ES2963046T3

ES2963046T3 - Tratamiento del cáncer con un anticuerpo contra la semaforina-4d combinado con un agente modulador epigenético

Info

Publication number: ES2963046T3
Application number: ES18771465T
Authority: ES
Inventors: Elizabeth Evans; Ernest S Smith; Maurice Zauderer
Original assignee: Vaccinex Inc
Current assignee: Vaccinex Inc
Priority date: 2017-03-20
Filing date: 2018-03-14
Publication date: 2024-03-25
Anticipated expiration: 2038-03-14
Also published as: BR112019019597A2; WO2018175179A1; IL268000B2; IL268000A; MX2019011130A; US20210179708A1; RU2019122330A; DK3600419T5; CN110446504A; KR102627372B1; DK3600419T3; AU2018237549A1; ZA201904432B; PT3600419T; PL3600419T3; SG11201906404RA; EP3600419A1; JP7159187B2; EP3600419B1; FI3600419T3

Abstract

Esta divulgación proporciona un método para inhibir, retrasar o reducir el crecimiento de células malignas en un sujeto con cáncer, que comprende administrar al sujeto una terapia de combinación que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D. (SEMA4D) y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un inhibidor de histona desacetilasa (HDAC) (HDACi), un inhibidor de ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi), o cualquier combinación de los mismos. La divulgación proporciona además una composición farmacéutica que comprende la terapia de combinación. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Tratamiento del cáncer con un anticuerpo contra la semaforina-4d combinado con un agente modulador epigenético

Antecedentes

La semaforina 4D (SEMA4D), también conocida como CD100, es una proteína transmembrana que pertenece a la familia génica de las semaforinas. La SEMA4D se expresa en la superficie celular en forma de un homodímero, pero tras la activación celular, SEMA4D puede liberarse de la superficie celular mediante escisión proteolítica para generar sSEMA4D, una forma soluble de la proteína, que también es biológicamente activa. Véase, Suzukiet al.,Nature Rev. Immunol., 3:159-167 (2003); Kikutaniet al.,Nature Immunol., 9:17-23 (2008).

La SEMA4D se expresa a niveles elevados en órganos linfoides, incluidos el bazo, el timo y los ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro y el riñón. En los órganos linfoides, la SEMA4D se expresa abundantemente en los linfocitos T en reposo, pero sólo débilmente en los linfocitos B en reposo y en las células presentadoras de antígenos ("antigen-presenting cells", APC), tales como las células dendríticas ("dendritic cells", DC). Sin embargo, su expresión aumenta en estas células tras su activación por diversos estímulos inmunológicos. La liberación de SEMA4D soluble de las células inmunitarias también aumenta con la activación celular. Se ha implicado a la SEMA4D en el desarrollo de determinados tipos de cáncer (Ch'nget al.,Cancer, 110:164-72 (2007); Camposet al.,Oncology Letters, 5:1527-1535 (2013); Katoet al.,Cancer Sci., 102:2029-2037 (2011)) y varios informes sugieren que un mecanismo para ejercer esta influencia es el papel de la SEMA4D en la estimulación de la angiogénesis tumoral (Conrottoet al.,Blood, 105:4321-4329 (2005); Basileet al.,J. Biol. Chem., 282: 34888-34895 (2007); Sierraet al.,J. Exp. Med., 205:1673 (2008); Zhouet al.,Angiogenesis, 15:391-407 (2012)). El crecimiento tumoral y la metástasis implican un complejo proceso de comunicación cruzada entre las células tumorales, el estroma y el infiltrado inmunitario, así como las células endoteliales y la vasculatura. La SEMA4D se sobreexpresa en una amplia gama de tipos tumorales y también es producida por células inflamatorias reclutadas al microambiente tumoral. Trabajos recientes sugieren que la SEMA4D desempeña un papel en la migración, la supervivencia, la diferenciación y la organización de los distintos tipos celulares que constituyen el estroma tumoral (Evanset al.,Cancer Immunol. Res., 3:689-701 (2015)), y el documento US 2016/115240 A1 (Vaccinex, Inc) indica que los anticuerpos anti-SEMA4D tienen actividad terapéutica contra tumores sólidos.

Las células cancerosas pueden adaptarse para evitar el reconocimiento inmunitario del hospedador mediante la modificación de la expresión génica a través de mecanismos epigenéticos, sin alterar la secuencia del ADN genómico. Los mecanismos epigenéticos se centran en gran medida en las alteraciones de la metilación del ADN genómico y las modificaciones postraduccionales de las histonas, lo que provoca, por ejemplo, alteraciones en la estructura de la cromatina y la disponibilidad del ADN para la transcripción. A través de estos mecanismos epigenéticos, las células cancerosas pueden establecer perfiles de expresión génica alterados y heredables que favorecen la proliferación y la evasión inmunitaria. Véase, por ejemplo, Maioet al.,Clin. Cancer Res., 21:4040-4047 (2015).

Las células pueden controlar el enrollamiento y desenrollamiento del ADN alrededor de las histonas a través de las histona acetil transferasas (HAT), que acetilan los residuos de lisina en el núcleo de las histonas dando lugar a una cromatina menos compacta y más activa desde el punto de vista transcripcional, y de las histona desacetilasas (HDAC), que eliminan los grupos acetilo de los residuos de lisina dando lugar a la formación de una cromatina condensada y silenciada desde el punto de vista transcripcional. La modulación de la actividad HAT/HDAC por las células tumorales puede dar lugar a una amplia modulación epigenética de la expresión génica en las células tumorales, lo que permite a las células eludir la vigilancia del sistema inmunitario del paciente. Véase, por ejemplo, Maioet al.,Clin. Cancer Res., 21:4040-4047 (2015).

Los inhibidores de la histona deacetilasa (HDACi (utilizados en el presente documento tanto en singular como en plural)) han surgido como agentes terapéuticos contra el cáncer. Los HDACi pueden inhibir la proliferación de células tumorales induciendo amplios cambios transcripcionales, activando y/o reprimiendo diversos genes mediante la modulación de la acetilación/desacetilación de histonas y/o proteínas no histónicas, tales como los factores de transcripción; Chueh, A.C.et al.,Antioxidants & Redox Signaling, 23:66-84 (2015). Los HDACi pueden interferir en la proliferación y la supervivencia celular, por ejemplo, en el ciclo celular, la diferenciación y la apoptosis de las células cancerosas. Los HDACi también pueden potenciar la inmunogenicidad y la presentación de antígenos por parte de las células tumorales, lo que justifica la combinación de HDACi con inmunoterapia (Gameiro S.R.et al.,Oncotarget, 7:7390-7402 (2016)). Varios compuestos se encuentran actualmente en fase inicial de desarrollo clínico como posibles tratamientos para cánceres sólidos y hematológicos, tanto en monoterapia como combinados con agentes citotóxicos y de diferenciación. Véase, por ejemplo, Mottamal, M.et al.,Molecules, 20:3898-3941 (2015).

La metilación del ADN genómico es una modificación epigenética ampliamente caracterizada. La metilación del ADN conduce a la quiescencia transcripcional, lo que provoca el silenciamiento de genes; Gravina G. L.et al.,Mol. Cancer, 9:305-320 (2010). La metilación es facilitada por las ADN metiltransferasas (DNMT), que catalizan la adición de un grupo metilo al carbono 5' de los residuos de citosina.Id.El ADN hipermetilado es frecuente en las células tumorales y otras células cancerosas. En la actualidad se utilizan o se están ensayando diversos inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMTi (utilizado en el presente documento tanto en singular como en plural)) para el tratamiento de diversos tipos de cáncer. Entre ellos se encuentran los análogos de desoxirribonucleósidos, tales como la azacitidina, y los análogos no nucleosídicos, tales como los oligonucleótidos antisentido y los inhibidores enzimáticos de molécula pequeña.Id.

Sumario

La invención se describe en las reivindicaciones adjuntas.

Las referencias a procedimientos de tratamiento mediante terapia con un agente, combinación o composición en esta divulgación deben interpretarse como referencias al agente, la combinación o la composición para su uso en dichos procedimientos.

La presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir, retrasar o reducir el crecimiento de células malignas en un sujeto con cáncer, en el que el procedimiento incluye administrar al sujeto una terapia combinada que incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético seleccionado entre un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi); o cualquier combinación de los mismos. Según el procedimiento proporcionado, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento del mismo puede inhibir la interacción de SEMA4D con su receptor, por ejemplo, plexina-B1, plexina-B2, o CD72. Por ejemplo, según el procedimiento proporcionado, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento del mismo puede inhibir la transducción de señales de plexina-B 1 mediada por SEMA4D.

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento del mismo incluye una cadena pesada variable (VH) que incluye las CDR 1-3 de VH que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, 3 y 4, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que incluye las CDR 1-3 de VL que tienen las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. En determinados aspectos, las secuencias de aminoácidos de la VH y la VL incluyen, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

En determinados aspectos, el agente modulador epigenético puede incluir un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241. En determinados aspectos, la HDAC puede ser una HDAC de clase I, una HDAC de clase IIA, una HDAC de clase IIB, una HDAC de clase IV o cualquier combinación de las mismas, o la HDAC puede incluir un dominio catalítico que contiene cinc. En determinados aspectos, el HDACi puede unirse al dominio catalítico que contiene cinc de la HDAC. En determinados aspectos, el HDACi puede incluir un resto químico seleccionado del grupo que consiste en un ácido hidroxámico o una sal del mismo, un tetrapéptido cíclico, un depsipéptido, una benzamida, una cetona electrófila, un ácido alifático o una sal del mismo, o cualquier combinación de los mismos. En determinados aspectos, el HDACi es entinostat (N-[[4-[(2-aminofenil)carbamoil]fenil]metil]carbamato de piridin-3-ilmetilo).

En determinados aspectos, el agente modulador epigenético puede incluir un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi). En determinados aspectos, la DNMT puede ser DNMT1, DNMT-3a, DNMT-3b o cualquier combinación de las mismas. En determinados aspectos, el DNMTi puede ser un análogo de nucleósido, un oligonucleótido antisentido, un inhibidor enzimático de molécula pequeña o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, en determinados aspectos, el DNMTi puede ser azacitidina, decitabina, zebularina, SGI-110, galato de epigalocatequina, MG98, RG108, procainamida, hidralazina, cualquier combinación de los mismos, o cualquier sal, cristal, estructura amorfa, hidrato, derivado, metabolito, isómero o profármaco de los mismos. En determinados aspectos, la DNMTi es la azacitidina.

En un aspecto concreto del procedimiento proporcionado, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y el agente modulador epigenético comprende el HDACi entinostat. En otro aspecto concreto del procedimiento proporcionado, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos s Eq ID NO: 5, y el agente modulador epigenético comprende el DNMTi azacitidina.

Según el procedimiento proporcionado, el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo y el agente modulador epigenético pueden administrarse por separado o pueden administrarse simultáneamente.

En determinados aspectos del procedimiento proporcionado, la administración de la terapia combinada puede dar como resultado una eficacia terapéutica mejorada en relación con la administración del anticuerpo o un fragmento del mismo o del agente modulador epigenético solos. Por ejemplo, en determinados aspectos, la eficacia terapéutica mejorada es mayor que un efecto aditivo, por ejemplo, un efecto sinérgico.

En determinados aspectos del procedimiento proporcionado, el cáncer a tratar puede ser un tumor sólido, una neoplasia hematológica, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos. En determinados aspectos, el tumor sólido puede ser, por ejemplo, un sarcoma, un carcinoma, un melanoma, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Más concretamente, el tumor sólido puede ser, por ejemplo, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células renales, carcinoma ductal de mama, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, melanoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de peritoneo, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer neuroendocrino, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, cáncer de esófago, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de cabeza y cuello, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos del procedimiento proporcionado, el cáncer a tratar puede ser una neoplasia hematológica 0 una metástasis de la misma. En determinados aspectos, la neoplasia hematológica puede ser leucemia, linfoma, mieloma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el procedimiento proporcionado en el presente documento puede incluir además la administración de una terapia adicional contra el cáncer, por ejemplo, cirugía, quimioterapia, radioterapia, una vacuna contra el cáncer, la administración de un agente inmunoestimulante, una terapia de linfocitos T adoptivos o anticuerpos, la administración de un inhibidor de bloqueo de punto de control inmunitario, la administración de un modulador de linfocitos T reguladores (Treg) y una combinación de los mismos.

La presente divulgación proporciona además una composición farmacéutica que incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético. En determinados aspectos, la composición farmacéutica puede incluir además un vehículo, un excipiente o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el anticuerpo o un fragmento del mismo de la composición proporcionada puede incluir una cadena pesada variable (VH) que comprende las CDR 1-3 de VH que comprenden las SEQ ID NO: 2, 3, y 4, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las CDR 1-3 de VL que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente. En determinados aspectos, el anticuerpo o un fragmento del mismo de la composición proporcionada puede incluir una VH y una VL que incluyen, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

En determinados aspectos, el agente modulador epigenético incluido en la composición farmacéutica proporcionada puede incluir un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi) o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el HDACi puede ser entinostat (N-[[4-[(2-aminofenil)carbamoil]fenil]metil]carbamato de piridin-3-ilmetilo).

Cuando la composición incluye un DNMTi, el DNMTi puede ser, por ejemplo, azacitidina, decitabina, zebularina, SGI-110, galato de epigalocatequina, MG98, RG108, procainamida, hidralazina, cualquier combinación de los mismos, o cualquier sal, cristal, estructura amorfa, hidrato, derivado, metabolito, isómero o profármaco de los mismos. En determinados aspectos, la DNMTi puede ser la azacitidina.

En un aspecto concreto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D), en la que el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye la secuencia de aminoácidos de VH SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de VL SEQ ID NO: 5; y una cantidad eficaz del HDACi entinostat. En otro aspecto concreto, la divulgación proporciona una composición farmacéutica que incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D), en la que el anticuerpo o un fragmento del mismo incluye la secuencia de aminoácidos de VH SEQ ID NO: 1 y la secuencia de aminoácidos de VL SEQ ID NO: 5; y una cantidad eficaz del DNMTi azacitidina.

Breve descripción de los dibujos/figuras

La figura 1 muestra el diseño experimental para los experimentos de terapia combinada de los ejemplos 1 y 2.

La figura 2A muestra el volumen tumoral medio a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 1.

La figura 2B muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 1. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox. Prism notifica los resultados como no significativos (ns) ap> 0,05, significativos (simbolizados por "*") a 0,01 <p< 0,05, muy significativos ("**") a 0,001 <p< 0,01, y extremadamente significativos ("***") ap< 0,001 o ("****") ap< 0,0001.

La figura 2C es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de regresión tumoral completa (volumen tumoral < 50 mm3) para los distintos tratamientos del ejemplo 1. La significación estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher. Prism notifica los resultados como no significativos (ns) ap> 0,05, significativos (simbolizados por "*") a 0,01 <p< 0,05, muy significativos ("**") a 0,001 <p< 0,01, y extremadamente significativos ("***") ap< 0,001 o ("****") ap< 0,0001.

La figura 2D muestra los mismos datos que la figura 2C, estratificados en función de si el tumor superaba o no al menos 100 mm3 antes de la regresión.

La figura 3A muestra el volumen tumoral medio a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 2. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de 2 vías. Prism notifica los resultados como no significativos (ns) ap> 0,05, significativos (simbolizados por "*") a 0,01 <p< 0,05, muy significativos ("**") a 0,001 <p< 0,01.

La figura 3B muestra el volumen tumoral de animales de control individuales a lo largo del tiempo en el ejemplo 2.

La figura 3C muestra el volumen tumoral de animales individuales tratados con el anticuerpo anti-SEMA4D a lo largo del tiempo en el ejemplo 2.

La figura 3D muestra el volumen tumoral de animales individuales tratados con entinostat (ENT) y el anticuerpo de control a lo largo del tiempo en el ejemplo 2.

La figura 3E muestra el volumen tumoral de animales individuales tratados con ENT y el anticuerpo anti-SEMA4D a lo largo del tiempo en el ejemplo 2.

La figura 3F muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 2. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox. Prism notifica los resultados como significativos (simbolizados por "*") a 0,01 <p< 0,05 y muy significativos ("**") a 0,001 <p< 0,01.

La figura 4 muestra el diseño experimental para el experimento de terapia combinada del ejemplo 3.

La figura 5A muestra el volumen tumoral medio a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 3. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de 2 vías. **p< 0,01

La figura 5B muestra el porcentaje de supervivencia a lo largo del tiempo para los distintos tratamientos del ejemplo 3. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox. Prism notifica los resultados como no significativos ap> 0,05 o muy significativos ("**") ap< 0,01.

La figura 5C es un gráfico de barras que muestra el porcentaje de regresión tumoral completa (volumen tumoral < 50 mm3) para los distintos tratamientos del ejemplo 3. La significación estadística se determinó mediante la prueba exacta de Fisher. Prism notifica los resultados como significativos (simbolizados por "*") ap> 0,05 o muy significativos ("**") ap< 0,01.

Descripción detallada

Definiciones

Cabe destacar que el término "una" (o "un") entidad se refiere a una o más de esa entidad; por ejemplo, "una molécula de unión" se entiende que representa una o más moléculas de unión. Como tales, los términos "un" (o "una"), "uno o más" y "al menos uno" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento.

Además, "y/o", cuando se utiliza en el presente documento, debe entenderse como la descripción específica de cada una de las dos características o componentes especificados, con o sin la otra. Por lo tanto, la expresión "y/o" utilizada en una expresión como "A y/o B" en el presente documento pretende incluir "A y B", "A o B", "A" (solo) y "B" (solo). Asimismo, la expresión "y/o" utilizada en una expresión como "A, B y/o C" pretende abarcar cada una de las siguientes realizaciones: A, B yC; A, B o C; A o C; A o B; B o C; A y C; A y B; B y C; A (solo); B (solo); y C (solo).

A menos que se definan de otro modo, los términos y las expresiones técnicos y científicos utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que entienden habitualmente los expertos en la materia con la que está relacionada esta divulgación. Por ejemplo, the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2a ed., 2002, CRC Press; The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3a ed., 1999, Academic Press; y the Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, revisado, 2000, Oxford University Press, proporcionan a los expertos un diccionario general de muchos de los términos y expresiones utilizados en la presente divulgación.

