CN101225437A - 半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法 - Google Patents

Abstract

一种半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，包括半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的筛选和克隆、半滑舌鳎遗传性别鉴定PCR方法的建立、半滑舌鳎伪雄鱼的制备以及利用半滑舌鳎伪雄鱼生产雌性化苗种的方法；筛选到半滑舌鳎雌性特异分子标记，建立了半滑舌鳎伪雄鱼诱导方法和利用雌性特异分子标记鉴定伪雄鱼的技术方法。本发明首次建立了采用AFLP分子标记结合性逆转技术对半滑舌鳎进行性别控制，提高雌性化鱼苗比例的方法，可将半滑舌鳎鱼苗中雌鱼的比例提高20－25％。本发明具有高效、准确和可靠的特点，在半滑舌鳎性别控制和单性苗种生产中具有重要的应用价值，同时在其它鱼类性别控制和单性化苗种生产中也具有应用前景。

Description

半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法

技术领域

本发明属于鱼类育种和养殖技术领域中的一种采用分子标记手段提高半滑舌鳎鱼苗中雌性鱼苗比例的方法。

背景技术

半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国沿海特有的一种名贵经济海水鱼类，也是目前海水鱼类养殖的主要品种之一。由于其味道鲜美、肉质细嫩、营养丰富，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。养殖产量目前近万吨，价格昂贵，市场价达到150元/500克左右，半滑舌鳎养殖业目前每年的产值约为15亿元人民币。但是，最新研究表明，半滑舌鳎雌性个体和雄性个体，在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体大3-4倍，半滑舌鳎鱼苗经过1年养殖后，雌性个体可长到500-750克，而雄性个体则只有50-150克。由于雄性个体生长过慢，影响了商品鱼的质量，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展，因此，开展半滑舌鳎雌性化育种技术研究，研制能提高半滑舌鳎鱼苗的雌性化比例的育种技术，培育半滑舌鳎雌性化苗种，对于提高半滑舌鳎的养殖产量和经济效益非常重要。目前，半滑舌鳎鱼苗生产中雌性鱼苗的比例为40-50％，如果将雌性鱼苗的比例从现在的不到50％提高到70％以上，并进行大面积推广后将增加半滑舌鳎养殖产量40-50％，每年将增加4-7亿元的经济效益。

分子标记技术是进行鱼类选育的重要技术手段。寻找鱼类性别特异的分子标记或DNA片段是进行鱼类性别控制的重要途径。有关鱼类性别相关分子标记的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。如加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼等鲑鳟鱼类雄性特异的DNA片段；美国新罕布什尔大学的Lee等(2004)采用微卫星标记技术找到10个与罗非鱼雄性性别相关的微卫星标记。目前国际上的研究还只是在某些鱼类找到少数性别相关的分子标记，但还没有建立基于这些标记的鉴定鱼类遗传性别的PCR方法，更没有建立分子标记辅助性别控制技术。另外，鲑鳟鱼类的性别决定机制均为XY型，即雄性为XY型、雌性为XX型性别决定，雌鱼只产生一种卵子，即X卵子，而雄鱼则产生XY型2种精子。而半滑舌鳎的性别决定机制不是XY型性别决定，而是ZW型性别决定，半滑舌鳎雌性个体存在W性染色体(黄海水产研究所周丽青等，2005)。有关半滑舌鳎的研究工作，目前主要集中在半滑舌鳎生殖调控、苗种培育和养殖方法上。1993年，采集野生的半滑舌鳎亲鱼，获得成熟卵与精子受精后首次获得半滑舌鳎鱼苗(中国水产科学研究院黄海水产研究所，姜言伟等，1993)；随后，姜言伟等(2002)在人工养殖条件下，通过控制亲鱼养殖池的水温和光照时间，诱导半滑舌鳎亲鱼成熟并自然产卵，获得了半滑舌鳎受精卵，并生产出了半滑舌鳎苗种。但有关半滑舌鳎性别控制技术，特别是采用分子标记技术，提高半滑舌鳎鱼苗的雌性化比例，即分子标记辅助性别控制技术的研究，目前国内外均未见报道。

发明内容：

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，以提高半滑舌鳎鱼苗中雌性鱼苗的比例，实现半滑舌鳎雌性化苗种的规模化生产，为半滑舌鳎养殖业提供高比例的雌性化鱼苗，提高半滑舌鳎养殖产量和经济效益。

