CN103214567A - 一种半滑舌鳎性别相关基因及其重组蛋白制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及半滑舌鳎性别相关基因，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1；编码上述的性别相关蛋白的核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达，抑制基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制中具有应用潜力。

Description

一种半滑舌鳎性别相关基因及其重组蛋白制备方法与应用

技术领域

本发明属于水产生物技术中的功能基因筛选与应用技术领域，具体涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的克隆、体外重组表达及其表达产物的活性分析。

背景技术

半滑舌鳎（Cynoglossμs semilaevis）是一种近海温水性大型底栖鱼类，其肉质鲜美、营养丰富，深受消费者喜爱，是我国海水养殖主导鱼类之一。但半滑舌鳎雌、雄个体生长速度差异很大，雌性比雄性生长快2-4倍。由于雄性个体生长缓慢、个体小等原因，致使增加了半滑舌鳎的养殖成本、降低了养殖产量，严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的发展。因而开展半滑舌鳎性别决定关键基因的筛选鉴定及其功能的分析研究是揭示半滑舌鳎性别决定机制、探索雌雄生长差异的分子机理、建立性别控制技术的重要任务。

在鱼类性别决定的分子机制的研究中，人们对哺乳动物的许多性别决定的同源基因进行了研究，这为从分子水平上阐明动物的性别决定和分化机制奠定了基础。但是，很多在其他脊椎动物中与性别决定相关的基因在鱼类中并没有性别的差异，说明鱼类有其特有的性别决定机制。因此，目前人们又逐渐转向寻找鱼类自身性别决定基因的研究上来。例如，在青鳉（Oryzias latipes）Y染色体上的性别决定相关区段发现了一个性别决定基因DMY，该基因是迄今为止在鱼类Y染色体上找到的与精巢发生和分化直接相关证据最充分的1个性别决定功能基因。但后来在一些与青鳉亲缘关系非常相近的物种及其他硬骨鱼类的研究中并未能找到DMY的同源基因（Matsuda et al.，2003；Volff et al.,2003;Kondo et al.,2003），而在其它鱼类尚未见有关性别决定基因克隆的成功报道。有关鱼类性别决定相关基因，特别是半滑舌鳎性别决定基因的筛选与克隆以及性别决定分子机制的研究是目前国内外急待攻克的重要科学问题，也是建立半滑舌鳎性别控制和全雌苗种培育技术的重要基础。

发明内容

本发明的目的是筛选半滑舌鳎性别决定相关基因，获得性别相关基因的序列，进行体外重组表达，获得重组表达产物，鉴定重组表达产物的生物活性及基因的功能，为半滑舌鳎性别控制和全雌苗种研制提供基因资源和技术方法。

本发明一个方面涉及半滑舌鳎性别相关基因CSsr1，其氨基酸序列为SEQ IDNO:1；

编码上述的性别相关蛋白CSsr1的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

本发明的另一个方面涉及用于重组表达CSsr1蛋白的重组质粒，

本发明的半滑舌鳎性别相关蛋白在半滑舌鳎性别控制中的应用。

本发明的CSsr1基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达，抑制CSsr1基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制和提高雌性鱼苗比例方面具有应用潜力。

附图说明

图1：本发明构建的原核表达载体图谱；

图2：半滑舌鳎CSsr1重组表达蛋白SDS-PAGE分析；

其中A:PET-32-CSsr1诱导不同时期采样SDS电泳图，M：标准分子量marker，1-3:诱导6h，4-5:诱导4h，6-7:诱导2h，8-9:pet-32a诱导6h.B:重组蛋白纯化SDS电泳图，1：纯化重组蛋白，2:标准分子量marker。

具体实施方式

下面结合附图实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

一、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的克隆及其序列

通过半滑舌鳎全基因组测序，转录组和生物信息学分析获得半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的部分cDNA序列，然后设计引物从半滑舌鳎精巢中克隆到了性别相关基因CSsr1的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的cDNA编码序列为519bp，见SEQ ID NO:2序列。