Las unidades, prefijos y símbolos se indican en su forma aceptada por el Sistema Internacional de Unidades (SI). Los intervalos numéricos incluyen los números que definen el intervalo. A menos que se indique lo contrario, las secuencias de aminoácidos se escriben de izquierda a derecha en la orientación amino-carboxi. Los epígrafes que figuran en el presente documento no constituyen limitaciones de los diversos aspectos o facetas de la divulgación, que pueden tenerse por referencia a la memoria descriptiva en su conjunto. Por consiguiente, los términos y expresiones definidos inmediatamente a continuación se definen de forma más completa remitiéndose a la memoria descriptiva en su totalidad.

Siempre que las realizaciones se describan con la expresión "que comprende", también se proporcionan realizaciones análogas descritas en términos de "que consiste en" y/o "que consiste fundamentalmente en".

En el presente documento los aminoácidos se mencionan con sus símbolos de tres letras habitualmente conocidos o con los símbolos de una letra recomendados por la Comisión de Nomenclatura Bioquímica IUPAC-IUB. Los nucleótidos, por su parte, se mencionan con sus códigos de una sola letra habitualmente aceptados.

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren o describen la afección fisiológica en mamíferos en la que una población de células se caracteriza por un crecimiento celular no regulado. Los cánceres pueden clasificarse, por ejemplo, como tumores sólidos o neoplasias malignas, o cánceres hematológicos o neoplasias malignas. Ambos tipos pueden migrar a lugares remotos en forma de metástasis. Un tumor sólido puede clasificarse, por ejemplo, como un sarcoma, un carcinoma, un melanoma o una metástasis de los mismos.

Las expresiones "trastorno proliferativo" y "enfermedad proliferativa" se refieren a trastornos asociados con la proliferación celular anómala, tal como el cáncer.

"Tumor" y "neoplasia", tal como se utilizan en el presente documento, se refieren a cualquier masa de tejido resultante de un crecimiento o proliferación celular excesiva, ya sea benigna (no cancerosa) o maligna (cancerosa), incluidas las lesiones precancerosas. En determinadas realizaciones, los tumores descritos en el presente documento expresan un receptor de SEMA4D, por ejemplo, plexina-B1, plexina-B2 y/o CD72 y/o pueden expresar SEMA4D.

Los términos "metástasis", "metastásico" y otros equivalentes gramaticales utilizados en el presente documento se refieren a las células cancerosas que se propagan o transfieren desde el lugar de origen (por ejemplo, un tumor primario) a otras regiones del cuerpo con el desarrollo de una lesión cancerosa similar en la nueva ubicación. Una célula "metastásica" o "metastatizante" es aquella que pierde los contactos adhesivos con las células vecinas y migra a través del torrente sanguíneo o linfático desde el lugar primario de la enfermedad para invadir estructuras corporales vecinas. Los términos también se refieren al proceso de metástasis, que incluye, entre otros, el desprendimiento de células cancerosas de un tumor primario, la intravasación de las células tumorales a la circulación, su supervivencia y migración a un lugar distante, la adhesión y extravasación a un nuevo lugar desde la circulación, y la microcolonización en el lugar distante, así como el crecimiento y desarrollo del tumor en el lugar distante.

Algunos ejemplos de tales tumores sólidos pueden incluir, por ejemplo, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células renales, carcinoma ductal de mama, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, melanoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico (CPNM), adenocarcinoma de pulmón, cáncer de peritoneo, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer neuroendocrino, glioblastoma, cáncer de cuello de útero, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma de endometrio o de útero, cáncer de esófago, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de próstata, cáncer de vulva, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de cabeza y cuello, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

Los ejemplos de cánceres o neoplasias hematológicas incluyen, entre otros, leucemia, linfoma, mieloma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinadas realizaciones, los cánceres que son susceptibles de tratamiento a través de los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen, entre otros, sarcomas, carcinomas de mama, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer de cabeza y cuello, CPNM, cáncer esofágico, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer colorrectal y cáncer de páncreas. En determinadas realizaciones, los cánceres o células tumorales que son susceptibles de tratamiento mediante los procedimientos proporcionados en el presente documento expresan receptores de plexina-B1, plexina-B2 o CD72 para SEMA4D.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "polipéptido" pretende abarcar un "polipéptido" en singular, así como "polipéptidos" en plural, y se refiere a una molécula compuesta de monómeros (aminoácidos) unidos linealmente por enlaces amida (también conocidos como enlaces peptídicos). El término "polipéptido" se refiere a cualquier cadena o cadenas de dos o más aminoácidos y no se refiere a una longitud específica del producto. Por lo tanto, los péptidos, dipéptidos, tripéptidos, oligopéptidos, "proteína", "cadena de aminoácidos" o cualquier otro término o expresión utilizado para referirse a una cadena o cadenas de dos o más aminoácidos se incluyen en la definición de "polipéptido", y el término "polipéptido" puede utilizarse en lugar de cualquiera de estos términos o indistintamente con ellos. El término "polipéptido" también se refiere a los productos de las modificaciones posteriores a la expresión del polipéptido, incluidas, entre otras, la glicosilación, acetilación, fosforilación, amidación y derivatización con grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica o modificación por aminoácidos de origen no natural. Un polipéptido puede proceder de una fuente biológica o producirse mediante tecnología recombinante, pero no se traduce necesariamente a partir de una secuencia de ácido nucleico indicada. Puede generarse de cualquier manera, incluida la síntesis química.

Un polipéptido, tal como se describe en el presente documento, puede tener un tamaño de aproximadamente 3 o más, 5 o más, 10 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 75 o más, 100 o más, 200 o más, 500 o más, 1000 o más, o 2000 o más aminoácidos. Los polipéptidos pueden tener una estructura tridimensional definida, aunque no necesariamente. Los polipéptidos con una estructura tridimensional definida se denominan plegados, y los polipéptidos que no poseen una estructura tridimensional definida, sino que pueden adoptar un gran número de conformaciones diferentes, se denominan desplegados. Tal como se utiliza en el presente documento, el término glucoproteína se refiere a una proteína acoplada al menos a un resto carbohidrato que está unido a la proteína a través de una cadena lateral de un aminoácido que contiene oxígeno o nitrógeno, por ejemplo, una serina o una asparagina.

Por polipéptido "aislado", o uno de sus fragmentos, variantes o derivados, se entiende un polipéptido que no se encuentra en su medio natural. No se requiere ningún nivel concreto de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede extraerse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos producidos de modo recombinante y las proteínas expresadas en células hospedadoras se consideran aislados según se describe en el presente documento, al igual que los polipéptidos nativos o recombinantes que se han separado, fraccionado o purificado parcial o sustancialmente mediante cualquier técnica adecuada.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "polipéptido de origen no natural" o cualquiera de sus variantes gramaticales es una expresión condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye a aquellas formas del polipéptido que un juez o un órgano administrativo o judicial determina o interpreta o pueda determinar o interpretar que son "de origen natural".

Otros polipéptidos divulgados en el presente documento son fragmentos, derivados, análogos o variantes de los polipéptidos anteriores y cualquiera de sus combinaciones. Los términos "fragmento", "variante", "derivado" y "análogo", tal como se divulgan en el presente documento, incluyen cualquier polipéptido que conserva al menos algunas de las propiedades del anticuerpo o polipéptido nativo correspondiente, por ejemplo, la unión específica a un antígeno. Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos, así como fragmentos de deleción, además de los fragmentos de anticuerpos específicos que se analizan en otros puntos del presente documento. Las variantes, por ejemplo, de un polipéptido incluyen fragmentos como los descritos anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. En determinados aspectos, las variantes pueden ser de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse mediante técnicas de mutagénesis conocidas. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos conservadoras o no conservadoras. Los derivados son polipéptidos que han sido alterados para que presenten características adicionales que no se encuentran en el polipéptido original. Algunos ejemplos son las proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden denominarse en el presente documento "análogos de polipéptidos" Tal como se utiliza en el presente documento, un "derivado" de un polipéptido también puede remitir a un polipéptido sujeto que tiene uno o más aminoácidos químicamente derivatizados por reacción de un grupo funcional lateral. También se incluyen como "derivados" los péptidos que contienen uno o más derivados de los veinte aminoácidos convencionales. Por ejemplo, la 4-hidroxiprolina puede sustituir a la prolina; la 5-hidroxilisina puede sustituir a la lisina; la 3-metilhistidina puede sustituir a la histidina; la homoserina puede sustituir a la serina; y la ornitina puede sustituir a la lisina.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un aminoácido se sustituye por otro aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de aminoácidos con cadenas laterales similares, que incluyen cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Por ejemplo, la sustitución de tirosina por una fenilalanina es una sustitución conservadora. En determinadas realizaciones, las sustituciones conservadoras en las secuencias de los polipéptidos y los anticuerpos de la presente divulgación no anulan la unión del polipéptido o anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos al antígeno al que se une la molécula de unión. Los procedimientos para identificar sustituciones conservadoras de nucleótidos y aminoácidos que no eliminan la unión al antígeno son bien conocidos en la técnica (véase, por ejemplo, Brummellet al.,Biochem., 32: 1180-1187 (1993); Kobayashiet al.,Protein Eng., 12(10):879-884 (1999); y Burkset al.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 94:412-417 (1997)).

El término "polinudeótido" pretende abarcar un ácido nucleico en singular, así como ácidos nucleicos en plural, y se refiere a una molécula o construcción aislada de ácido nucleico, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm), ADNc o ADN plasmídico (ADNp). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, como el que se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (ANP)). Las expresiones "ácido nucleico" o "secuencia de ácido nucleico" se refieren a uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido.

Un ácido nucleico o polinucleótido "aislado" significa cualquier forma del ácido nucleico o polinucleótido que está separada de su entorno nativo. Por ejemplo, un polinucleótido purificado en gel o un polinucleótido recombinante que codifica un polipéptido contenido en un vector se consideraría "aislado" También se considera "aislado" un segmento polinucleotídico, por ejemplo, un producto de PCR, que ha sido diseñado para tener sitios de restricción para la clonación Otros ejemplos de polinucleótidos aislados incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células hospedadoras heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en una solución no nativa, tal como un tampón o una solución salina. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN de polinucleótidosin vivooin vitro,en los que dichos transcritos no se encontrarían en la naturaleza. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados incluyen además moléculas de este tipo producidas sintéticamente. Además, el polinucleótido o un ácido nucleico puede ser o puede incluir un elemento regulador, tal como un promotor, un sitio de unión a ribosomas o un terminador de la transcripción.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "polinucleótido de origen no natural" o cualquiera de sus variantes gramaticales es una expresión condicional que excluye explícitamente, pero solo excluye a aquellas formas del polinucleótido que un juez o un órgano administrativo o judicial determina o interpreta o pueda determinar o interpretar que son "de origen natural".

Tal como se utiliza en el presente documento, una "región codificante" es una porción de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de terminación" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse parte de una región codificante, pero cualquier secuencia flanqueante, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosomas, terminadores transcripcionales, intrones y similares, no forman parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes pueden estar presentes en una única construcción polinucleotídica, por ejemplo, en un único vector, o en construcciones polinucleotídicas distintas, por ejemplo, en vectores distintos (diferentes). Además, cualquier vector puede contener una única región codificante o puede comprender dos o más regiones codificantes, por ejemplo,un único vector puede codificar por separado una región variable de cadena pesada de inmunoglobulina y una región variable de cadena ligera de inmunoglobulina. Además, un vector, un polinucleótido o un ácido nucleico puede incluir regiones codificantes heterólogas, fusionadas o no con otra región codificante. Las regiones codificantes heterólogas incluyen, entre otras, las que codifican elementos o motivos especializados, tales como un péptido señal secretor o un dominio funcional heterólogo.

En determinadas realizaciones, el polinucleótido o ácido nucleico es ADN. En el caso del ADN, un polinucleótido que comprende un ácido nucleico que codifica un polipéptido normalmente puede incluir un promotor y/u otros elementos de control de la transcripción o la traducción asociados operativamente con una o más regiones codificantes. Una asociación operativa es cuando una región codificante de un producto génico, por ejemplo, un polipéptido, se asocia con una o más secuencias reguladoras de tal manera que la expresión del producto génico queda bajo la influencia o el control de la secuencia o secuencias reguladoras. Dos fragmentos de ADN (tales como una región codificante de polipéptido y un promotor asociado a ella) están "asociados operativamente" si la inducción de la función del promotor provoca la transcripción del ARNm que codifica el producto génico deseado y si la naturaleza de la unión entre los dos fragmentos de ADN no interfiere con la capacidad de las secuencias reguladoras de la expresión para dirigir la expresión del producto génico ni interfiere con la capacidad del molde de ADN para ser transcrito. Así, una región promotora estará asociada operativamente a un ácido nucleico que codifica un polipéptido si el promotor es capaz de llevar a cabo la transcripción de dicho ácido nucleico. El promotor puede ser un promotor específico de célula que dirija la transcripción sustancial del ADN en células predeterminadas. Otros elementos de control de la transcripción, además de un promotor, por ejemplo, potenciadores, operadores, represores y señales de terminación de la transcripción, pueden asociarse operativamente con el polinucleótido para dirigir la transcripción específica de célula.

Los expertos en la materia conocen diversas regiones de control de la transcripción. Entre ellas se incluyen, entre otras, regiones de control de la transcripción que actúan en células de vertebrados, tales como, por ejemplo, segmentos promotores y potenciadores de citomegalovirus (el promotor temprano inmediato, junto con el intrón-A), virus del simio 40 (el promotor temprano) y retrovirus (tal como el virus del sarcoma de Rous), entre otras. Otras regiones de control de la transcripción incluyen las procedentes de genes de vertebrados, tales como la actina, la proteína de choque térmico, la hormona de crecimiento bovina y la p-globina de conejo, así como otras secuencias capaces de controlar la expresión génica en células eucariotas. Otras regiones de control de la transcripción adecuadas incluyen promotores y potenciadores específicos de tejido, así como promotores inducibles por linfocinas (por ejemplo, promotores inducibles por interferones o interleucinas).

Del mismo modo, los expertos en la materia conocen diversos elementos de control de la traducción. Estos incluyen, entre otros, sitios de unión a ribosomas, codones de inicio y terminación de la traducción y elementos procedentes de picornavirus (en concreto, un sitio interno de entrada a ribosomas, o IRES ("internal ribosome entry site"), también denominado secuencia CITE).

En otras realizaciones, un polinucleótido puede ser ARN, por ejemplo, en forma de ARN mensajero (ARNm), ARN de transferencia o ARN ribosómico.

Las regiones codificantes de polinucleótidos y ácidos nucleicos pueden asociarse con otras regiones codificantes que codifican péptidos secretores o señal, que dirigen la secreción de un polipéptido codificado por un polinucleótido tal como se divulga en el presente documento. Según la hipótesis de la señal, las proteínas secretadas por las células de mamíferos tienen un péptido señal o secuencia líder secretora que se escinde de la proteína madura una vez que se ha iniciado la exportación de la cadena proteica en crecimiento a través del retículo endoplásmico rugoso. Los expertos en la materia saben que los polipéptidos secretados por células de vertebrados pueden tener un péptido señal fusionado con el extremo N-terminal del polipéptido, que se escinde del polipéptido completo o "de longitud completa" para producir una forma secretada o "madura" del polipéptido. En determinadas realizaciones, se utiliza el péptido señal nativo, por ejemplo, un péptido señal de cadena pesada o de cadena ligera de inmunoglobulina, o un derivado funcional de esta secuencia que conserva la capacidad de dirigir la secreción del polipéptido que está asociado operativamente con él. Como alternativa, puede utilizarse un péptido señal heterólogo de mamífero o uno de sus derivados funcionales. Por ejemplo, la secuencia líder de tipo salvaje puede sustituirse por la secuencia líder del activador tisular del plasminógeno ("tissue plasminogen activator", TPA) humano o de la p-glucuronidasa de ratón.

En el presente documento se divulgan determinadas moléculas de unión, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de las mismas. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de tamaño completo, la expresión "molécula de unión" engloba anticuerpos de tamaño completo, así como subunidades de unión al antígeno, fragmentos, variantes, análogos o derivados de dichos anticuerpos, por ejemplo, moléculas de anticuerpo modificadas o sus fragmentos que se unen al antígeno de forma similar a las moléculas de anticuerpo, pero que utilizan un andamiaje diferente.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión" se refiere, en su sentido más amplio, a una molécula que se une específicamente a un receptor, por ejemplo, un epítopo o un determinante antigénico. Tal como se describe más adelante, una molécula de unión puede comprender uno o más "dominios de unión al antígeno" descritos en el presente documento. Un ejemplo no limitante de molécula de unión es un anticuerpo o uno de sus fragmentos que conserva la unión específica al antígeno.

Las expresiones "dominio de unión" y "dominio de unión al antígeno" se utilizan indistintamente en el presente documento y se refieren a una región de una molécula de unión que es necesaria y suficiente para unirse específicamente a un epítopo. Por ejemplo, un "Fv", por ejemplo, una cadena pesada variable y una cadena ligera variable de un anticuerpo, ya sea como dos subunidades polipeptídicas separadas o como una única cadena, se considera un "dominio de unión" Otros dominios de unión al antígeno incluyen, entre otros, la cadena pesada variable (VHH) de un anticuerpo procedente de una especie de camélido, o seis regiones determinantes de la complementariedad ("complementarity determining regions", CDR) de inmunoglobulina expresadas en un andamiaje de fibronectina. Una "molécula de unión", tal como se describe en el presente documento, puede incluir uno, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce o más "dominios de unión al antígeno".

Los términos "anticuerpo" e "inmunoglobulina" pueden utilizarse indistintamente en el presente documento. Un anticuerpo (o uno de sus fragmentos, variantes o derivados según se describe en el presente documento) incluye al menos la región variable de una cadena pesada (para especies de camélidos) o al menos las regiones variables de una cadena pesada y una cadena ligera. Las estructuras básicas de las inmunoglobulinas en los sistemas de vertebrados se conocen relativamente bien. Véase, por ejemplo, Harlowet al.,Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed., 1988). Amenos que se indique lo contrario, el término "anticuerpo" engloba desde un pequeño fragmento de un anticuerpo que se une a un antígeno hasta un anticuerpo de tamaño completo, por ejemplo, un anticuerpo IgG que incluye dos cadenas pesadas completas y dos cadenas ligeras completas, un anticuerpo IgA que incluye cuatro cadenas pesadas completas y cuatro cadenas ligeras completas y, opcionalmente, incluye una cadena J y/o un componente secretor, o un anticuerpo IgM que incluye diez o doce cadenas pesadas completas y diez o doce cadenas ligeras completas y, opcionalmente, incluye una cadena J.