研究发现，半滑舌鳎的雌性个体产生Z型和W型两种卵子，而雄性个体只产生一种Z型精子。这种ZW型雌鱼如果用激素性反转为雄鱼，那么这种遗传上为雌性、生理上为雄性的伪雄鱼将产生Z型和W型2种精子，这种伪雄鱼(遗传上为ZW型)与正常雌鱼(ZW型)交配后就会产生25％的ZZ型雄鱼，50％的ZW雌鱼以及25％的WW型超雌鱼三种类型。也就是说，从理论上伪雄鱼后代中有75％的个体为雌性个体。采用伪雄鱼与正常雌鱼交配，就可以将鱼苗的雌性个体比例提高到75％，从而增加25％的雌性鱼苗。

因此本发明的基本构思就是采用AFLP分子标记技术，首先筛选出半滑舌鳎雌性特异的AFLP标记，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术；其次，采用雄激素处理半滑舌鳎鱼苗，制作遗传上雌性、生理上雄性的伪雄鱼；随后，采用遗传性别鉴定技术将伪雄鱼挑选出来，培养成熟，然后与正常雌鱼交配，生产雌性化鱼苗，达到将雌性鱼苗的比例提高到75％左右，以实现半滑舌鳎雌性化鱼苗的规模化生产。

本发明的方法是：采用AFLP技术筛选半滑舌鳎雌性特异AFLP标记，克隆这些雌性特异标记并进行核苷酸序列分析，根据所获得的雌性特异标记的序列，设计特异引物，建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；通过外源雄激素处理使半滑舌鳎雌性鱼苗性转换为雄性鱼苗，采用遗传性别鉴定的PCR方法筛选出遗传上雌性、生理上雄性的伪雄鱼，将这些伪雄鱼培养成熟后与正常雌鱼进行交配生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗。

因此，本发明包括四大步骤：一)筛选和克隆半滑舌鳎雌性特异AFLP标记；二)建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；三)制备半滑舌鳎伪雄鱼；四)利用半滑舌鳎伪雄鱼生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗。上述的一)筛选和克隆半滑舌鳎雌性特异AFLP标记包括：：

A、性别特异AFLP分子标记的筛选；B、性别特异AFLP标记的克隆与序列分析；

其中上述的A、性别特异AFLP分子标记的筛选：

采用常规方法从半滑舌鳎鱼血液或鳍条中提取基因组DNA，基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80。

采用商业上获得的AFLP试剂盒进行雌性特异AFLP标记的筛选(LifeTechnologies公司等)。包括如下步骤：1)对DNA模板进行酶切，2)将特异接头连接到酶切片段上，3)进行预扩增，4)进行选择性扩增，5)电泳分析。

采用商业上获得的AFLP引物(即8个MseI序列引物分别与8个EcoRI序列引物进行组合形成64个引物组合)对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，其中引物组合M-CTA和E-ACC(引物序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTA ACTA-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCACC-3’)在所有雌性个体基因组中扩增出一条305-310bp的雌性特异DNA片段，这个片段在雄性个体基因组DNA中不存在。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异AFLP标记。

其中上述的B、半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的克隆与序列分析：包括如下步骤：1)半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP片段的序列分析：

上述的1)雌性特异AFLP片段的回收：

选取能扩增出305-310bp雌性特异AFLP条带的引物组合M-CTA和E-ACC，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有305-310bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。

上述的2)AFLP片段的克隆：

将回收的305-310bp的雌性特异AFLP标记，克隆到商业上获得的pMD

18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。

上述的3)序列分析：

选取阳性克隆，按照常规方法进行序列分析，获得一个308bp的雌性特异DNA片段的序列，其中AFLP引物序列为24bp，半滑舌鳎雌性个体基因组中特异DNA片段的序列为284bp。将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性为99％以上，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。

上述的二)建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法

采集半滑舌鳎鱼苗或鳍条，提取基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎雌性特异片段的序列，设计1对特异引物，CseF305N1和CseF305C1，其序列分别为5’-CTCCCCTGACCTTCCTTT-3’和5’-CGGCAGCACAATTATTACA-3’。PCR反应体系为：DNA模板100ng；上下游引物浓度均为0.4μM；dNTP浓度为0.2mM；1×PCR buffer；MgCl₂浓度为1.5mM；TaqDNA聚合酶0.75unit；补充灭菌双蒸水至终体积为25μl。PCR反应程序为：94℃预变性4min，之后94℃50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环；再于72℃延伸7min。这对引物可以从雌性个体基因组中扩增出160bp的特异DNA片段，而从雄性个体基因组中则不能扩增出该特异DNA片段。提取15个雌性个体和15个雄性个体的基因组DNA，用合成的特异引物进行PCR扩增。如果某个个体产生了160bp的特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。

上述的三)制备半滑舌鳎伪雄鱼步骤包括：

1、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定；2、半滑舌鳎雌性向雄性转化的诱导方法；3、半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定。

