet eller avlivet form, som en immunogent aktiv komponent til en vaksine mot pneumokokkisk inf eksjon. I den transformerte bakterium kan et slikt pspA- gen bli fusert til et gen som koder for et annet protein. Følgelig fremskaffer et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelsen en vaksine mot pneumokokkisk inf eksjon, omfattende som en immunologisk aktiv komponent, en levende og hemmet eller avlivet bakterium inneholdende et gen som koder for den avkortede form av PspA.

Den avkortede form av PspA kan også bli anvendt i konju-gater med normalt svakt immunogene eller ikke-immunogene beskyttelsesfremmende molekyler, så som forskjellige polysakkarider for å oppnå immunogen beskyttelse derav. Et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse fremskaffer følgelig en vaksine omfattende, som en immunologisk aktiv komponent, et konjugat av rensede immunobeskyttende pneumokokkiske overflateprotein fremstilt heri, samt et normalt svakt immunogent eller ikke-immunogent beskyttelsesfremmende molekyl.

Konserverte sekvenser av pspA, spesielt de i de prolinrike og/eller gjentagende områder av genet, kan bli anvendt som prober for å påvise tilstedeværelsen av pneumokokker fra forskjellige stammer ved påvisning av pneumokokkisk DNA, i vev, kroppsvæsker og/eller sekreter. På lignende måte kan deler av pspA- genet bli anvendt i diagnostiske kits for påvisningen av pneumokokkiske inf eksjoner.

I tillegg kan primere som er dannet basert på konserverte sekvenser av pspA, spesielt de i de prolinrike og/eller

gjentagende områder, bli brukt for å undersøke tilstedeværelsen av pneumokokker i vev, kroppsvæsker og/eller sekreter ved amplifikering av pneumokokkisk DNA. I dette henseende kan et enkelt primerpar, avledet fra nukleotidsekvensen av pspA- genet fra S. pneumoniae, bli anvendt i et forsøk som bruker polymerase-kjedereaksjonen (PCR) for spesifikk påvisning av S. pneumoniae.

Spesifikk amplifikering har blitt oppnådd av et 678 basepar DNA-fragment fra S. pneumoniae stamme Rxl. Etter 30 ampli-fikeringssykler var amplimeren påviselig ved agarosegel-elektroforese. Fragmentet ble suksessfullt amplifikert i alle 32 stammer av S. pneumoniae som var undersøkt. PCR DNA-amplifikering var i stand til å påvise mindre enn en beregnet 20 pikogram total mengde genomisk pneumokokkisk

DNA.

Primere LSMl og LSM2, med nukleotidsekvensene:

amplifikerte det 678 basepar store produkt fra pspA fra nukleotid 1312 til 1990 av Rxl pspA-sekvensen {FIGUR 3).

PCR-analysen som bruker primerne beskrevet heri, utføres i henhold til konvensjonelle PCR-teknikker slik som beskrevet i litteraturen, f eks som beskrevet i Arnhem et al ved C&EN Special Report, 36, l. oktober 1990. For påvisningsforhold kan primeren bli merket eller merkede nukleotid-trifosfater kan bli inkludert i PCR-reaksjonen for å merke PCR-amplifi-keringsproduktet.

PCR-primerne kan bli fremstilt ved velkjente metoder, f eks ved oligonuklotidsyntese eller ved fragmentering av en større nukleotidsekvens ved å bruke passende restriksjons-enzymer.

Muligheten til å bruke en enkel primer som er i stand til å påvise et stort antall S. pneumoniaestammer, tillater et universelt PCR-påvisningskit å bli fremskaffet, som er i stand til å diagnostisere pneumokokkisk infeksjon hos pattedyr, innbefattende mennesker, uavhengig av stammen som har forårsaket sykdommen.

Stammer, plasmider og prober

I eksemplene som følger, så vel som i de medfølgende tegn-inger, er det referert til visse plasmider og bakterielle stammer transformert med slike plasmider, så vel som DNA vektorsegmenter, hvorav enkelte har blitt deponert hos ATCC og hvorav alle er fullstendig beskrevet heri. Den følgende tabell II gir en oppsummering av slike materialer.

EKSEMPLER

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer fremstillingen og veksten av nye stammer av S. pneumoniae.