Tal como se analizará con más detalle a continuación, el término "inmunoglobulina" comprende diversas clases amplias de polipéptidos que pueden distinguirse bioquímicamente. Los expertos en la materia apreciarán que las cadenas pesadas se clasifican como gamma, mu, alfa, delta o épsilon (<y>,<m>, a, 8, £) con algunas subclases (por ejemplo, y1-y4 o a1-a2)). La naturaleza de esta cadena determina la "clase" del anticuerpo como IgG, IgM, IgA IgG o IgE, respectivamente. Las subclases de inmunoglobulinas (isotipos), por ejemplo, IgGi, IgG<2>, IgG<3>, IgG<4>, IgAi, IgA<2>, etc., están bien caracterizadas y se sabe que confieren especialización funcional. Las versiones modificadas de cada una de estas clases e isotipos son fácilmente discernibles por el experto a la vista de la presente divulgación y, en consecuencia, están dentro del alcance de esta divulgación.

Las cadenas ligeras se clasifican como kappa o lambda (k, A). Cada clase de cadena pesada puede unirse a una cadena ligera kappa o lambda. En general, las cadenas ligeras y pesadas están unidas covalentemente entre sí, y las porciones de "cola" de las dos cadenas pesadas están unidas entre sí por enlaces disulfuro covalentes o enlaces no covalentes cuando las inmunoglobulinas son generadas por hibridomas, linfocitos B o células hospedadoras modificadas genéticamente. En la cadena pesada, las secuencias de aminoácidos van desde un N-terminal en los extremos bifurcados de la configuración Y hasta el C-terminal en la parte inferior de cada cadena. La estructura básica de determinados anticuerpos, por ejemplo, los anticuerpos IgG, incluye dos subunidades de cadena pesada y dos subunidades de cadena ligera conectadas covalentemente mediante enlaces disulfuro para formar una estructura en "Y", también denominada en el presente documento estructura "H2L2".

Tanto las cadenas ligeras como las pesadas se dividen en regiones de homología estructural y funcional. Los términos "constante" y "variable" se utilizan desde el punto de vista funcional. A este respecto, se apreciará que las regiones variables de las porciones variables de cadena ligera (VL) y pesada (VH) determinan el reconocimiento del antígeno y la especificidad. Por el contrario, los dominios constantes de la cadena ligera (CL) y de la cadena pesada (CH1, CH2 o CH3) confieren propiedades biológicas tales como la secreción, la movilidad transplacentaria, la unión al receptor de Fc, la unión al complemento y similares. Por convención, la numeración de los dominios de la región constante aumenta a medida que se alejan del sitio de unión al antígeno o amino-terminal del anticuerpo. La porción N-terminal es una región variable, y en la porción C-terminal hay una región constante; los dominios CH3 (o CH4 en el caso de la IgM) y CL en realidad comprenden el carboxi-terminal de la cadena pesada y ligera, respectivamente.

Tal como se ha indicado anteriormente, una región variable (es decir, el "dominio de unión") permite a la molécula de unión reconocer selectivamente y unir específicamente epítopos en antígenos. Es decir, el dominio VL y el dominio VH, o subconjunto de las regiones determinantes de la complementariedad (CDR), de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, se combinan para formar la región variable que define un sitio tridimensional de unión al antígeno. Más concretamente, el sitio de unión al antígeno está definido por tres CDR en cada una de las cadenas VH y VL. Algunos anticuerpos forman estructuras más grandes. Por ejemplo, la IgA puede formar una molécula que incluya dos unidades H2L2, una cadena J y un componente secretor, todos conectados covalentemente mediante enlaces disulfuro, y la IgM puede formar una molécula pentamérica o hexamérica que incluya cinco o seis unidades H2L2 y, opcionalmente, una cadena J conectada covalentemente mediante enlaces disulfuro.

Las seis "regiones determinantes de la complementariedad" o "CDR" presentes en el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo son secuencias cortas y no contiguas de aminoácidos que están específicamente colocadas para formar el dominio de unión al antígeno cuando el anticuerpo adopta su configuración tridimensional en un entorno acuoso. El resto de los aminoácidos del dominio de unión al antígeno, denominados regiones "marco", muestran una menor variabilidad intermolecular. Las regiones marco adoptan en gran medida una conformación de lámina p y las CDR forman bucles que conectan la estructura de lámina p y, en algunos casos, forman parte de ella. Así, las regiones marco actúan formando un andamiaje que permite colocar las CDR en la orientación correcta mediante interacciones no covalentes entre cadenas. El dominio de unión al antígeno formado por las CDR colocadas define una superficie complementaria al epítopo del antígeno inmunorreactivo. Esta superficie complementaria favorece la unión no covalente del anticuerpo a su epítopo afín. Los expertos en la materia pueden identificar con facilidad los aminoácidos que componen las<c>D<r>y las regiones marco, respectivamente, para cualquier región variable de cadena pesada o ligera concreta, ya que se han definido de diversas formas (véase, "Sequences of Proteins of Immunological Interest", Kabat, E.,et al.,U.S. Department of Health and Human Services (1983); y Chothia y Lesk, J. Mol. Biol., 796:901-917 (1987)).

En el caso de que existan dos o más definiciones de un término o expresión que se utilicen y/o acepten en la técnica, la definición del término o la expresión, tal como se utiliza en el presente documento, pretende incluir todos esos significados a menos que se indique explícitamente lo contrario. Un ejemplo específico es el uso de la expresión "región determinante de la complementariedad" ("CDR") para describir los sitios de combinación con el antígeno no contiguos que se encuentran dentro de la región variable de los polipéptidos de cadena pesada y ligera. Estas regiones concretas han sido descritas, por ejemplo, por Kabatet al.,U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequences of Proteins of Immunological Interest" (1983) y por Chothiaet al.,J. Mol. Biol., 196:901-917 (1987). Las definiciones de Kabat y Chothia incluyen solapamientos o subconjuntos de aminoácidos cuando se comparan entre sí. No obstante, la aplicación de cualquiera de las definiciones (u otras definiciones conocidas por los expertos en la materia) para referirse a una CDR de un anticuerpo o una variante del mismo se entiende que está dentro del ámbito de la expresión tal como se define y utiliza en el presente documento, a menos que se indique lo contrario. Los aminoácidos apropiados que incluyen las CDR definidas por cada una de las referencias citadas anteriormente se exponen a continuación en la tabla 1 a modo de comparación. Los números exactos de aminoácidos que incluye una CDR concreta variarán en función de la secuencia y el tamaño de la CDR. Los expertos en la materia pueden determinar por procedimientos habituales qué aminoácidos comprende una CDR concreta dada la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo.

Tabla 1: Definiciones de CDR1

Kabatet al.también definieron un sistema de numeración para secuencias de dominio variable que es aplicable a cualquier anticuerpo. Los expertos en la materia pueden asignar sin ambigüedad este sistema de "numeración de Kabat" a cualquier secuencia de dominio variable, sin depender de ningún dato experimental más allá de la propia secuencia. En el presente documento, la "numeración Kabat" se refiere al sistema de numeración establecido por Kabatet al.,U.S. Dept. of Health and Human Services, "Sequence of Proteins of Immunological Interest" (1983). Sin embargo, a menos que se indique explícitamente el uso del sistema de numeración de Kabat, en esta divulgación se utiliza la numeración consecutiva para todas las secuencias de aminoácidos.

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados incluyen, entre otros, anticuerpos policlonales, monoclonales, humanos, humanizados o quiméricos, anticuerpos monocatenarios, fragmentos de unión al epítopo, por ejemplo, Fab, Fab' y F(ab')<2>, Fd, Fv, Fv monocatenarios (scFv), anticuerpos monocatenarios, Fv unidos por disulfuro (sdFv), fragmentos que comprenden un dominio VL o VH, fragmentos producidos por un banco de expresión de Fab. Las moléculas scFv son conocidas en la técnica y se describen, por ejemplo, en la patente de e E. UU. 5 892 019. Las moléculas de inmunoglobulina o de anticuerpo incluidas en la presente divulgación pueden ser de cualquier tipo (por ejemplo, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA e IgY), clase (por ejemplo, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 e IgA2) o subclase de molécula de inmunoglobulina.

"Se une específicamente" significa, en general, que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo, o un fragmento, variante o derivado del mismo, se une a un epítopo a través de su dominio de unión al antígeno, y que la unión implica cierta complementariedad entre el dominio de unión al antígeno y el epítopo. Según esta definición, se dice que una molécula de unión se "une específicamente" a un epítopo cuando se une a ese epítopo, a través de su dominio de unión al antígeno, con más facilidad de la que se uniría a un epítopo aleatorio no relacionado. El término "especificidad" se utiliza en el presente documento para calificar la afinidad relativa por la que una determinada molécula de unión se une a un determinado epítopo. Por ejemplo, se puede considerar que la molécula de unión "A" tiene una mayor especificidad por un epítopo dado que la molécula de unión "B", o se puede decir que la molécula de unión "A" se une al epítopo "C" con mayor especificidad que la que tiene por el epítopo relacionado "D"

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo divulgado en el presente documento, se une a un antígeno diana con una constante de disociación (k(off)) inferior o igual a 5 x 10-2 s-1, 10-2s-1, 5 x 10-3s-1, 10-3 s-1, 5 x 10-4s-1, 10-4 s-1, 5 x 10-5s-1, o 10-5s-15 x 10-6s-1, 10-6s-1, 5 x 10 7 s-1, o 10-7 s-1.

Se puede decir que una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante 0 derivado divulgado en el presente documento, se une a un antígeno diana con una constante de asociación (k(on)) mayor o igual a 103 M-1 s-1, 5 x 103 M-1 s-1, 104 M-1 s-1, 5 x 104 M-1 s-1, 105 M-1 s-1, 5 x 105 M-1 s-1, 106 M-1 s-1, o 5 x 106 M-1 s-1, o 107 M-1 s-1.

Se dice que una molécula de unión, por ejemplo,un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo inhibe competitivamente la unión a un epítopo dado de un anticuerpo de referencia o un fragmento de unión al antígeno si se une preferentemente a ese epítopo hasta el punto de bloquear, en cierto grado, la unión al epítopo del anticuerpo de referencia o un fragmento de unión al antígeno. La inhibición competitiva puede determinarse por cualquier procedimiento conocido en la técnica, por ejemplo, ensayos ELISA de competición. Puede decirse que una molécula de unión inhibe competitivamente la unión del anticuerpo de referencia o del fragmento de unión al antígeno a un epítopo dado en al menos un 90 %, al menos un 80 %, al menos un 70 %, al menos un 60 % o al menos un 50 %.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "afinidad" se refiere a una medida de la fuerza de la unión de un epítopo individual a uno o más dominios de unión, por ejemplo, de una molécula de inmunoglobulina. Véase, por ejemplo, Harlowet al.,Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) en las páginas 27-28. Tal como se utiliza en el presente documento, el término "avidez" se refiere a la estabilidad global del complejo entre una población de dominios de unión y un antígeno. Véase, por ejemplo, Harlow en las páginas 29-34. La avidez está relacionada tanto con la afinidad de los dominios individuales de unión en la población por epítopos específicos, como con las valencias de las inmunoglobulinas y el antígeno. Por ejemplo, la interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un antígeno con una estructura de epítopo altamente repetitiva, al como un polímero, sería de alta avidez. Una interacción entre un anticuerpo monoclonal bivalente y un receptor presente en alta densidad en la superficie de una célula también sería de alta avidez.

Las moléculas de unión o los fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de las mismas, tal como se divulgan en el presente documento, también pueden describirse o especificarse en términos de su reactividad cruzada. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "reactividad cruzada" se refiere a la capacidad de una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo, específico para un antígeno, de reaccionar con un segundo antígeno; una medida de parentesco entre dos sustancias antigénicas diferentes. Así, una molécula de unión tiene reactividad cruzada si se une a un epítopo distinto del que indujo su formación. El epítopo de reactividad cruzada suele contener muchas de las mismas características estructurales complementarias que el epítopo inductor y, en algunos casos, puede encajar mejor que el original.

Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo también puede describirse o especificarse en términos de su afinidad de unión a un antígeno. Por ejemplo, una molécula de unión puede unirse a un antígeno con una constante de disociación o Kd no superior a 5 x 10-2 M, 10-2 M, 5 x 10-3 M, 10-3 M, 5 x 10-4 M, 10-4 M, 5 x 10-5 M, 10-5 M, 5 x 10-6 M, 10-6 M, 5 x 10-7 M, 10-7 M, 5 x 10-8 M, 10-8 M, 5 x 10-9 M, 10-9 M, 5 x 10-10 M, 10-10 M, 5 x 10-11 M, 10-11 M, 5 x 10-12 M, 10-12 M, 5 x 10-13 M, 10-13 M, 5 x 10-14 M, 10-14 M, 5 x 10-15 M, o 10 15 M.

Los fragmentos de anticuerpo que incluyen anticuerpos monocatenarios u otros dominios de unión pueden existir solos o combinados con uno o más de los siguientes: región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, cadena J o componente secretor. También se incluyen fragmentos de unión al antígeno que pueden incluir cualquier combinación de regiones variables con una o más de una región bisagra, dominios CH1, CH2, CH3 o CH4, una cadena J o un componente secretor. Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos, o sus fragmentos de unión al antígeno, pueden ser de cualquier origen animal, incluidas aves y mamíferos. Los anticuerpos pueden ser anticuerpos humanos, murinos, de burro, conejo, cabra, cobaya, camello, llama, caballo o pollo. En otra realización, la región variable puede ser de origen condrictoide (por ejemplo, de tiburones). Tal como se utilizan en el presente documento, los anticuerpos "humanos" incluyen anticuerpos que tienen la secuencia de aminoácidos de una inmunoglobulina humana e incluyen anticuerpos aislados de bancos de inmunoglobulinas humanas o de animales transgénicos para una o más inmunoglobulinas humanas y, en algunos casos, pueden expresar inmunoglobulinas endógenas y en otros no, tal como se describeinfray, por ejemplo en la patente de EE. UU. n.° 5939598 de Kucherlapatiet al.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "subunidad de cadena pesada" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena pesada de inmunoglobulina. Una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo que comprende una subunidad de cadena pesada, incluye al menos uno de los siguientes: un dominio VH, un dominio CH1, un dominio bisagra (por ejemplo, región bisagra superior, intermedia y/o inferior), un dominio CH2, un dominio CH3, un dominio CH4, o una de sus variantes o fragmentos. Por ejemplo, una molécula de unión, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, además de un dominio VH, un dominio CH1; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH2; un dominio CH1 y un dominio CH3; un dominio CH1, una bisagra y un dominio CH3; o un dominio CH1, un dominio bisagra, un dominio CH2 y un dominio CH3. En determinados aspectos, una molécula de unión, por ejemplo,un anticuerpo o un fragmento, variante o derivado del mismo puede incluir, además de un dominio VH, un dominio CH3 y un dominio CH4; o un dominio CH3, un dominio CH4 y una cadena J. Además, una molécula de unión para su uso en la divulgación puede carecer de determinadas porciones de región constante, por ejemplo,todo o parte de un dominio CH2. Un experto en la materia entenderá que estos dominios (por ejemplo, la subunidad de cadena pesada) pueden modificarse de modo que varíen en la secuencia de aminoácidos con respecto a la molécula de inmunoglobulina original.

Las subunidades de cadena pesada de una molécula de unión, por ejemplo,un anticuerpo o un fragmento del mismo, pueden incluir dominios derivados de diferentes moléculas de inmunoglobulina. Por ejemplo, una subunidad de cadena pesada de un polipéptido puede incluir un dominio CH1 derivado de una molécula de IgG1 y una región bisagra derivada de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una subunidad de cadena pesada puede incluir una región bisagra derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG3. En otro ejemplo, una subunidad de cadena pesada puede comprender una bisagra quimérica derivada, en parte, de una molécula de IgG1 y, en parte, de una molécula de IgG4.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "subunidad de cadena ligera" incluye secuencias de aminoácidos derivadas de una cadena ligera de inmunoglobulina. La subunidad de cadena ligera incluye al menos uno de los dominios VL o CL (por ejemplo, C<k>o CA).

Las moléculas de unión, por ejemplo, anticuerpos o sus fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados pueden describirse o especificarse en términos del epítopo o epítopos o porción o porciones de un antígeno que reconocen o al que se unen específicamente. La porción de un antígeno diana que interactúa específicamente con el dominio de unión al antígeno de un anticuerpo es un "epítopo" o un "determinante antigénico" Un antígeno diana puede comprender un único epítopo o al menos dos epítopos, y puede incluir cualquier número de epítopos, en función del tamaño, la conformación y el tipo de antígeno.

Tal como se ha indicado anteriormente, las estructuras de las subunidades y la configuración tridimensional de las regiones constantes de las diversas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas. Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio VH" incluye el dominio variable amino terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina y la expresión "dominio CH1" incluye el primer dominio de región constante (más amino terminal) de una cadena pesada de inmunoglobulina. El dominio CH1 es adyacente al dominio VH y es amino-terminal a la región bisagra de una molécula de cadena pesada típica de inmunoglobulina.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "dominio CH2" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que se extiende, por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido 244 hasta el aminoácido 360 de un anticuerpo IgG utilizando esquemas de numeración convencionales (aminoácidos 244 a 360, sistema de numeración Kabat; y aminoácidos 231-340), sistema de numeración EU; véase Kabat E.A.et al. op. cit.El dominio CH3 se extiende desde el dominio CH2 hasta el extremo C-terminal de la molécula de IgG y comprende aproximadamente 108 aminoácidos. Determinadas clases de inmunoglobulina, por ejemplo, IgM, incluyen además una región CH4.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "región bisagra" incluye la porción de una molécula de cadena pesada que une el dominio CH1 con el dominio CH2. Esta región bisagra comprende aproximadamente 25 aminoácidos y es flexible, lo que permite que las dos regiones de unión al antígeno N-terminales se muevan independientemente.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "enlace disulfuro" incluye el enlace covalente formado entre dos átomos de azufre. El aminoácido cisteína comprende un grupo tiol que puede formar un enlace disulfuro o puente con un segundo grupo tiol. En determinadas moléculas de IgG, las regiones CH1 y CL están unidas por un enlace disulfuro y las dos cadenas pesadas están unidas por dos enlaces disulfuro en las posiciones correspondientes a 239 y 242 según el sistema de numeración de Kabat (posición 226 o 229, sistema de numeración EU).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo quimérico" se refiere a un anticuerpo en el que la región o sitio inmunorreactivo se obtiene o deriva de una primera especie y la región constante (que puede estar intacta, ser una parte o estar modificada) se obtiene de una segunda especie. En algunas realizaciones, la región o sitio de unión a la diana provendrá de una fuente no humana (por ejemplo, ratón o primate) y la región constante es humana.

