DE10223057A1 - Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen - Google Patents
Verfahren zur Erzeugung von PolynukleotidmolekülenInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen mit veränderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus, umfassend die folgenden Schritte durchlaufen wird: DOLLAR A (a) Bereitstellung eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide dieser Population mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt besitzen, DOLLAR A (b) Erzeugung von Einzelstrangbrüchen in den doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen, DOLLAR A (c) nukleolytischer Abbau in 5'->3'Richtung, ausgehend von den Einzelstrangbrüchen bei gleichzeitiger Neusynthese in 5'->3'Richtung unter Verschiebung der Einzelstrangbrüche in Richtung des 3'-Endes, DOLLAR A (d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmolekülen, DOLLAR A (e) Herstellung von partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelsträngigen Polynukleotidmolekülen, DOLLAR A (f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese, ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen, DOLLAR A wobei die Schritte (b) und (c) nacheinander oder gleichzeitig ausgeführt werden können.
Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen mit veränderten Eigenschaften.
- Biomoleküle - und insbesondere Biopolymere wie Polynukleotide, Polypeptide, Polysaccharide etc. - sind nicht nur Grundlage des uns bekannten biologischen Lebens, sondern finden zunehmend auch in den verschiedensten technischen Anwendungsfeldern Verwendung. Die Suche nach neuen funktionalen Biomolekülen, ihre Isolierung bzw. Herstellung, sowie ihre technische Anwendung ist Gegenstand der modernen Biotechnologie. Neben das zufällige Auffinden von bislang unbekannten Biomolekülen mit gewünschten Eigenschaften in der Natur (vgl. Naturstoff-Screening) treten seit einiger Zeit Verfahren, die die Prinzipien der natürlichen Evolution im Labor nachvollziehen.
- Neben den Verfahren zum Erzeugen punktueller Mutationen (in Form von Basenaustausch, -deletion und -insertion) stellt die Rekombination von Sequenzabschnitten in der Natur eine sehr erfolgreiche Strategie zur Kombination von punktuellen Mutationen, aber auch von Domänen innerhalb eines Polymers, von Untereinheiten eines Heteromultimers, oder von Genvarianten innerhalb eines Genclusters oder von Genen innerhalb eines Genoms dar. Insbesondere der homologen Rekombination, d. h. der Kombination sich entsprechender Sequenzabschnitte aus verschiedenen Varianten unter Beibehaltung von Orientierung und Leseraster kommt eine große Bedeutung zu.
- Experimentell lässt sich Rekombination unterschiedlich realisieren: Einerseits in-vitro unter Verwendung einzelner Enzymfunktionen oder definierter Mischungen bzw. Abfolgen enzymatischer Prozessierungsschritte, andererseits in-vivo unter Verwendung zellulärer Rekombinations- und/oder Reparaturprozesse.
- Für in-vitro-Verfahren werden technisch bislang vorwiegend PCR-basierende Verfahren eingesetzt. Zunächst ist hier das DNA-Shuffling, auch als secual PCR bezeichnet, zu nennen (WO 95/22625; Stemmer, Nature 370 (1994), 389). Hierbei werden beliebige in ihrer Sequenz überlappende Genfragmente erzeugt und anschließend durch PCR ohne Primier-Zugabe wieder zu Produkten der Originallänge aufgebaut. Durch gegenseitiges Primen der Fragmente können so bei jedem PCR-Zyklus Fragmente unterschiedlichen Ursprungs zufällig zu einem Produktmolekül homolog verbunden werden. Durch Einstellen der Fragmentlänge ermöglicht das DNA-Shuffling prinzipiell ein Eingrenzen der Häufigkeit von Rekombinationsereignissen. Jedoch ist dieses Verfahren experimentell aufwendig, da zunächst die Reaktionsbedingungen zur Erzeugung der Nukleinsäurefragmente etabliert werden müssen. Ein anderes Verfahren zur Herstellung rekombinanter DNA in-vitro wurde von Shao et al., Nucl. Acids Res. 26 (1998), 681). In diesem Verfahren werden Primer mit randomisierten Sequenzen verwendet, die ein Starten der Polymerisation an zufälligen Stellen innerhalb eines Polynukleotids ermöglichen. So entstehen ähnlich dem DNA-Shuffling kurze Polynukleotid-Fragmente, die durch gegenseitiges Primen miteinander rekombinieren können. Ein Steuern der Rekombinationshäufigkeit ist mit dieser Methode kaum möglich. Außerdem führen die unspezifischen Primer zu einer vergleichsweise hohen inhärenten Fehlerrate, die bei sensiblen Sequenzabschnitten und/oder langen Genen problematisch werden kann. Alternativ zu diesen Methoden verwendet der staggered extension process (WO 98/42728; Zhao et al., Nat. Biotechnol. 16 (1998), 258) ein modifiziertes PCR-Protokoll um einen Strangaustausch während der PCR-Amplifikation zu provozieren. Durch Verwendung sehr kurzer Phasen bei der Polymerisationstemperatur zwischen den Aufschmelz- und Annealingphasen können unvollständig gebildete Produkte mit neuen Matrizen hybridisieren und weiter verlängert werden. Das Einstellen der Rekombinationshäufigkeit kann durch Vorgabe der Polymerisationszeit und der Zyklusanzahl erfolgen. Technisch limitierend ist hier das exakte Einstellen sehr kurzer Phasen einer bestimmten Temperatur. Alternativ zu diesen PCR-basierenden Verfahren ist ein Verfahren beschrieben, das aus einer Population von Polynukleotidsequenzen mit Mutationen Heteroduplices erzeugt, welche dann in-vivo durch Einfügen in Zellen oder in-vitro durch Inkubation mit einem Zellextrakt einer statistischen Reparatur unterworfen werden, wodurch je nach relativer Häufigkeit der Varianten in der Ausgangspopulation zu einem gewissen Anteil rekombinierte Molekülvarianten entstehen (WO 99/29902). Charakteristisch für dieses Verfahren ist die Verwendung von zellulären Reparatursystemen, die spezifisch ungepaarte Basen erkennen und statistisch einen der beiden Stränge im Doppelstrang reparieren. Die Limitation dieses Verfahrens liegt einerseits in der begrenzten Effizienz, Polynukleotide in Zellen einzubringen und in der fehlenden Kontrollierbarkeit der Reparaturprozesse. Weiterhin ist von entscheidendem Nachteil, dass in einem Reparaturschritt nur jeweils zwei Ausgangsmoleküle miteinander rekombiniert werden können.
- Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Polynukleotiden mit veränderten Eigenschaften zur Verfügung zu stellen, das die oben beschriebenen Nachteile der bekannten Verfahren vermeidet und das eine effiziente Neukombination von Genotypen von Polynukleotid- Molekülen erlaubt und das so zur Erzeugung veränderter Phänotypen führt.
- Diese Aufgabe wird durch die Bereitstellung der in den Ansprüchen dargestellten Ausführungsformen gelöst.
- Somit betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen mit veränderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus umfassend die folgenden Schritte durchlaufen wird:
- a) Bereitstellung eines doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide dieser Population mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt besitzen,
- b) Erzeugung von Einzelstrangbrüchen in den doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen
- c) nukleolytischer Abbau in 5'→3'Richtung ausgehend von den Einzelstrangbrüchen bei gleichzeitiger Neusynthese in 5'→3'Richtung unter Verschiebung der Einzelstrangbrüche in Richtung des 3'-Ende
- d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmoleküle
- e) Herstellung von partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelsträngigen Polynukleotidmolekülen
- f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich somit durch eine Kombination von Vorteilen aus, die so mit keinem der bisher beschriebenen Verfahren erreichbar ist. Der geringe experimentelle und zeitliche Aufwand der Methode und die Möglichkeit der Automatisierung sind weitere Vorzüge.
- Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass durch gleichzeitigen nukleolytischen Abbau und Nukleinsäuresynthese; also durch die sogenannte Nick-Translation sowohl eine übermäßige Fragmentierung der Nukleinsäuren als auch der Abbau rekombinantionsfähiger Nukleinsäuren vermieden wird. Für die anschließende Rekombination der Nukleinsäuren in-vitro steht prinzipiell die Gesamtmenge der eingesetzten DNA zur Verfügung.
- Die Effizienz der Rekombination kann dadurch gegenüber den bisher beschriebenen Methoden zur Rekombination von Nukleinsäuren in-vitro gesteigert werden.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird mehr als ein Zyklus umfassend die obengenannten Schritte (a) bis (d) durchlaufen, d. h. mindestens zwei, vorzugsweise mindestens 5, besonders bevorzugt mindestens 10 und ganz besonders bevorzugt mindestens 20.
- Durch die zyklische Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich so aus einer Ausgangsverteilung verwandter Polynukleotidsequenzen Polynukleotide mit mehrfach neu kombinierten Sequenzbereichen herstellen. Insbesondere erlaubt die zyklische Anwendung, mehrere verschiedene heterologe Sequenzabschnitte miteinander zu kombinieren. Weiterhin kann durch die Anzahl der Zyklen die Rekombinationshäufigkeit pro Polynukleotidstrang exakt gesteuert werden. Bei zyklischer Anwendung lässt sich so auch der mittlere Abstand zwischen Neukombinationsereignissen von einem zum nächsten Zyklus steuern.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird nach einem, mehreren oder allen Zyklen des erfindungsgemäßen Verfahrens ein Selektionsschritt ausgeführt. Dieser kann sich entweder auf den Genotyp oder auf den Phänotyp oder sowohl auf den Genotyp als auch auf den Phänotyp des Polynukleotids beziehen.
- Der Genotyp eines Polynukleotids ist dabei die sequentielle Abfolge von verschiedenen Monomeren in dem Polynukleotid. Der Phänotyp ist die Summe der Funktionen und Eigenschaften eines Polynukleotidmoleküls sowie der durch ein Polynukleotid codierten Transkriptions- oder Translationsprodukte.
- Der Selektionsschritt kann dabei z. B. in Form von amplifikationsgekoppelter (natürlicher) Selektion, Selektion durch physikalische Separation oder Selektion durch Screening erfolgen (Koltermann und Kettling, Biophys. Chem. 66 (1999), 159; Kettling et al. Current Topics in Microbiol. and Immunol. 243 (1999), 173; Koltermann, Dissertation, TU Berlin (1998), Zhao et al. in Manual of Ind. Microbiol. and Biotechnol. Chapter 49, pp. 597604, ASM Press, Washington, DC, 1999; Reetz, Angew. Chem. 113 (2001) 113, 292-320. In Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ein doppelsträngiges Polynukleotidmolekül oder eine Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle bereitgestellt.