S. pneumoniae-stammen Rxl, som er et ikke-innkapslet deri-vat av kapsulær type 2 stamme D39 {National Collection of Type Cultures, London, NCTC #7466), ble underkastet innsetningsmessig inaktivering (som beskrevet i McDaniel et al (III) 1987, Crain et al 1990, Talkington et al 1991, med 10 forskjellige klonede fragmenter av PspA (se FIGUR 4). Disse fragmenter har alle blitt erholdt fra restriksjonsspaltninger av klonet PspA-DNA på et plasmid i E. coli stamme JY4313 {deponert hos the American Type Culture Collection, 31. januar 1991 under ATCC tilgangsnummer 68529). Denne innsetningsmessig duplikasjonsmutågenese {se FIGUR 4) resulterer i termi-neringen av genekspresjon nær den 3<1>ende av det klonede fragment.

En av de resulterende stammer, JY2 008 (deponert hos the American Type Culture Collection, 24. januar 1991 under tilgangsnummer 55143), som ble fremstilt med et fragment av DNA kodet for i pKSD300 (McDaniel et al (III) 1987), danner et PspA-fragment på 27 kDa (observert molekylvekt 43 kDa). Dette fragment er omtrentlig 40% av størrelsen av det native 65 kDa (84 kDa observert størrelse) protein.

Den ventede molekylstørrelse er basert på den utledede aminosyresekvens og den observerte molekylstørrelse er basert på migreringen i SDS-PAGE. Forskjellen mellom ventet og observert molekylstørrelse er grunnet konformasjonen av PspA-fragmentet.

Prolin og gjentagnings/forankringsregionene (se FIGUR 1) ble fjernet, og det resulterende protein var ute av stand til å feste seg til cellen, grunnet deres fravær. Det ufestede protein kan så bli isolert fra kultursupernatanter som beskrevet nedenfor.

Ved å dirigere innsetningen til forskjellige punkter i pspA- genet, kan forskjellige lengder av avkortede, ikke-festede PspA-proteinderivater bli fremstilt som vist i

FIGUR 7.

Den pneumokokkiske stamme JY2008 ble dyrket i 6 liter av et kjemisk definert medium (se Inf. Imm. 27:444) supplementert med 0,10% cholinklorid, 0,075% L-cystein hydroklorid og 0,25% NaHC03. Supernatantvæsken av den midt-logaritmiske fasekultur av JY2008 ble innhøstet ved å bruke et 0,2um membrantangensielt strømningsfilter og konsentrert 60 ganger.

Innføringen av plasmidet pKSD300 i den umodifiserte D39-stamme ga på lignende måte det 43 kD avkortede PspA-protein. Innføring av plasmidet pKSD300 i type 3 S. pneumoniae stamme WU2 (PspA-protein omkring 92 kD) ga, ved vekst av organismen et ikkefestet avkortet PspA-protein med omtrentlig 46 kD molekylstørrelse.

Eksempel 2

Dette eksempel illustrerer opprenskningen av PspA.

Den konsentrerte supernatantvæske, fremstilt som beskrevet i eksempel 1, ble vasket i 0,1 M PBS, pH 7,2, og ultra-sentrifugert ved 196.000 x g. Supernatantvæsken ble fortynnet 1:5 i 20 mM L-histidinbuffer-NaCl, pH ble justert til 6,0 og derpå injisert i en DEAE-fibret Isonet-D2 en ione-bytterkolonne.

En trinnvis NaCl-gradient fra 80 mM til 2 M ble påført til kolonnen og PspA-inneholdende fraksjoner (0,32 - 0,64 M ionestyrke) ble slått sammen og separert på en SDA-poly-akrylamidgel. Proteinene på et representativt utsnitt av gelen ble farget med Comassie Blue R-250 for å identifisere PspA. Fraksjonen inneholdende PspA ble skåret ut fra det gjenværende av SDS-gelen, og elektroeluert fra den utskå-rede gel. Det eluerte protein ble utfelt i et 50:50 metanol: aceton oppløsningsmiddel og resuspendert i PBS. Renhet av produktet ble bekreftet med sølvfarging, og Western Immuno-blotting med mAb Xil26 (IgG 2b, k, se McDaniel et al (I), supra).

Eksempel 3

Dette eksempel illustrerer isoleringen av PspA fra det periplasmiske rom hos E. coli.