上述的1、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定：

采用常规石蜡组织切片方法，对半滑舌鳎鱼苗早期性腺分化进行了组织学观察，发现：在22-24℃饲养条件下，孵化后25-30天半滑舌鳎性腺开始分化，因此确定诱导半滑舌鳎性逆转的激素处理时间为孵化后20-30天内。

上述的2、半滑舌鳎雌性个体向雄性个体转化的诱导方法从孵化后25天开始，随机选取伏底的半滑舌鳎鱼苗分养在50cm×50cm×50cm的水族箱中，每箱养150尾鱼苗，激素为商业上购买的17A甲基睾酮(MT)，激素处理采用浸泡法。即每天将鱼苗浸泡在含有甲基睾酮MT的海水中，激素浓度分别为每升海水含有10μg、20μg、40μg、60μg或80μg甲基睾酮MT，每天浸泡8-10小时，连续浸泡处理50-60天。激素处理完毕后，采用自然海水进行饲养，按照半滑舌鳎饲养的常规方法进行养殖。

上述的3、半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定

1)通过性腺外部形态鉴定生理性别：在饲养至7-9个月时，半滑舌鳎精巢和卵巢外形和外部颜色差异显著，卵巢呈长条形，外表为乳白色；而精巢前端较粗，向后急剧变小，形成锥形形状，颜色较暗，外表为浅黑色。根据这种显著不同的雌雄特征，采用强光透射活体半滑舌鳎性腺部位，可以区分半滑舌鳎活体的表型性别。

2)通过性腺组织切片鉴定生理性别：随机采取7-9个月的激素处理实验鱼苗，取性腺用Bouin’s液进行固定，按照常规组织切片技术，进行石蜡组织切片鉴定表型性别，具有体积较大且呈圆球形的卵原细胞或卵母细胞的为雌性个体，具有体积较小且呈颗粒状的精母细胞或精子细胞的为雄性个体；结果表明：所有激素处理组都能显著提高群体中的雄性比例，达到90-100％。因而能有效诱导半滑舌鳎鱼苗性腺由雌性向雄性转换的MT浓度和处理方式为10-80μg/L·H₂O浓度的甲基睾酮MT浸浴处理半滑舌鳎鱼苗。

3)遗传性别的鉴定：在饲养至7-9个月时，随机采集实验鱼苗的鳍条，按照常规方法提取DNA，采用上述遗传性别鉴定的PCR技术，利用一对半滑舌鳎雌性特异PCR引物，CseF305N1和CseF305C1，进行PCR扩增，鉴定半滑舌鳎的遗传性别。能扩增出160bp雌性特异DNA片段，而表型又为雄性的个体是性别由雌性逆转为雄性的性逆转个体，即伪雄鱼个体。

上述的四)用伪雄鱼生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗的步骤包括：

1、半滑舌鳎性转换鱼苗的培养、标记与繁殖

采用MT对1500尾20-25日龄的半滑舌鳎仔鱼进行了性反转处理，获得了近500尾性激素处理实验鱼，对其中的282尾生理雄鱼进行了荧光标记，采用黄、红、橙3种荧光染料，在鱼的背前、背后和腹部3个地方分别注射不同颜色的染料，对这些生理雄鱼逐条进行标记。同时，剪取一点鳍条，用于提取基因组DNA，进行遗传性别鉴定。从282条生理雄鱼中共检测到62条鱼具有雌性特异DNA标记，这62条雄鱼就是由遗传上的雌性个体性反转为生理上的雄性个体。对这些伪雄鱼进行培育，其中部分伪雄鱼于2007年10月达性成熟，并在2007年10月采集了部分伪雄鱼精液进行了人工繁殖实验，生产了一批半滑舌鳎伪雄鱼后代鱼苗。

2、伪雄鱼繁殖鱼苗遗传性别的鉴定：

采用上述的半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法对伪雄鱼与正常雌鱼交配产生的后代鱼苗进行了遗传性别鉴定。从64尾鱼苗中检测到47尾鱼苗含有160bp的雌性特异DNA片段，表明采用半滑舌鳎伪雄鱼精子与正常雌鱼卵交配产生的后代中的雌性化鱼苗比率为73％以上，伪雄鱼后代鱼苗中雌性个体的比例比普通鱼苗中的雌性个体比例提高了23％以上。