- Bei der gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten Population aus doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen kann es sich um jede beliebige Population doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle handeln, die mindestens zwei Arten von Polynukleotidmolekülen umfasst, wobei diese mindestens einen homologen Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen Sequenzabschnitt umfassen. Der Begriff "Population einzelsträngiger Polynukleotidmoleküle" bezeichnet dabei eine Menge von Polynukleotidmolekülen, wobei intermolekularen Wechselwirkungen in Form von spezifischen Basenpaarungen zwischen den Molekülen verhindert werden oder nicht bestehen. Der Begriff "Polynukleotide" (Nukleinsäuren, Oligonukleotide) umfasst dabei sowohl DNA als auch RNA, Polynukleotide sind lineare, orientierte (5'→3'Richtung) Heteropolymere, die einzelsträngig oder doppelsträngig vorliegen können. Im Doppelstrang sind zwei Einzelstränge durch Wechselwirkungen in Form spezifischer Basenpaarung aneinander gebunden. Prinzipiell können die Polynukleotide auch DNA oder RNA mit modifizierten Monomeren sein. Generell lässt sich das Verfahren auch auf analog aufgebaute, artifizielle Polymere anwenden sowie auf DNA-RNA Hybrid Doppelstänge.
- Der Begriff "Homologe Abschnitte" bezeichnet Abschnitte, die auf zwei oder mehr Polynukleotidmolekülen identisch oder komplementär sind, d. h. an der entsprechenden Position die gleiche Information aufweisen. Der Begriff "Heterologe Abschnitte" bezeichnet Abschnitte, die auf zwei oder mehr Polynukleotidmolekülen nicht identisch bzw. nicht komplementär sind, d. h. an der entsprechenden Position eine voneinander abweichende Information aufweisen. Information eines Polynukleotidmoleküls (Genotyp) bezeichnet dabei die sequentielle Abfolge von verschiedenen Monomeren in einem Polynukleotidmolekül. Ein heterologer Sequenzbereich hat eine Länge von mindestens einem Nukleotid kann jedoch auch wesentlich länger sein. Insbesondere kann ein heterologer Sequenzbereich eine Länge von zwei Nukleotiden, oder von drei Nukleotiden, beispielsweise von Codon, sowie vorzugsweise von mehr als 5 Nukleotiden, besonders bevorzugt von mehr als 10 Nukleotiden aufweisen. Nach oben ist der Länge eines heterologen Bereichs im Prinzip keine Grenze gesetzt. Allerdings sollte ein heterologer Bereich vorzugsweise nicht länger als 10000 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht länger als 5000 Nukleotide, insbesondere nicht länger als 2000 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt nicht länger als 1000 Nukleotide sein. Derartige längere Sequenzabschnitte können beispielsweise die hypervariablen Bereiche einer einen Antikörper codierenden Sequenz sein. Domänen eines Proteins, Gene in einem Gencluster oder Bereiche eines Genoms. Vorzugsweise handelt es sich bei den heterologen Bereichen um Sequenzbereiche in denen die Polynukleotidmoleküle in einzelnen Basen voneinander abweichen. Heterologe Bereiche können jedoch auch darauf beruhen, dass in einem Polynukleotidmolekül eine Deletion, Duplikation, Insertion, Inversion oder Addition vorliegt oder aufgetreten ist.
- Die gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten doppelsträngigen Polynukleotidmoleküle weisen erfindungsgemäß mindestens einen homologen und mindestens einen heterologen Sequenzbereich auf. Vorzugsweise weisen sie jedoch eine Vielzahl homologer und heterologer Abschnitte. Der Anzahl der homologen und heterologen Abschnitte ist nach oben prinzipiell keine Grenze gesetzt.
- Die heterologen Abschnitte in den doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen werden dabei jeweils von homologen Abschnitten unterbrochen. Dabei haben die homologen Abschnitte eine Länge von vorzugsweise mindestens 5, bevorzugt von mindestens 10 und besonders bevorzugt von mindestens 20 Nukleotiden. Wie die heterologen Abschnitte können aber auch die homologen Abschnitte wesentlich länger sein und eine obere Grenze für ihre Länge gibt es im Prinzip nicht. Vorzugsweise sollten sie nicht länger als 50000 Nukleotide, bevorzugt nicht länger als 20000 Nukleotide, besonders bevorzugt nicht länger als 10000 Nukleotide und ganz besonders bevorzugt nicht länger als 1000 Nukleotide sein.