Isolering fra det periplasmiske rom hos E. coli ble utført ved standard teknikker. E. coli stamme JY4306 (som danner det 43 kDa N-terminale fragment av PspA, hvorav aminosyresekvensen er vist i FIGUR 3. Denne stamme ble deponert hos ATCC den 31. januar 1991 under tilgangsnummer 68522} ble vasket i bufret saltvann, inkubert i 20% sucrose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris pH 7,7 i 10 min ved 0°C. Cellene ble så sentrifugert ved 400 xg i 10 min ved 0°C All supernatant ble fjernet fra pelleten og pelleten ble resuspendert raskt i omkring 100 volumdeler 4°C vann. Etter 10 min ble suspen-sjonen sentrifugert ved 4.000 x g i 10 min ved 4°C. Pelleten ble kastet og supernatanten, som inneholdt PspA, ble spart. Konsentrasjonen av supernatanten ble foretatt ved standard prosedyrer, så som konsentrasjon mot fast sucrose eller ultrafiltrering. Opprenskning av proteinet, isolert fra E. coli, foregikk med samme kromatografiteknikker som ble brukt for isoleringen av 43 kDa (avkortet) PspA fra mediet av voksne pneumokokker.

Eksempel 4

Dette eksempel illusterer de immunogene egenskaper hos PspA-proteinet.

Seksten 7-ukers gamle CBA/N-mus som bærer Xid-mutasjonen (Jackson Laboratories, Bar Harber, ME) ble tappet for blod via den periorbitale sinus for å etablere pre-eksponerings- nivåer for antistoff mot PspA. Renset PspA, fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble emulgert i fullstendig Freunds's adjuvant og injisert subkutant i de inguinale og aks i Hære områder, ved å tilføre omtrent 5 ug protein pr mus. 14 dager senere ble musene injisert intraperitonealt med 5 ug PspA, fremstilt som beskrevet i eksempel 2. Kontrollmus ble immunisert via samme ruter med steril SDS-buffer. Flere dager etter siste immunisering ble alle mus tappet for blod via den periorbitale sinus og ble tilført intravenøst med 300 CFU av type 3 stamme WU2, dyrket som beskrevet i eksempel 1.

Preimmuniserings- og pretilførselsserum ble analysert med Western immunoblots for å etablere baselinje og postimmuni-seringsrespons overfor det avkortede protein. PspA fra stamme WU2 ble underkastet elektroforese og overført til nitrocellulosemembraner. Membranene ble delt i strimler og probet med de passende museantisera ved en 1:50 fortynning i 2 timer, inkubert med biotinylert geite-antimus-immuno-globulin i 1 time, vasket og inkubert med Strepavidin-konjugert fosfatase. Membranene ble fremkalt med 5-brom-4-klor-3-indoyl fosfattoludinsalt med 0,01% i blått tetrazo-lium.

Av de åtte CBA/N-mus immunisert med det rensede fragment av PspA, var alle fremdeles i live 14 dager etter tilføring av stamme WU2, og ingen viste noen tegn på sykdom etter til-førsel . Av de åtte mus immunisert med bufferkontroller var seks døde to dager etter tilførsel, mens de to gjenværende kontrollmus var meget syke med rufset pels, bøyd rygg og nedsatt bevegelse 2-3 dager etter tilførsel, men over-levde. Chi<2->analyse indikerte at det var en signifikant forskjell (P <0,003) i overlevelse mellom den immuniserte og kontrollgruppene.

Preimmunisering- og pretilførselssera ble analysert med Western immunobotting. Ingen av preimmuniseringsseraene inneholdt antistoffer mot avkortet PspA. Postimmuniserings- sera av åtte mus inneholdt påviselige antistoff mot PspA, og seks mus hadde meget sterke anti-PspA-reaksjoner. Når tilføringsstammen WU2 ble probet med antisera, hadde alle de immuniserte mus antistoff som var sterkt kryssreaktive med WU2-PspA-epitopene. Ingen kontrollmus utviklet antistoff mot PspA.

Immuniseringsdataene er oppsummert i den følgende tabell

III:

Slik det kan observeres fra dataene i tabell III, ga immunisering med to 5 ug doser av det rensede PspA-molekyl beskyttelse mot dødelig infeksjon av CBA/N-mus, og ga antistoff som var reaktive med PspA fra den tilførte stamme.

Eksempel 5

Dette eksempel illustrerer sekvensering av PspA-proteinet.