本发明与已有技术对比其特点是：本发明首先筛选到半滑舌鳎雌性特异AFLP分子标记，建立了半滑舌鳎遗传性别检测的PCR技术，其次，本发明建立了诱导半滑舌鳎遗传上的雌性个体转化为生理上的雄性个体的技术方法，采用性别特异分子标记筛选到一批遗传上雌性、生理上雄性的半滑舌鳎鱼苗，并培养至性成熟，用研制的伪雄鱼与正常雌鱼交配，获得了伪雄鱼后代鱼苗，并采用性别特异分子标记检测了伪雄鱼后代鱼苗的遗传性别，表明伪雄鱼后代鱼苗中的雌性个体比例提高到73％以上。因此，本发明首次建立了半滑舌鳎分子标记辅助性别控制技术，并将半滑舌鳎雌性鱼苗的比例提高了23％以上。目前，国内外未见同类技术的报道。本发明技术具有先进、高效、易行、可靠等优点，达到实用化水平，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，适宜在半滑舌鳎以及其它养殖鱼类上推广应用，对养殖鱼类性别控制和单性育种具有重要意义和应用价值，推广应用后将产生重大经济效益和社会效益。

附图说明：

图1：半滑舌鳎雌性特异AFLP标记CseF305的核苷酸序列.

图2：用雌性特异AFLP标记鉴定半滑舌鳎遗传性别

图3：甲基睾酮诱导半滑舌鳎性逆转个体的性腺组织切片；A和B：雌性对照；C和D：雄性对照；E.10μg/L·H₂O MT处理性反转雄性；F.20μg/L·H₂O MT处理性反转雄性；G.40μg/L·H₂O MT处理性反转雄性；H.60μg/L·H₂O MT处理性反转雄性。

图4：雄激素诱导半滑舌鳎性逆转个体的遗传性别分析；

M：Marker；1：雌性对照；2：MT处理但未发生性逆转的雌鱼；3：雄性对照；4：MT处理的雄鱼；5-16：MT诱导性逆转的雄鱼(伪雄鱼)。

图5：伪雄鱼繁殖鱼苗遗传性别的鉴定。在鉴定的64尾鱼苗中有47尾鱼苗含有雌性特异DNA片段。

具体实施方式：

下面通过‘半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法’的实施例，结合附图对本发明的技术内容进行详细说明：

本发明包括四大步骤：一)筛选和克隆半滑舌鳎雌性特异AFLP标记；二)建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；三)制备半滑舌鳎伪雄鱼；四)利用半滑舌鳎伪雄鱼生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗。

所述的一)筛选和克隆半滑舌鳎雌性特异AFLP标记：

包括：1、雌性特异AFLP分子标记的筛选；2、雌性特异AFLP分子标记的克隆与序列分析；

1、雌性特异AFLP分子标记的筛选：

采用常规方法从半滑舌鳎鱼血液或鳍条中提取基因组DNA，基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80。

采用商业上获得的AFLP试剂盒进行性别特异AFLP分子标记的筛选(LifeTechnologies公司等)，其主要步骤包括：1)对DNA模板进行酶切，2)将特异接头连接到酶切片段上，3)进行预扩增，4)进行选择性扩增，5)电泳分析。

所述的对DNA模板进行酶切，其方法是：先用EcoRI/MseI酶混合物(1.25U/μl)消化80-110ng模板DNA 4-6小时，用1％琼脂糖凝胶电泳检测酶切是否充分，将充分酶切的DNA溶液置于70℃孵育15分钟灭活限制性内切酶。

所述的特异接头连接到酶切片段上，其方法是：向上面的酶切反应混合

液中加入12.0μl接头混合物和0.5μl T4 DNA连接酶，20℃孵育12-20小时。

所述的预扩增，其方法是：将上述连接产物稀释10倍，作为PCR预扩增的模板；PCR引物是3’末端带有一个选择性碱基(A或者C)的引物混合物，进行PCR预扩增。

所述的选择性扩增：其方法是：将预扩增产物稀释30-50倍，作为选择性扩增的模板。用荧光标记的MseI引物和EcoRI引物进行选择性PCR扩增，这两种引物3’末端带有三个选择性碱基。向PCR扩增产物中加入适量的上样液，于94℃变性3分钟后立即置于冰上待用。总共用了64个引物组合进行选择性扩增，获得的PCR产物经94℃变性后用6.5％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳分离。

所述的电泳分析，其方法是：将变性好的扩增产物用5.5-6.5％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。电泳条件：电压1500V，功率40W，电流40mA，温度45℃，时间3.5小时。然后对电泳后产生的DNA条带进行观察，照相和分析。