- Das Bereitstellen doppelsträngiger Polynukleotidmoleküle gemäß Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Hierzu zählen z. B. physikalische, chemische, biochemische und biologische Verfahren. Hierzu zählen sowohl synthetische als auch präparative Verfahren wie z. B. chemische Synthese von Oligonukleotiden, Synthese von Nukleinsäuren durch Polymerase-Kettreaktion (PCR), Präparation von Plasmiden, Cosmiden, Phagen, BACs (bacterial artificial chromosome), YACs (yeast artificial chromosome) oder chromosomaler DNA.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens werden für das Bereitstellen einer Population doppelsträngiger Polynukleotide mit homologen und heterologen Abschnitten verwandte Polynukleotid-Sequenzen aus der Mutantenverteilung einer Quasi-Spezies verwendet. Der Begriff "verwandt" betrifft dabei Polynukleotide, die untereinander sowohl homologe als auch heterologe Abschnitte aufweisen. Als Quasi-Spezies wird dabei eine durch fehlerhafte Replikation entstehende, dynamische Population miteinander verwandter Molekülvarianten (Mutanten) bezeichnet. Es konnte gezeigt werden, dass entsprechend des Quasi-Spezies-Prinzips nicht der Wildtyp (Schwerpunkt der Quasi- Spezies), sondern die gesamte Verteilung Objekt der Selektion ist. Unter veränderten Selektionsbedingungen sind vorteilhafte Varianten in einer solchen Mutantenverteilung bereits entsprechend ihrem Fitnesswert enthalten und müssen nicht erst durch anschließende, zufällige Mutationen entstehen. Bei sukzessiver Verschiebung der Selektionsparameter gleicht die evolutive Generierung dann einer implizit gelenkten Drift der Quasi-Spezies entlang von Graten der Wertelandschaft. Die Herstellung von Quasi-Spezies und die Anwendung dieses Prinzips für die evolutive Biotechnologie ist beschrieben in WO 92/18645.
- Grundlage für die Erzeugung einer Quasi-Spezies ist eine fehlerhafte Replikation der Molekülvarianten. Bei Verwendung von Polynukleotiden erfolgt die Replikation bevorzugt mit Hilfe von Replikationsenzymen, d. h. Polymerasen, die die matrizengesteuerte Synthese eines Polynukleotidmoleküls ermöglichen. Die Einführung von Fehlern, d. h. die Variation der Molekülinformation, kann durch den inhärent fehlerhaften Kopierprozess allein, aber auch durch eine gezielte Erhöhung der Ungenauigkeit der Polymerase (z. B. definiert ungleichgewichtige Zugabe der Monomere, Zugabe von Basenanaloga, fehlerhafte PCR, Polymerasen mit sehr hoher Fehlerrate), durch chemische Modifikation von Polynukleotiden nach erfolgter Synthese, durch die komplette Synthese von Polynukleotiden unter zumindest teilweisem Einsatz von Monomergemischen und/oder von Nukleotidanaloga, sowie durch eine Kombination dieser Verfahren erreicht werden. Vorzugsweise werden Mutantenverteilungen einer Quasi-Spezies eingesetzt, wobei die einzelnen Mutanten der Quasi-Spezies in ihren phänotypischen Eigenschaften einer gewünschten molekularen Funktion gegenüber dem Wildtyp bereits verbessert sind. Der Begriff "Phänotyp eines Polynukleotidmoleküls" bezeichnet die Summe der Funktionen und Eigenschaften eines Polynukleotidmoleküls sowie der durch ein Polynukleotid codierten Transkriptions- oder Translationsprodukte.
- Darüber hinaus können Sequenzen unterschiedlichen Ursprungs Verwendung finden, u. a. Polynukleotid-Sequenzen einer Genfamilie aus unterschiedlichen Spezies, Polynukleotid-Sequenzen, die in-vivo (z. B. durch Viren, durch Mutatorbakterien, durch Bakterien unter UV-Bestrahlung) oder in-vitro (z. B. mittels Qβ-Replikase-Reaktion, fehlerhafter PCR) mit besonders hoher Fehlerrate repliziert wurden. Polynukleotid-Sequenzen, in die nach Synthese mittels chemischer Agenzien Mutationen eingeführt wurden oder die chemisch derart synthetisiert wurden, dass sie homologe und heterologe Abschnitte aufweisen, oder Polynukleotid-Sequenzen, die durch eine Kombination vorgenannter Verfahren erzeugt wurden. Prinzipiell, kann es sich bei den Polynukleotiden, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden, um beliebige Polynukleotide handeln, insbesondere um DNA- oder RNA-Moleküle.
- Zur Erzeugung der in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Einzelstrangbrüche eignen sich prinzipiell alle Methoden, die zur Spaltung einer Phosphodiesterbrückenbindung zwischen 2 Nukleotiden in einem Polynukleotidstrang des doppelsträngigen Polynukleotidmoleküls führen. Dies können physikalische oder chemische Verfahren sein (z. B. Ultraschallbehandlung, partielle Esterhydrolyse).
- Besonders geeignet für Schritt (b) sind enzymatische Methoden.
- Geeignet hierfür sind beispielsweise Nukleasen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahren werden die Einzelstrangbrüche durch sequenzspezifische Nicking Enzyme eingeführt.
- Beispiele hierfür sind die Nicking-Enzyme V.BchI aus Bacillus chitinosporus, N.BstNBI aus Bacillus stearothermophilus, N.BstSEI aus Bacillus stearothermophilus, N. CviPII aus Chlorella strain NC64A, N.CviQXI aus Chlorella strain NC64A, V.EcoDem aus E.coli, V.HpaII aus Haemophilus parainfluenzae, V.Neal aus Nocardia aerocolonigenes und V.XorII aus Xanthomonas oryzae.
- In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform können die Einzelstrangbrüche in die doppelsträngigen Polynukleotidmoleküle durch sequenzunspezifische Nicking-Enzyme eingefügt werden. Möglich ist dabei z. B. die Verwendung von DNase I aus Kälberpankreas mit Mg2+ als Cofactor (Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 349; Kunitz, J. Genetic Physiology 33 (1950), 363, und Melgac und Goldthwaite, J. Biolog. Chem. 243 (1968), 4409).
