CN101343667A - 一种水产动物snp标记筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明建立了一种水产动物SNP标记筛选方法，可以解决现有SNP标记筛选技术中存在的效率低、成本高的问题。所采用的技术方案包括如下步骤：1)基因组DNA提取；2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增；3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸；4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序；6)SNP位点鉴定。本发明的SNP标记分离新方法，可以在基因组信息未知的情况下，高效、大批量地随机分离SNP，有利于大量SNP的开发及其后续利用，在水产动物SNP标记筛选、种质鉴定、遗传多样性评价和分子育种等方面具有重大应用价值和推广前景。

Description

一种水产动物SNP标记筛选方法

技术领域

本发明属于水产生物技术领域中的水产动物分子标记筛选技术，具体涉及一种水产动物SNP标记筛选的新方法，适合于在水产动物中发现和筛选SNP分子标记。

背景技术

SNP(单核苷酸多态性)作为第三代分子标记，具有以下特点：SNP为双等位型标记；SNP在DNA分子上分布不均匀；S NP有很高的密度；SNP具有遗传稳定性；SNP的检测和分析易实现自动化。SNP在高密度遗传连锁图谱构建、性状相关分子标记筛选等方面发挥着越来越重要的作用。大量基因组序列信息的获得对于SNP的发现至关重要，所以目前SNP研究主要集中在人类及各种模式生物上，其在非模式生物上的研究受到了极大限制。在水产领域内，SNP研究更为罕见，并且所用的方法存在诸多不足，严重制约了SNP标记在水产领域内的应用。

目前，水产动物上SNP的开发方式主要有两种：一种是基于大量序列信息的筛选方式(He et al.，2003；Smith et al.，2005；Bradleyet al.，2007)，这种方式主要集中在模式鱼类-斑马鱼及重要经济鱼类-鲑鱼等种类上。因为这种基于大规模测序的方法，成本较高，并不适合于所有经济鱼类的SNP开发，所以并没有得到普及。第二种是针对候选基因的SNP开发(Tao and Boulding，2003；

andPrimmer，2006)，这类方法在经济鱼类上有一定的应用前景，成本较低，但由于需要首先进行基因克隆，其效率较低，而且由于SNP的连锁性，邻近的SNP位点往往以单倍型的形式存在，难以得到大量有效的SNP位点。

因而，在水产动物上，亟需一种能够有效开发大量SNP位点，并且成本较低的方法。我们发明的这种方法，可以在整个基因组内批量寻找SNP位点，具有高效率、低成本的特点，有利于SNP标记在水产动物上的推广应用。

为此，本发明提出了一种全新的SNP标记筛选方法。

发明内容

本发明提供了一种水产动物SNP标记筛选方法，可以解决现有技术存在的效率低、成本高的问题。

本发明的目的是建立一种全新的SNP标记开发方法，能够在基因组序列信息较少的情况下，获得大量的SNP标记，为基因组序列未知的非模式生物及水产经济动物提供筛选大量SNP标记的新方法。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案予以实现：

一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

1)基因组DNA提取

按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体的高纯度DNA，取少量样本放入研钵中，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；

2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增

取1-2μg混合后的基因组总DNA，加入50-100单位内切酶MseI进行酶切反应，65℃温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序列为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接头用T4连接酶16℃连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM、序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min，反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；

3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸

将预扩增产物进行变性及复性，使其形成杂交双链，变性及复性条件为：95℃变性2min，以2℃/秒的速度从95℃降至85℃，然后以0.1℃/秒的速度从85℃降到25℃，最后4℃保存。复性产物用CELI对SNP位点进行酶切，酶切条件为：10μL复性产物与20μL反应缓冲液，10mM HEPES 7.5，10mM MgSO₄，0.002％(w/v)Triton X-100，20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1单位CEL I酶，45℃温浴25-35分钟，加入5μL 0.15M EDTA，pH 8，终止反应；

酶切产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于Bst延伸，延伸条件为：20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％吐温X-100，20nM dATP，20nM dGTP，20nM dCTP，13nM dTTP，7nMbiotin-dUTP，4单位Bst DNA聚合酶，然后置于65℃温浴1小时；

4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离

1-2mg的包被有链亲和素的磁珠用300μL TEN100(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，pH 7.5)溶液在室温下洗涤3次，然后将其与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35分钟，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，首先进行3次非严谨性洗脱：使用400μL缓冲液TEN1000(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1000mM NaCl，pH 7.5)于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟；随后进行3次严谨性洗脱：使用400μL 0.2×SSC(30mM NaCl，3mM柠檬酸钠，pH 7.0)+0.1％SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清；最后再用1×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH7.0)洗脱两次，除去SDS，加入50μL TE，吹打均匀，于95℃下水浴10分钟，期间不时搅动或者轻轻吹打均匀，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经纯化后备用；