Renset PspA, fremstilt som beskrevet i eksempel 2, ble underkastet elektroforese gjennom 9% adskillende geler inneholdende rekrystallisert SDS med Laemmli-ffersystemet {Nature 227:680). Gelene ble trukket to ganger i en 10 mM 3-(cykloheksylamino)-1-propansulfonsyre, pH 11,0, inneholdende 10% metanol i 10 min. En polyvinyliden-difluoridmembran (PVDF) ble fuktet fullstendig i flere sekunder i 100% metanol, derpå vasket i CAPS-buffer i 10 min. PspA ble elektro-overført til PVDF-membranen i CAPS- buffer ved 0,5 A i én time. Etter overførsel ble membranen vasket to ganger i avionisert vann i 5 min og farget med 0,1% Coomassie Blue R-250 i 50% metanol i 20 min. Delen av membranen som inneholder PspA ble skåret ut og avfarget i 40% metanol og 10% eddiksyre i 5 min. Membranen ble skåret i små segmenter og lagret i sterile Eppendorf-rør inntil sekvensering.

Det isolerte PspA ble sekvensert direkte fra PVDF-membranene. FIGUR 2 viser den N-terminale 45 residuers aminosyresekvens og FIGUR 5 viser aminosyresekvensen for hele den alpha-heliske region. DNA-sekvensen av hele PspA- genet og den utledede aminosyresekvens for PspA-proteinet er vist i

FIGUR 3.

Eksempel 6

Dette eksempel illustrerer bruken av PspA 5<1->sekvens og/ eller PspA N-terminale region for å virke som en ekspresjon og ledersekvens for å uttrykke og/eller utskille/utsondre heterologe proteiner fra S. pneumoniae og E. coli. I dette eksempel er det beskrevet ekspresjonen av N-terminalen av PspA-proteinet fusert til B-subenheten av koleratoksin (CTB) via en genetisk fusjon, og utskillelsen av det fu-serte protein fra pneumokokker, samt dets sekresjon i det periplasmiske rom hos E. coli.

Et fusjonsprotein bestående av CTB og den N-terminale halvdel av PspA ble konstruert og uttrykt i E. coli. Hindlll/

Pral pspA genfragmentet som ble brukt, inneholdt alle pspA-transkripsjons- og translasjonsinitieringssignaler og PspA signalpeptidledersekvens for transport over cellemembranen. Det ferdigutvikiede PspA kodet for av dette fragment er forutsagt å være et produkt på 29 kDa (observert molekylvekt på 42 kDa), omfattende mer enn 90% av den 6-heliske, kveilede domene. CTB-fragmentet som ble brukt manglet transkripsjons-og translasjonsinitieringsignaler. Ekspresjon fra pspA-promoter gjennom pspA og derpå translasjonen gjennomlesning i ramme inn i det CTB-kodende gen ctxB resulterte i fremstilling av et 12 kDa CTB-produkt, fusert til det oppstrøms PspA-produkt. PspA-CTB fusjonsproteinet ble stabilt uttrykt i både høyt og lavt kopiantall plasmider (pUC18, mer enn 100 kopier/celle;

pJY4163, omkring 15-30 kopier/celle i E. coli.

Fusjonsproduktene var av den ventede størrelse (ca 54 kDa) og reagerte med antistoff mot både PspA og CTB. At CTB-produktet opprettholdt sin funksjonalitet ble vist ved egen-skapen til dette fusjonsprotein å binde gangliosid Gm, en egenskap hos CTB.

Det høye ekspresjonsnivå av fusjonsproduktet resulterte tilsynelatende i en redusert prosesseringsgrad og/eller konformasjonelle endringer som forhindret proteinet fra å bli fullstendig transportert til periplasma. Imidlertid var i den lavere kopiantallkonstruksjonen ca 60% av fusjonsproteinet lokalisert i periplasma, hvor store mengder lett ble frigjort fra E. coli ved osmotisk sjokk.

I tillegg til ekspresjon i E. coli ble fusjonsproteinet også uttrykt i 5. pneumoniae ved transformasjon av den lave kopiantallkonstruksjon, inn i det avirulente S. pneumoniae Rxl, for å danne en innsetningsduplikasjonsmutant. På denne måte ble genet som koder for fusjonsproteinet integrert i S. pneumoniae kromosomet, hvorfra det ble stabilt uttrykt. Som i tilfelle fra eksempel 1 ble det avkortede PspA-molekyl som mangler feste/forankringsregionen, denne gang i form av PspA-CTB fusjonsproteinet, utskilt i kultur-supernatanten. Fusjonsproteinproduktet var av den ventede molekylstørrelse (54 kDa), reagerte med antistoff mot PspA og CTB og bunnet Gm.

Eksempel 7

Dette eksempel illustrerer bruken av PspA feste- eller for-ankringsregionen for å tillate ekspresjon av heterologe proteiner på overflaten av S. pneumoniae, eller andre bakterier hvor feste/forankringssekvensen er funksjonell, spesielt ekspresjonen av en PspA-CTB (koleratoksin B-sub-enhet) fusjon uttrykt på overflaten av pneumokokker.