共采用64个引物组合(即8个MseI序列引物分别与8个EcoRI序列引物进行组合)对15个半滑舌鳎雌性个体和13个半滑舌鳎雄性个体的基因组DNA进行了AFLP-PCR扩增，通过SAGA软件分析筛选出1个引物组合M-CTA和E-ACC(引物序列为：5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’和5’-GACTGCGTACCAATTCA CC-3’)产生了1条305-310bp的雌性特异的DNA片段，这个片段在雄性个体基因组DNA中不存在。将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异AFLP标记，将此雌性特异AFLP标记命名为CseF305。

2、半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的克隆与序列分析：它的技术内容包括：1)半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP片段的序列分析：

1)、雌性特异AFLP片段的回收步骤：

选取能扩增出305-310bp雌性特异AFLP标记的引物组合，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用刀片切下含有305bp雌性特异DNA标记的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用。

2)、AFLP片段的克隆：

将回收的305-310bp的雌性特异AFLP标记，克隆到pMD 18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，符合预期长度的样品可以视为阳性克隆。

3)、序列分析：

选取阳性克隆，用ABI3730测序仪进行序列分析，获得一个308bp的雌性特异DNA片段的序列(图1)，扣除24bp的AFLP引物序列后，半滑舌鳎基因组中雌性特异DNA片段的实际序列为284bp。将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，其同源性为99％以上，表明各个个体得到的条带是同一个序列。共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源的序列。

所述的二)建立半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法

采集半滑舌鳎鱼苗或鳍条，提取基因组DNA，根据获得的半滑舌鳎雌性特异片段的序列，设计1对特异引物，CseF305N1和CseF305C1，其序列分别为5’-CTCCCCTGACCTTCCTTT-3’和5’-CGGCAGCACAATTATTACA-3’。PCR反应体系为：DNA模板100ng；上下游引物浓度均为0.4μM；dNTP浓度为0.2mM；1×PCR buffer；MgCl₂浓度为1.5mM；TaqDNA聚合酶0.75unit；补充灭菌双蒸水至终体积为25μl。PCR反应程序为：94℃预变性4min，之后94℃50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环；再于72℃延伸7min。用此对引物可以从雌性个体基因组中扩增出160bp的特异DNA片段，而从雄性个体基因组中则扩增不出这样的特异DNA片段。提取15个雌性个体和15个雄性个体的基因组DNA，用合成的上述特异引物进行PCR扩增，结果表明15个雌性个体都扩增出160bp的特异DNA片段，而15个雄性个体都没有产生160bp的特异DNA片段(图2)，从而证明该PCR方法鉴定遗传性别的准确率为100％。

所述的三)制备半滑舌鳎伪雄鱼的步骤包括：

1、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定；2、半滑舌鳎雌性鱼苗向雄性鱼苗转化的诱导方法；3、半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定。

所述的1、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定：

半滑舌鳎亲鱼经暂养、驯化、人工诱导性腺成熟，雌、雄亲鱼同时排卵、排精得到自然产卵受精的鱼苗。在22-24℃饲养条件下，在孵化后10、20、30、45、50、75天分别取样5-10条，Bouin’s液固定。通过石蜡组织切片，对半滑舌鳎早期性腺分化进行组织学观察，半滑舌鳎在孵化后10天和20天显微镜下都可见性腺原基，原基位于肾管下方，肠道上方，原基在细胞学和形态学上都未发现明显的差异。在孵化后30天性腺出现了分化，性腺组织学出现了两种明显的性腺类型，一种性腺原基中没有裂隙；另一种原基中央出现裂隙，其中具有裂隙的性腺原基未来发育为卵巢，而不具裂隙的性腺原基未来发育为精巢。因而认为半滑舌鳎的组织学性腺分化在孵化后30天开始，激素对性腺分化的诱导作用必须在组织学性腺分化之前进行，并且必须至少部分重叠这个关键时期，因而诱导半滑舌鳎性逆转的时间应该在孵化后25-30天内开始，最好在孵化后20天-30天期间开始进行激素诱导处理。

所述的2、半滑舌鳎雌性鱼苗向雄性鱼苗转化的诱导方法

从孵化后25天开始，随机选取伏底的半滑舌鳎鱼苗分养在50cm×50cm×50cm的水族箱中，每箱养150尾鱼苗，激素为商业上购买的17a甲基睾酮(MT)，激素处理采用浸泡法。即每天将鱼苗浸泡在含有甲基睾酮MT的海水中，激素浓度分别为每升海水含有10μg、20μg、40μg、60μg或80μg甲基睾酮MT，每天浸泡8-10小时，浸泡完毕后，去掉含激素的海水，添加新鲜海水。连续浸泡处理50-60天，每个激素处理组重复2次，所有处理组鱼苗都饲养在22-24℃海水中。激素处理完毕后，采用自然海水进行饲养，按照半滑舌鳎饲养的常规方法进行养殖。