Las expresiones "anticuerpo multiespecífico" o "anticuerpo biespecífico" se refieren a un anticuerpo que tiene dominios de unión para dos o más epítopos diferentes dentro de una única molécula de anticuerpo. Además de la estructura canónica del anticuerpo, pueden construirse otras moléculas de unión con dos especificidades de unión. La unión a epítopos de anticuerpos biespecíficos o multiespecíficos puede ser simultánea o secuencial. Los triomas y los hibridomas híbridos son dos ejemplos de líneas celulares que pueden secretar anticuerpos biespecíficos. Los anticuerpos biespecíficos también pueden construirse por medios recombinantes (Strohlein y Heiss, Future Oncol., 6:1387-1394 (2010); Mabry y Snavely, IDrugs, 13:543-9 (2010)). Un anticuerpo biespecífico también puede ser un diacuerpo.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "anticuerpo modificado" se refiere a un anticuerpo en el que el dominio variable en la cadena pesada y ligera o en ambas se altera mediante la sustitución al menos parcial de uno o más aminoácidos en las regiones CDR o marco. En determinados aspectos, pueden injertarse CDR enteras procedentes de un anticuerpo de especificidad conocida en las regiones marco de un anticuerpo heterólogo. Aunque las CDR alternativas pueden derivarse de un anticuerpo de la misma clase o incluso subclase que el anticuerpo del que se derivan las regiones marco, las CDR también pueden derivarse de un anticuerpo de clase diferente, por ejemplo, de un anticuerpo de una especie diferente. Un anticuerpo diseñado en el que una o más CDR "donantes" de un anticuerpo no humano de especificidad conocida se injertan en una región marco de cadena pesada o ligera humana se denomina en el presente documento un "anticuerpo humanizado" En determinados aspectos, no todas las CDR se sustituyen por las CDR completas de la región variable del donante y, sin embargo, la capacidad de unión al antígeno del donante puede seguir transfiriéndose a los dominios variables receptores. Dadas las explicaciones expuestas, por ejemplo, en las patentes de EE. UU. n.os 5585089, 5693761, 5693762y 6180370, la obtención de un anticuerpo modificado funcional o humanizado está dentro de las competencias de los expertos en la materia, ya sea mediante la experimentación habitual o por ensayo y error.

Tal como se utiliza en el presente documento, el término "modificado" incluye la modificación de moléculas de ácido nucleico o polipéptido por medios sintéticos (por ejemplo, mediante técnicas recombinantes, síntesis de péptidosin vitro,mediante acoplamiento enzimático o químico de péptidos o alguna combinación de estas técnicas).

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "unido", "fusionado" o "fusión" u otros equivalentes gramaticales pueden utilizarse indistintamente. Estos términos se refieren a la unión de dos elementos o componentes más, por cualquier medio, incluida la conjugación química o los medios recombinantes. Una "fusión dentro del marco" se refiere a la unión de dos o más marcos de lectura abiertos ("open reading frames", ORF) polinucleotídicos para formar un ORF continuo más largo, de manera que se mantenga el marco de lectura traduccional de los ORF originales. Así, una proteína de fusión recombinante es una proteína única que contiene dos o más segmentos que corresponden a polipéptidos codificados por los ORF originales (segmentos que normalmente no están unidos de esta manera en la naturaleza). Aunque el marco de lectura se convierte de esta forma en continuo a través de los segmentos fusionados, los segmentos pueden estar física o espacialmente separados, por ejemplo, por una secuencia conectora dentro del marco. Por ejemplo, los polinucleótidos que codifican las CDR de una región variable de inmunoglobulina pueden estar fusionados, dentro del marco, pero separados por un polinucleótido que codifica al menos una región marco de inmunoglobulina o regiones CDR adicionales, siempre que las CDR "fusionadas" se cotraduzcan como parte de un polipéptido continuo.

En el contexto de los polipéptidos, una "secuencia lineal" o una "secuencia" es un orden de aminoácidos en un polipéptido en la dirección desde el amino terminal hasta el carboxilo terminal, en la que los aminoácidos vecinos entre sí en la secuencia son contiguos en la estructura primaria del polipéptido. Una porción de un polipéptido que es "aminoterminal" o "N-terminal" con respecto a otra porción de un polipéptido es la porción que aparece antes en la cadena polipeptídica secuencial. Del mismo modo, una porción de un polipéptido que es "carboxi-terminal" o "C-terminal" con respecto a otra porción de un polipéptido es la porción que aparece después en la cadena polipeptídica secuencial. Por ejemplo, en un anticuerpo típico, el dominio variable es "N-terminal" con respecto a la región constante, y la región constante es "C-terminal" con respecto al dominio variable.

El término "expresión", tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un proceso por el cual un gen produce un producto bioquímico, por ejemplo, un polipéptido. El proceso incluye cualquier manifestación de la presencia funcional del gen dentro de la célula, incluidas, entre otras, la inactivación del gen, así como tanto la expresión transitoria como la expresión estable. Incluye, entre otras, la transcripción del gen a ARN mensajero (ARNm) y la traducción de dicho ARNm a uno o más polipéptidos. Si el producto final deseado es un producto bioquímico, la expresión incluye la creación de ese producto bioquímico y de cualquier precursor. La expresión de un gen produce un "producto génico". Tal como se utiliza en el presente documento, un producto génico puede ser un ácido nucleico, por ejemplo, un ARN mensajero producido por la transcripción de un gen, o un polipéptido que se traduce a partir de una transcrito. Los productos génicos descritos en el presente documento incluyen además ácidos nucleicos con modificaciones postranscripcionales, por ejemplo, poliadenilación, o polipéptidos con modificaciones postraduccionales, por ejemplo, metilación, glucosilación, adición de lípidos, asociación con otras subunidades de proteínas, escisión proteolítica y similares.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "modificación o modificaciones epigenéticas" se refiere a fenotipos heredables de forma estable resultantes de alteraciones cromosómicas sin alteraciones de la secuencia de ADN. Las modificaciones epigenéticas, en algunos casos, pueden provocar una enfermedad o un trastorno, tal como el cáncer; Berger, S.L.et al.,Genes Dev., 23:781-783 (2009). Las modificaciones epigenéticas suelen implicar cambios en la estructura de la cromatina que pueden dar lugar a la sobreexpresión y/o represión de genes que controlan procesos celulares, tales como la diferenciación, la proliferación y/o la apoptosis. Estas modificaciones pueden implicar, por ejemplo, la metilación del ADN y la acetilación de las histonas. Véase, por ejemplo, Gnyska, A.et al.,Anticancer Res., 33:2989-2996 (2013).

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "agente modulador epigenético" se refiere a un agente, por ejemplo, un agente terapéutico, que puede afectar, por ejemplo, bloquear, reducir, revertir o aliviar una modificación epigenética causante de enfermedad, tratando así la enfermedad, por ejemplo, el cáncer. Algunos ejemplos de agentes moduladores epigenéticos son los inhibidores de la ADN metiltransferasa (DNMTi) y los inhibidores de la histona desacetilasa (HDACi). Diversos HDACi y DNMTi están aprobados o en fase de prueba para el tratamiento de determinados tipos de cáncer. En el presente documento se describen algunos ejemplos de agentes.

Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "inhibidor o inhibidores de la histona desacetilasa" o "inhibidor o inhibidores de la HDAC" o el término "HDACi" se refieren a un compuesto o compuestos capaces de inhibir la desacetilación de las histonasin vivo, in vitro,o ambas. Las HDAC inhiben la actividad de al menos una histona desacetilasa. Como resultado de la inhibición de la desacetilación de al menos una histona, se produce un aumento de la histona acetilada y la acumulación de histona acetilada puede proporcionar un marcador biológico para evaluar la actividad de la HDAC.

Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "inhibidor o inhibidores de la ADN metiltransferasa" o "inhibidor o inhibidores de la DNMT" o el término "DNMTi" se refieren a un compuesto o compuestos que son capaces de inhibir la hipermetilación del ADN y/o la sobreexpresión de la ADN metiltransferasa ("DNMT")in vivo, in vitro,o ambas. Como resultado de la inhibición de la sobreexpresión de DNMT y/o de la actividad de DNMT, el DNMTi, por ejemplo, puede restablecer la expresión de genes aberrantemente silenciados, tales como los genes supresores de tumores.

Tal como se utiliza en el presente documento, la expresión "molécula de unión anti-SEMA4D" se refiere a una molécula que se une específicamente a SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. A menos que se refiera específicamente a anticuerpos de tamaño completo, tales como anticuerpos naturales, la expresión "anticuerpo anti-SEMA4D" abarca anticuerpos de tamaño completo, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes, análogos o derivados de dichos anticuerpos, por ejemplo, moléculas de anticuerpos o de inmunoglobulina naturales o moléculas o fragmentos de anticuerpos modificados que se unen al antígeno de forma similar a las moléculas de anticuerpos.

Términos como "tratar" o "tratamiento" o "aliviar" se refieren a medidas terapéuticas que curan, ralentizan, disminuyen los síntomas y/o detienen o ralentizan la progresión de una afección o un trastorno patológico diagnosticado existente. Términos como "prevenir", "prevención", "evitar", "disuasión" y similares se refieren a medidas profilácticas o preventivas que impiden el desarrollo de una afección o un trastorno patológico específico no diagnosticado. Por lo tanto, "los que necesitan tratamiento" pueden incluir a los que ya padecen el trastorno, a los propensos a padecerlo y a aquellos en los que se quiere prevenir el trastorno.

La expresión "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad de un anticuerpo, polipéptido, polinucleótido, molécula orgánica pequeña u otro fármaco eficaz para "tratar" una enfermedad o un trastorno en un sujeto o mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad terapéuticamente eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas; retardar o detener la división de las células cancerosas, reducir o retardar el aumento del tamaño del tumor; inhibir, por ejemplo, suprimir, retardar, prevenir, detener, retrasar o revertir la infiltración de células cancerosas en órganos periféricos que incluye, por ejemplo, la propagación del cáncer a tejidos blandos y huesos; inhibir, por ejemplo,suprimir, retardar, prevenir, reducir, detener, retrasar o revertir la metástasis tumoral; inhibir, por ejemplo,suprimir, retardar, prevenir, detener, retrasar o revertir el crecimiento tumoral; aliviar hasta cierto punto uno o más de los síntomas asociados al cáncer, reducir la morbilidad y la mortalidad; mejorar la calidad de vida; o una combinación de tales efectos. En la medida en que el fármaco impide el crecimiento y/o destruye las células cancerosas existentes, puede denominarse citostático y/o citotóxico.

Por "sujeto" o "individuo" o "animal" o "paciente" o "mamífero" se entiende cualquier sujeto, en especial un sujeto mamífero, para el que se desea un diagnóstico, pronóstico o terapia. Entre los sujetos mamíferos se incluyen los seres humanos, los animales domésticos, los animales de granja y los animales de zoológico, deportivos o de compañía, tales como perros, gatos, cobayas, conejos, ratas, ratones, caballos, cerdos, vacas, osos, etc.

Tal como se usan en el presente documento, expresiones tales como "un sujeto que se beneficiaría de la terapia" y "un animal que necesita tratamiento" incluyen sujetos, tales como sujetos mamíferos, que se beneficiarían de la administración de una terapia tal como se describe en el presente documento, tal como un anticuerpo, que comprende uno o más dominios de unión al antígeno, combinado con un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi, un DNMTi y/o una combinación de los mismos.

La expresión "terapia inmunomoduladora" o el término "inmunoterapia" se refiere al tratamiento que afecta a una enfermedad o un trastorno en un sujeto induciendo y/o potenciando una respuesta inmunitaria en dicho sujeto. Las terapias inmunomoduladoras incluyen vacunas contra el cáncer, agentes inmunoestimuladores, terapia adoptiva de linfocitos T o anticuerpos y bloqueo de puntos de control inmunitarios (Lizéeet al.,Ann. Rev. Med., 64:71-90 (2013)).

La expresión "agente inmunomodulador" se refiere a los agentes activos de la inmunoterapia. Los agentes inmunomoduladores incluyen una amplia gama de preparados recombinantes, sintéticos y naturales. Algunos ejemplos de agentes inmunomoduladores incluyen, entre otros, interleucinas, tales como IL-2, IL-7, IL-12; citocinas, tales como el factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), interferones; diversas quimiocinas, tales como CXCL13, CCL26, CXCL7; antagonistas de los bloqueantes de puntos de control inmunitarios, tales como anti-CTLA-4, anti-PD-1 o anti-PD-L1 (ligando de PD-1), anti-LAG3, anti-TIM3, anti-B7-H3, oligodesoxinucleótidos sintéticos de citosina fosfato-guanosina (CpG), glucanos; y moduladores de linfocitos T reguladores (Treg), tales como la ciclofosfamida.

Descripción del polipéptido diana - SEMA4D

Tal como se utilizan en el presente documento, los términos "semaforina-4D", "SEMA4D" y la expresión "polipéptido de SEMA4D" se utilizan indistintamente, al igual que "SEMA4D" y "Sema4D" En determinadas realizaciones, SEMA4D se expresa en la superficie de una célula o es secretada por ella. En otra realización, SEMA4D está unida a la membrana. En otra realización, SEMA4D es soluble, por ejemplo, sSEMA4D. En otra realización, SEMA4D puede incluir una SEMA4D de tamaño completo o un fragmento de la misma, o un polipéptido variante de SEMA4D, en la que el fragmento de SEMA4D o el polipéptido variante de SEMA4D conserva algunas o todas las propiedades funcionales de la SEMA4D de tamaño completo.

La proteína de SEMA4D humana de tamaño completo es una proteína transmembrana homodimérica que consta de dos cadenas polipeptídicas de 150 kDa. SEMA4D pertenece a la familia de las semaforinas de receptores de la superficie celular y también se denomina CD100. Tanto SEMA4D/Sema4D humana como de ratón pueden escindirse proteolíticamente de su forma transmembrana para generar formas solubles de 120 kDa, dando lugar a dos isoformas de Sema4D (Kumanogohet al.,J. Cell Science, 116:3464 (2003)). Las semaforinas consisten en proteínas solubles y unidas a membranas que se definieron originariamente como factores de guía axonal que desempeñan un papel importante en el establecimiento de conexiones precisas entre las neuronas y su diana apropiada. Considerada estructuralmente una semaforina de clase IV, SEMA4D consta de una secuencia señal amino-terminal seguida de un dominio "Sema" característico, que contiene 17 residuos de cisteína conservados, un dominio similar a Ig, un tramo rico en lisina, una región transmembrana hidrófoba y una cola citoplásmica.

El polipéptido SEMA4D incluye una secuencia señal de aproximadamente 13 aminoácidos, seguida de un dominio semaforina de aproximadamente 512 aminoácidos, un dominio similar a inmunoglobulina (similar a Ig) de aproximadamente 65 aminoácidos, un tramo rico en lisina de 104 aminoácidos, una región transmembrana hidrofóbica de aproximadamente 19 aminoácidos y una cola citoplásmica de 110 aminoácidos. Un sitio consenso para la fosforilación de tirosina en la cola citoplásmica apoya la asociación predicha de SEMA4D con una tirosina cinasa (Schlossmanet al.,eds. (1995), Leucocyte Typing V (Oxford University Press, Oxford).

Se sabe que SEMA4D tiene al menos tres receptores funcionales, plexina-B 1, plexina-B2 y CD72. La plexina-B 1 se expresa en tejidos no linfoides y ha demostrado ser un receptor de alta afinidad (1 nM) para SEMA4D (Tamagnoneet al.,Cell, 99:71-80 (1999)). Se ha demostrado que la estimulación por SEMA4D de la transducción de señales por la plexina-B 1 induce el colapso de los conos de crecimiento de las neuronas y el colapso de la extensión de los procesos y la apoptosis de los oligodendrocitos (Giraudonet al.,J. Immunol., 172:1246-1255 (2004); Giraudonet al.,NeuroMolecularMed., 7:207-216 (2005)). Tras unirse a SEMA4D, la transducción de señales de la plexina-B 1 media en la inactivación de R-Ras, lo que conduce a una disminución de la unión mediada por integrina a la matriz extracelular, así como a la activación de RhoA, lo que conduce al colapso celular por reorganización del citoesqueleto (Krugeret al.,Nature Rev. Mol. Cell Biol., 6:789-800 (2005); Pasterkamp, TRENDS in Cell Biology, 15:61-64 (2005)). La plexina-B2 tiene una afinidad intermedia por SEMA4D y un informe reciente indica que la plexina-B2 se expresa en los queratinocitos y activa los linfocitos T y§ positivos para SEMA4D para contribuir a la reparación epitelial (Witherdenet al.,Immunity, 37:314-325 (2012)).