Den N-terminale kodende region av PspA, innbefattende dets transkripsjons- og translasjonsinitieringssignaler og dets signalpeptidledersekvens er tilkoblet via en translasjonen genetisk fusjon i leseramme til det CTB-kodende ctxB-fragment som mangler transkripsjons- og translasjonsinitier-ings- og termineringssignaler. Denne sekvens er fulgt i ramme av PspA feste/forankringsdomene, innbefattende deler eller alt av prolin, gjentagende og C-terminale domener. Det resulterende fusjonsprotein er rettet mot utsiden av cellen via PspA ledersekvensen som blir renset etter transport over membranen, og derpå festet til cellen ved hjelp av PspA feste/forankringssekvensen. Det heterologe protein som ligger mellom de to PspA-fragmenter blir uttrykt på den utvendige overflate av membranen, og i S. pneumoniae på overflaten av cellen.

Eksempel 8

Dette eksempel illustrer ekspresjonen av avkortet og full-lengde PspA av Mycobacterium tuberculosis stamme Baeilie Calmette-Guerin (BCG).

BCG ble kromosomisk modifisert til å innbefatte PspA- genet som koder for det avkortede PspA-protein. Det 43 kDa avkortede PspA-protein ble uttrykt fra de modifiserte BCG i omkring 15% av det totale BCG-protein. Dette resultat ble oppnådd med en ekspresjonsvektorkonstruksjon som bærer PspA-gensegmentet som koder for 43 kDa regionen uten dets 5'-sekresjonssignal. Ekspresjon var kun ca 1% av BGC-protein når PspA eller mykrobakterielle signalsekvenser var inkludert. I hvert tilfelle ble en signifikant del av det utrykte PspA skilt ut i mediet. Ekspresjon av 43 kDa PspA-proteinet i fusjon med en mykobakterielle lipoprotein-signalsekvens resulterte i ekspresjonen av det rekombinante PspA i membranfraksjonen av BCG.

Dette sistnevnte resultat antydet at fusjonen av lipopro-teinsignalsekvensen resulterte i acylering av det rekombinante PspA. Fluorescent aktivert cellesortering med fluor-kromkonjugerte monoklonale antistoff mot PspA viste ekspresjon av PspA på overflaten av disse bakterier.

Eksempel 9

Dette eksempel illustrerer den nære homologi av deler av pspA- genet blant forskjellige stammer av pneumokokker, og potensialet at slik homologi kan være anvendelig for mole-kylære (DNA) muligheter for å påvise pneumokokker i vev, kroppsvæsker og/eller sekreter, og å identifisere pneumokokker dyrket fra pasientprøver.

Tre DNA-prober ble anvendt, nemlig pspA av full lengde, JY4323 (N-terminal HinDlll til C-terminal Kpnl), den N-terminale halvdel av pspA, JY4306 (N-terminal HindiII til Pral ved posisjon 996 (se FIGUR 3), og mesteparten av de proline og gjentagende områder, JY4262 ( Bell ved posisjon 1221 til BstNI ved posisjon 1832). Under stringensitets-betingelser som krever 95% identitet, reagerte prober JY4323 og JY4262 med celler på over 2 00 uavhengige isolater av S. pneumoniae i Southern blot.

Når det kromosomale DNA ble spaltet med Hindlll, ble det generelt observert at hver av disse prober påviste to adskilte bånd, hvis nøyaktige størrelse var avhengig av den undersøkte stamme. I Rxl-pneumokokker var de to bånd 4,0 og 9,1 kb. 4,0 kb båndene tilsvarte pspA og ble endret eller var fraværende i pspA-mutanter. Det andre bånd deler en viss homologi med de kodende områder for både de N-terminale og C-terminale halvdeler av PspA, men blir ikke på-virket av pspA-mutasjoner. JY4323 og JY4262 probene klarte ikke å rea-gere med et annet gram positivt bakterium, Streptococcus pyogenes, og et gram negativ bakterium, Salmonella typhimurium. Den N-terminale probe, JY4306, gjenkjente omkring 1/3 av stammene av de undersøkte pneumokokker .

Disse resultater indikerer at en sekvens inkludert i prolin gjentagende område er felles for alle stammer av pneumokker, og tilsynelatende ikke av andre bakterielle arter. Sekvenser i den N-terminale halvdel av molekylet synes å være mer variable.