具体步骤如下：

1、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1 cDNA片段的克隆

根据半滑舌鳎基因组测序，转录组测序和生物信息学预测的CSsr1部分序列设计引物CSsr1-hf1（5′-CAGACTGTCTCAGGAGCGCAA-3′）、CSsr1-Hr1（5′-GGGCAAACTTCTTGGCCTG-3′），并利用此对引物扩增CSsr1基因片段，验证基因片段的准确性。

PCR反应条件按照以下进行：94℃预变性5min,94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，32个循环；72℃延伸5min。

2、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的序列

采用cDNA末端快速扩增（RACE）技术，根据上述CSsr1基因片段设计PCR引物（CSsr1-5′GSP：5′-CACTGTGCCTGACGGATAGACATTTGGGT-3′，CSsr1-3′GSP：5′-AGGAACCTTATGGGAGGGAGGGCTTTACA-3′），从半滑舌鳎精巢中克隆到了别相关基因CSsr1的全长cDNA，其全长序列为SEQ ID NO:2，其编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

cDNA序列获得采取cDNA末端扩增（RACE），方法按照SMARTer^TM RACE cDNAAmplification Kit(Clontech)，其具体操作条件如下：

3′RACE所用的体系以及反应条件：

50μl反应体系

5μl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer

1μl dNTP Mix(10mM)

5μl μPM

1μl GSP

2μl 3'-RACE-Ready cDNA

1μl 50X BD Advantage 2 Polymerase Mix

35μl PCR-grade water

反应条件如下：

94℃ 30S，72℃ 3min5个循环，94℃ 30S,70℃ 30S,72℃ 3min5个循环，94℃ 30S,68℃ 30S,72℃ 3min27个循环

5′RACE所用体系及反应条件：

50μl反应体系

5μl 10X BD Advantage 2 PCR Buffer

1μl dNTP Mix(10mM)

5μl μPM

1μl GSP

2μl 5'-RACE-Ready cDNA

1μl50X BD Advantage 2 Polymerase Mix

35μl PCR-grade water

反应条件如下：

94℃ 30S，72℃ 3min5个循环，94℃ 30S,70℃ 30S,72℃ 3min5个循环，94℃ 30S,68℃ 30S,72℃ 3min27个循环。

将3′RACE和5′RACE的PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测，用胶回收试剂盒（Tiangen gel extraction kit）进行PCR产物的回收和纯化，再与pMD-18T载体（Takara）连接后转化至大肠杆菌TOP10感受态细胞，挑选阳性克隆提取质粒测序，测得的序列经Vector NTI 11软件分析拼接得到全长序列。其核苷酸序列为SEQ ID NO:2，编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

半滑舌鳎性别相关基因CSsr1的cDNA序列全长为1905bp，包括519bp的开放阅读框（ORF区域），编码173个氨基酸，5′非编码区长296bp，3′非编码区长1090bp，有多聚腺苷酸加尾信号和多聚腺苷酸尾巴。

二、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1在不同组织及性腺不同发育时期的表达模式

1、半滑舌性别相关基因CSsr1在不同组织的表达模式：采用适时定量PCR技术分析了CSsr1基因在半滑舌鳎不同组织（心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、精巢及伪雄鱼精巢）的表达情况，发现CSsr1在性腺中表达最高，其次是脑和血，在肌肉和肠中表达最低（表1）。

表1：半滑舌鳎不同组织中CSsr1基因的表达水平分析

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

在性腺中，伪雄鱼精巢的表达最高，精巢次之，卵巢表达最低（表2）。雌鱼和伪雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行（Chen S L et al.,2012,Marine Biotechnology,14(1):120-128.）。CSsr1基因在不同组织的表达检测的具体步骤为：

（1）半滑舌鳎不同组织总RNA的提取及反转录：取1年生长期的半滑舌鳎心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、精巢和伪雄鱼精巢组织，用RNA提取试剂盒提取总RNA，采用常规方法通过M-MLV反转录酶（Takara）反转录成cDNA。