5)目标DNA的扩增富集及克隆测序

将纯化后的5μL DNA液用于PCR扩增，条件与预扩增相同，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后，按照常规方法进行序列分析；

6)SNP标记鉴定

根据测序结果进行引物设计；将8-12个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增，克隆测序，每条序列需测序10个克隆，验证SNP位点，将单碱基差异出现频率在20％及以上的位点定义为SNP标记。

本发明的学术思路是采用CEL I内切酶特异性切割SNP位点，BstDNA聚合酶链置换活性及生物素-磁珠分离方法。通过变性和复性后，含有SNP的DNA链会形成单碱基不匹配的杂交双链，CEL I内切酶可以特异识别这种位置，并在SNP位点处切割DNA双链中的一条，形成3’-OH末端。Bst DNA聚合酶具有链置换活性，可以以CEL I酶切后的一条链为模板，而以带有3’-OH末端的一条链为引物进行DNA延伸反应。在DNA延伸过程中，可以将Biotin标记的dUTP渗入到DNA链中。生物素与链亲和素可以特异结合，因此，含有SNP位点的DNA可以与链亲和素包被的磁珠特异结合，从而起到SNP的分离作用。

本发明的方法是：将8-12个个体DNA混合形成DNA池；经MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增获得大量DNA；通过变性和复性形成杂合双链，CEL I酶切SNP位点及Bst DNA聚合酶渗入生物素；通过生物素-磁珠分离方法特异分离含有SNP位点的DNA；将分离得到的DNA进行克隆测序；最后通过多个个体序列的比对验证SNP位点。

与现有技术相比，本发明的优点和积极效果是：本发明建立了一种分离SNP位点的新方法。目前已有的SNP分离方法主要有两种，一种是随机测序或全基因组测序，成本较高且分离效率较低；第二种是候选基因或候选基因组区域的SNP分离，这种方法必须事先知道基因的序列，而且仅仅局限在同源区域，操作比较繁琐，不利于大规模SNP发现及其应用。本发明的SNP标记分离新方法，可以在基因组信息未知的情况下，高效、大批量地随机分离SNP，有利于大量SNP的开发及其后续利用。

附图说明

图1是水产动物SNP标记筛选方法的技术路线示意图；

图2是序列1的SNP筛选结果；

图3是序列2的SNP筛选结果；

图4是序列3的SNP筛选结果；

图5是序列4的SNP筛选结果；

图6是序列5的SNP筛选结果；

图7是序列6的SNP筛选结果；

图8是序列7的SNP筛选结果；

图9是序列8的SNP筛选结果；

图10是序列9的SNP筛选结果；

其中：上述序列1-9是含有SNP位点的9条序列，是从分离的DNA序列中随机选取了10条序列用于SNP位点鉴定，每个片段测10个克隆，其中单碱基差异出现频率为20％及以上的位点定义为SNP位点，最终有9条序列含有SNP位点，大写字母代表相同的碱基，小写字母代表SNP位点及碱基；点(…)表示空位；横线(---)表示碱基相同。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细的说明。

实施例1

下面以半滑舌鳎为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细阐述：

如图1所示，包括六个步骤：1)基因组DNA提取；2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增；3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸；4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离；5)目标DNA的扩增富集及克隆测序；6)SNP标记鉴定。其中，

1)基因组DNA提取

利用酚氯仿方法分别提取10个半滑舌鳎个体的DNA。取10-20mg肝组织放入研钵，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末。加入1ml DNA提取液TENS(10mM Tris-HCl pH 8.0，100mM NaCl，25mM EDTA，0.5％SDS)匀浆。在裂解液中加入等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)溶液，封严离心管盖，反复轻柔的转动离心管，形成乳状液，室温下离心12000rpm，20min，重复抽提两次。将上清液分装在1.5ml的离心管中，每个离心管加入1/10体积的NaAc(3M)和2倍体积的冰冷无水乙醇，混匀，置冰上10-30min，使DNA沉淀。70％乙醇漂洗沉淀，TE(10mM Tris-HCl pH 8.0，1mM EDTA)溶解DNA。定量测定DNA浓度后，将10个个体的DNA等量混合后形成DNA池。