Eksempel 10

Dette eksempel illustrerer påvisningen og bestemmelsen av beliggenheten av epitoper i det 6-heliske N-terminale område av PspA.

Monoklonale antistoff, beskyttende mot pneumokokkisk infeksjon i en musemodell betegnet med asterisk i FIGUR 5, 6 og 7 ble brukt for å bestemme beliggenheten av epitoper for hvert antistoff i det 6-heliske enterminale område av PspA. Punktene ble kartlagt til fragmenter av PspA. Resultatene er illustrert i FIGUR 5-7, hvor FIGUR 5 viser den utledede aminosyresekvens for det omterminale område av PspA, og den generelle beliggenhet av epitoper gjenkjent av monoklonale antistoff. FIGUR 6 viser antistoffreaktivitet med PspA-fragmenter fremstilt av forskjellige pspA- gensegmenter, og FIGUR 7 viser den kartlagte beliggenhet av epitoper i PspA-fragmentene fremstilt av de forskjellige pspA- gensegmenter.

Tallene 138, 193 og 261 i FIGUR 5 indikerer bruddposisjoner i PspA-fragmentene, brukt for å kartlegge beliggenheten av epitoper påvist med monoklonale antistoffXil526, Xil26, XiR35, XiR38, XiR1224, XiR16, Xi64, XiR278, Xil325 og Xil323. Astriksen (*) etter enkelte av antistoffene betegner de som er i stand til å beskytte mot dødelig pneumokokkisk infeksjon med stamme WU2 pneumokokker.

I tillegg indikerer de vertikale linjer til høyre på figuren de områder som er forutsagt å ha kveilet 6-helisk struktur. Delelinjene til venstre på figuren indikerer den kartlagte beliggenhet av epitopene for hvert antistoff.

Oppsummering av beskrivelsen

oppsummering av foreliggende beskrivelse angår foreliggende oppfinnelse et avkortet PspA-molekyl som er i stand til å fremskaffe en immunobeskyttende respons, og således inneholdende de beskyttende epitoper til PspA-proteinet. Modifikasjoner er mulige innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse.

Claims (48)

1. Renset immunobeskyttende pneumokokkisk overflateprotein A (PspA), karakterisert vedat det omfatter en forkortet form av PspA som inneholder minst en beskyttende epitop av proteinet og opp til omkring 90% av hele PspA og hvorfra den funksjonelle cellemembranforankringsregion av hele PspA er fraværende.

2. Protein ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter omkring 50% av hele PspA-proteinet hvorfra cellemembranforankrings-regionen, den gjentatte region og prolinregionen av hele PspA er fraværende.

3. Protein ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter minst den N-terminale, beskyttende epitop-inneholdende region av PspA-proteinet.

4. Protein ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter minst den N-terminale, beskyttende epitopinneholdende region av PspA-proteinet og som har domenene vist i Fig. 1.

5. Protein ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter en N-terminal a-helisk kveilet region av hele PspA-proteinet.

6. Protein ifølge krav 5, karakterisert vedat den a-heliske kvei-lete region har en syv-residuers periodisitet.

7. Protein ifølge krav 1, karakterisert vedat det omfatter den 43 kD (observert molekylstørrelse) N-terminale region av et 84 kD PspA-protein.

8. Mutert stamme av Streptococcus pneumoniae,karakterisert vedat den omfatter pspA-genet som koder for et forkortet PspA-protein i henhold til krav 1 koblet til et gen som koder for et annet protein.

9. Stamme ifølge krav 8, karakterisert vedat genet som koder for det andre protein er cfcxS-genet som koder for B-subenheten av koleratoksin.

10. Mutert stamme av Afycobacterium,karakterisert vedat den omfatter et pspA-gen som koder for et forkortet uttrykkbart PspA-protein i henhold til krav 1, hvor nevnte stamme er mutert Mycobacterium tuberculosis stamme BCG.

11. Mutert stamme av Eschericia coli,karakterisert vedat den omfatter et pspA- gen som koder for et forkortet uttrykkbart PspA-protein hvor nevnte stamme er JY4306-stammen av E. coli (ATCC 68522).

12. Biologisk rent rekombinant DNA-molekyl,karakterisert vedat det koder for en forkortet form av PspA som inneholder opp til 90% av hele PspA-proteinet og hvorfra den funksjonelle cellemembran forankringsregion er fraværende, hvor nevnte DNA-molekyl har en kodende sekvens inkludert i nukleotidsekvensen angitt i Fig. 3a til 3c.