所述的3.半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定

1)通过性腺外部形态鉴定生理性别：在饲养至7-9个月时，半滑舌鳎精巢和卵巢外形和外部颜色差异显著，卵巢呈长条形，外表为乳白色；而精巢前端较粗，向后急剧变小，形成锥形形状，颜色较暗，外表为浅黑色。根据这种显著不同的雌雄性状，采用强光手电筒透射活体半滑舌鳎鱼种性腺部位，可以区分半滑舌鳎活体的表型性别。结果表明：在所有激素处理组(10-80μg/L)都能显著提高群体中的雄性比例，分别达到90-100％。因而采用10-80μg/L·H₂O浓度的甲基睾酮浸浴处理半滑舌鳎鱼苗，能有效诱导半滑舌鳎鱼苗由雌性向雄性的性别转换。

2)通过性腺组织切片鉴定生理性别：在用甲基睾酮浸浴处理后9个月随机从各实验组选取10条鱼取其肝脏保存于-80℃备用，并取性腺用Bouin′s液固定。对取出的仔鱼和性腺作石蜡切片，经各级乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋，作连续横切切片，切片厚度为5～6μm。H.E染色，0lympus光学显微镜观察鉴别其表型性别。具有体积较大且呈圆球形的卵原细胞或卵母细胞的为雌性个体，具有体积较小且呈颗粒状的精母细胞或精子细胞的为雄性个体；结果表明：激素处理组都能显著提高群体中的雄性比例，达到90-100％；因而能有效诱导半滑舌鳎鱼苗性腺由雌性向雄性转换的MT浓度和处理方式为10-80μg/L·H₂O浓度的甲基睾酮MT浸浴处理半滑舌鳎鱼苗；组织切片鉴定的雌雄结果也证明采取强光透射性腺部位，根据其性腺颜色和性状判断该鱼的表型性别是可行的。

3)遗传性别的鉴定：在用甲基睾酮浸浴处理后9个月随机从各实验组选取10条鱼，剪取米粒般大的鳍条，按照常规方法提取DNA，采用上述遗传性别鉴定的PCR技术，利用一对半滑舌鳎雌性个体特异PCR引物，CseF305N1和CseF305C1，其序列分别为5’-CTCCCCTGACCTTCCTTT-3’和5’-CGGCAGCACAATTATTACA-3’，进行PCR扩增，能扩增出160bp雌性特异DNA片段的个体为遗传上的雌性个体，具有遗传性别为雌性而表型性别为雄性的个体是性别由雌性逆转为雄性的伪雄鱼(图4)。

所述的四)利用半滑舌鳎伪雄鱼生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗

1、半滑舌鳎性转换鱼苗的培养、标记与繁殖

本项研究从2004年11月-2005年4月期间，采用17a-甲基睾酮处理对1500尾20-25日龄的半滑舌鳎仔鱼进行了性反转实验，经过半年多的饲养后，最后获得了近500尾性反转实验鱼，我们对其中的282尾生理雄鱼进行了荧光标记，采用黄、红、橙3种荧光染料，在鱼的背前、背后和腹部3个地方分别注射不同颜色的染料，将3种颜色进行不同组合，对这些生理雄鱼逐条进行标记。同时，剪取一点鳍条，用于提取基因组DNA，进行遗传性别鉴定。从282条生理雄鱼中共检测到62条鱼具有雌性特异DNA标记，这62条雄鱼就是由遗传上的雌性个体性反转为生理上的雄性个体。对这些伪雄鱼进行培育，其中部分伪雄鱼于2007年10月达性成熟，并在2007年10月进行了人工繁殖实验。分别采集了6-8条伪雄鱼的精液，与正常雌性个体的卵进行了人工受精，并获得了伪雄鱼的后代鱼苗13万尾左右。

2、伪雄鱼繁殖鱼苗遗传性别的鉴定：

采用上面建立的半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR技术对性逆转的伪雄鱼与正常雌鱼交配产生的后代鱼苗进行了遗传性别鉴定。我们从64尾鱼苗中检测到47尾鱼苗含有160bp的雌性特异DNA片段，表明采用半滑舌鳎伪雄鱼精子与正常雌鱼卵交配产生的后代中的雌性化鱼苗比率为73％以上(图5)，而普通鱼苗中雌性个体的比例为40-50％，因此，伪雄鱼后代鱼苗中雌性个体的比例比普通鱼苗中的雌性个体比例提高了23％以上。

Claims (5)

1.一种半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，其特征在于它包括如下四个步骤：一)半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的筛选和克隆；二)半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法；三)半滑舌鳎伪雄鱼的制备；四)利用半滑舌鳎伪雄鱼生产雌性化比例高的半滑舌鳎鱼苗。

