CN106591429A - 半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用 - Google Patents

半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用。该筛选方法包括：对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记，获得多个SNP位点；将遗传雌鱼是否性逆转作为性状，对多个SNP位点进行全基因组关联分析，获得半滑舌鳎性逆转遗传控制位点。通过从控制雌鱼性逆转的遗传控制角度，利用遗传雌鱼独有的SNP位点与性逆转的相关性进行全基因组分析，从而发现了控制遗传雌鱼发生性逆转的分子开关，即Z染色体上第6676874位核苷酸。利用该位点控制半滑舌鳎的雌雄鱼的交配方式，使人工养殖的半滑舌鳎后代中不进行性逆转的雌鱼比例提高，进而提高养殖生产效益。

Description

半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用
技术领域
本发明涉及水产养殖领域，具体而言，涉及一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是一种暖温性近海大型底层鱼类，终年生活栖息在中国近海海区，具广温、广盐和适应多变的环境条件的特点，适温范围3.5～32℃，最适水温14～24℃，适盐范围14～33‰。半滑舌鳎自然资源量少，味道鲜美，营养丰富。半滑舌鳎生长速度快、个体大，经过科技人员多年的努力，半滑舌鳎人工育苗技术已经非常成熟并应用于生产。
半滑舌典型的生物学特点是成体雌鱼和雄鱼差异很大，雌鱼体尺和体重约为雄鱼的2～4倍，所以养殖户非常青睐雌鱼。但近年来，全国各地的苗种场和养殖场发现，雌鱼比例越来越少，目前的比例大致为20％左右，严重制约了半滑舌鳎的生产效益。半滑舌鳎雌鱼比例较低的原因是部分雌鱼在早期发育阶段，大约在30～90日龄这个时期会发生逆转，遗传雌鱼(即从染色体角度看是ZW型)的舌鳎卵巢退化，精巢发育，发育为生理雄鱼(即伪雄鱼，从体型上看是雄鱼，但染色体是ZW型)，因而成熟时体型较小。
很多研究者尝试采用雌核发育或染色体加倍等方式生产全雌苗种，但效果均不如人意。其中最主要的原因是，由于半滑舌鳎性别决定属于ZW型，雌性为ZW型，雄性为ZZ型。要想生产全雌苗种，必须首先生产出WW型的超雌鱼。根据舌鳎基因组和其他ZW型物种的基因组研究表明，W染色体上基因数目很少，缺少很多个体生长发育所必需的基因。因此，目前的方法还无法生产出WW的超雌鱼。据报道WW型超雌鱼在肌节期就无法进一步发育而死亡。
既然无法做到生产全雌苗种，通过一定的手段提高雌鱼的比例也可以有效提高半滑舌鳎的生产效益。目前利用半滑舌鳎性别差异来改善养殖生产效益的手段仅限于通过分子标记来判断雌鱼和雄鱼，但没有办法提高雌鱼的比例，因而对半滑舌鳎生产效益的改善作用有限。而且，一直以来，相关研究人员均认为半滑舌鳎的雌性比例与温度有关，随着温度的升高，雌性比例呈下降趋势。但在实际生产中，水温的控制技术非常成熟，但仍然难以抵挡雌性逆转为雄性这一趋势。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法、试剂盒及应用，以解决现有技术中养殖群体中雌鱼比例降低而影响生产效益的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法，该筛选方法包括：对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个SNP位点；将遗传雌鱼是否性逆转作为性状，对多个SNP位点进行全基因组关联分析，获得半滑舌鳎性逆转遗传控制位点。
进一步地，全基因组关联分析步骤中包括控制遗传背景影响的步骤，优选控制遗传背景影响的步骤采用线性混合模型进行控制。