（2）实时荧光定量PCR反应条件

根据半滑舌鳎CSsr1基因cDNA序列设计实时荧光定量PCR引物CSsr1-RT-f（5'GTTTGATGGTGATGGCTGGTC3'）,CSsr1-RT-r（5'TTATGGGAGGGAGGGCTTTAC3'）,对半滑舌鳎不同组织（心、肝、鳃、皮、血、肾、肠、脑、脾、肌肉、垂体、卵巢、雄鱼精巢以及伪雄鱼精巢）中CSsr1的表达进行分析。

实时荧光定量PCR反应体系以及反应条件：

20μl反应体系

10μl SYBR Taq

0.4μl primer F

0.4μl Primer R

0.4μl Rox RD II

1μl cDNA(600ng/μl)

7.8μl H₂0

反应条件如下：

95℃ 10s；95℃ 5s,60℃ 34s，40个循环

发现CSsr1在性腺中表达最高，其次是脑和血，在肌肉和肠中表达最低（表1）。在性腺中，伪雄鱼精巢的表达最高，精巢次之，卵巢表达最低（表2）。由此提示，CSsr1与半滑舌鳎性逆转密切相关。

表2：1年龄半滑舌鳎卵巢、精巢和伪雄鱼精巢CSsr1基因的表达水平分析

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

由此证明CSsr1基因在半滑舌鳎性别修饰和性腺发育过程中起着重要作用。

雌雄鱼遗传性别的鉴定按照已报道的方法进行（Chen S L et al.,2012,Marine Biotechnology,14(1):120-128.）。CSsr1基因在半滑舌鳎胚胎和性腺不同发育时期表达检测的具体步骤为：

（1）半滑舌鳎不同发育时期性腺总RNA的提取及反转录：取半滑舌鳎7天、25天、48天、62天、5月、8月、1年、2年等不同发育时期的鱼苗或成鱼的卵巢，用RNA提取试剂盒提取Total RNA，M-MLV反转录酶（Takara）反转录成cDNA。

（2）实时荧光定量PCR反应条件：

对不同发育时期（7天、25天、48天、62天、5月、8月、1年、2年）半滑舌鳎性腺的cDNA进行实时荧光定量PCR分析，反应体系及反应条件如下：

20μl反应体系

10μl SYBR Taq

0.4μl primer F

0.4μl Primer R

0.4μl Rox RD II

1μl cDNA(600ng/μl)

7.8μl H₂0。

结果表明CSsr1基因在性腺不同发育时期，25天之前CSsr1表达量极低，48天至2年表达量呈现随时间增长而增加趋势，5个月时期表达量开始剧增，2年龄表达量最高（表3）。

表3：半滑舌鳎性腺不同发育时期CSsr1基因的表达水平分析

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

3、半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定：

从半滑舌鳎鱼苗或成鱼上采取0.1g大小的尾鳍组织，按照常规的酚氯仿方法提取基因组DNA，随后采用中国水产科学研究院黄海水产研究所陈松林实验室建立的半滑舌鳎性别连锁微卫星标记和建立的遗传性别鉴定方法（Chen S L etal.,2012,Marine Biotechnology,14:120-128）进行半滑舌鳎鱼苗和成鱼的遗传性别鉴定。

三、半滑舌鳎性别相关基因CSsr1重组表达载体的构建及其在大肠杆菌的重组表达和表达产物的分离纯化

采用常规PCR技术，扩增了CSsr1基因的开放阅读框ORF区域，并将其克隆到pET-32a(+)表达载体上,构建了CSsr1原核表达载体（图1），将该表达载体转化大肠杆菌BL21中，进行了CSsr1基因的体外重组表达，获得了重组表达产物，重组表达产物经过GE公司His-tag亲和层析柱纯化后，获得了纯化的CSsr1重组蛋白，重组蛋白分子量为35kD左右（图2）。实现上述目标的具体方案如下：