2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增

取1000ng混合后的基因组总DNA，加入50U的内切酶MseI进行酶切反应。酶切总体积为250μL，65℃温浴2小时。酶切产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后，用50μl TE溶解。取15μL的酶切产物与MseI接头(5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3)用T4连接酶连接，16℃过夜。PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM的MseI-N引物(5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’)、1×PCR缓冲液(含Mg2+)、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶。反应条件为：首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min。反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量。

3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸

将预扩增产物进行变性及复性，条件为95℃2min，95℃到85℃(-2℃/s)，85℃到25℃(-0.1℃/s)，4℃保存。复性产物用CEL I酶切，酶切条件为：10μL复性产物与20μL反应缓冲液(10mM HEPES7.5，10mM MgSO₄，0.002％(w/v)Triton X-100，20ng/mL小牛血清蛋白)混合，加入1单位CEL I酶，45℃温浴25-35分钟。加入5μL 0.15M EDTA(pH 8)终止反应。

CEL I酶可以采用商品化产品，也可自行制备，制备方法参考相关文献进行，操作步骤为：取约500g芹菜茎，4℃下匀浆，将溶液调节至0.1M Tris-HCl，pH 7.7，100μM PMSF，2600g离心10分钟，去除杂质；将上清调节至25％饱和硫酸铵，4℃下混匀30分钟，16000g，4℃离心40分钟；将上清调节至80％饱和硫酸铵，4℃下混匀30分钟，16000g、4℃离心90分钟；沉淀用十分之一起始体积的0.1M Tris-HCl，0.5M KCL pH 7.7，100μM PMSF溶液重悬，将其装入透析袋中并在相同的溶液中透析4小时，每小时更换一次透析液；最后将其分装并-20℃保存。CEL I酶活力单位定义为45℃温浴30分钟可以有效切割含有已知SNP位点(突变型与野生型比例为1∶1)DNA链的最少剂量。

酶切产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后用于Bst延伸，延伸条件为：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％吐温X-100，20nM dATP，20nM dGTP，20nM dCTP，13nM dTTP，7nM biotin-dUTP，4单位Bst DNA聚合酶。然后置于65℃温浴1小时。Bst DNA聚合酶具有链替换活性，可以以酶切后的一条链为引物而另一条链为模板进行DNA链的延伸，在延伸过程中可以使biotin-dUTP渗入到含有SNP位点的DNA链中。

4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离

1-2mg的包被有链亲和霉素的磁珠用300μL TEN100(10mmol/LTris-HCl，1mmol/L EDTA，100mmol/L NaCl，pH7.5)在室温下洗涤3次，然后与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35min，其间需要不时的轻轻搅动和吹打，以避免磁珠沉淀。磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液。首先进行3次非严谨性洗脱：使用400μL缓冲液TEN1000(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，1000mMNaCl，pH 7.5)于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻吹打。然后紧接着进行3次严谨性洗脱：使用400μL 0.2×SSC(30mM NaCl，3mM柠檬酸钠，pH7.0)+0.1％SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，不时的搅动或轻轻吹打。每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清。最后再用1×SSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸钠，pH 7.0)洗脱两次，除去SDS。加入50μL TE(pH＝8.0)，吹打均匀，然后于95℃下水浴10分钟。期间不时搅动或者轻轻吹打均匀。用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后，用于PCR扩增或冻存于-20℃冰箱备用

5)目标DNA的扩增富集及克隆测序

将纯化后的5μL DNA洗脱液用于PCR扩增，具体条件与预扩增相同。PCR产物经PCR产物纯化试剂盒(Qiagen)纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后测序(具体克隆步骤参考《分子克隆》第三版进行)。

6)SNP标记鉴定

根据测序结果，利用常规引物设计软件和人工校正相结合的方法进行引物设计，设计的基本原则有：GC含量在40％-60％之间；引物长度在22bp-25bp之间；一对引物的退火温度相差不超过2度；避免引物3‘端发卡结构及引物间的二聚体结构。按照以上原则及方法，共设计引物23对(表1)，其中15对引物有特异性扩增产物(表1)，将其中的10对用于SNP位点鉴定；将10个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增(PCR扩增反应混合物中含有模板DNA 50ng、序列特异引物10pmol、1×PCR缓冲液(含Mg2⁺)、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶。反应条件为：首先94℃预变性5min，然后94℃变性30s，56℃-65℃退火30s，72℃延伸1min进行35个循环，最后72℃延伸10min)，克隆测序(具体克隆步骤参考《分子克隆》第三版进行)。每条序列需测序10个克隆，验证SNP标记，为了防止PCR和测序中的误差，将单碱基差异出现频率在20％及以上的位点定义为SNP标记。我们从分离得到的10条序列中，发现有9条序列含有共35个SNP标记，如图2-图10所示，仅有一条序列不含有SNP标记。