2.如权利要求1所述的半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，其特征在于半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的筛选和克隆包括有A、性别特异AFLP分子标记的筛选；B、性别特异AFLP标记的克隆与序列分析；

其中所述的A、性别特异AFLP分子标记的筛选步骤如下：

采用常规方法从半滑舌鳎鱼血液或鳍条中提取基因组DNA，基因组DNA的浓度应不低于20ng/μl，而且基因组DNA的纯度要求OD₂₆₀/OD₂₈₀值为1.76-1.80；

采用商业上获得的AFLP试剂盒进行雌性特异AFLP标记的筛选；包括如下步骤：1)对DNA模板进行酶切，2)将特异接头连接到酶切片段上，3)进行预扩增，4)进行选择性扩增，5)电泳分析；

采用商业上获得的8个MseI序列AFLP引物和8个EcoRI序列AFLP引物进行组合形成64个引物组合对半滑舌鳎雌性个体和雄性个体的基因组DNA进行AFLP-PCR扩增，其中序列为5’-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3’的M-CTA和序列为5’-GACTGCGTACCAATTCACC-3’的E-ACC引物组合在所有雌性个体基因组中扩增出一条305-310bp的雌性特异DNA片段，这个片段在雄性个体基因组DNA中不存在，将只在雌性个体中出现，而在雄性个体中不出现的片段作为雌性特异AFLP标记；

B、所述的半滑舌鳎雌性特异AFLP标记的克隆与序列分析：包括如下步骤：1)半滑舌鳎雌性特异AFLP片段的回收；2)雌性特异AFLP片段的克隆；3)雌性特异AFLP片段的序列分析：

其中1)所述的雌性特异AFLP片段的回收：

选取能扩增出305-310bp雌性特异AFLP条带的引物组合M-CTA和E-ACC，进行AFLP扩增，扩增产物进行聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再用刀片切下含有305-310bp雌性特异DNA条带的聚丙烯酰胺凝胶，溶解后回收目的片段备用；

其中2)所述的AFLP片段的克隆：

将回收的305-310bp的雌性特异AFLP片段，克隆到商业上获得的pMD 18-T载体中，采用标准方法进行连接和转化，采用常规PCR法筛选含有目的片段的克隆，用琼脂糖凝胶电泳检测产物的长度，将符合预期长度的样品视为阳性克隆；

其中3)所述的序列分析：

选取阳性克隆，按照常规方法进行序列分析，获得一个308bp的雌性特异DNA片段的序列；将来自8个阳性克隆的雌性特异AFLP片段的核苷酸序列，用DNAMAN Version 4.0进行多序列比对，使其同源性为99％以上，表明各个个体得到的条带是同一个序列；其中共有序列同源性比对和相似性搜索用BLAST软件进行，在GenBank中没有找到任何同源序列，上述半滑舌鳎308bp的雌性特异标记的序列示于下：

ACCTTCCAGAGAAGGAAAAAATCCTGAAGCTCACTCGTCTGCACGCTCCCCTGA

Primer E-ACC                                                Primer CseF305N1

CCTTCCTTTTTCCAGCCAGATTGGTATTCATCTACAGTACGGAGCAGAAAATATTCCAGGATGCCACGGAAGCCAA

AACTTTCATAGACAAATTCATTACGCTCTCCGCCACTGCAAAGTGAGATATAGAAATGTAATAATTGTGCTGC

                                                         Primer CseF305C1

CGTACCCAGACACTTGTTTAGGATAATGAACTGTATATACTTCTGTATATATAGTTCAGTTTAGATT

Primer M-CTA。

3.如权利要求1所述的半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，其特征在于半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法如下：

采集半滑舌鳎鱼苗或鳍条，提取基因组DNA，根据上述已获得的半滑舌鳎雌性特异标记的序列，设计1对特异引物，CseF305N1和CseF305C1，其上下游引物序列分别为5’-CTCCCCTGACCTTCCTTT-3’和5’-CGGCAGCACAATTATTACA-3’；PCR反应体系为：DNA模板50-150ng；上下游引物浓度均为0.4μM；dNTP浓度为0.2mM；1×PCR buffer；MgCl₂浓度为1.5mM；TaqDNA聚合酶0.75unit；补充灭菌双蒸水至终体积为25μl，PCR反应程序为：94℃预变性4min，之后94℃50s，56℃退火50s，72℃延伸50s，30个循环；再于72℃延伸7min，这对引物可以从雌性个体基因组中扩增出160bp的特异DNA片段，而从雄性个体基因组中则不能扩增出该特异DNA片段，提取30个雌性个体和30个雄性个体的基因组DNA，用上述合成的特异引物进行PCR扩增，如果某个个体产生了160bp的特异片段，即可认为这些鱼为遗传上的雌性个体，而没有这些片段的个体则被认为是遗传上的雄性个体。