En los tejidos linfoides, CD72 se utiliza como receptor de SEMA4D de baja afinidad (300 nM) (Kumanogohet al.,Immunity, 73:621-631 (2000)). Los linfocitos B y las células presentadoras de antígenos ("Antigen Presenting Cells", APC) expresan CD72, y los anticuerpos anti-CD72 tienen muchos de los mismos efectos que la sSEMA4D, tales como la potenciación de las respuestas de los linfocitos B inducidos por CD40 y el desprendimiento de CD23 de los linfocitos B. Se cree que CD72 actúa como regulador negativo de las respuestas de los linfocitos B reclutando la tirosina fosfatasa SHP-1, que puede asociarse con muchos receptores inhibidores. La interacción de SEMA4D con CD72 provoca la disociación de SHP-1 y la pérdida de esta señal de activación negativa. Se ha demostrado que la SEMA4D favorece la estimulación de los linfocitos T y la agregación y supervivencia de los linfocitos Bin vitro.La adición de células que expresan SEMA4D o sSEMA4D aumenta la proliferación de linfocitos B inducida por CD40 y la producción de inmunoglobulinasin vitroy acelera las respuestas de anticuerposin vivo(Ishidaet al.,Inter. Immunol., 15:1027-1034 (2003); Kumanogoh y H. Kukutani, Trends in Immunol., 22:670-676 (2001)). La sSEMA4D potencia la maduración de las DC inducida por CD40, incluida la regulación al alza de moléculas coestimuladoras y el aumento de la secreción de IL-12. Además, la sSEMA4D puede inhibir la migración de células inmunitarias, lo que puede revertirse añadiendo anticuerpos de bloqueo anti-SEMA4D de ratón (Elhabaziet al.,J. Immunol., 166:4341-4347 (2001); Delaireet al.,J. Immunol., 166:4348-4354 (2001)).

La Sema4D se expresa a altos niveles en órganos linfoides, incluidos el bazo, el timo y los ganglios linfáticos, y en órganos no linfoides, tales como el cerebro, el corazón y el riñón. En los órganos linfoides, la Sema4D se expresa abundantemente en los linfocitos T en reposo, pero sólo débilmente en los linfocitos B en reposo y en las células presentadoras de antígenos ("antigen-presenting cells", APC), tales como las células dendríticas ("dendritic cells", DC).

La activación celular aumenta la expresión en la superficie de SEMA4D, así como la generación de SEMA4D soluble (sSEMA4D). El patrón de expresión de SEMA4D sugiere que desempeña un importante papel tanto fisiológico como patológico en el sistema inmunitario. Se ha demostrado que la SEMA4D estimula la activación, la agregación y la supervivencia de linfocitos B; aumenta la proliferación inducida por CD40 y la producción de anticuerpos; aumenta la respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; aumenta la proliferación de linfocitos T; aumenta la maduración de células dendríticas y la capacidad de estimular linfocitos T; y está directamente implicada en la desmielinización y degeneración axonal (Shiet al.,Immunity, 13:633-642 (2000); Kumanogohet al.,J. Immunol., 169:1175-1181 (2002); y Watanabeet al.,J. Immunol., 167:4321-4328 (2001)).

Anticuerpos anti-SEMA4D

Se han descrito en la técnica anticuerpos que se unen a SEMA4D. Véase, por ejemplo, las publicaciones de EE. UU. n.os 2008/0219971 A1, US 2010/0285036 A1y US 2006/0233793 A1, solicitudes de patente internacional WO 93/14125, WO 2008/100995y WO 2010/129917, y Heroldet al.,Int. Immunol., 7:1-8 (1995).

La divulgación se refiere en general a un procedimiento para inhibir, retrasar o reducir el crecimiento tumoral o las metástasis en un sujeto, por ejemplo, un paciente humano con cáncer, que comprende la administración de un anticuerpo que se une específicamente a SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi), un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNM<t í>) o cualquier combinación de los mismos. El HDACi y el DNMTi se describen con detalle en otro apartado del presente documento. En determinadas realizaciones, el anticuerpo anti-SEMA4D bloquea la interacción de SEMA4D con uno o más de sus receptores, por ejemplo, plexina-B1, plexina-B2 y/o CD72. En determinadas realizaciones, las células cancerosas expresan plexina-B1 y/o plexina-B2. Los anticuerpos anti-SEMA4D que tienen estas propiedades se pueden utilizar en los procedimientos proporcionados en el presente documento. Los anticuerpos que pueden utilizarse incluyen, entre otros, los MAb VX15/2503, 67, 76, 2282 y los fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos que se describen detalladamente en los documentos US 2010/0285036 A1 y US 2008/0219971 A1. Otros anticuerpos que pueden utilizarse en los procedimientos descritos en el presente documento son el anticuerpo BD16 descrito en el documento US 2006/0233793 A1, así como fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos; o cualquiera de los anticuerpos MAb 301, MAb 1893, MAb 657, MAb 1807, MAb 1656, MAb 1808, Mab 59, MAb 2191, MAb 2274, MAb 2275, MAb 2276, MAb 2277, MAb 2278, MAb 2279, MAb 2280, MAb 2281, MAb 2282, MAb 2283, MAb 2284 y MAb 2285, así como sus fragmentos, variantes o derivados descritos en el documento US 2008/0219971 A1. En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento se une a la SEMA4D humana, murina o a ambas humana y murina. También son útiles los anticuerpos que se unen al mismo epítopo que cualquiera de los anticuerpos mencionados y/o anticuerpos que inhiben competitivamente la unión o la actividad de cualquiera de los anticuerpos mencionados.

En determinadas realizaciones, un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo útil en los procedimientos proporcionados en el presente documento tiene una secuencia de aminoácidos que tiene al menos aproximadamente un 80 %, aproximadamente un 85 %, aproximadamente un 88 %, aproximadamente un 89 %, aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un 92 %, aproximadamente un 93 %, aproximadamente un 94 % o aproximadamente un 95 % de identidad de secuencia con la secuencia de aminoácidos de una molécula de anticuerpo anti-SEMA4D de referencia, por ejemplo, las descritas anteriormente. En otra realización, la molécula de unión comparte al menos un 96 %, un 97 %, un 98 %, un 99 % o un 100 % de identidad de secuencia con un anticuerpo de referencia.

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo puede inhibir la interacción de SEMA4D con su receptor, por ejemplo, plexina-B 1, plexina-B2 o CD72. En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo puede inhibir la transducción de señales de plexina-B 1 mediada por SEMA4D.

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo inhibe competitivamente la unión a SEMA4D de un anticuerpo de referencia que comprende una región de cadena pesada variable (VH) que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una región de cadena ligera variable (VL) que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo se une al mismo epítopo SEMA4D que un anticuerpo de referencia que comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5. En determinados aspectos, la VH del anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo comprende tres regiones determinantes de la complementariedad (CDR) HCDR1, HCDR2 y HCDR3, y la VL comprende tres CDR LCDR1, LCDR2 y LCDR3, comprendiendo las CDR las secuencias de aminoácidos S<e>Q ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente, excepto por al menos una, dos, tres, cuatro, cinco o seis sustituciones conservadoras simples de aminoácidos en una o más de las CDR. En determinados aspectos, las CDR comprenden las secuencias de aminoácidos SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 y SEQ ID NO: 8, respectivamente.

En determinados aspectos, la VH del anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 1 y la VL del anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 5; o la VH comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 9 y la VL comprende una secuencia de aminoácidos al menos un 70 %, un 75 %, un 80 %, un 85 %, un 90 %, un 95 % o un 100 % idéntica a SEQ ID NO: 10. En determinados aspectos, la VH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5; o la VH comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 9 y la VL comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 10.

También se incluyen para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento polipéptidos que codifican anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos como se describen en el presente documento, polinucleótidos que codifican dichos polipéptidos, vectores que comprenden dichos polinucleótidos, y células hospedadoras que comprenden dichos vectores o polinucleótidos, todos para producir anticuerpos anti-SEMA4D, o fragmentos de unión al antígeno, variantes o derivados de los mismos para su uso en los procedimientos descritos en el presente documento.

En los procedimientos de la presente divulgación pueden utilizarse variantes biológicamente activas adecuadas de los anticuerpos anti-SEMA4D de la divulgación. Dichas variantes conservarán las propiedades de unión deseadas del anticuerpo anti-SEMA4D original. Los procedimientos para fabricar variantes de anticuerpos están por lo general disponibles en la técnica.

Los procedimientos de mutagénesis y alteración de secuencias nucleotídicas son bien conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Walker y Gaastra, eds. (1983), Techniques in Molecular Biology (MacMillan Publishing Company, Nueva York); Kunkel, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82:488-492 (1985); Kunkelet al.,Methods Enzymol., 154:367-382 (1987); Sambrooket al.(1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor, N.Y); patente de EE. UU. n.° 4873 192y las referencias allí citadas. Puede encontrarse una guía acerca de las sustituciones apropiadas de aminoácidos que no afectan a la actividad biológica del polipéptido de interés en el modelo de Dayhoffet al.(1978) en Atlas of Protein Sequence and Structure (Natl. Biomed. Res., Found., Washington, D.C.), págs. 345-352. El modelo de Dayhoffet al.utiliza la matriz de similitud de aminoácidos Point Accepted Mutation (PAM) (matriz PAM 250) para determinar las sustituciones de aminoácidos conservadoras adecuadas. En determinados aspectos, se utilizan sustituciones conservadoras, tales como intercambiar un aminoácido por otro que tenga propiedades similares.

Algunos ejemplos de sustituciones conservadoras de aminoácidos según indica la matriz<p>A<m>250 del modelo de Dayhoffet al.incluyen, entre otras, G ly^Ala, Val^-Ile^Leu, Asp-^-Glu, Lys-^-Arg, Asn-^-Gln y Phe^Trp^Tyr.

Al construir variantes de la molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, polipéptidos de interés, se realizan modificaciones de tal forma que las variantes continúan poseyendo las propiedades deseadas, por ejemplo, son capaces de unirse específicamente a una SEMA4D, por ejemplo, humana, murino o ambas SEMA4D humana y murina, por ejemplo, expresada en la superficie de una célula o secretada por ésta, y tienen actividad bloqueante de SEMA4D, tal como se describe en el presente documento. En determinados aspectos, las mutaciones realizadas en el ADN que codifica el polipéptido variante mantienen el marco de lectura y no crean regiones complementarias que podrían producir una estructura secundaria del ARNm. Véase la publicación de solicitud de patente EP n.° 75444.

Los procedimientos para medir la especificidad de unión de la molécula de unión anti-SEMA4D, por ejemplo, un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo, incluyen, entre otros, ensayos de unión competitiva convencionales, ensayos para controlar la secreción de inmunoglobulina por linfocitos T o linfocitos B, ensayos de proliferación de linfocitos T, ensayos de apoptosis, ensayos ELISA y similares. Véanse, por ejemplo, los ensayos de este tipo divulgados en el documento WO 93/14125; Shiet al.,Immunity, 13:633-642 (2000); Kumanogohet al.,J. Immunol., 169:1175-1181 (2002); Watanabeet al.,J. Immunol., 167:4321-4328 (2001); Wanget al.,Blood, 97:3498-3504 (2001); yGiraudonet al.,J. Immunol., 172:1246-1255 (2004).

Los procedimientos para medir la capacidad antiangiogénica de un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo son bien conocidos en la técnica.

Cuando se analiza en el presente documento si cualquier polipéptido concreto, incluidas las regiones constantes, CDR, dominios VH, o dominios VL divulgados en el presente documento, es al menos aproximadamente un 65 %, aproximadamente un 70 %, aproximadamente un 75 %, aproximadamente un 80 %, aproximadamente aproximadamente un 90 %, aproximadamente un 91 %, aproximadamente un %, aproximadamente aproximadamente un 94 %, aproximadamente un 95 %, aproximadamente un 96 %, aproximadamente aproximadamente un 98%, aproximadamente un 99%, o incluso aproximadamente un 100% idéntico a otro polipéptido, el porcentaje de identidad puede determinarse utilizando procedimientos y programas informáticos/software conocidos en la técnica tales como, entre otros, el programa BESTFIT (Wisconsin Sequence Analysis Package, versión 8 para Unix, Genetics Computer Group, University Research Park, 575 Science Drive, Madison, Wis. 53711). BESTFIT utiliza el algoritmo de homología local de Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Math., 2:482-489 para encontrar el mejor segmento de homología entre dos secuencias. Cuando se utiliza BESTFIT o cualquier otro programa de alineación de secuencias para determinar si una secuencia concreta es idéntica, por ejemplo, en un 95 % a una secuencia de referencia según la presente divulgación, los parámetros se establecen, por supuesto, de forma que el porcentaje de identidad se calcule sobre toda la longitud de la secuencia polipeptídica de referencia y se permitan huecos en la homología de hasta un 5 % del número total de aminoácidos de la secuencia de referencia.

Para los objetivos de la presente divulgación, el porcentaje de identidad de secuencia puede determinarse utilizando el algoritmo de búsqueda de homología Smith-Waterman utilizando una búsqueda de hueco afín con una penalización de apertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se explica en Smith y Waterman (1981), Adv. Appl. Math., 2:482-489.

Una variante puede diferir, por ejemplo, de un anticuerpo anti-SEMA4D de referencia (por ejemplo, MAb VX15/2503,

67, 76, o 2282) tan solo en 1 a 15 residuos de aminoácidos, tan solo en 1 a 10 residuos de aminoácidos, tal como de

6 a 10, tan solo en 5, tan solo en 4, 3, 2 o incluso en 1 residuo de aminoácido.

La región constante de un anticuerpo anti-SEMA4D puede mutarse para alterar la función efectora de varias maneras.

Por ejemplo, véase la patente de EE. UU. n.° 6737056 B1 y publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2004/0132101 A1, que divulgan mutaciones de Fc que optimizan la unión del anticuerpo a los receptores de Fc.

En determinados anticuerpos anti-SEMA4D o fragmentos, variantes o derivados de los mismos útiles en los procedimientos proporcionados en el presente documento, la porción Fc puede mutarse para disminuir la función efectora usando técnicas conocidas en el arte. Por ejemplo, la supresión o inactivación (mediante mutaciones puntuales u otros medios) de un dominio de región constante puede reducir la unión al receptor de Fc del anticuerpo modificado circulante, aumentando así la localización tumoral. En otros casos, las modificaciones de la región constante coherentes con la presente divulgación moderan la unión del complemento y, por tanto, reducen la semivida sérica. Otras modificaciones de la región constante pueden emplearse para modificar enlaces disulfuro o restos oligosacáridos que permiten una mejor localización debido a una mayor especificidad del antígeno o flexibilidad del anticuerpo. El perfil fisiológico resultante, la biodisponibilidad y otros efectos bioquímicos de las modificaciones, tales como la localización tumoral, la biodistribución y la semivida sérica, pueden medirse y cuantificarse con facilidad mediante técnicas inmunológicas bien conocidas sin necesidad de experimentos excesivos.

Los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen derivados que están modificados, por ejemplo, por la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo de tal manera que la unión covalente no impida que el anticuerpo se una específicamente a su epítopo afín. Por ejemplo, pero no a modo de limitación, los derivados de anticuerpos incluyen anticuerpos que han sido modificados, por ejemplo, por glucosilación, acetilación, pegilación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular u otra proteína, etc. Cualquiera de las numerosas modificaciones químicas puede llevarse a cabo mediante técnicas conocidas, incluidas, entre otras, escisión química específica, acetilación, formilación, etc. Además, el derivado puede contener uno o más aminoácidos no clásicos.

Una "sustitución conservadora de aminoácidos" es aquella en la que un residuo de aminoácido se sustituye por un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. En la técnica se han definido familias de residuos de aminoácidos que tienen cadenas laterales con cargas similares. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína), cadenas laterales no polares (por ejemplo, glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). Como alternativa, las mutaciones pueden introducirse aleatoriamente a lo largo de toda o de parte de la secuencia codificante, tal como mediante mutagénesis de saturación, y los mutantes resultantes pueden cribarse en busca de una actividad biológica para identificar los mutantes que conserven la actividad (por ejemplo, la capacidad de unirse a un polipéptido anti-SEMA4D, de bloquear la interacción de SEMA4D con su receptor, o de inhibir, retrasar o reducir las metástasis en un sujeto, por ejemplo, un paciente con cáncer).

Por ejemplo, es posible introducir mutaciones sólo en regiones marco o sólo en regiones CDR de una molécula de anticuerpo. Las mutaciones introducidas pueden ser mutaciones silenciosas o neutras, es decir, que no tienen ningún efecto, o tienen muy poco, sobre la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Estos tipos de mutaciones pueden ser útiles para optimizar el uso de codones o mejorar la producción de anticuerpos de un hibridoma. Por otra parte, las mutaciones no neutras pueden alterar la capacidad de un anticuerpo para unirse al antígeno. Un experto en la materia podrá diseñar y ensayar moléculas mutantes con las propiedades deseadas, tales como la ausencia de alteración en la actividad de unión al antígeno o la alteración en la actividad de unión (por ejemplo, mejoras en la actividad de unión al antígeno o cambios en la especificidad del anticuerpo). Tras la mutagénesis, la proteína codificada puede expresarse de la manera habitual y puede determinarse la actividad funcional y/o biológica de la proteína codificada (por ejemplo, la capacidad de unirse inmunoespecíficamente al menos a un epítopo de un polipéptido SEMA4D) utilizando técnicas descritas en el presente documento o mediante técnicas de modificación habituales conocidas en la técnica.

En determinadas realizaciones, los anticuerpos anti-SEMA4D para su uso en los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden al menos una región determinante de la complementariedad (CDR) optimizada. Por "CDR optimizada" se entiende que la CDR ha sido modificada y optimizada para mejorar la afinidad de unión y/o la actividad anti-SEMA4D que se imparte a un anticuerpo anti-SEMA4D que comprende la CDR optimizada. La "actividad anti-SEMA4D" o "actividad bloqueante de SEMA4D" puede incluir la actividad que modula una o más de las siguientes actividades asociadas con SEMA4D: activación, agregación y supervivencia de linfocitos B; proliferación y producción de anticuerpos inducidas por CD40; respuesta de anticuerpos a antígenos dependientes de linfocitos T; proliferación de linfocitos T u otras células inmunitarias; maduración de células dendríticas; desmielinización y degeneración axonal; apoptosis de precursores neuronales pluripotentes y/o oligodendrocitos; inducción de la migración de células endoteliales; inhibición de la migración espontánea de monocitos; inhibición, retraso o reducción del crecimiento de células tumorales o metástasis, unión a plexina-B1 de la superficie celular u otro receptor, o cualquier otra asociación de actividad con SEMA4D soluble o SEMA4D que se expresa en la superficie de células SEMA4D+. En una realización concreta, la actividad anti-SEMA4D incluye la capacidad de inhibir, retrasar o reducir las metástasis tumorales, ya sea combinada con la inhibición, el retraso o la reducción del crecimiento de células tumorales primarias y metástasis tumorales, o independientemente del crecimiento de células tumorales primarias y metástasis tumorales. La actividad anti-SEMA4D también puede atribuirse a una disminución de la incidencia o gravedad de enfermedades asociadas con la expresión de SEMA4D, incluidas, entre otras, determinados tipos de cánceres que incluyen linfomas, enfermedades autoinmunitarias, enfermedades inflamatorias que incluyen enfermedades inflamatorias del sistema nervioso central (SNC) y del sistema nervioso periférico (SNP), rechazos de trasplantes y angiogénesis invasiva. Algunos ejemplos de anticuerpos optimizados basados en el MAb murino anti-Se Ma 4D BD16 se describieron en la publicación de EE. UU. n.° 2008/0219971 A1, solicitud de patente internacional WO 93/14125 y Heroldet al.,Int. Immunol., 7:1-8 (1995). Las modificaciones pueden implicar la sustitución de residuos de aminoácidos dentro de las CDR de manera que un anticuerpo anti-SEMA4D conserve la especificidad para el antígeno SEMA4D y tenga una afinidad de unión mejorada y/o una actividad anti-SEMA4D mejorada.