- Die Reaktionsbedingungen in Schritt (c) werden in Abhängigkeit von den eingesetzten Enzymen gewählt.
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird Schritt (c) unter Bedingungen durchgeführt die zu einer erhöhten Fehlerrate der Neusynthese führen.
- Die Fehlerrate der Neusynthese kann dabei in Abhängigkeit der gewünschten zu erzeugenden Varianten gewählt werden. Übliche Fehlerraten sind 0,1 × 10-3 bis 10 × 10-3, d. h. 0,01 bis 1% Fehler (Austausch von 1 bis 10 Basen in einem DNA-Abschnitt von 10000 Basen).
- Besonders geeignet ist die Durchführung von Schritt (c) bei einer Fehlerrate von 1 × 10-3 bis 5 × 10-3, d. h. 0,1 bis 0,5% Fehler, d. h. es werden 1 bis 5 Basen in einem DNA-Abschnitt von 1000 Basen ausgetauscht.
- Die Fehlerrate der DNA-Polymerase I beträgt 9 × 10-6 (Kunkel et al. (1984) J. Biol. Chem. 259: 1539-1545. Die Erhöhung der Fehlerrate bei Verwendung der DNA-Polymerase I bedeutet folglich eine Fehlerrate größer als 9 × 10-6.
- Die Fehlerrate der Neusynthese kann prinzipiell z. B. durch Einsatz mutierter DNA-Polymerase erhöht werden oder durch Wahl der geeigneten Reaktionsbedingungen in Schritt (c).
- In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Fehlerrate der Neusynthese erhöht durch Polymerasen mit verringerter oder ohne Korrekturleseaktivität.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch unterschiedliche Nukleotidkonzentrationen als Edukte erhöht. Dabei kann die Konzentration einzelner oder mehrerer Nukleotide im Verhältnis zu den übrigen Nukleotiden variiert werden. Bevorzugt ist ein Unterschuss eines Nukleotids, insbesondere von dATP im Vergleich zu den übrigen Nukleotiden. Geeignet sind Konzentrationen von beispielsweise je 200 µM dGTP, dCTP und dTTP und von 20 bis 50 µM ATP.
- Bevorzugt ist ein Unterschuss zweier Nukleotide, insbesondere von dATP und dGTP in Vergleich zu den übrigen Nukleotiden. Geeignet sind Konzentrationen von beispielsweise je 200 µM dCTP und dTTP und je 40 µM dATP und dGTP.
- In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch den Zusatz von Nukleotidanaloga erhöht. Als Nukleotidanaloga seien genannt Desoxyinosinosintriphosphat, 7-Desazadesoxyguanosintriphosphat und Desoxynucleosid-α-thio-triphosphat. Besonders bevorzugt ist der Einsatz von Desoxyinosintriphosphat.
- In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch Variation der Salzkonzentration erhöht. Geeignet hierfür ist beispielsweise eine Erhöhung der Mg2+-Ionen Konzentration auf Konzentrationen über 1,5 mM. weiterhin geeignet ist die Zugabe von Mn2+-Ionen, beispielsweise in einem Konzentrationsbereich von 0,1 bis 1 mM, insbesondere 0,2 bis 0,5 mM.
- In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Fehlerrate der Neusynthese durch Zusatz von Addition erhöht. Geeignete Additive sind alle Substanzen, welche die Fehlerrate erhöhen, exemplarisch seien genannt Dimethylsulfoxid, Polyethylenglykol oder Glycerin. Besonders bevorzugt werden die Additive in folgenden Konzentrationen zugegeben: DMSO 2 bis 10%, PEG 5 bis 15%, Glycerin > 0 bis 30%, bevorzugt 5 bis 20%.
- In einer weiteren Ausführungsform wird die Fehlerrate der Neusynthese durch eine Änderung der Reaktionstemperatur, insbesondere durch eine Temperaturerhöhung, erhöht.
- Alle genannten Maßnahmen zur Erhöhung der Fehlerrate können auch in Kombination miteinander durchgeführt werden, z. B. Überschuss eines Nukleotids bei erhöhter Mn2+ Ionen Konzentration.
- In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Schritte (b) und (c) gleichzeitig durchgeführt.
- Die Herstellung einzelstängiger Polynukleotidmoleküle gemäß Schritt (d) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen. Hierzu zählen z. B. physikalische, chemische, biochemische und biologische Verfahren. Beispielhaft aufgezählt seien dabei das Aufschmelzen von Polynukleotid-Doppelsträngen mittels Erhitzen auf Temperaturen oberhalb der Annealingtemperatur (Newton, in: PCR, Spektrum Akademischer Verlag (1994); Lazurkin, Biopolymers 9 (1970), 1253-1306), die Denaturierung von Polynukleotid-Doppelsträngen mittels Zugabe von Denaturierungsreagenzien (z. B. Harnstoff oder Detergenzien), die Zugabe von Enzymen, welche aus doppelsträngigen Polynukleotiden einzelsträngige Polynukleotide machen, z. B. durch exonukleolytischen Abbau von doppelsträngiger DNA zu einzelsträngiger DNA.
