CN101240348A - 半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，包括半滑舌鳎DNA快速提取、LAMP特异引物的设计与合成、LAMP反应体系的建立、LAMP反应产物的检测及遗传性别的鉴定。利用半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，设计特异引物，在恒温条件下进行短时间的核酸扩增，遗传上的雌性个体产生特异的DNA片段，而雄性个体则不产生这样的DNA扩增产物。本发明首次建立了快速检测半滑舌鳎遗传性别的LAMP方法，可在养殖场现场使用，测定操作可在2.5h内完成。有先进、快速、特异、准确、灵敏、简便以及无需大型仪器设备等特点，为鱼类性别检测和控制开辟了新的技术途径，在半滑舌鳎性别控制和单性苗种生产中具有重要应用价值，同时在其它鱼类遗传性别鉴定和性别控制研究中也具有广阔应用前景。
Description
技术领域
本发明属于水产生物技术领域中的鱼类遗传性别鉴定技术，具体涉及一种半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法。适用于在鱼类性别控制和单性育种中应用的分子生物学方法。
背景技术
半滑舌鳎(Cynoglossus semiliaevis)是我国特有的一种名贵经济海水鱼类，属于近海温水性底层鱼类，我国沿海均有分布，以黄海、渤海为多。半滑舌鳎由于其味道鲜美，肉质细嫩，营养丰富，深受广大消费者欢迎，其市场价值极高，养殖前景非常广阔。近两年来，半滑舌鳎人工育苗技术获得突破，年产半滑舌鳎苗种300～500万尾，研究表明，半滑舌鳎雌性个体和雄性个体，在生长速率上存在巨大差别，其雌性个体比雄性个体生长快3～4倍(中国水产科学研究院黄海水产研究所，孟田湘等，1988；中国水产科学研究院黄海水产研究所，柳学周等，2006)。由于雄性个体生长过慢，降低了半滑舌鳎的养殖产量，增加了养殖成本，因而严重影响了半滑舌鳎苗种的推广及养殖产业的形成，由于缺乏鉴定半滑舌鳎遗传性别的有效手段，缺乏半滑舌鳎人工雌核发育和性别控制技术，难以生产半滑舌鳎全雌或高雌性化率的苗种，严重影响了半滑舌鳎养殖业的发展。
有关鱼类性别鉴定方法的研究，目前只是在少数几种鱼类上进行过。加拿大西温哥华实验室的Devlin(1994)找到了大鳞大马哈鱼Y染色体特异的DNA片段；英国的Griffiths等(2000)在三椎棘鱼(Gasterosteus aculeatus L.)中找到了两个雄性特异的AFLP标记，但是，当应用于另外两种棘鱼时，却不能正确的鉴定其性别。英国的Ezaz等(2004)用AFLP技术扫描尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus L.)基因组，找到3个Y染色体连锁和一个X染色体连锁的AFLP标记，然而这些标记却不能鉴别没有亲缘关系的个体的性别，表明这些标记和性别决定位点之间发生了重组。日本的Watanabe等(2005)利用AFLP技术，应用EcoRI和MseI限制性内切酶消化孔雀鱼(Poecilia reticulata)的基因组DNA，筛选了32组引物组合，最后找到5个与性别决定位点相连锁的标记。后来他们又采了48个样品对这几个标记进行验证，发现性别表型和基因型之间并非完全一致，其中A2-218标记在性别表型和基因型之间的一致性达到90％，是与性别联系比较紧密的1个标记。
由于半滑舌鳎雌性个体生长比雄性个体快3～4倍，培育全雌半滑舌鳎苗种对于半滑舌鳎养殖产业的发展非常重要，因此有关半滑舌鳎性别特异分子标记筛选等方面的研究也引起人们高度重视。黄海水产研究所周丽青等(2005)观察到半滑舌鳎雌性个体存在W性染色体；Chen et al.(2007)首次发现半滑舌鳎雌性特异AFLP标记。但有关鱼类遗传性别快速鉴定方法，特别是采用LAMP原理进行的鱼类遗传性别快速鉴定方法，目前国内外均未见报道。
由于半滑舌鳎苗种生产量大，需要进行遗传性别鉴定的数量多，因而建立一种能在育苗场现场使用的半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，能在2～3小时内迅速鉴定出半滑舌鳎的遗传性别，可以避免对半滑舌鳎单个个体进行荧光标记的麻烦，由于荧光标记操作会导致部分鱼死亡，而快速鉴定方法只是采用物理隔离方法将待鉴定鱼进行短暂隔离，剪取一点鳍条，无需对待鉴定鱼进行荧光标记，因而不会对鱼体造成伤害，可以保证待鉴定鱼100％的成活率。因此，遗传性别快速鉴定方法在半滑舌鳎等鱼类性别控制和单性苗种产业化培育方面将具有巨大的应用价值和推广前景。