进一步地，采用2b-RAD方法对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个SNP位点；优选地，在对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定之前，筛选方法还包括确定遗传雌鱼的步骤。
根据本发明的另一方面，提供了一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点在半滑舌鳎人工养殖中的应用，半滑舌鳎性逆转遗传控制位点为Z染色体上第6676874位核苷酸。
根据本发明的另一方面，提供了一种半滑舌鳎性逆转检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增Z染色体上第6676874位核苷酸的引物序列。
进一步地，引物序列为：正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
根据本发明的另一方面，提供了一种半滑舌鳎性逆转检测方法，该检测方法包括：用引物序列对半滑舌鳎遗传雌鱼Z染色体上第6676874位核苷酸进行扩增，得到扩增序列；根据扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A或T来判断遗传雌鱼是否性逆转，当扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A时，遗传雌鱼不逆转。
进一步地，引物序列为：正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
根据本发明的另一方面，提供了一种半滑舌鳎的育种方法，该育种方法包括：将遗传雄鱼与生理雌鱼进行交配，得到Z染色体上第6676874位核苷酸为A的半滑舌鳎苗种。
进一步地，交配的方式为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的遗传雄鱼与生理雌鱼进行交配；更优选为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的遗传雄鱼与Z染色体上第6676874位核苷酸为A的生理雌鱼进行交配。
根据本发明又一个方面，提供了一种半滑舌鳎雌鱼的人工养殖方法，该人工养殖方法包括育种方法，育种方法采用上述育种方法。
应用本发明的技术方案，通过从控制雌鱼性逆转的遗传控制角度，对遗传雌鱼进行分子标记测定，找到了遗传雌鱼独有的SNP位点，并将这些位点与性逆转的相关性进行了全基因组分析，从而发现了控制遗传雌鱼发生性逆转的分子开关，即Z染色体上第6676874位核苷酸。利用该位点控制半滑舌鳎的雌雄鱼的交配方式，使人工养殖的半滑舌鳎后代中不进行性逆转的雌鱼比例提高，进而提高养殖生产效益。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
图1示出了根据本申请的一优选实施例中的遗传性别的鉴定结果图；
图2A、2B、2C和2D示出了根据本申请的一优选实施例中的遗传雌鱼性逆转为伪雄鱼过程中生理性别鉴定的组织切片图；其中，图2A显示的是卵巢和卵母细胞(X100)；图2B显示的是从ZW雌鱼向伪雄鱼性逆转早期的嵌合性腺，箭头所指为精子细胞(X100)；图2C显示的是从ZW雌鱼向伪雄鱼性逆转过程中的嵌合性腺，主要由精囊组成，其中箭头所指为卵母细胞(X100)；图2D显示的是睾丸和精子细胞(X100)；以及
图3示出了根据本申请的一优选实施例中的与性逆转相关联的SNP位点的全基因组关联分析结果图。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如背景技术所提到的，现有的半滑舌鳎的性别鉴定方法及养殖方法对提高雌鱼比例有限，对半滑舌鳎养殖的生产效益的提高有限。为了提高养殖群体中半滑舌鳎的雌性比例，申请人从控制半滑舌鳎雌性向雄性逆转的遗传控制角度出发，从群体规律中去寻找个体遗传差异，对半滑舌鳎性逆转的遗传控制位点进行了研究。