13. DNA-molekyl ifølge krav 12,karakterisert vedat det koder for minst en del av en a-helisk kveiltet region av PspA-proteinet, minst en del av en prolinrik region av PspA-proteinet, eller minst en del av den gjentakende region av PspA-proteinet .

14. DNA-molekyl ifølge krav 12 eller krav 13,karakterisert vedat det foreligger i form av en DNA-probe for påvisning av pneumokokkisk DNA i en prøve, og som er særpreget ved en konservert sekvens av pspA- genet, hvor nevnte sekvens er valgt fra gruppen omfattende en nukleinsyresekvens som koder for en prolinrik region av PspA, en nukleinsyresekvens som koder for en gjentatt region av PspA og en nukleinsyre som koder for en prolinrik region og en gjentatt region av PspA.

15. DNA-molekyl ifølge krav 12 eller 13,karakterisert vedat det foreligger i form av en DNA-primer for å utføre polymerase kjedereaksjon av pneumokokkisk DNA, og som er særpreget ved en konservert sekvens av pspA- genet.

16. DNA-molekyl ifølge krav 15,karakterisert vedat den konserverte sekvens ligger i den prolinrike region av genet, den gjentatte region i genet eller begge deler.

17. DNA-molekyl ifølge krav14,karakterisert vedat det er DNA-proben JY4262 omfattende basene 1221 til 1832 av sekvensen vist i Fig. 3a til 3c.

18. DNA-molekyl ifølge krav 15,karakterisert vedat det foreligger i form av en DNA-primer, hvor nevnte primer har nukleotidsekvensen: 5'-CCGGATCCAGCTCCTGCACCAAAAC-3' {LSM1) eller 5'GCGCTGCGACGGCTTAAACCCATTCACCATTGG-3 ' (LSM2) .

19. DNA-molekyl ifølge krav 12,karakterisert vedat det koder for en forkortet form av PspA-proteinet og som inneholder omkring 50% av hele PspA-proteinet hvorfra cellemembran forank- ringsregionen, den gjentatte region og prolin-regionen er fraværende.

20. DNA-molekyl ifølge krav 12 eller krav 19,karakterisert vedat den er bundet ved en translasjonen genetisk fusjon i leseramme til et gen som koder for et annet protein.

21. DNA-molekyl ifølge krav 20,karakterisert vedat nevnte gen som koder for et annet protein, er ctxB-genet.

22. Fremgangsmåte ved dannelse av et immunobeskyttende forkortet PspA-protein, karakterisert vedat den omfatter: å utføre innsetnings-duplikasjonsmutagenese av en bakterie med et klonet pspA- gen inneholdende en innset-ningsmutasjon i sin kodende region for å danne en mutert bakterie som uttrykker et forkortet PspA-protein i henhold til krav 1, dyrke nevnte muterte bakterie for å fremskaffe ekspresjon av et forkortet PspA-protein og isolere nevnte protein.

23. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte bakterie omfatter en S. pneumoniae-stamme, hvor nevnte muterte stamme dyrkes i et definert medium for å fremskaffe ekspresjon av det forkortede PspA-protein i nevnte medium, og isolere proteinet fra mediet.

24. Fremgangsmåte ifølge krav 23,karakterisert vedat den muterte stamme er S. pneumoniae stamme JY2008.

25. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat nevnte isolerte protein blir renset med ionebytter-kromatografi.

26. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat det immunobeskyttende forkortede PspA-protein inneholder immunobeskyttende epitoper og mangler den cellemembran-forankrende region.

27. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat det immunobeskyttende forkortede PspA-protein inneholder omkring 50% av hele PspA-proteinet og har cellemembran forankringsregio-nen, den gjentatte region og prolinregionene fraværende.

28. Fremgangsmåte ifølge krav 22,karakterisert vedat det immunobeskyttende forkortede PspA-protein inneholder immunobeskyttende epitoper og omkring 90% av hele PspA-proteinet og har celleforankringsregionen fraværende.

29. Fremgangsmåte ved isolering av det forkortede PspA-protein ifølge krav 1, karakterisert vedat den omfatter: mutagenese av en Streptococcus pneumoniae-stamme eller en Escherichia coli-stamme ved innsetnings-inaktivering av genet som koder for et pneumokokkisk overflateprotein ( PspA) hvor mutagenesen resulterer i en Streptococcus pneumoniae-stamme eller en Escherichia coli-stamme som inneholder genet som koder for det forkortede PspA-protein, dyrke nevnte muterte Streptococcus pneumoniae-stamme for å uttrykke det forkortede PspA-protein og isolere det forkortede PspA-protein.