4.如权利要求1所述的半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，其特征在于半滑舌鳎伪雄鱼的制备方法骤包括：A、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定；B、半滑舌鳎雌性向雄性转化的诱导方法；C、半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定；

其中所述的A、适宜性逆转诱导的鱼苗发育时期的确定：

采用常规石蜡组织切片方法，对半滑舌鳎鱼苗早期性腺分化进行了组织学观察，发现：在22-24℃饲养条件下，孵化后25-30天半滑舌鳎性腺开始分化，因此确定诱导半滑舌鳎性逆转的激素处理时间为孵化后20-30天内。

其中所述的B、半滑舌鳎雌性个体向雄性个体转化的诱导方法：

从孵化后20-30天开始，选取伏底的半滑舌鳎鱼苗分养在100-400升的水族箱中，每箱养100-300尾鱼苗，采用商业上购买的甲基睾酮MT，对鱼苗进行浸泡处理；每天将鱼苗浸泡在含有甲基睾酮MT的海水中，激素浓度为每升海水含有10-80μg甲基睾酮MT，每天浸泡8-10小时，连续浸泡处理40-60天，激素处理完毕后，采用自然海水进行饲养，按照半滑舌鳎饲养的常规方法进行养殖；

其中所述的C、半滑舌鳎性转换鱼苗的性别鉴定，包括：

1)通过性腺外部形态鉴定生理性别：采用强光透射7-9月龄的活体半滑舌鳎性腺部位，如果性腺呈长条形，外表为乳白色者为生理上的雌性个体；如果性腺前端较粗，向后急剧变小，形成锥形形状，且颜色较暗，外表为浅黑色者则为生理上的雄性个体；

2)通过性腺组织切片鉴定生理性别：采用常规方法对7-9月龄的实验鱼苗的性腺进行石蜡组织切片鉴定生理性别，具有体积较大且呈圆球形的卵原细胞或卵母细胞的为雌性个体，具有体积较小且呈颗粒状的精母细胞或精子细胞的为雄性个体；

3)遗传性别的鉴定：在饲养至7-9个月时，随机采集实验鱼苗的鳍条，按照常规方法提取DNA，采用上述遗传性别鉴定的PCR技术，利用一对半滑舌鳎雌性特异PCR引物，CseF305N1和CseF305C1，进行PCR扩增，鉴定半滑舌鳎的遗传性别，能扩增出160bp雌性特异DNA片段，而表型又为雄性的个体是由雌性逆转为雄性的性逆转个体，即伪雄鱼个体。

5.如权利要求1所述的半滑舌鳎分子标记辅助性别控制方法，其特征在于用伪雄鱼生产雌性化比例提高的半滑舌鳎鱼苗的方法，包括以下步骤：

1)、半滑舌鳎性转换鱼苗的培养、标记与繁殖

采用MT对1500尾20-25日龄的半滑舌鳎仔鱼进行了性反转处理，获得了近500尾性激素处理实验鱼，对其中的282尾生理雄鱼进行了荧光标记，采用黄、红、橙3种荧光染料，在鱼的背前、背后和腹部3个地方分别注射不同颜色的染料，对这些生理雄鱼逐条进行标记；同时，剪取一点鳍条，用于提取基因组DNA，进行遗传性别鉴定；从282条生理雄鱼中共检测到62条鱼具有雌性特异DNA标记，这62条雄鱼就是由遗传上的雌性个体性反转为生理上的雄性的伪雄鱼，对这些伪雄鱼进行培育，经过1-2年的培育后，伪雄鱼可以达到性成熟，采集这些伪雄鱼的精液，与正常雌性个体的卵进行人工授精，可以获得雌性比例提高的伪雄鱼后代鱼苗；

2)、伪雄鱼繁殖鱼苗遗传性别的鉴定：

采用上述的半滑舌鳎遗传性别鉴定的PCR方法对伪雄鱼与正常雌鱼交配产生的后代鱼苗进行了遗传性别鉴定，从64尾鱼苗中检测到47尾鱼苗含有160bp的雌性特异DNA片段，表明采用半滑舌鳎伪雄鱼精子与正常雌鱼卵交配产生的后代中的雌性化鱼苗比率为73％以上，伪雄鱼后代鱼苗中雌性个体的比例比普通鱼苗中的雌性个体比例提高了23％以上。

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