发明内容
本申请的发明目的，是研究能在育苗场现场使用的一种半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法。为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径。
实施本发明的技术方案，包括以下三个步骤：
1)半滑舌鳎鳍条DNA的快速提取；
2)特异引物的设计与合成；
3)LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)方法建立及遗传性别检测。
其中，
所述的半滑舌鳎鳍条DNA的快速提取，包括
①剪取半滑舌鳎成鱼个体鳍条，保存于无水乙醇中；
②从步骤①无水乙醇中取出鳍条，另放入新鲜的无水乙醇中，在95℃～100℃水浴中处理，去除乙醇，得到处理后的鳍条；
③向步骤②处理后的鳍条，加入1M NaOH，在95℃～100℃水浴中处理，得到均一的透明溶液；
④向步骤③得到的溶液中，加入1M pH值为8.0的Tris-HCl和1M HCl，混匀，12000rpm离心，取上清液作为半滑舌鳎DNA模板备用。
所述的特异引物的设计与合成，包括
根据半滑舌鳎雌性特异标记序列，设计了六条特异引物，共识别该序列的8个位点，所用的引物序列如下：
BIP 5-GTCCTAAGTAAACTGAACCTGGAGTCTTTTACATCAACGTTCTTATATGCCAA
CAG-3
FIP 5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3
B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3
F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3
LP1 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3
LP2 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3
这些特异引物在半滑舌鳎雌性特异DNA序列中的位置如下：
B3 B2
CCGCTTCAAT CCGTCAAGCG ACTCAGGTCA CGTTTGTAGT TGCAAGAATA TACGGTTGTC
61 ACTTTAGAAG CCAAGAATTA TGTGTCATAT TTGTTTTGAC TCCAGGTTCA GTTTACTTAG
LP1 F1 B1
CTGTTTGAGT CCCTAAACTT TACTGCTCGT TGTAGAATAG cGGAGTTCAc GTGTACCCAT
LP2
F2
241 GGCCGAGACT AGTTTTACAA TGATGGTGCC ACAAAAAAAG AAAGGGAAAC TCTATGAGTG
F3
301 GACACAGACT GAGA
CTGTGTCTGA CTCT
其中，引物RTP为图1序列图中的B1和B2序列连接而成，引物FTP为序列图中的F1和F2序列连接而成。
所述的LAMP反应和检测，包括
采用LAMP原理，利用本实验室筛选到的半滑舌鳎雌性特异标记的序列，设计特异引物，在恒温条件下进行30～60min的核酸扩增，扩增出雌性特异的DNA片段；具体是取DNA模版，99℃变性，快速冰浴，作为LAMP反应DNA模板；
LAMP反应体系为12.5～25μl，包含：
pH值为8.8的Tris-HCl 20mM；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；2mM MgSO4；0.5mM MgCl2；0.6M甜菜碱；0.1％吐温X-100；0.2μM引物F3；0.2μM引物B3；0.8μM引物FTP；0.8μM引物BIP；0.4μM引物LP1；0.4μM引物LP2；0.5mM dNTP，4单位Bst DNA聚合酶和1μl LAMP反应模板，然后置于65℃温浴1h；
所述的LAMP产物检测是指取LAMP反应产物，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察并记录扩增出的雌性特异DNA片段，能扩增出特异DNA片段的为遗传上的雌性个体，不能扩增出DNA片段的为遗传上的雄性个体。