Inhibidores de la histona desacetilasa (HDACi)

Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "inhibidor o inhibidores de la histona desacetilasa", "inhibidor o inhibidores de HDAC" y "HDACi" se utilizan indistintamente y pueden referirse a HDACi en singular o HDACi en plural.

Las histona acetil transferasas (HAT) y las histona desacetilasas (HDAC) regulan el estado de acetilación de las histonas. Las histona acetil transferasas son enzimas que acetilan los residuos de lisina en el núcleo de las histonas, dando lugar a una cromatina menos compacta y más activa desde el punto de vista transcripcional, lo que favorece la expresión génica. Por el contrario, las HDAC son enzimas que catalizan la eliminación de los grupos acetilo de los residuos de lisina en las colas amino-terminales de las histonas del núcleo nucleosómico. Las HDAC pueden dividirse en tres clases en función de su homología estructural. Las HDAC de clase I (HDAC 1,2, 3 y 8) están relacionadas con el gen RPD3 de levadura. La clase IIA (HDAC 4, 5, 7 y 9) presenta similitudes con el gen Hda1 de levadura. La clase III, también conocida como sirtuinas, está relacionada con el gen Sir2 e incluye SIRT1-7. La clase IV, que sólo contiene HDAC11, comparte características de las clases I y II. Véase, por ejemplo, Mottamal, M.et al.,Molecules, 20:3898-3941 (2015).

Determinados inhibidores de HDAC actúan uniéndose al dominio catalítico que contiene cinc de las HDAC. Pueden clasificarse en función del resto químico que se une al ion cinc, o como tetrapéptidos cíclicos, que se unen al ion cinc con un grupo tiol. Véase, por ejemplo, Drummond, D.C.et al.,Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol., 45:495-528 (2005). Estos incluyen, entre otros: ácidos hidroxámicos (o hidroxamatos), tales como la tricostatina A; tetrapéptidos cíclicos (tales como la trapoxina B) y los depsipéptidos; benzamidas; cetonas electrófilas; y compuestos de ácidos alifáticos (ácidos grasos de cadena corta (AGCC), tales como el fenilbutirato y el ácido valproico. Véase, por ejemplo, Porcu, M., y Chiarugi, A., Trends Pharmacolog. Sci., 26:94-103 (2005). Más específicamente, los inhibidores de HDAC incluyen, entre otros, los ácidos hidroxámicos vorinostat (SAHA), belinostat (PXD101), LAQ824 y panobinostat (LBH589); y las benzamidas entinostat (MS-275), CI994 y mocetinostat (MGCD0103). Las HDAC de clase III sirtuinas dependen de NAD+ y, por lo tanto, son inhibidas por la nicotinamida, así como por derivados de NAD, dihidrocumarina, naftopiranona y 2-hidroxinaftaldehídos.Id.

En la tabla 2 se enumeran ejemplos no limitantes de inhibidores de HDAC para su uso en la inhibición de la histona desacetilasa, la inducción de la diferenciación terminal, la detención del crecimiento celular y/o la apoptosis en células malignas y/o la inducción de la diferenciación, la detención del crecimiento celular y/o la apoptosis de células tumorales en un tumor. Se entiende que los inhibidores de la HDAC incluyen cualesquiera sales, estructuras cristalinas, estructuras amorfas, hidratos, derivados, metabolitos, estereoisómeros, isómeros estructurales y profármacos de los inhibidores de la HDAC descritos en el presente documento.

Tabla 2: Lista no limitante de inhibidores de HDAC

En determinadas realizaciones, los inhibidores de HDAC útiles en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen entinostat, chidamida, belinostat, ácido valproico, mocetinostat, abexinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, 4SC-202, ACY-241, AR-42, tefinostat, CHR-3996, ricolinostat (ACY-1215) y/o CG200745. A continuación, se enumeran algunos inhibidores de HDAC aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer, así como inhibidores de HDAC que se encuentran actualmente en ensayos clínicos pendientes o finalizados.

Inhibidores de HDAC aprobados por la Food and Drug Administration (FDA).El vorinostat fue autorizado por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos) estadounidense en octubre de 2006 para el tratamiento del linfoma cutáneo de linfocitos T (LCLT). La FDA estadounidense autorizó la romidepsina (nombre comercial: Istodax) en noviembre de 2009 para el linfoma cutáneo de linfocitos T (LCLT). La chidamida fue aprobada por China en 2015 para el linfoma periférico de linfocitos T (LPLT). La FDA estadounidense autorizó el panobinostat (nombre comercial: Farydak) en febrero de 2015 para el tratamiento del mieloma múltiple. belinostat (PXD101) fue autorizado por la FDA para el tratamiento del linfoma periférico de linfocitos T en 2014.

En un aspecto no limitante, el inhibidor de HDAC es entinostat (ENT). El nombre químico IUPAC del entinostat es N-[[4-[(2-aminofenil)carbamoil]fenil]metil]carbamato de piridin-3-ilmetilo. El ENT, también conocido como SNDX-275 y Ms -275, es un inhibidor de las HDAC de clase I (Syndax Pharmaceuticals). El ENT es un inhibidor benzamídico de la histona desacetilasa que inhibe HDAC1 y HDAC3 con una CI50 de 0,51 ^M y 1,7 ^M. El ENT está siendo objeto de ensayos clínicos para el tratamiento de diversos tipos de cáncer.

Inhibidores de la ADN metiltransferasa

Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones "inhibidor o inhibidores de la ADN metiltransferasa", "inhibidor o inhibidores de D<n>MT" y "DNMTi" se usan indistintamente, y pueden referirse a DNMTi en singular o DNMTi en plural.

Las ADN metiltransferasas catalizan la adición de grupos metilo al carbono 5' de los residuos de citosina. En las células cancerosas, el silenciamiento de los genes supresores de tumores se produce a través de la metilación mediada por DNMT; Gravinaet al.,Molecular Cancer, 9:305-320 (2010). Existen varias isoformas de DNMT, entre ellas DNMT1, DNMT-3a y DNMT-3b.Id.Se han identificado diversos DNMTi, y dos de ellos están aprobados para el tratamiento del cáncer en Estados Unidos. Las clases de moléculas incluyen análogos de nucleósidos, oligonucleótidos antisentido, inhibidores enzimáticos de molécula pequeña y agentes que bloquean la interacción de las DNMT con el ADN.

En la tabla 3 se enumeran ejemplos no limitantes de DNMTi para su uso en la inhibición de las ADN metiltransferasas, la inducción de la diferenciación terminal, la detención del crecimiento celular y/o la apoptosis en células malignas y/o la inducción de la diferenciación, la detención del crecimiento celular y/o la apoptosis de células tumorales en un tumor. Se entiende que los DNMTi incluyen cualesquiera sales, estructuras cristalinas, estructuras amorfas, hidratos, derivados, metabolitos, estereoisómeros, isómeros estructurales y profármacos de los inhibidores de DNMT descritos en el presente documento.

Tabla 3: Lista no limitante de inhibidores de DNMT

En determinadas realizaciones, los inhibidores de DNMT útiles en los procedimientos proporcionados en el presente documento incluyen azacitidina, decitabina, zebularina, SGI-110, galato de epigalocatequina, MG98, RG108, procainamida y/o hidralazina. A continuación, se enumeran algunos inhibidores de DNMT aprobados por la FDA para el tratamiento del cáncer, así como inhibidores de DNMT que se encuentran actualmente en ensayos clínicos pendientes o finalizados.

Aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) y en ensayos de DNMTi.La azacitidina, comercializada como VIDAZA®, fue aprobada por la FDA para el tratamiento del síndrome mielodisplásico (SMD) el 19 de mayo de 2004 y se encuentra en ensayos clínicos para tumores sólidos avanzados. Se ha demostrado que la azacitidina potencia la actividad de los inhibidores de los puntos de control inmunitarios ("immune checkpoint", ICP) en modelos preclínicos de melanoma y cáncer de colon mediante la regulación al alza de la vía del interferón (If N) y la eliminación de la represión de los antígenos víricos, lo que hace que el tumor sea más inmunógeno y susceptible a un tratamiento eficaz con ICP (Liet al.,Oncotarget, 5:587 (2014) y Rouloiset al.,Cell, 162:961 (2015)). Además, se demostró que la azacitidina regula al alza la expresión de antígenos del cáncer testicular (ACT) en los tumores, lo que conduce a un aumento de la actividad de los linfocitos T contra los ATC en pacientes con SMD, leucemia mieloide aguda (LMA) y leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) (Gang, A.O.et al.,Blood Cancer J., doi:10.1038/bcj.2014.14.(2014)). Juergens, R.A.et al.(Cancer Discov., 1:598-607 (2011)) utilizaron azacitidina y entinostat en CPNM avanzado refractario. Seis pacientes de este ensayo se inscribieron en un ensayo adicional (Wrangle, J.et al.,Oncotarget, 4:2067-2079 (2013)) con inhibidores de puntos de control inmunitarios, y cinco pacientes desarrollaron respuestas. Véase también: blogs.biomedcentral.com/on-biology/2015/03/26/improving-lungcancer-immunotherapy-using-epigenetic-approaches/ (visitado el 16 de marzo de 2017).

La decitabina, comercializada como DACOGEN®, está aprobada para el tratamiento del SMD, y también está aprobada en Europa para el tratamiento de la LMA y se encuentra en ensayos clínicos para la LMA. El SGI-1 10 se encuentra en ensayos clínicos de fase II para el tratamiento de la LMA. El MG98 completó los ensayos clínicos de fase I para tumores sólidos avanzados. El ECGC finalizó los ensayos clínicos de fase II para el cáncer de próstata.

En un aspecto no limitante, el DNMTi es la azacitidina. La azacitidina es un análogo químico del nucleósido citosina. La azacitidina, entre otras actividades, puede incorporarse al ADN causando la hipometilación del ADN mediante la unión covalente con la DNMT, impidiendo la síntesis de ADN y provocando citotoxicidad y degradación de la DNMT atrapada; Stresemann, C. y Lyko, F., Int. J. Cancer, 123:8-13 (2008).

Procedimientos de tratamiento que utilizan moléculas terapéuticas de unión anti-SEMA4D y un agente modulador epigenético, por ejemplo, un Hd A c í y/o un DNMTi

La presente divulgación proporciona un procedimiento para inhibir, retrasar o reducir el crecimiento de células malignas en un sujeto con cáncer mediante la administración al sujeto de una terapia combinada que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a SEMA4D, combinado con una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético, que es un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (C<h>R-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos. Algunos ejemplos de anticuerpos anti-SEMA4D y de agentes moduladores epigenéticos se describen en detalle en otro punto del presente documento. En determinados aspectos, la administración de la terapia combinada proporcionada en el presente documento puede inhibir el crecimiento tumoral o de células malignas parcial o completamente, puede retrasar la progresión del crecimiento tumoral y de células malignas en el sujeto, puede prevenir la diseminación metastásica en el sujeto, puede reducir el tamaño del tumor del sujeto, por ejemplo, para permitir una extirpación quirúrgica más exitosa, puede disminuir la vasculatura tumoral en el sujeto, o puede dar como resultado cualquier combinación de respuestas terapéuticas positivas en el sujeto. En el presente documento se describen ejemplos de respuestas terapéuticas que pueden lograrse.

En determinado aspecto, la administración de la terapia combinada puede conseguir una eficacia terapéutica mejorada en relación con la administración del anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento del mismo o el agente modulador epigenético solo. En determinados aspectos, la eficacia mejorada del tratamiento es sinérgica, y es mayor que la eficacia aditiva de cada agente individual. En determinados aspectos, la mejora de la eficacia del tratamiento con respecto a cualquiera de los agentes administrados solos, medida, por ejemplo, como el aumento del retraso del crecimiento tumoral ("tumor growth delay", TGD), el aumento de la frecuencia de regresión tumoral, por ejemplo, la regresión tumoral completa, o el aumento de la supervivencia es de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 150 %, al menos un 200 %, al menos un 250 %, al menos un 300 %, al menos un 350 %, al menos un 400 %, al menos un 450 %, al menos un 500 %, al menos un 550 %, al menos un 600 %, al menos un 650 %, al menos un 700 %, al menos un 750 %, al menos un 800 %, al menos un 850 %, al menos un 900 %, al menos un 950 %, o al menos un 1000 %. En determinados aspectos, la mejora de la eficacia del tratamiento con respecto a la eficacia aditiva de ambos agentes administrados individualmente, medida, por ejemplo, como el aumento del retraso del crecimiento tumoral (TGD), el aumento de la frecuencia de regresión tumoral, por ejemplo, la regresión tumoral completa, o el aumento de la supervivencia es de al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 5 %, al menos un 10 %, al menos un 20 %, al menos un 30 %, al menos un 40 %, al menos un 50 %, al menos un 60 %, al menos un 70 %, al menos un 80 %, al menos un 90 %, al menos un 100 %, al menos un 150 %, al menos un 200 %, al menos un 250 %, al menos un 300 %, al menos un 350 %, al menos un 400 %, al menos un 450 %, al menos un 500 %, al menos un 550 %, al menos un 600 %, al menos un 650 %, al menos un 700 %, al menos un 750 %, al menos un 800 %, al menos un 850 %, al menos un 900 %, al menos un 950 %, o al menos un 1000 %.

En determinados aspectos, el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento puede ser VX15/2503, mAb 67, o un fragmento de unión al antígeno, variante o derivado del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo o un fragmento del mismo puede incluir una cadena pesada variable (VH) que comprende las CDR 1-3 de VH que comprenden las SEQ ID NO: 2, 3, y 4, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las CDR 1-3 de VL que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente, o la VH y la VL comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID NO: 5 o SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

En determinados aspectos, el procedimiento proporcionado en el presente documento comprende la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo y un HDACi que inhibe una HDAC que puede ser una HDAC de clase I, clase IIA, clase IIB, clase IV y/o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo, una HDAC comprende un dominio catalítico que contiene cinc. En determinados aspectos, el HDACi puede incluir un resto que se une al dominio catalítico de la HDAC que contiene cinc. Por ejemplo, en determinados aspectos, el HDACi puede incluir una o más, o una combinación de moléculas químicas tales como, entre otras, un ácido hidroxámico o una sal del mismo, un tetrapéptido cíclico, un depsipéptido, una benzamida, una cetona electrófila y/o un ácido alifático o una sal del mismo. El HDACi que puede usarse en el procedimiento de tratamiento proporcionado en el presente documento comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215, ACY-241 y/o cualquier combinación de los mismos. En determinados aspectos, el HDACi puede ser entinostat (N-[[4-[(2-aminofenil)carbamoil]fenil]metil]carbamato) de piridin-3-ilmetilo.

En determinados aspectos, el procedimiento proporcionado en el presente documento comprende la administración de un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo y un DNMTi que inhibe DNMT1, DNMT-3a, DNMT-3b y/o cualquier combinación de los mismos. Por ejemplo, en determinados aspectos, el DNMTi puede incluir una o más, o una combinación de moléculas químicas tales como, entre otras, azacitidina, decitabina, zebularina, SGI-110, galato de epigalocatequina, MG98, RG108, procainamida, hidralazina y/o cualquier combinación de las mismas. En determinados aspectos, la DNMTi puede ser la azacitidina.

Según el procedimiento proporcionado en el presente documento, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a SEMA4D y el agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi, o cualquier combinación de los mismos, puede administrarse por separado o simultáneamente. Cualquiera de los agentes puede administrarse antes que el otro o los agentes pueden administrarse simultáneamente, por ejemplo, en una única formulación. Además, las vías de administración, la formulación de los agentes y/o las pautas posológicas pueden ser las mismas o diferentes.

Según el procedimiento proporcionado en el presente documento, el anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a SEMA4D y el agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi y/o cualquier combinación de los mismos se administran a un sujeto con cáncer. El cáncer del sujeto puede ser de reciente diagnóstico o, en determinados aspectos, la administración puede seguir tratamientos oncológicos más tradicionales. En determinados aspectos, la administración de la terapia combinada proporcionada en el presente documento puede utilizarse como medida preventiva en un sujeto con alta susceptibilidad a desarrollar un determinado cáncer, o para prevenir la recurrencia de un cáncer que ha sido tratado previamente. El cáncer del sujeto puede ser, por ejemplo, un tumor sólido, un tumor hematológico maligno, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el cáncer del sujeto es un tumor sólido o una metástasis del mismo. El tumor sólido puede ser, por ejemplo, un sarcoma, un carcinoma, un melanoma, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos. Algunos ejemplos de tumores sólidos que pueden tratarse según el procedimiento proporcionado en el presente documento incluyen, entre otros, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células renales, carcinoma ductal de mama, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, melanoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de peritoneo, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer neuroendocrino, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, cáncer de esófago, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de glándula tiroidea, cáncer de cabeza y cuello, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el cáncer es una neoplasia hematológica o una metástasis de la misma. Algunos ejemplos de neoplasias hematológicas que pueden tratarse según el procedimiento proporcionado en el presente documento incluyen, entre otras, leucemia, linfoma, mieloma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

En determinados aspectos, el procedimiento de tratamiento del cáncer proporcionado en el presente documento puede incluir además la administración de una terapia adicional contra el cáncer. La terapia adicional contra el cáncer puede tener lugar simultáneamente con la administración de la terapia combinada proporcionada en el presente documento, antes de la terapia combinada proporcionada en el presente documento o después de la terapia combinada proporcionada en el presente documento. En determinados aspectos, la terapia adicional puede incluir, entre otras, cirugía, quimioterapia, radioterapia, administración de una vacuna contra el cáncer, administración de un agente inmunoestimulador, terapia adoptiva de linfocitos T o anticuerpos, administración de un inhibidor del bloqueo de puntos de control inmunitarios, administración de un modulador de linfocitos T reguladores (Treg) o una combinación de dichas terapias.