申请人从遗传角度研究性逆转的机制，并根据所做大量实验的研究结果，发现Z染色体上第6676874位核苷酸是一个单核苷酸多态性位点(SNP)，该遗传位点控制着性逆转是否产生，是逆转产生的开关，控制了整个性逆转遗传变异的80％以上。当雌鱼在该SNP位点上的核苷酸的碱基类型为A型时，不会发生逆转；当雌鱼在该SNP位点上的核苷酸的碱基类型为T型时，雌鱼可能会产生逆转。一旦逆转后的伪雄鱼作为生产用的亲鱼，其后代不论是何种碱基类型均会发生逆转。因此，养殖场亲鱼中一旦混入伪雄鱼，就是灭顶之灾。根据上述研究结果可知，生产中若要提高雌性比例，不仅要剔除伪雄鱼，同时要从根源上排除T型鱼出现的可能。
因此根据上述研究结果，正常的雄鱼(不包括伪雄鱼)和正常的雌鱼(不包括伪雄鱼的遗传雌鱼)交配共有以下6中可能的交配方式：
上述n表示不逆转，pr表示可能会逆转。
上述六种交配方式中的亲鱼均为正常亲鱼，不包括伪雄鱼。可以看出，只有a)和d)两种交配方式能保证后代雌鱼不发生性逆转。其他交配方式，目前的研究结果还不能保证不逆转，而且逆转比例也无法准确知道，取决于家系，可能与其他基因有关，该部分还需进一步研究确定。
根据研究结果，本申请提出了提高雌性比例的养殖方案，可以通过对雄鱼进行遗传检测，选出A型雄鱼，然后与正常的雌鱼(即指不是生理雄鱼/伪雄鱼的遗传雌鱼)交配，则后代只会出现A型的雌鱼，因此不会发生性逆转，理论上雌鱼的比例可提高至50％左右。在养殖场亲鱼遗传多样性较好的情况下，同时也可以对雌性亲鱼进行遗传检测，排除T型雌鱼，这样可以从根本上剔除T型不利基因，无论如何交配，交配几代，则均不会发生雌鱼逆转为雄鱼的现象。
在上述研究结果的基础上，在本申请一种典型的实施方式中，提供了一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点，该半滑舌鳎性逆转遗传控制位点为Z染色体上第6676874位核苷酸。由于该核苷酸位点控制半滑舌鳎的性逆转，利用该位点能够筛选出不逆转的雌鱼，便于从鱼苗期对雌鱼进行选育，减少伪雄鱼的养殖成本，从而提高生产效益。同时，还可以利用该位点控制半滑舌鳎的雌雄鱼的交配方式，使人工养殖的半滑舌鳎后代中不产生性逆转的比例提高，进而提高养殖生产效益。
在本申请另一种典型的实施方式中，还提供了一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法，该筛选方法包括：对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个SNP位点；将遗传雌鱼是否性逆转作为性状，对多个SNP位点进行全基因组关联分析，获得半滑舌鳎性逆转遗传控制位点。该方法通过从遗传角度对全基因组上与性逆转相关的位点进行分析，获得了准确性更高的性逆转控制位点，即Z染色体上第6676874位核苷酸。
全基因组关联分析，是以基因组中数以百万级的SNP为分子遗传标记，进行全基因组水平上的对照分析或关联性分析，通过比较发现影响复杂形状的基因变异的一种方法。具体分析的方法有很多种，比如可以采用广义线性模型、贝叶斯模型(Bayes)或广义线性混合模型等方法。
上述筛选方法中，全基因组关联分析步骤中需要考虑遗传背景对SNP位点的影响，还包括控制遗传背景影响的步骤。遗传背景影响有群体分层、个体间的相关及微效多基因效应等。在本申请一种优选的实施例中，上述控制遗传背景影响的步骤采用广义线性混合模型进行控制，广义线性混合模型相比线性模型具有准确性高的优势。
在本申请一种优选的实施例中，采用2b-RAD方法对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个SNP位点。2b-RAD方法进行全基因组分子标记相比其他方法，具有成本低廉，标记更均匀的有益效果。