本发明的学术思路就是采用LAMP(Loop-mediated isothermal amplification，环介导等温扩增)原理[Notomi et al，2000]，利用本实验室筛选到的半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，设计特异引物，在恒温条件下进行短时间(30～60min)的核酸扩增，遗传上的雌性个体产生特异的DNA片段，而遗传上的雄性个体则不产生这样的DNA扩增产物。
本发明的方法是：根据筛选到的半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列设计6对特异引物，让其识别特异DNA片段的8个位点，然后利用Bst DNA聚合酶的链置换活性，在恒温水浴中进行DNA的恒温扩增，扩增45min后，用EB(Ethidium bromide，溴化乙锭)染色，在紫外灯下观察，如果是雌性个体，就会出现弥散的DNA条带，而雄性个体则不会扩增出特异DNA条带。同时，我们建立了从半滑舌鳎鳍条中快速提取DNA的方法，可以在2.5～3.5h内完成96个个体的遗传性别检测。
本发明与已有技术对比，其特点是：
本发明是利用LAMP原理，首先获得半滑舌鳎雌性特异DNA序列，根据特异DNA片度的序列，设计特异引物6对，将这些引物与快速提取的DNA模板在Bst DNA聚合酶(Bst DNAPolymerase)的作用下，在恒温状态进行快速扩增，从雌性个体中能够扩增出DNA条带，在电泳时形成弥散状的条带；而雄性个体则不产生DNA条带，从而快速鉴定出遗传上的雌性和雄性。整个测定操作可以在2.5h内完成，因而具有快速、特异、准确、灵敏、简便以及不需要大型仪器设备等特点，可以在养殖公司现场进行检测，为鱼类性别控制和单性育种开辟了新的技术途径，除可以在半滑舌鳎养殖场推广应用外，还可以在其它养殖鱼类上推广应用。本发明的技术方案，目前在国内外未见任何文献和专利报道。
根据克隆出的半滑舌鳎雌性特异分子标记的序列，设计特异引物，建立半滑舌鳎遗传性别快速鉴定技术，这对于生产半滑舌鳎全雌苗种，进行全雌苗种养殖，提高半滑舌鳎的养殖产量，提高养殖的经济效益，真正将半滑舌鳎开发为一个被广大养殖户接受的优良养殖品种，推动半滑舌鳎养殖产业的发展及海水鱼类养殖品种的更新换代，具有重要的现实意义和重大的应用价值，推广后必将产生巨大的经济效益和社会效益。
附图说明
图1半滑舌鳎雌性特异DNA片段的核苷酸序列及引物位点的序列图；
图2快速提取半滑舌鳎鳍条DNA应用于LAMP分析的琼脂糖凝胶电泳照片；
图3LAMP反应时间筛选的琼脂糖凝胶电泳照片；
图4LAMP反应特异性检测的琼脂糖凝胶电泳照片；
图5LAMP方法在半滑舌鳎遗传性别鉴定上应用的照片。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明作进一步阐述。
图1中显示，根据半滑舌鳎雌性特异标记序列，设计了六条特异引物，在图1中注明了该特异序列及其引物的位置。
图1中左侧序号表示序列位置，B1、B2、B3、LP1、LP2、F1、F2、F3分别表示所用的6条引物所识别的8个位点，所用的6个引物序列如下：
引物BIP：5-GTCCTAAGTAAACTGAACCTGGAGTCTTTTACATCAACGTTCTTATATGCCAACAG-3
引物FIP：5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3
引物B3：5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3
引物F3：5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3
引物LP1：5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3
引物LP2：5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3
其中，引物BIP为图1中的B1和B2连接而成，引物FIP为图1中的F1和F2连接而成。
图2中显示，快速提取DNA应用于LAMP分析的可行性；
取3个个体的鳍条进行DNA的快速提取，其模板DNA应用于LAMP分析的可行性如图2所示。1～3号泳道为加入快速提取的DNA模板溶液8μL，而4～6号为加入DNA模板溶液1μL，7号为普通高盐法所提取雌性DNA作为对照。结果说明：快速提取的DNA溶液的用量对扩增结果有明显影响，当用量为1μL时，可以扩增出雌性特异DNA片段，如4～6号；而当用量过大时(如8μL)时，反而扩增不出DNA片段，如1～3号。