1、CSsr1重组表达载体的构建方法：

对PET-32a(+)载体序列和CSsr1基因ORF区序列进行酶切位点分析，并设计带酶切位点特异引物PET-32-CSsr1S和PET-32-CSsr1A，序列如下：(PET-32-CSsr1S:GGCGATATCATGTCTGGCATTGCTCTTAGC,PET-32-CSsr1A:CGGGAATTCTGTGGGAGCAAACTTCTTGG)

上游5′端含EcoRV酶切位点，下游3′端含EcoRI酶切位点。以精巢cDNA为模板进行PCR反应，扩增CSsr1编码区。将PCR产物纯化后与克隆载体pMD18-T连接，将阳性克隆进行测序。将测序正确的克隆质粒与PET-32a（+）同时用EcoRI和EcoRV进行双酶切，琼脂糖电泳回收CSsr1片段与表达载体质粒，按照连接酶说明书，用T4 DNA连接酶连接，构建重组表达质粒PET-32a-CSsr1，转化大肠杆菌TOP10感受态，将检测阳性克隆进行测序，测序正确的克隆提取质粒。再将PET-32a-CSsr1质粒转化表达感受态BL21(DE3)细菌,同时添加30%甘油到2-3毫升感受态细菌菌种中于-80℃冷冻保存作为保种菌。

2、重组蛋白的诱导表达与表达产物的分析

取5μl保种菌加入到1mL新鲜的LB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃，200r/min过夜培养，将过夜培养的细菌1%接种到10mL新鲜的LB培养基中（含100μg/mL氨苄青霉素），37℃，250r/min培养至OD600达到0.6时，在对照组（PET-32a）和实验组（PET-32a-CSsr1）菌液中加入IPTG诱导，使IPTG终浓度为1mmol/L，28℃，200r/min继续培养,培养2h，4h，6h各取样1mL，将采集的样本在4℃，12000r/min条件下离心5min，收集菌体用200μL的PBS缓冲液（NaCl137mmol/L，KCl2.7mmol/L，Na₂HPO₄ 10mmol/L，KH₂PO₄ 2mmol/L）洗三次，每次漂洗后12000r/min离心2min，洗涤后样品加入100μL Laemmli上样缓冲液（63mmol/L pH6.8Tris-HCl,0.0025%溴酚蓝，2.5%β-巯基乙醇,2%SDS,10%甘油）处理，沸水浴5min裂解菌体，收集裂解菌液样品进行12%SDS-PAGE电泳检测，发现在CSsr1重组表达载体pet-32-CSsr1经IPTG诱导后的菌体蛋白中有1条分子量为35kD的蛋白带（图2A），而空载体pet-32a对照组中则无此条蛋白带（图2A）。

3.重组蛋白的分离纯化

将上述保种菌在37℃条件下大量（250mL）培养至菌体密度达到OD600为0.6，加入IPTG终浓度为1mmol/L28℃诱导6h后，4℃12000r/min离心5min收集菌体，按照1g湿菌体/20mL裂解缓冲液（20mM/L Na₃PO4，0.5M NaCl，20mM/L咪唑,DNaseI 10μ,200μL 50mM/L,200μl 10mg/L溶菌酶）的比例重悬菌体，加入1mM苯甲基磺酰氟化物（PMSF）后在冰浴条件下超声破碎，4℃，12000r/min离心10min收集上清,将上清用0.45μL的过滤器过滤，将过滤的上清收集备用。应用His Trap HP（GE公司）亲和层析柱进行分离纯化，具体操作如下：

首先，用5mL蒸馏水洗1mL柱子一次，随后5ml结合缓冲液（20mM/L Na₃PO4，0.5M NaCl，20mM/L咪唑）洗柱子，再将收集的预处理的上清过柱子，流速为1-2mL/min，用5mL结合缓冲液洗柱子，再用5mL的洗脱缓冲液（20mM/L Na₃PO₄，0.5M NaCl，500mM/L咪唑）洗脱一次，最后用5mL的结合缓冲液再生柱子。收集经过亲和层析后纯化的重组蛋白样品进行12% SDS-PAGE电泳检测，观察到重组蛋白分子量为35kD左右（图2B）。