30. Fremgangsmåte ifølge krav 29,karakterisert vedat den muterte stamme er Streptococcus pneumoniae stamme JY2008 {ATCC deponeringsnummer 55143).

31. Fremgangsmåte ifølge krav 29,karakterisert vedat den muterte stamme er Escherichia coli stamme JY4306 (ATCC deponeringsnummer 68522)

32. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 29 til 31,karakterisert vedat det forkortede PspA-protein isoleres ved ionebytterkromatografi.

33. Fremgangsmåte ved fremstilling av et fusjonsprotein,karakterisert vedat den omfatter å dyrke en transformert bakterie for å uttrykke fusjonsproteinet, hvor den transformerte bakterie inneholder og uttrykker DNA som koder for et fusjonsprotein omfattende forkorter PspA i henhold til krav 1 som er fusert til et annet protein.

34. Fremgangsmåte ifølge krav 33,karakterisert vedat den transformerte bakterie er dannet ved å transformere en bakterie for å fremskaffe en transformert bakterie som inneholder og uttrykker DNA som koder for et fusjonsprotein omfattende forkortet PspA fusert til et annet protein.

35. Fremgangsmåte ifølge krav 34,karakterisert vedat pspA- genet som koder for en forkortet form av PspA-protein, er fusert til et gen som koder for et annet protein for å danne en fusjonsproteinklon og hvor nevnte transformerte bakterie er dannet ved å transformere en bakterie med nevnte fusjonsproteinklon.

36. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 33 til 35,karakterisert vedat nevnte bakterie er en grampositiv bakterie og hvor den grampositive bakterie dyrkes i et definert medium for å framskaffe ekspresjon av fusjonsproteinet i nevnte medium, og hvor fusjonsproteinet isoleres fra mediet.

37.Fremgangsmåte ifølge krav 36,karakterisert vedat den grampositive bakterie er en stamme av S. pneumoniae eller en stamme av Mycobacterium.

38.Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 33 til 35,karakterisert vedat nevnte bakterie er en gramnegativ bakterie, og hvor den gramnegative bakterie dyrkes i et definert vekstmedium for å fremskaffe ekspresjon av fusjonsproteinet i periplasma hos nevnte bakterie, og fusjonsproteinet isoleres fra nevnte periplasma.

39. Fremgangsmåte ifølge krav 38,karakterisert vedat den gramnegative bakterie er en stamme av E. coli.

40. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 33 til 39,karakterisert vedat nevnte gen som koder for det andre protein er et gen som koder for B-subenheten av koleratoksin (CTB).

41. Fremgangsmåte ifølge krav 40,karakterisert vedat nevnte fusjonsprotein omfatter en syrelabil sekvens som kobler sammen den forkortede form av PspA-proteinet og CTB og hvor nevnte PspA-protein og CTB blir adskilt fra hverandre ved behand-ling med fortynnet syre.

42. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 33 til 39,karakterisert vedat nevnte fusjonsprotein isoleres fra kulturmediet ved absorpsjon til en Gm affinitetskolonne hvorfra nevnte fusjonsprotein elueres.

43. Vaksine mot pneumokokkisk inf eksjon,karakterisert vedat den omfatter, som en immunogent aktiv komponent, protein ifølge krav 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7.

44. Vaksine ifølge krav 43, karakterisert vedat nevnte protein er konjugert til et normalt svakt immunogent eller ikke-immunogent beskyttelsesfremmende molekyl.

45. Vaksine mot pneumokokkisk infeksjon,karakterisert vedat den omfatter, som en immunologisk aktiv komponent, en levende svekket eller avlivet grampositiv bakterie inneholdende et gen som koder for et protein ifølge krav 1, 2, 3, 4, 5, 6 eller 7.

46. Vaksine ifølge krav 45, karakterisert vedat den grampositive bakterie er Streptococcus pneumoniae.

47. Vaksine ifølge krav 46, karakterisert vedat den grampositive bakterie er Mycobacterium tuberculosis.

48. Anordning til anvendelse i et fastfase immunoabsor-bantassay til påvisning av PspA-antistoff eller -antigener,karakterisert vedat den omfatter et belegg av en forkortet form av PspA-protein i henhold til krav 1 på et fast substrat, hvor nevnte PspA-protein er fusert til B-subenheten av koleratoksin (CTB) som er bundet til monosinlogangliosid (Ghi) som bekler nevnte faste substrat.