上述筛选方法中，在对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定之前，需要对遗传雌鱼进行遗传鉴定。遗传鉴定可以采用现有的RFLP、RAPD、AFLP等分子标记进行鉴定。优选通过黄海所陈松林课题组所设计的引物SEQ ID NO:3：5′-GAGGCCGACAGGATCGTAC-3′和SEQ ID NO:4：5′-TACGACGTACTCCGGTGGTTTT-3′进行判定(具体参见Artificalgynogenesis and sex determination in half-smooth tongue sole(Cynoglossussemilaevis)Mar.Biotechnol.11,120–128)。
在本申请另一种优选的实施方式中，还提供了一种半滑舌鳎性逆转检测试剂盒，该试剂盒包括用于扩增Z染色体上第6676874位核苷酸的引物序列。根据申请人的研究结果，Z染色体上第6676874位核苷酸的碱基类型决定了雌鱼是否发生性逆转，因而，用能够扩增该位点的引物对包含该位点的序列进行扩增，然后通过测序鉴定是A型还是T型，从而能够检测雌鱼是否发生性逆转。
上述试剂盒中，能够扩增上述位点的引物可以根据该位点两侧的基因组序列进行合理设计，设计方法采用常规引物设计方法即可，只要能够扩增该位点。在本申请另一种优选的实施例中，扩增上述位点的引物序列为：正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
相应地，本申请还提供了一种半滑舌鳎性逆转检测方法，该检测方法包括：用引物序列对半滑舌鳎遗传雌鱼Z染色体上第6676874位核苷酸进行扩增，得到扩增序列；根据扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A或T来判断遗传雌鱼是否性逆转，当扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A时，遗传雌鱼不逆转；当扩增序列第6676874位核苷酸的碱基类型为T型时，遗传雌鱼性逆转。优选地，引物序列为：正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
在本申请再一种典型的实施方式中，提供了一种半滑舌鳎的育种方法，该育种方法包括：将遗传雄鱼与生理雌鱼进行交配，得到Z染色体上第6676874位核苷酸为A的苗种。在本申请另一种典型的实施方式中，还提供了一种半滑舌鳎的人工养殖方法，该人工养殖方法包括育种的方法，其中，育种方法采用上述育种方法。
根据本申请的上述研究，控制雌雄鱼交配的后代中保留A型的雌鱼，进而使得雌鱼的比例得到提高。这样的人工养殖方法，尤其在半滑舌鳎的鱼苗育种上，能够提高养殖群体中雌鱼的比例，提高养殖生产效益。
如前述提到的，A型的雄鱼与A型或T型的雌鱼交配，能够使后代得到来源与雄鱼Z染色体上的A型碱基的核苷酸，进而使得后代雌鱼均不发生性逆转。因而，在本申请一种优选的实施例中，上述交配方式为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的雄鱼与雌鱼进行交配；更优选为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的雄鱼与Z染色体上第6676874位核苷酸为A的雌鱼进行交配。
在本申请再一种典型的实施方式中，还提供了一种筛选不性逆转的转半滑舌鳎雌鱼的方法，该方法包括：对遗传雌鱼的Z染色体上第6676874位核苷酸进行检测，得到Z染色体上第6676874位核苷酸为A的雌鱼，Z染色体上第6676874位核苷酸为A的雌鱼即为不性逆转的转半滑舌鳎雌鱼。
上述PCR检测过程中所使用的引物可以是任何能够扩增第6676874位核苷酸的核酸引物。优选采用如下这一对引物：正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。此外，也可以在该位点所在的基因组序列的上下游进行引物选择和设计，具有所得引物也本申请的保护范围内。引物的具体设计方法采用现有设计方法即可，在此不在赘述。
下面将结合具体的实施例来进一步说明本申请的有益效果。