La administración del agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi y/o cualquier combinación de los mismos, combinado con el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a SEMA4D, puede ser útil para el tratamiento de diversos tumores malignos y no malignos. Por "actividad antitumoral" se entiende una reducción de la tasa de proliferación o acumulación de células malignas y, por tanto, una disminución de la tasa de crecimiento de un tumor existente o de un tumor que surja durante la terapia y/o la destrucción de las células neoplásicas (tumorales) existentes o de las células neoplásicas de nueva formación y, por tanto, una disminución del tamaño total de un tumor durante la terapia. La "actividad antitumoral" también puede comprender la estimulación de la infiltración inmunitaria en el tumor, un cambio hacia linfocitos T citotóxicos CD8+ funcionales, específicos de tumor y secretores de IFNy, un aumento de la proporción entre linfocitos T efectores y linfocitos T reguladores, un aumento de la actividad de los linfocitos T, la infiltración y activación de células presentadoras de antígenosque presentan antígenos tumorales y activan localmente a los linfocitos T específicos de tumor, la reducción de la angiogénesis asociada al tumor, la inhibición de la progresión tumoral y el aumento de la supervivencia. Por ejemplo, la terapia con un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi, un DNMTi y/o una combinación de los mismos y un anticuerpo anti-SEMA4D puede provocar una respuesta fisiológica, por ejemplo, inhibición, retraso o reducción del crecimiento tumoral o de las células malignas y la metástasis, que es beneficiosa con respecto al tratamiento del cáncer asociado con células que expresan SEMA4D en un ser humano.

En determinados aspectos, la terapia combinada con un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-24l, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, y un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, puede utilizarse como medicamento, en especial para su uso en el tratamiento o la profilaxis del cáncer o para su uso en una afección o lesión precancerosa. En determinados aspectos, la terapia combinada con un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, y un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, puede utilizarse para el tratamiento de un cáncer que sobreexprese SEMA4D, o un cáncer asociado a células que expresen SEMA4D.

De acuerdo con los procedimientos de tratamiento proporcionados en el presente documento, la administración de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, y un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, según se define en el presente documento, puede utilizarse para estimular una respuesta terapéutica positiva en el sujeto con cáncer o predispuesto a contraer cáncer. Una "respuesta terapéutica positiva" con respecto al cáncer pretende incluir una mejora de la enfermedad en asociación con la actividad "antitumoral" que pretende una reducción de la tasa de proliferación o acumulación de células malignas, y por lo tanto una disminución de la tasa de crecimiento de un tumor existente o en un tumor que surge durante la terapia y/o la destrucción de células neoplásicas (tumorales) existentes o células neoplásicas recién formadas, y por lo tanto una disminución del tamaño total de un tumor durante la terapia. Estas respuestas terapéuticas positivas no se limitan a la vía de administración. Los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden servir para inhibir, retrasar o reducir el crecimiento tumoral, el crecimiento de células malignas y las metástasis en un sujeto con cáncer. Así, como ejemplo no limitante, una mejora de la enfermedad puede caracterizarse como una reducción del crecimiento tumoral o la ausencia de tumores. Tal como se describe en otros puntos del presente documento, la respuesta terapéutica lograda tras la administración de la terapia combinada proporcionada puede ser mayor que la respuesta terapéutica correspondiente lograda tras la administración de un agente modulador epigenético o un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo individualmente. En determinados aspectos, la respuesta terapéutica lograda es mayor que la respuesta aditiva esperada tras la administración de los dos agentes. En otras palabras, la respuesta terapéutica conseguida es sinérgica. En determinados aspectos, la respuesta sinérgica puede dar como resultado un tratamiento más eficaz, un tratamiento más rápido, o puede permitir el tratamiento con dosis reducidas de los agentes en la terapia combinada.

Composiciones farmacéuticas y procedimientos de administración

La presente divulgación proporciona una composición farmacéutica, que incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-SEMA4D, o un fragmento de unión al antígeno del mismo, y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos. La composición puede comprender además uno o más vehículos o excipientes farmacéuticamente aceptables y/o uno o más agentes terapéuticos adicionales, cuyos ejemplos se describen en el presente documento. En el presente documento se proporcionan anticuerpos anti-SEMA4D y agentes moduladores epigenéticos adecuados para su uso en dicha composición farmacéutica.

En determinados aspectos, la composición farmacéutica incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo que incluye una VH y una VL, en la que la VH y la VL comprenden las secuencias de aminoácidos de CDR contenidas en los MAb VX15/2503 y en el MAb 67, concretamente, una HCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 2, un HCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 3, un HCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 4, una LCDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 6, un LCDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 y un LCDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 8. En determinados aspectos, la composición farmacéutica incluye una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo que incluye las secuencias de aminoácidos de VH y VL del MAb VX15/2503, concretamente, una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5.

En determinados aspectos, la composición farmacéutica incluye una cantidad eficaz del HDACi entinostat. En determinado aspecto, la composición farmacéutica incluye una cantidad eficaz del DNMTi azacitidina.

Un ejemplo de una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento incluye una cantidad eficaz de MAb VX15/2503 y una cantidad eficaz de entinostat. Otro ejemplo de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento incluye una cantidad eficaz de MAb VX15/2503 y una cantidad eficaz de azacitidina. En determinados aspectos, la "cantidad eficaz" de un agente concreto incluido en la composición farmacéutica proporcionada puede ser diferente, por ejemplo, inferior, a la cantidad del agente que sería eficaz como terapia individual. En determinados aspectos, la eficacia terapéutica de la composición farmacéutica proporcionada en el presente documento es mayor que el efecto aditivo de los agentes incluidos si se administraran individualmente.

La vía de administración del agente modulador epigenético combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo puede ser, por ejemplo, oral, parenteral, por inhalación o tópica. El término parenteral utilizado en el presente documento incluye, por ejemplo, la administración intravenosa, intraarterial, intraperitoneal, intramuscular, subcutánea, rectal o vaginal. Los modos de administración de ambos agentes pueden ser iguales o diferentes. Aunque todas estas formas de administración se contemplan claramente dentro del ámbito de los procedimientos proporcionados en el presente documento, un ejemplo no limitante de una forma de administración sería una solución inyectable, en especial para inyección o goteo intravenoso o intraarterial. Una composición farmacéutica inyectable adecuada puede comprender un tampón (por ejemplo, tampón acetato, fosfato o citrato), un tensioactivo (por ejemplo, polisorbato), opcionalmente un agente estabilizante (por ejemplo, albúmina humana), etc. Sin embargo, en otros procedimientos compatibles con las indicaciones del presente documento, el agente modulador epigenético y/o el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo pueden administrarse directamente al lugar de la población celular adversa, aumentando así la exposición del tejido enfermo al agente terapéutico.

Los procedimientos de preparación y administración de la terapia combinada proporcionada en el presente documento que incluye el agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, a un sujeto que lo necesite son bien conocidos o pueden ser determinados con facilidad por los expertos en la materia.

Tal como se analiza en el presente documento, el agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, puede administrarse en una cantidad farmacéuticamente eficaz para el tratamientoin vivodel cáncer. A este respecto, se apreciará que el agente modulador epigenético y el anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo divulgados pueden formularse para facilitar la administración y estimular la estabilidad del agente activo. En determinadas realizaciones, las composiciones farmacéuticas de acuerdo con los procedimientos proporcionados en el presente documento comprenden un vehículo farmacéuticamente aceptable, no tóxico y estéril, tal como solución salina fisiológica, tampones no tóxicos, conservantes y similares. A efectos de la presente solicitud, una cantidad farmacéuticamente eficaz del agente modulador epigenético y del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo es una cantidad suficiente para afectar a la actividad de al menos una modificación epigenética en una célula cancerosa, por ejemplo, para reducir la actividad de la histona desacetilasa o la actividad de la ADN metiltransferasa, y para lograr una unión eficaz a una diana y lograr un beneficio, por ejemplo, un efecto antiproliferativo, una inhibición, retraso o reducción del crecimiento tumoral y de células malignas y metástasis, la prevención de nuevos brotes tumorales, una reducción del tamaño del tumor, una disminución de la vasculatura tumoral y una reducción del número de células cancerosas en un sujeto con cáncer y/o una disminución de uno o más síntomas asociados a la enfermedad.

Las composiciones farmacéuticas usadas en los procedimientos proporcionados en el presente documento pueden incluir vehículos farmacéuticamente aceptables, tales como, por ejemplo, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina, proteínas séricas, tales como albúmina sérica humana, sustancias tampón, tales como fosfatos, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio, mezclas parciales de glicéridos de ácidos grasos vegetales saturados, agua, sales o electrolitos, tales como sulfato de protamina, hidrogenofosfato de disodio, hidrogenofosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de cinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, polivinilpirrolidona, sustancias a base de celulosa, polietilenglicol, carboximetilcelulosa de sodio, poliacrilatos, ceras, polímeros en bloque de polietilenopolioxipropileno, polietilenglicol y lanolina.

Los preparados para la administración parenteral pueden incluir soluciones, suspensiones y emulsiones acuosas o no acuosas estériles. Algunos ejemplos no limitantes de disolventes no acuosos son el propilenglicol, el polietilenglicol, aceites vegetales, tales como el aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables, tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen, por ejemplo, agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluidos los medios salinos y tamponados. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen, entre otros, tampón fosfato 0,01-0,1 M, por ejemplo, 0,05 M, o solución salina al 0,8 %. Otros vehículos parenterales habituales son las soluciones de fosfato sódico, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactada o aceites fijos. Los vehículos intravenosos incluyen reponedores de fluidos y nutrientes, reponedores de electrolitos, tales como los basados en dextrosa de Ringer, y similares. También pueden estar presentes conservantes y otros aditivos tales como, por ejemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes y gases inertes y similares.

Algunos ejemplos no limitantes de composiciones farmacéuticas adecuadas para un uso inyectable incluyen soluciones acuosas estériles (cuando son solubles en agua) o dispersiones y polvos estériles para la preparación improvisada de soluciones o dispersiones inyectables estériles. En tales casos, la composición debe ser estéril y fluida hasta el punto de que se pueda inyectar fácilmente. Las composiciones suelen estar formuladas para ser estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento y pueden preservarse contra la acción contaminante de microorganismos, tales como bacterias y hongos. El vehículo puede ser un disolvente o medio de dispersión que contenga, por ejemplo, agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propilenglicol y polietilenglicol líquido, y similares) y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez adecuada puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un recubrimiento, tal como la lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de la dispersión y mediante el uso de tensioactivos. Las formulaciones adecuadas para los procedimientos terapéuticos descritos en el presente documento se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Co.), 16a ed. (1980).

La prevención de la acción de los microorganismos puede lograrse mediante diversos agentes antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal y similares. Pueden incluirse en la composición agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes, tales como manitol, sorbitol, o cloruro de sodio . La absorción prolongada de las composiciones inyectables puede conseguirse incluyendo en la composición un agente que retrase la absorción, por ejemplo, monoestearato de aluminio y gelatina.

Las soluciones inyectables estériles pueden prepararse incorporando los principios activos (por ejemplo, un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, por sí solo o combinado con otros agentes activos) en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes enumerados en el presente documento, según se requiera, seguido de una esterilización por filtración. Por lo general, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo a un vehículo estéril, que contiene un medio de dispersión básico y los demás ingredientes necesarios de los enumerados anteriormente. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, dos ejemplos no limitantes de procedimientos de preparación son el secado al vacío y la liofilización, que producen un polvo de un principio activo más cualquier ingrediente adicional deseado a partir de una solución previamente esterilizada por filtración del mismo. Los preparados inyectables se procesan, se envasan en recipientes, tales como ampollas, bolsas, frascos, jeringas o viales, y se sellan en condiciones asépticas según procedimientos conocidos en la técnica. Además, los preparados pueden envasarse y comercializarse en forma de kit. Dichos artículos manufacturados pueden llevar etiquetas o prospectos que indiquen que las composiciones asociadas son útiles para tratar a un sujeto que padezca cáncer o esté predispuesto a padecerlo.

Las formulaciones parenterales pueden ser una dosis única en embolada, una infusión o una dosis en embolada de carga seguida de una dosis de mantenimiento. Estas composiciones pueden administrarse a intervalos específicos fijos o variables, por ejemplo, una vez al día, o "según sea necesario".

Determinadas composiciones farmacéuticas utilizadas pueden administrarse por vía oral en una forma farmacéutica aceptable que incluye, por ejemplo, cápsulas, comprimidos, suspensiones acuosas o soluciones. Determinadas composiciones farmacéuticas también pueden administrarse por aerosol nasal o inhalación. Dichas composiciones pueden prepararse como soluciones en solución salina, empleando alcohol bencílico u otros conservantes adecuados, estimulantes de la absorción para mejorar la biodisponibilidad y/u otros agentes solubilizantes o dispersantes convencionales.

La cantidad de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, y un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que se combinará con los materiales vehículo para producir una única forma farmacéutica variará en función del sujeto a tratar y del modo concreto de administración. La composición puede administrarse como dosis única, dosis múltiples o durante un periodo de tiempo establecido en infusión. Las pautas posológicas también pueden ajustarse para proporcionar la respuesta óptima deseada (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica).

De acuerdo con el alcance de la presente divulgación, el agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, puede administrarse a un sujeto humano o animal de acuerdo con los procedimientos de tratamiento mencionados anteriormente en una cantidad suficiente para producir un efecto terapéutico. El agente modulador epigenético combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo puede administrarse a dicho ser humano u otro animal en una forma farmacéutica convencional preparada combinando el anticuerpo y el agente modulador epigenético con un vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable convencional según técnicas conocidas. Un experto en la materia reconocerá que la forma y el carácter del vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable vienen dictados por la cantidad de principio activo con el que se va a combinar, la vía de administración y otras variables bien conocidas. Los expertos en la materia apreciarán además que puede utilizarse un cóctel que comprenda un agente modulador epigenético y un anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo.

Por "cantidad eficaz" se entiende una cantidad del agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi y/o una combinación de los mismos, y una cantidad del anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, que al administrarse produce una respuesta terapéutica positiva con respecto al tratamiento de un paciente con una enfermedad que se va a tratar, por ejemplo, puede observarse un efecto antiproliferativo, la prevención de nuevos brotes tumorales, una reducción del tamaño del tumor, una disminución de la vasculatura tumoral, una reducción del número de células cancerosas, la inhibición, el retraso o la reducción del crecimiento de tumores y/o células malignas y/o metástasis en un sujeto con cáncer y/o la disminución de uno o más síntomas asociados con la enfermedad.

Las dosis terapéuticamente eficaces de las composiciones descritas en el presente documento, por ejemplo, para un efecto antiproliferativo, la prevención de nuevos brotes tumorales, una reducción del tamaño del tumor, una disminución de la vasculatura tumoral, una reducción del número de células cancerosas, la inhibición, el retraso o la reducción del crecimiento de tumores y/o células malignas y/o metástasis en un sujeto con cáncer y/o la disminución de uno o más síntomas asociados a la enfermedad, puede variar en función de muchos factores diferentes, incluidos los medios de administración, el sitio diana, el estado fisiológico del paciente, si el paciente es un ser humano u otro animal, otros medicamentos administrados, y si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En determinadas realizaciones, el paciente es un ser humano, pero también pueden tratarse animales no humanos, incluidos animales transgénicos. Las dosis de tratamiento pueden ajustarse utilizando procedimientos habituales conocidos por los expertos en la materia para optimizar la seguridad y la eficacia.

La cantidad del agente modulador epigenético, por ejemplo, el HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, el DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o el fragmento de unión al antígeno del mismo que se va a administrar puede ser determinada con facilidad por una persona conocedora de la materia sin experimentación innecesaria dada la divulgación proporcionada en el presente documento. Los factores que influyen en el modo de administración y la cantidad respectiva del agente modulador epigenético y del anticuerpo 0 un fragmento de unión al antígeno del mismo incluyen, entre otros, la gravedad de la enfermedad, los antecedentes de la enfermedad y la edad, la altura, el peso, la salud y el estado físico del individuo sometido a terapia. De modo similar, la cantidad del agente modulador epigenético y del anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se administrará dependerá del modo de administración y de si el sujeto recibirá una dosis única o a dosis múltiples de este agente.

También se proporciona el uso de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto con cáncer y, en algunos, aspectos incluye además el pretratamiento con al menos otra terapia. Por "pretratado" o "pretratamiento" se entiende que el sujeto ha recibido otra u otras terapias (por ejemplo, ha sido tratado con al menos otra terapia contra el cáncer) antes de recibir el medicamento que comprende el agente modulador epigenético combinado con el anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo. "Pretratados" o "pretratamiento" incluye sujetos que han sido tratados con al menos otra terapia en un plazo de 2 años, en un plazo de 18 meses, en un plazo de 1 año, en un plazo de 6 meses, en un plazo de 2 meses, en un plazo de 6 semanas, en un plazo de 1 mes, en un plazo de 4 semanas, en un plazo de 3 semanas, en un plazo de 2 semanas, en un plazo de 1 semana, en un plazo de 6 días, en un plazo de 5 días, en un plazo de 4 días, en un plazo de 3 días, en un plazo de 2 días, o incluso en un plazo de 1 día antes del inicio del tratamiento con el medicamento que comprende el agente modulador epigenético, por ejemplo, HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, por ejemplo, entinostat y/o DNMTi, por ejemplo, azacitidina, y un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, por ejemplo, el anticuerpo monoclonal VX15/2503 divulgado en el presente documento, o un fragmento de unión al antígeno del mismo. No es necesario que el sujeto haya respondido al pretratamiento con la terapia o terapias anteriores. Así, el sujeto que recibe el medicamento que comprende el agente modulador epigenético combinado con un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo podría haber respondido, o podría no haber respondido, al pretratamiento con la terapia anterior, o a una o más de las terapias anteriores cuando el pretratamiento comprendiera múltiples terapias.