4.蛋白浓度测定

采用北京天根生化科技有限公司的BCA蛋白定量试剂盒对纯化后的蛋白进行定量分析，具体操作按照说明书进行。

四、半滑舌鳎CSsr1重组表达产物生物活性的测定及其应用

将CSsr1重组表达纯化产物注射到1年龄半滑舌鳎雌鱼卵巢，检测了重组CSsr1蛋白对性腺FST基因和雌性相关基因（P450,Foxl2和CTNNB1）表达水平的影响，发现注射CSsr1重组表达产物后，0-48h内，FST基因表达上调，48h表达最高，随后逐渐下降，至96小时，恢复到正常水平（表4）。

表4：注射CSsr1蛋白后半滑舌鳎卵巢中FST基因不同时间的表达分析；

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

与此相反，雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达水平均为先下降后升高，其最低表达时间分别为12h、12h和48h（表5，表6，表7）。

表5：注射CSsr1蛋白后半滑舌鳎卵巢中P450基因不同时间的表达分析；

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

表6：注射CSsr1蛋白后半滑舌鳎卵巢中Foxl2基因不同时间的表达分析；

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

表7：注射CSsr1蛋白后半滑舌鳎卵巢中CTNNB1基因不同时间的表达分析。

备注：不同字母表达差异显著（p<0.05）,相同字母表达差异不显著（p>0.05）

具体检测方法如下：实现上述目标的具体方案为：

1.脂质体(DC-CHOL/DOPE)制备参照Zhang等（2010），将目的蛋白与脂质体按照每100ul脂质体包裹50ug重组蛋白制备成重组蛋白混合液。

2.取一龄半滑舌鳎雌鱼39尾，21尾鱼注射重组CSsr1蛋白（150μl），另18尾注射失活重组CSsr1蛋白（沸水浴5min,150μl）作为对照组。实验组与对照组分别在注射后6h，12h，24h，36h，48h，72h，96h取性腺迅速投入液氮中，随后转入-80℃保存备用，每个组每个时间点采样3尾。根据NCBI中报道的半滑舌鳎性别相关基因FST（JF423304.1）、P450（EF134716.1）、Foxl2（GQ402462）和CTNNB1（未公布）序列设计定量PCR引物，各引物序列如下：

FST-S：GCACTCGTCCCTGCTCATTC，

FST-A：AGGAGGAAGAACTTGGGATTTGT；

P450-S：TGAGACACCAACTCCACCCG，

P450-A：GGTGAGGATGTGACCCAGTGT；

Foxl2-S：TGGTTGGAAGTGCGTGGG，

Foxl2-A：GAGAGGAAGGGCAACTACTGGA；

CTNNB1-S：TCTGTCAGGTTGGCGGTATTG，

CTNNB1-A:ATAATGCAGTCTCACGGCGTT.

对注射重组蛋白后的性腺实时定量PCR检测各基因表达变化。用SPSS17统计软件进行显著性差异分析,将各基因不同时间表达量进行单因素ANVOA,DUNCAN检验。

结果表明，本发明的CSsr1基因与半滑舌鳎性逆转密切相关，其体外重组蛋白能够明显升高卵泡抑素FST基因的表达水平，并在短期内抑制雌性相关基因P450,Foxl2和CTNNB1的表达，抑制CSsr1基因的表达可能降低半滑舌鳎性逆转比例，因此，在半滑舌鳎性别控制中具有应用潜力。

Claims (5)

1.一种半滑舌鳎性别相关蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.一种半滑舌鳎性别相关蛋白的基因，所述的基因用于编码权利要求1所述的半滑舌鳎性别相关蛋白。

3.如权利要求2所述的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。

4.一种重组质粒，所述的重组质粒用于表达权利要求1所述的蛋白。

5.权利要求1所述的半滑舌鳎性别相关蛋白在半滑舌鳎性别控制中的应用。

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