- Die Herstellung von partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten einzelsträngigen Polynukleotidmolekülen gemäß Schritt (e) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann durch dem Fachmann bekannte Verfahren erfolgen.
- Sie wird vorzugsweise durch Hybridisierung der homologen Abschnitte der komplementären einzelsträngigen Polynukleotidmoleküle erreicht.
- Die Hybridisierung zu Doppelstrang-Polynukleotiden erfolgt nach dem Fachmann bekannten Methoden. Insbesondere kann sie z. B. erreicht werden durch Zusammengeben der Einzelstränge und Einstellung von Reaktionsbedingungen, die das Annealing komplementärer Polynukleotide fördern, wie z. B. durch Absenken der Temperatur und/oder Erniedrigung der Salzkonzentration.
- In Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird ausgehend von den in Schritt (e) hergestellten partiell doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen eine template-gerichtete Nukleinsäuresynthese durchgeführt.
- Der Begriff "template-gerichtete Nukleinsäuresynthese" bezeichnet dabei die Synthese eines Polynukleotids durch Verlängerung eines existierenden Einzelstrangs anhand der Information eines entsprechenden Matrizenstrangs.
- Die Durchführung einer derartigen template-gerichteten Polymerisierung ist dem Fachmann geläufig und ist z. B. beschrieben in Sambrook (Molecular Cloning, Cold Spring Habor Laboratory Press (1989)).
- Für die Polymerasereaktion kann ein beliebiges Enzym mit matrizengesteuerter Polynukleotid-Polymerisations-Aktivität eingesetzt werden, das in der Lage ist Polynukleotidstränge zu synthetisieren. Eine Vielzahl an Polymerasen aus verschiedensten Organismen und mit unterschiedlichen Funktionen wurden bereits isoliert und beschrieben. In Bezug auf die Art von Matrize und synthetisiertem Polynukleotid werden DNA-abhängige DNA-Polymerasen, RNA-abhängige DNA-Polymerasen (Reverse Transkriptasen), DNA-abhängige RNA-Polymerasen und RNA-abhängige RNA-Polymerasen (Replikasen) unterschieden. In Bezug auf die Temperaturstabilität werden nicht thermostabile (37°C) und thermostabile Polymerasen (75 bis 95°C) unterschieden. Weiterhin unterscheiden sich Polymerasen in Bezug auf das Vorhandensein von 5'-3'- und 3'-5'-exonukleolytischer Aktivität. DNA-abhängige DNA-Polymerasen stellen die wichtigsten Polymerasen dar.
- Verwendet werden können insbesondere DNA-Polymerasen mit einem Temperaturoptimum bei oder um 37°C. Hierzu gehören beispielsweise die DNA-Polymerasen I aus E. coli, T7-DNA-Polymerase des Bakteriophagen T7 und die T4-DNA-Polymerase des Bakteriophagen T4, die jeweils von einer Vielzahl von Herstellern, z. B. USB, Roche Molecular Biochemicals, Stratagene, NEB oder Quantum Biotechnologies, kommerziell vertrieben werden. DIe DNA-Polymerase I aus E. coli (Holoenzym) besitzt eine 5'-3'-Polymerase- Aktivität, eine 3'-5'-Proofreading-Exonuclease-Aktivität und eine 5'-3'-Exonuclease-Aktivität. Das Enzym wird für in-vitro-Labeling von DNA mittels der Nick-Translation-Methode eingesetzt (Rigby et al. (J. Mol. Biol. 113 (1977)), 237-251)). Im Gegensatz zum Holoenzym besitzt das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli wie die T7-DNA-Polymerase und die T4-DNA-Polymerase eine 5'-Exonuclease-Aktivität. Diese Enzyme werden daher für sogenannte Auffüllreaktionen oder für die Synthese langer Stränge eingesetzt (Young et al. (Biochemistry 31 (1992), 8675-8690), Lehman (Methods Enzymol. 29 (1974), 46-53)). Der 3'-5'-exo(-)- Variante des Klenow-Fragments der DNA-Polymerase I aus E. coli fehlt schließlich auch die 3'-Exonuclease-Aktivität. Dieses Enzym wird of für die DNA-Sequenzierung nach Sanger eingesetzt (Sanger (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467)). Neben diesen Enzymen existieren noch eine Vielzahl weiterer 37°C-DNA-Polymerasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzt werden können.