Los procedimientos proporcionados en el presente documento también prevén el uso de un agente modulador epigenético, por ejemplo, un HDACi que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241, un DNMTi y/o una combinación de los mismos, combinado con un anticuerpo anti-SEMA4D o un fragmento de unión al antígeno del mismo, en la fabricación de un medicamento para tratar a un sujeto con cáncer, en el que el medicamento se utiliza en un sujeto que también está siendo tratado con al menos otra terapia. Las terapias disponibles descritas en el presente documento incluyen, entre otras, cirugía, radioterapia, una vacuna contra el cáncer, la administración de un agente inmunoestimulador, una terapia de linfocitos T adoptivos o de anticuerpos, la administración de un inhibidor del bloqueo de puntos de control inmunitario, la administración de un modulador de linfocitos T reguladores (Treg) o una combinación de los mismos.

Esta divulgación emplea, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, cultivo celular, biología molecular, biología transgénica, microbiología, ADN recombinante e inmunología, que están dentro de las competencias de la técnica. Estas técnicas se explican detalladamente en la bibliografía (véase, por ejemplo, Sambrooket al.,ed. (1989), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Sambrooket al.,ed. (1992), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Springs Harbor Laboratory, NY); D. N. Glover ed., (1985), DNA Cloning, volúmenes I y II; Gait, ed. (1984), Oligonucleotide Synthesis; Mulliset al.,patente de EE. UU. n.° 4683 195; Hames y Higgins, eds. (1984), Nucleic Acid Hybridization; Hames y Higgins, eds. (1984), Transcription And Translation; Freshney (1987), Culture Of Animal Cells (Alan R. Liss, Inc.) Immobilized Cells And Enzymes (IRL Press) (1986); Perbal (1984), A Practical Guide To Molecular Cloning; the treatise, Methods In Enzymology (Academic Press, Inc., N.Y.); Miller y Calos, eds. (1987), Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Cold Spring Harbor Laboratory); Wuet al.,eds., Methods In Enzymology, vols. 154 y 155; Mayer y Walker, eds. (1987), Immunochemical Methods In Cell And Molecular Biology (Academic Press, Londres); Weir y Blackwell, eds. (1986), Handbook Of Experimental Immunology, volúmenes I-IV; Manipulating the Mouse Embryo, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y, (1986); y en Ausubelet al.(1989), Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley and Sons, Baltimore, Md.).

Los principios generales de la modificación de anticuerpos se exponen en Borrebaeck, ed. (1995), Antibody Engineering (2a ed., Oxford Univ. Press). Los principios generales de la modificación de proteínas se exponen en Rickwoodet al.,eds. (1995), Protein Engineering, A Practical Approach (IRL Press at Oxford Univ. Press, Oxford, Reino Unido). Los principios generales de los anticuerpos y de la unión anticuerpo-hapteno se exponen en: Nisonoff (1984), Molecular Immunology (2a ed., Sinauer Associates, Sunderland, Mass.); y Steward (1984), Antibodies, Their Structure and Function (Chapman and Hall, Nueva York, N.Y). Además, pueden seguirse métodos convencionales de inmunología conocidos en la técnica y no descritos específicamente, como en Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Stiteset al.(1994), Basic and Clinical Immunology (8a ed., Appleton & Lange, Norwalk, Conn.); y Mishell y Shiigi (eds.) (1980), Selected Methods in Cellular Immunology (W.H. Freeman and Co., NY).

Las obras de referencia convencionales que establecen los principios generales de la inmunología incluyen Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons, Nueva York; Klein J., Immunology: The Science of Self-Nonself Discrimination (John Wiley & Sons, NY); Kennettet al.,eds. (1980), Monoclonal Antibodies, Hybridoma: A New Dimension in Biological Analyses (Plenum Press, NY); Campbell (1984), "Monoclonal Antibody Technology" en Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, ed. Burdenet al.(Elsevier, Amsterdam); Goldsbyet al.,eds. (2000), Kuby Immunology (4a ed.; W.H. Freeman and Co., NY); Roittet al.(2001), Immunology (6a ed., Londres: Mosby); Abbaset al.(2005), Cellular and Molecular Immunology (5a ed., Elsevier Health Sciences Division); Kontermann y Dubel (2001), Antibody Engineering (Springer Verlag); Sambrook y Russell (2001), Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Lewin (2003), Genes VIII (Prentice Hall, 2003); Harlow y Lane (1988), Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Press); Dieffenbach y Dveksler (2003), PCR Primer (Cold Spring Harbor Press).

Los siguientes ejemplos se ofrecen a título ilustrativo y no limitante.

Ejemplos

Ejemplo 1: La administración de entinostat (ENT) y un anticuerpo anti-SEMA4D aumenta la supervivencia, retrasa significativamente el crecimiento tumoral y aumenta el porcentaje de regresión tumoral completa

El efecto de la administración combinada de ENT y MAb anti-SEMA4D sobre la supervivencia, el crecimiento tumoral y la regresión tumoral se ensayó en un modelo tumoral de ratón. Se implantaron células Colon26 (500000 células) por vía subcutánea en ratones Balb/c. Los ratones se trataron con 1) Ig de control (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 5, empezando el día 2) (n = 20); 2) Ig de control (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 5, empezando el día 2) ENT (20 mg/kg, 3x/semanalmente x 2 semanas, iniciado cuando el volumen tumoral medio fue de -300 mm3) (n = 21); 3) anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 5 semanas, empezando el día 2) (n = 24); o 4) anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 5 semanas, empezando el día 2) y ENT (20 mg/kg, 3x/semanalmente x 2 semanas, empezando cuando el volumen tumoral medio era de -300 mm3)(n = 26) (diseño experimental representado en la figura 1). El volumen tumoral en el momento del tratamiento fue similar entre los grupos de control y experimental. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar la función de supervivencia, se midió el cambio en el volumen tumoral para determinar las tasas de crecimiento tumoral y se evaluó la frecuencia de regresión tumoral completa determinando el porcentaje de ratones sin tumores. El porcentaje de regresión completa (% de RC) también se estratificó por tumores que superaban al menos 100 mm3 antes de la regresión. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox para la supervivencia, ANOVA de 2 vías para el volumen tumoral y la prueba exacta de Fisher para la RC. Prism notifica los resultados como no significativos (ns) ap> 0,05, significativos (simbolizados por"*") a 0,01 <p< 0,05, muy significativos ("**") a 0,001 <p£0,01, extremadamente significativo ("***") ap< 0,001, y de máxima significación ("****") ap< 0,0001. Los ratones que no desarrollaron tumores o que desarrollaron ulceración tumoral antes de alcanzar un volumen tumoral de 700 mm3 fueron excluidos del análisis.

Se observó un efecto sinérgico en el retraso del crecimiento tumoral para el grupo al que se le administró ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 combinados (un 782 % máximo de retraso del crecimiento tumoral ("tumor growth delay, TGD)) en comparación con los grupos a los que se les administraron cualquiera de los agentes solos: 107% de TGD con SEMA4D/MAb 67 y 214% de TGD con ENT (figura 2A). Los ratones tratados con ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 también mostraron una mejora significativa de la supervivencia en comparación con los ratones tratados con ENT o anti-SEMA4D/MAb 67(p< 0,05) (figura 2B). Además, el tratamiento combinado con ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 aumentó significativamente la frecuencia de regresión tumoral completa (62 %***), especialmente entre los tumores que superaban 100 mm3 antes de la regresión, en comparación con cualquiera de los dos agentes por separado (figuras 2C y 2D). Estos resultados demuestran que el tratamiento con ENT y MAb anti-SEMA4D mejoró la supervivencia, redujo el crecimiento tumoral y provocó la regresión de los tumores establecidos de mayor tamaño.

Ejemplo 2: La administración de ENT y un anticuerpo anti-SEMA4D mejora la supervivencia, reduce el crecimiento tumoral y aumenta la frecuencia de regresión completa

Se implantaron células Colon26 (500000 células) por vía subcutánea en ratones Balb/c. Los ratones fueron tratados con 1) Ig de control (10 mg/kg, semanalmente x 5 semanas, comenzando el día 2 (n = 12)); 2) Ig de control (10 mg/kg, semanalmente x 5 semanas, comenzando el día 2) y ENT (20 mg/kg, 3x/semana x 2 semanas, iniciado cuando el volumen tumoral medio -250 mm3) (n = 9); 3) anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, IP, semanal x 5 semanas, a partir del día 2) (n = 8);o 4) anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, semanal x 5 semanas, a partir del día 2) y ENT (20 mg/kg, 3x/semana x 2 semanas, iniciada cuando el volumen tumoral medio -250 mm3) (n = 13). El volumen tumoral en el momento del tratamiento fue similar entre los grupos de control y experimental. Se muestran para cada grupo el volumen tumoral medio, las curvas de supervivencia de Kaplan Meier y la frecuencia de regresión tumoral completa. La significación estadística se determinó mediante ANOVA de 2 vías, la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox y la prueba exacta de Fisher, respectivamente. Prism notifica los resultados como no significativos (ns) ap> 0,05, significativos (simbolizados por"*") a 0,01 <p< 0,05, muy significativo ("**") a 0,001 <p<0,01, y extremadamente significativo ("***") ap< 0,001. Los ratones que no desarrollaron tumores o que desarrollaron ulceración tumoral antes de alcanzar un volumen tumoral de 700 mm3 fueron excluidos del análisis.

Los ratones que recibieron ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 presentaron un TGD máximo del 705 %, mientras que los ratones tratados con anti-SEMA4D/MAb67 mostraron un retraso del 119 % en el crecimiento tumoral (figura 3a ). El tratamiento combinado de ratones con ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 también aumentó la frecuencia de regresión tumoral completa (un 62 %**), en comparación con los grupos de tratamiento con Ig de control y ENT (un 25 %*) (figuras 3B-3D). Además, los ratones que recibieron ENT y anti-SEMA4D/MAb 67 mostraron una mejora significativa de la supervivencia en comparación con los ratones tratados con Ig de control (p < 0,001) o Ig de control y ENT (p < 0,01) (figura 3E). Estos resultados demuestran que un tratamiento combinado con ENT y MAb anti-SEMA4D dio como resultado en una mayor supervivencia, la disminución del crecimiento tumoral y la erradicación de tumores.

Ejemplo 3: La administración de azacitidina (AZA) y un anticuerpo anti-SEMA4D aumenta la supervivencia, retrasa significativamente el crecimiento tumoral y aumenta el porcentaje de regresión tumoral completa

El efecto de la administración combinada de AZA y MAb anti-SEMA4D sobre la supervivencia, el crecimiento tumoral y la regresión tumoral se ensayó en un modelo tumoral de ratón. Se implantaron células Colon26 (500000 células) por vía subcutánea en ratones Balb/c. Los ratones fueron tratados con: Grupo 1: Ig control (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 4, empezando el día 2 (n = 12)); Grupo 2 : anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 4, empezando el día 2 (N = 8)); Grupo 3: Ig control (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 4, empezando el día 2 AZA (0,8 mg/kg, 3x/semana X 4 dosis, empezando el día 22-24, cuando el volumen promedio del tumor era de aproximadamente 200 mm3 (n = 10)); y Grupo 4: anti-SEMA4D/MAb 67 (10 mg/kg, i.p., semanalmente x 4, empezando el día 2 AZA (0,8 mg/kg, 3x/semana X 4 dosis, empezando el día 22-24, cuando el volumen promedio del tumor era de aproximadamente 200 mm3 (n = 9)). El diseño experimental se muestra en la figura 4). Los ratones fueron controlados durante 60 días o hasta que los volúmenes tumorales alcanzaron aproximadamente 1500 mm3.

Los volúmenes tumorales en el momento del tratamiento fueron similares entre los grupos de control y experimental. Se realizó un análisis de supervivencia de Kaplan-Meier para evaluar la función de supervivencia, se midió el cambio en el volumen tumoral para determinar las tasas de crecimiento tumoral y se evaluó la frecuencia de regresión tumoral completa determinando el porcentaje de ratones sin tumores. La significación estadística se determinó mediante la prueba de rangos logarítmicos de Mantel Cox para la supervivencia, ANOVA de 2 vías para el volumen tumoral y la prueba exacta de Fisher para la regresión tumoral completa. Prism notifica los resultados como no significativosp> 0,05, significativos (simbolizados por"*") a 0,01 <p< 0,05, o muy significativos ("**") a 0,001 <p<0,01. Los ratones que no desarrollaron tumores o que desarrollaron ulceración tumoral antes de alcanzar un volumen tumoral de 700 mm3 fueron excluidos del análisis.

Los ratones que recibieron AZA y anti-SEMA4D/MAb 67 presentaron un TGD máximo del 705%, mientras que los ratones tratados con anti-SEMA4D/MAb67 mostraron un retraso del 119 % en el crecimiento tumoral (figura 5A). Los ratones tratados con AZA y anti-SEMA4D/MAb 67 también mostraron una mejora significativa de la supervivencia en comparación con los ratones de control (p < 0,001) y una mejora casi significativa de la supervivencia en comparación con el agente único anti-SEDMA4D/MAb67 (p = 0,0697) (figura 5B). Además, el tratamiento combinado de AZA y anti-SEMA4D/MAb 67 aumentó significativamente la frecuencia de regresión tumoral completa hasta el 78 % (p < 0,01), en comparación con Ig de control (un 17 %) (figura 5C). Estos resultados demuestran que el tratamiento con AZA y MAb anti-SEMA4D mejoró la supervivencia, redujo el crecimiento tumoral y provocó la regresión de los tumores establecidos de mayor tamaño.

La amplitud y el alcance de la presente divulgación no deben verse limitados por ninguna de las realizaciones ilustrativas descritas anteriormente, sino que deben definirse únicamente de acuerdo con las siguientes reivindicaciones.

Tabla 4: Secuencias

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) e inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor para su uso en la inhibición, el retraso o la reducción del crecimiento de células malignas en un sujeto con cáncer, combinado con una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético seleccionado entre un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DN<m>T) (DNMTi); o cualquier combinación de los mismos.

2. Una terapia combinada para su uso en la inhibición, el retraso o la reducción del crecimiento de células malignas en un sujeto con cáncer, en la que la terapia combinada incluye (a) un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) e inhibe la interacción de SEMA4D con su receptor y (b) una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético, en la que el agente modulador epigenético se selecciona entre un inhibidor de la histona deacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi); o cualquier combinación de los mismos.

3. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo para el uso de la reivindicación 1, o la terapia combinada para el uso de la reivindicación 2, en los que el receptor es plexina-B 1, plexina-B2 o CD72.

4. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en los que el anticuerpo o un fragmento del mismo inhibe la transducción de señales de plexina-B1 mediada por SEMA4D.

5. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en los que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las CDR 1-3 de VH que comprenden las SEQ ID NO: 2, 3, y 4, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las CDR 1-3 de VL que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.

6. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 5, en los que el VH y el VL comprenden, respectivamente, SEQ ID NO: 1 y SEQ ID n O: 5 o SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10.

7. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en los que el HDACi es entinostat (N-[[4-[(2-aminofenil)carbamoil]fenil]metil]carbamato de piridin-3-ilmetilo).

8. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en los que el agente modulador epigenético comprende un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi).

9. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 8, en los que el DNMT comprende DNMT1, DNMT-3a, DNMT-3b o cualquier combinación de los mismos.

10. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 8 o 9, en los que el DNMTi es un análogo de nucleósido, un oligonucleótido antisentido, un inhibidor enzimático de molécula pequeña o cualquier combinación de los mismos.

11. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 8 o 10, en los que el DNMTi comprende azacitidina, decitabina, zebularina, 8SGI-110, galato de epigalocatequina, MG98, RG108, procainamida, hidralazina, cualquier combinación de los mismos, o cualquier sal, cristal, estructura amorfa, hidrato, derivado, metabolito, isómero o profármaco de los mismos.

12. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 10, en los que el DNMTi es azacitidina.

13. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en los que el cáncer comprende un tumor sólido, una neoplasia hematológica, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

14. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de la reivindicación 13, en los que el cáncer comprende un tumor sólido seleccionado del grupo que consiste en carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, carcinoma de células basales, carcinoma de células renales, carcinoma ductal de mama, sarcoma de tejidos blandos, osteosarcoma, melanoma, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de pulmón no microcítico, adenocarcinoma de pulmón, cáncer de peritoneo, carcinoma hepatocelular, cáncer gastrointestinal, cáncer gástrico, cáncer de páncreas, cáncer neuroendocrino, glioblastoma, cáncer de cuello uterino, cáncer de ovario, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer cerebral, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorrectal, carcinoma endometrial o uterino, cáncer de esófago, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñón, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, cáncer de cabeza y cuello, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos, o una neoplasia hematológica o metástasis de la misma seleccionada entre leucemia, linfoma, mieloma, leucemia mieloide aguda, leucemia mieloide crónica, leucemia linfocítica aguda, leucemia linfocítica crónica, leucemia de células pilosas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano, mieloma múltiple, cualquier metástasis de los mismos o cualquier combinación de los mismos.

15. El anticuerpo o un fragmento de unión al antígeno del mismo, o la terapia combinada, para el uso de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en los que:

(a) el anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) comprende una VH que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 1 y una VL que comprende la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 5, y

(b) el agente modulador epigenético comprende el HDACi entinostat o el DNMTi azacitidina.

16. Una composición farmacéutica que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo aislado o un fragmento de unión al antígeno del mismo que se une específicamente a la semaforina-4D (SEMA4D) y una cantidad eficaz de un agente modulador epigenético seleccionado entre un inhibidor de la histona desacetilasa (HDAC) (HDACi) que comprende chidamida, belinostat, ácido valproico o una sal del mismo, mocetinostat, abexinostat, entinostat, pracinostat, resminostat, givinostat, quisinostat, kevetrina, CUDC-101, AR-42, tefinostat (CHR-2845), CHR-3996, 4SC-202, CG200745, ACY-1215 o ACY-241; un inhibidor de la ADN metiltransferasa (DNMT) (DNMTi); o cualquier combinación de los mismos.

17. La composición farmacéutica de la reivindicación 16, en la que el anticuerpo o un fragmento del mismo comprende una cadena pesada variable (VH) que comprende las CDR 1-3 de VH que comprenden las SEQ ID NO: 2, 3, y 4, respectivamente, y una cadena ligera variable (VL) que comprende las CDR 1-3 de VL que comprenden las SEQ ID NO: 6, 7 y 8, respectivamente.