表1：用于SNP标记鉴定的23对引物序列

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (1)

1、一种水产动物SNP标记筛选方法，其特征在于包括如下步骤：

1)基因组DNA提取

按照常规酚氯仿方法分别提取8-12个半滑舌鳎个体组织DNA，取少量组织放入研钵中，加少许液氮研磨，直至组织被碾成粉末，将粉末转入离心管中并加入DNA提取液TENS，然后再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇溶液，混匀直至形成乳状液，室温下离心，取上清，重复抽提两次，向上清液中加入1/10体积的NaAc和2倍体积的冰冷无水乙醇，使DNA沉淀10-30分钟，70％乙醇漂洗沉淀，TE溶解DNA，测定DNA浓度后，将8-12个个体的DNA等量混合形成DNA池；

2)MseI限制性内切酶酶切，接头连接及预扩增

取1-2μg混合后的基因组总DNA，加入50-100单位内切酶MseI进行酶切反应，65℃温浴1.5-2.5小时，酶切产物经纯化后，用TE溶解，取部分纯化的酶切产物与序列为5-TACTCAGGACTCAT-3/5-GACGATGAGTCCTGAG-3的MseI接头用T4连接酶16℃连接过夜，然后对连接产物进行PCR预扩增，用以富集DNA产物，PCR预扩增反应混合物中含有稀释10倍后的5μL酶切-连接产物、终浓度为0.4μM、序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’的MseI-N引物、1×PCR缓冲液、0.2μM的dNTP以及1U的Taq DNA聚合酶，反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性30s，53℃退火1min，72℃延伸1min进行20个循环，最后72℃延伸10min，反应产物用1％琼脂糖电泳检测，判断产物分布范围及产物量，PCR产物应该为一分步均匀的弥散带；

3)杂合双链的形成，CEL I酶切及Bst DNA聚合酶延伸

将预扩增产物进行变性及复性，使其形成杂交双链，变性及复性条件为95℃2min，在5秒内将其从温度95℃降到85℃，速度为-2℃/秒，然后从85℃降到25℃，速率为-0.1℃/秒，4℃保存，复性产物用CEL I对SNP位点进行酶切，酶切条件为：10μL复性产物与20μL反应缓冲液，10mM HEPES 7.5，10mM MgSO₄，0.002％(w/v)TritonX-100，20ng/mL小牛血清蛋白，混合，加入1单位CEL I酶，45℃温浴25-35分钟，加入5μL 0.15M EDTA，pH 8，终止反应；

酶切产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后用于Bst延伸，延伸条件为：20mM Tris-HCl，pH 8.8，10mM KCl，10mM(NH₄)₂SO₄，2mM MgSO₄，0.1％吐温X-100，20nM dATP，20nM dGTP，20nM dCTP，13nM dTTP，7nMbiotin-dUTP，4单位Bst DNA聚合酶，然后置于65℃温浴1小时；

4)含有SNP位点DNA分子的磁珠分离

1-2mg的包被有链亲和素的磁珠用300μL TEN100溶液在室温下洗涤3次，然后将其与PCR产物-生物素复合体在室温下混合杂交25-35分钟，磁珠吸附完毕后，用磁力架固定磁珠，移去杂交混合液，首先进行3次非严谨性洗脱：使用400μL缓冲液TEN1000于室温下洗涤PCR产物-磁珠复合物3次，每次5分钟；随后进行3次严谨性洗脱：使用400μL 0.2×SSC+0.1％SDS于室温下洗涤3次，每次5分钟，每次洗涤后都需使用磁力架固定磁珠，弃上清；最后再用1×SSC洗脱两次，除去SDS，加入50μL TE，吹打均匀，于95℃下水浴10分钟，期间不时搅动或者轻轻吹打均匀，用磁力架固定磁珠后，迅速吸出上清液，经纯化后备用；

5)目标DNA的扩增富集及克隆测序

将纯化后的5μL DNA液用于PCR扩增，条件与预扩增相同，PCR产物经PCR产物纯化试剂盒纯化后与克隆载体连接，转化大肠杆菌感受态细胞，挑取单克隆，阳性克隆检测后，按照常规方法让测序公司进行序列分析；

6)SNP标记鉴定

根据测序结果进行引物设计；将8-12个个体的DNA等量混合后作为PCR模板，然后进行PCR扩增，克隆测序，每条序列需测序10个克隆，验证SNP位点，将单碱基差异出现频率在20％及以上的位点定义为SNP标记。

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