- Die am weitesten verbreitete, thermostabile DNA-Polymerase mit einem Temperaturoptimum bei 75°C und ausreichender Stabilität bei 95°C ist die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die kommerziell erhältlich ist. Die Taq-DNA-Polymerase ist eine hoch-prozessive 5'-3'-DNA-Polymerase ohne 3'-5'-Exonuclease- Aktivität. Sie wird oft für Standard-PCRs, für Sequenzier- Reaktionen sowie für mutagene PCRs verwendet (Cadwell und Joyce (PCR Methods Appl. 3 (1994), 136-140, Agrogoni und Kaminski (Methods Mol. Biol. 23 (1993), 109-114)). Ähnliche Eigenschaften weisen die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus HB8 und die Tfl-DNA-Polymerase aus Thermus flavus auf. Die Tth- DNA-Polymerase weist jedoch zusätzlich noch eine intrinsische Reverse-Transkriptase-(RT)-Aktivität in Gegenwart von Mangan- Ionen auf (Cusi et al. (Biotechniques 17 (1994), 1034-1036)). Unter den thermostabilen DNA-Polymerasen ohne 5'- jedoch mit 3'-Exonuclease-Aktivität werden wiederum eine ganze Reihe kommerziell vertrieben: Pwo-DNA-Polymerase aus Pyrococcus woesei, Tli-, Vent- bzw. DeepVent-DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralix, Pfx- bzw. Pfu-DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus, Tub-DNA-Polymerase aus Thermus ubiquitous, Tma- bzw. UlTma-DNA- Polymerase aus Thermotoga maritima (Newton und Graham, in: PCR,-spektrum Akad. Verlag Heidelberg (1994), 1)). Polymerasen ohne 3'-proofreading-Exonuclease-Aktivität werden eingesetzt, um möglichst fehlerfrei PCR-Produkte zu amplifizieren. Schließlich sind mit dem Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase, mit der Vent-(exo-)-DNA-Polymerase, sowie der Tsp-DNA-Polymerase thermostabile DNA-Polymerasen ohne 5'- und ohne 3'-exo-nukleolytischer Aktivität verfügbar. Unter den RNA-abhängigen DNA- Polymerasen (Reverse Transkriptasen) gehören die AMV-Reverse- Transkriptase aus dem Avian Myeloblastosis Virus, die M-MuLV- Reverse Transkriptase aus Moloney Murine Leukemia Virus, und die HUV-Reverse Transkriptase aus dem Human Immunodeficiency Virus zu den gebräuchlichsten Enzymen, welche auch von diversen Anbietern wie z. B. NEB, Life Technologies, Quantum Biotechnologies kommerziell vertrieben werden. Die AMV-Reverse Transkriptase besitzt wie die HIV-Reverse Transkriptase eine assoziierte RNase-H-Aktivität. Diese ist bei der M-MuLV-Reverse Transkriptase deutlich reduziert. Sowohl der M-MuLV- als auch der AMV-Reversen Transkriptase fehlt eine 3'-5'-Exonuclease- Aktivität.
- Unter den DNA-abhängigen RNA-Polymerasen gehören die RNA- Polymerase aus E. coli, die SP6-RNA-Polymerase aus Salmonella thyphimurium LT2, infiziert mit dem Bakteriophagen SP6, die T3-RNA-Polymerase aus dem Bakteriophage T3, und die T7-RNA-Polymerase aus dem Bakteriophage T7 zu den gebräuchlichsten Enzymen.
- In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Matrizenstränge in Schritt (f) des Verfahrens DNA-Moleküle, und es wird für die template-gerichtete Einzelstrangsynthese eine DNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet.
- In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird dabei eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet, besonders bevorzugt eine solche mit 5'- und 3'-exonukleolytischer Aktivität, wie z. B. Polymerase I aus E. coli.
- Alternativ kann auch eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden, die keine 5'→3'-exonukleolytische Aktivität, aber eine 3'→5'-exonukleolytische Aktivität besitzt, wie z. B. das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli, die T7-DNA-Polymerase aus dem Bakteriophagen T7 oder die T4-DNA- Polymerase aus dem Bakteriophagen T4.
- Ferner kann auch eine nicht thermostabile DNA-Polymerase verwendet werden, die weder 5'→3'- noch 3'→5'-exonukleolytische Aktivität aufweist, wie z. B. die 3'-5'-exo(-)-Variante des Klenow-Fragmentes der DNA-Polymerase I aus E. coli.
- In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform wird eine thermostabile Polymerase (z. B. Taq-Pol, Pwo-Pol) eingesetzt. Diese kann dabei wiederum 5'- und 3'-exonukleolytische Aktivität aufweisen oder aber 5'-exonukleolytische Aktivität, aber keine 3'-exonukleolytische Aktivität wie z. B. die Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilis HB8 oder die Tfl-DNA-Polymerase aus Thermus flavus.
- Alternativ kann die thermostabile DNA-Polymerase keine 5'→3'- aber 3'→5'-exonukleolytische Aktivität aufweisen, wie z. B. die Pwo-DNA-Polymerase aus Pyrococcus woesei, die VentR-DNA- Polymerase, die DeepVentR-DNA-Polymerase bzw. die Tli-DNA- Polymerase aus Thermococcus litoralis, die Pfu-DNA-Polymerase bzw. die Pfx-DNA-Polymerase aus Pyrococcus furiosus oder Tma-DNA- Polymerase bzw. UlTma-DNA-Polymerase aus Thermotoga maritima.
- Ferner kann eine thermostabile Polymerase verwendet werden, die weder 3'→5'- noch 5'→3'-exonuclelytische Aktivität aufweist, wie z. B. das Stoffel-Fragment der Taq-DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus, die Tsp-DNA-Polymerase oder die exo(-)-Variante der VentR-DNA-Polymerase bzw. DeepVentR-DNA-Polymerase aus Thermococcus litoralis.
- Im Fall der Verwendung einer thermostabilen Polymerase schließt sich die Polymerasereaktion vorzugsweise direkt an den Schritt (e) an ohne zwischenzeitliche Aufreinigung oder weitere Probenbehandlung.