需要说明的是，以下所有实验用鱼从受精卵开始均饲养在同一池中，以避免环境因素带来的影响。
一、采样
2013年3月，对山东东营培养的11条生理雄鱼和6条雌鱼进行标记作为亲鱼，并将亲鱼置于同一池中饲养繁殖。待孵化后36h的所有幼苗转入另一池塘中。由于半滑舌鳎性逆转通常发生在早期阶段最初的90天左右，因此在23℃的常温下持续培养90天以避免环境影响。之后采用随机选择268条90日龄的半滑舌鳎进行系谱分析、性别检测以及DNA提取。
在2014年4月，从上述养殖场采集598条鱼用于确认筛选到的与性逆转相关的SNP位点。
二、遗传性别和生理性别鉴定
收集鱼的鳞片和性腺，其中鳞片用于提取DNA，遗传性别采用以下引物对进行鉴定：SEQ ID NO:3：5′-GAGGCCGACAGGATCGTAC-3′和SEQ ID NO:4：5′-TACGACGTACTCCGGTGGTTTT-3′。鉴定结果见图1。
图1显示了对部分雄鱼和雌鱼的遗传鉴定结果，从左到右显示分别显示了21个样本的遗传性别检测结果。图1中，双带显示的是ZW型的遗传雌鱼，而单带的ZZ型显示的遗传雄鱼，CK表示水空白对照。
之后，将鉴定到的遗传雌鱼的性腺通过组织切片(切片包括正常雄鱼、伪雄鱼和雌鱼)的方法进一步确定其生理性别。
组织切片的具体流程如下：
摘取不同发育阶段的性腺组织，立即放入Bounin’s固定液中过夜，然后采用体积浓度分别为70％、80％、90％和95％的乙醇对固定组织进行梯度脱水，每个浓度处理时间为1h；最后用100％的乙醇脱水40min。然后用二甲苯：乙醇(V:V)＝1：1的溶液对性腺组织清洗40min，接着再用二甲苯清洗30min.
用二甲苯：石蜡(V:V)＝1：1的溶液进行包埋1h，接着用纯的石蜡中处理两次，共处理1h。石蜡包埋的目的是为了后续的切片步骤。用Leica 2200组织切片机上进行切片，每片厚度为6μm。采用纯二甲苯对切片进行脱蜡两次共15min，然后用100％的苯乙醇处理5min。之后采用体积浓度分别为100％、90％、80％、70％、50％、30％的乙醇各进行再水化处理2min，然后用水离子水处理两次，处理时间共3min。
最后采用HE溶液对样品进行染色，最后置于奥林巴斯显微镜下进行拍照。其中，HE溶液的制备步骤如下：
将5g苏木精溶于50ml乙醇中，记为A溶液；
100g明矾溶于1000ml水中，即为B溶液；
将A溶液和B溶解混合后加热2min，再加入2.5g升汞，静置过夜，最后过滤，将滤液即为C溶液；
将10g伊红溶于1000ml乙醇中，记为D溶液。
染色的具体步骤如下：
1)将样品置于A溶液中染色5-10min，然后置于水中10min直到水显示蓝色，再浸于水中3min；接着用HCl溶液冲洗数秒钟直至呈现浅红色；然后将样品置于水中冲洗3min直至水变蓝；
2)将样品置于梯度乙醇中冲洗，每个梯度冲洗2min，梯度洗脱的顺序为30％、50％、70％、80％(体积浓度)；
3)采用D溶液对样品进行染色20s，然后依次置于体积浓度为90％、95％、100％以及100％的乙醇中清洗，每个浓度下清洗2min，接着置于苯乙醇中2min，二甲苯中两次共2min。
组织切片鉴定的结果见图2A至图2D。图2A至图2D示出了半滑舌鳎遗传雌鱼逆转为生理雄鱼的过程。从图2A至图2D依次为雌性性腺、雌性开始向雄性逆转时的性腺、明显兼性性腺和发育精巢的状态。图2A显示的是卵巢和卵母细胞(X100)。图2B显示的是从ZW雌鱼向伪雄鱼性逆转早期的嵌合性腺，箭头所指为精子细胞(X100)。图2C显示的是从ZW雌鱼向伪雄鱼性逆转过程中的嵌合性腺，主要由精囊组成，其中箭头所指为卵母细胞(X100)。图2D显示的是睾丸和精子细胞(X100)。
三、对遗传雌鱼进行全基因组分子标记
用2b-RAD的方法对115条遗传雌鱼进行了基因型鉴定，总共获得了66563个SNP位点，将这些SNP位点比对到C.semilaevis基因组上，并对具有微效等位基因频率小于5％的SNP位点或者“提取率(call rate)”小于0.90的SNP位点剔除，将剩余基因型缺失的数据加入总数据中进行连锁不平衡分析。经过上述质量控制后，最终获得了17618个没有基因型缺失的SNP位点，具体分布见表1。
表1：
染色体 SNPs数目 SNPs跨度(Mb)
1 1573 34.47
2 846 20.05
3 747 16.24
4 876 19.9
5 977 19.17
6 882 18.82
7 734 13.76
8 1276 30.11
9 829 19.6
10 905 20.92
11 841 20.43
12 748 18.3
13 806 21.79
14 1081 28.83
15 734 19.88
16 792 18.65
17 686 16.46
18 532 14.94
19 677 17.72
20 705 15.15
W 110 17.17
Z 261 21.4
四、统计学分析
通过利用遗传雌鱼所具有的17618个SNP位点，采用全基因组关联分析(GWAS)分析与性逆转相关的SNP位点。分析结果发现，在Z染色体第6676874位的SNP位点与半滑舌鳎遗传雌鱼性逆转紧密关联的位点，具体见图3。从图3中可以看出，Z染色体上的-log10(p值)远远高于其余染色体的相应值。可见，性逆转这一性状与Z染色的相关性最高(P<1.0×10-7)。
根据半滑舌鳎的基因组数据可知，Z染色体第6676874位的SNP位点位于F-box和富亮氨酸重复序列蛋白17基因(FBXL17)的第三个内含子中，该蛋白是SCF(SKP1-CUL1-F-box蛋白)类型的E3泛素连接酶复合体的底物识别元件，通过别的蛋白的互作结构与泛素化的靶标结合。
Z染色体第6676874位的SNP位点解释了82.7％的遗传变异或者58.4％的生理变异。该SNP位点有两个等位基因，A和T。当基因型是ZAW，遗传雌鱼将不逆转；然而，ZTW基因型将部分发生性逆转。
五、实验验证
采用正向引物SEQ ID NO:1和反向引物SEQ ID NO:2，对包括Z染色体上第6676874位核苷酸的目的片段进行扩增，并通过测序对第6676874位核苷酸的碱基类型进行鉴定。
在339个样本中，通过遗传性别鉴定，其中196条为遗传雌鱼，进一步通过组织切片进行生理鉴定，发现196条遗传雌鱼中101条伪雄鱼，即基因型为ZTW，95条为生理雌鱼，即基因型是ZAW。通过对101条伪雄鱼和95条为生理雌鱼的后代进行跟踪，发现，101条伪雄鱼中52条发生性逆转，而95条生理雌鱼全部不发生性逆转。
该实验验证了本申请所提供的性逆转的遗传控制位点在遗传雌鱼性逆转上的作用。
根据上述验证结果，本申请还提出了在遗传育种以及人工养殖中的指导方案。通过鉴定出AA型雄性个体，并与正常雌鱼交配，通过上述切片或其他性别鉴定手段(比如RAPD、AFLP、RFLP)鉴定雌鱼比例，并与没有鉴定基因型的对照组进行比较。
实验组通过基因型筛选，选出15条左右的AA型雄鱼，在原有的生产模式下进行苗种繁育；对照组仍然按照原有的生产模式，采用未经基因型筛选亲鱼进行苗种繁育。两个组采用同样的管理模式，通过两种方式进行评价比较：一是在120日龄时，随机取100～200条鱼苗，通过组织切片和基因型判定雌鱼的比例；二是从120日龄开始记录鱼苗的生长，能长大的记为雌鱼，不能长大的记为雄鱼，根据生产记录判定雌鱼的比例。第二种方法对生产的影响较小，且易操作，贴近生产实际。
从理论角度分析，经过基因筛选的AA型雄鱼与正常雌鱼交配产生的雌鱼后代均为ZAW基因型，而上述验证试验已经证明，ZAW基因型雌鱼的后代均不发生性逆转。也就是说，理论上上述实验组后代群体中雌鱼比例可提高至50％，相比现有的不足20％的雌鱼比例，本申请的育种繁殖方法大大提高了雌鱼比例，提高了养殖生产效益。
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：本申请通过从控制雌鱼性逆转的遗传控制角度，发现了控制遗传雌鱼发生性逆转的分子开关，即Z染色体上第6676874位核苷酸。利用该位点控制半滑舌鳎的雌雄鱼的交配方式，使人工养殖的半滑舌鳎后代中不进行性逆转的雌鱼比例提高，进而提高养殖生产效益。可见，本申请所提供的遗传控制位点在控制遗传雌鱼性逆转方面具有相当显著的应用价值和经济效益。