- In einer anderen bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Matrizenstränge in Schritt (f) des erfindungsgemäßen Verfahrens, an denen die template-gerichtete Einstrangsynthese erfolgt, RNA-Moleküle. In diesem Fall wird für die template-gerichtete Einzelstrangsynthese eine RNA-abhängige DNA-Polymerase verwendet, vorzugsweise AMV-Reverse Transkriptase aus dem Avian Myeloblastosis Virus, HIV-Reverse Transkriptase aus dem Human Immunodeficiency Virus, oder M-MuLV-Reverse Transkriptase aus dem Moloney Murine Leukemia Virus. Ferner wird bevorzugt eine thermostabile Reverse Transkriptase verwendet, ganz besonders die Tth-DNA-Polymerase aus Thermus thermophilus mit intrinsischer Reverse-Transkriptase-Aktivität.
- Sofern nicht anders angegeben, erfolgten die Versuche nach Current Protocolls in Molecular Biology.
- Als Ausgangsmaterial wurden 4 Lipasevarianten eingesetzt: LipA H86W codiert durch pBP2035, LipA S87T codiert durch pBP2008, LipA F142W codiert durch pBP2006, LipA L167A codiert durch pBP2007.
- 1. Plasmidpräparation folgender Plasmide:
- 2. Spaltung der Plasmide mit den Restriktionsendonukleasen HindIII und SacI
- 3. Isolierung der Insertionen durch Gelextraktion mit dem GFX-Kit (Fa. Pharmacia)
- 4. Resuspendierung der DNA-Fragmente in H2O
- 5. Einstellung der DNA-Konzentrationen auf ~250 ng/µl
-
- 1. 4 getrennte Reaktionsansätze für die Nick-Translation
der Insertionen 56-20, 98-10, 124-9, 198-1-3 mit dem
Nick-Translation-Kit (Fa. Roche, Kat. No. 976776)
- 2. Inkubation der Ansätze bei 15°C, 90 min
- 3. Abstoppen der Reaktion durch Zugabe von 5 µl 0,5 M EDTA, pH 8,8
- 4. Fällen, Waschen, Trocknen und Resuspendieren der Ansätze in 20 µl H2O
-
- 1. 20 µl der PCR-Produkte aus Schritt 4 werden mit HindIII und SacI geschnitten
- 2. Fällen, Waschen, Trocknen und Resuspendieren des Ansatzes in 20 µl H2O
- 3. Reinigung der geschnittenen Fragmente mit dem GFX-Kit (Fa. Pharmacia)
- 4. Ligation der geschnittenen Fragmente mit dem Vektor pBSIIKS (Fa. Stratagene), der zuvor mit HindIII und SacI geschnitten wurde
- 5. Transformation der Ligationsansätze in Escherichia coli XL1-Blue
- 6. Sequenzanalyse von 29 Klonen mit Insertion
Claims (11)
1. Verfahren zur Erzeugung von Polynukleotidmolekülen mit
veränderten Eigenschaften, wobei mindestens ein Zyklus umfassend
die folgenden Schritte durchlaufen wird:
wobei die Schritte (b) und (c) nacheinander oder gleichzeitig
ausgeführt werden können.
a) Bereitstellung eines doppelsträngigen
Polynukleotidmoleküls oder einer Population doppelsträngiger
Polynukleotidmoleküle, wobei die einzelnen Polynukleotide
dieser Population mindestens einen homologen
Sequenzabschnitt und mindestens einen heterologen
Sequenzabschnitt besitzen,
b) Erzeugung von Einzelstrangbrüchen in den doppelsträngigen
Polynukleotidmolekülen
c) nukleolytischer Abbau in 5'→3'Richtung ausgehend von den
Einzelstrangbrüchen bei gleichzeitiger Neusynthese in
5'→3'Richtung unter Verschiebung der Einzelstrangbrüche
in Richtung des 3'-Endes
d) Herstellung einzelsträngiger Polynukleotidmolekülen
e) Herstellung von partiell doppelsträngigen
Polynukleotidmolekülen der aus Schritt (d) bereitgestellten
einzelsträngigen Polynukleotidmolekülen
f) template-gerichtete Nukleinsäuresynthese ausgehend
von den in Schritt (e) hergestellten partiell
doppelsträngigen Polynukleotidmolekülen
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei mehr als ein Zyklus
umfassend die Schritte (a) bis (f) durchlaufen wird.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei nach einem, mehreren oder
allen Zyklen ein Selektionsschritt ausgeführt wird, und sich
der Selektionsschritt entweder auf den Genotyp oder auf den
Phänotyp oder sowohl auf den Genotyp als auch auf den
Phänotyp des Polynukleotids bezieht.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt
(b) die Einzelstrangbrüche durch sequenzspezifische Nicking-
Enzyme eingefügt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei in Schritt
(b) die Einzelstrangbrüche durch sequenzunspezifische
Nicking-Enzyme eingefügt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei in Schritt
(c) DNA-Polymerase I verwendet wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei in Schritt
(c) durch Wahl geeigneter Reaktionsbedingungen die Fehlerrate
der Neusynthese erhöht wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch einen Überschuss eines
oder mehrerer nukleotidtriphosphate.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch den Einsatz eines oder
mehrerer nukleotidanaloga.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch eine Variation der
Salz-Konzentration.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die
Fehlerrate der Neusynthese erhöht wird durch Polymerasen mit
verringerter oder ohne Korrekturleseaktivität.
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