此外，利用该位点能够筛选出不逆转的雌鱼，便于从鱼苗期对雌鱼进行选育，较少伪雄鱼的养殖成本，从而提高生产效益。在实际应用中，可以通过验证试验，根据养殖场的实际生产规模和鱼苗的雌雄配比，制定建立高雌比例半滑舌鳎的苗种繁育体系，探索快速简便的亲鱼基因型鉴定体系，从而制定符合养殖场的检测和苗种培育体系。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (11)

1.一种半滑舌鳎性逆转遗传控制位点的筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括：
对半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个SNP位点；
将遗传雌鱼是否性逆转作为性状，对多个所述SNP位点进行全基因组关联分析，获得所述半滑舌鳎性逆转遗传控制位点。
2.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，所述全基因组关联分析步骤中包括控制遗传背景影响的步骤，优选所述控制遗传背景影响的步骤采用线性混合模型进行控制。
3.根据权利要求1所述的筛选方法，其特征在于，采用2b-RAD方法对所述半滑舌鳎遗传雌鱼进行全基因组分子标记测定，获得多个所述SNP位点；
优选地，在对所述半滑舌鳎遗传雌鱼和雄鱼进行全基因组分子标记之前，所述筛选方法还包括确定所述遗传雌鱼的步骤。
4.半滑舌鳎性逆转遗传控制位点在半滑舌鳎人工养殖中的应用，其特征在于，所述半滑舌鳎性逆转遗传控制位点为Z染色体上第6676874位核苷酸。
5.一种半滑舌鳎性逆转检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于扩增Z染色体上第6676874位核苷酸的引物序列。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述引物序列为：
正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
7.一种半滑舌鳎性逆转检测方法，其特征在于，所述检测方法包括：
用引物序列对半滑舌鳎遗传雌鱼Z染色体上第6676874位核苷酸进行扩增，得到扩增序列；
根据所述扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A或T来判断遗传雌鱼是否性逆转，当所述扩增序列中第6676874位核苷酸的碱基类型为A时，所述遗传雌鱼不逆转。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述引物序列为：
正向引物SEQ ID NO:1:5'-CAGATAGCCAGCACTTAGCCC-3'和反向引物SEQ ID NO:2：5'-CCTGTTGTGAGTGGAGTGTGG-3'。
9.一种半滑舌鳎的育种方法，其特征在于，所述育种方法包括：
将遗传雄鱼与生理雌鱼进行交配，得到Z染色体上第6676874位核苷酸为A的半滑舌鳎苗种。
10.根据权利要求9所述的育种方法，其特征在于，所述交配的方式为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的遗传雄鱼与生理雌鱼进行交配；更优选为Z染色体上第6676874位核苷酸为A的遗传雄鱼与Z染色体上第6676874位核苷酸为A的生理雌鱼进行交配。
11.一种半滑舌鳎雌鱼的人工养殖方法，所述人工养殖方法包括育种方法，其特征在于，所述育种方法采用权利要求9或10所述的育种方法。
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