图3中显示，LAMP反应时间的确定
横向数字10-90：代表雌性个体DNA模板进行LAMP反应的时间，分别为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min；♂表示雄性个体，其LAMP反应时间为60分钟。结果说明：雌性个体DNA模板进行LAMP反应30-90min，都能扩增出雌性特异DNA片段，其中50～80分钟的扩增产物最多；而雄性个体，即使LAMP反应时间为60min，仍无反应产物出现。
图4中显示，LAMP反应特异性分析
1～3号为3个雌性个体的LAMP结果，都有DNA扩增产物产生；而4～6号为3个雄性个体的LAMP结果，均没有DNA扩增产物出现；M为DNA分子量标准。结果说明：雌性个体都能扩增出DNA产物，而雄性个体则不产生扩增产物，本发明方法的特异性好。
图5中显示，LAMP方法在半滑舌鳎遗传性别鉴定上的应用结果
A图中，1～11为11个雄性个体，M为分子量标准，♀表示雌性个体；
B图中，M为分子量标准，1～15为15个雌性个体。
结果表明，在11个雄性个体中均没有扩增出DNA片段，而在15个雌性个体中都扩增出特异DNA片段，证明该方法可以用于半滑舌鳎遗传性别的快速鉴定。
实施例下面通过“半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法”为例，结合附图对本发明的技术内容进行详细阐述：
本方法包括三个方面：一、半滑舌鳎DNA的快速提取；二、特异引物的设计与合成；三、LAMP方法建立与遗传性别鉴定。
一、半滑舌鳎非损伤性DNA的快速提取；
剪取体长在6-8厘米以上半滑舌鳎鱼的鳍条，保存于无水乙醇中。取一小块鳍条(0.1-0.3mm2)，置于无水乙醇中，在95～100℃水浴中处理2～3min，去除乙醇，加入200μL 1M NaOH，95～100℃水浴中处理5min，然后加入200μL 1M Tris-HCl(pH 8.0)和175μL 1M HCl，混匀，12000rpm离心2min，取上清液作为DNA模板，用于后面的LAMP反应。通过实验，筛选到适宜的DNA模板溶液量，结果表明当雌性个体的DNA模板溶液量为8μL时(图2中，1～3号泳道)，没有扩增出特异DNA产物，而当雌性个体的DNA模板溶液量为1μL时，扩增出特异DNA产物(图2中，4～6号泳道)，与常规普通高盐法所提取雌性DNA的效果相当(图2中，7号泳道)。
二、特异引物的设计与合成；
根据半滑舌鳎雌性特异标记序列，设计了六条特异引物，共识别该序列的8个位点，所用的引物序列如下：
BIP 5-GTCCTAAGTAAACTGAACCTGGAGTCTTTTACATCAACGTTCTTATATGCCAACAG-3
FIP 5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3
B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3
F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3
LP1 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3
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半滑舌鳎雌性特异DNA片段及引物位置如图1所示。图中，左侧序号表示序列位置，图中标有下划线的序列为引物位置，箭头表示引物扩增的方向。引物BIP为B1和B2序列连接而成，引物FIP为F1和F2序列连接而成。
三、LAMP方法建立与遗传性别鉴定。
1.LAMP反应体系的建立与反应产物分析：取模版DNA溶液10μl，在99℃变性10min，快速冰浴，作为变性模板DNA溶液待用。在12.5-25μl扩增反应体系中，包含：20mM Tris-HCl(pH 8.8)，10mM KCl，10mM(NH4)2SO4，2mM MgSO4，0.5mM MgCl2，0.6M甜菜碱，0.1％吐温X-100，0.2μM引物F3，0.2μM引物B3，0.8μM引物FIP，0.8μM引物BIP，0.4μM引物LP1，0.4μM引物LP2，0.5mM dNTP，4单位Bst DNA聚合酶和1μl变性模板DNA溶液。然后置于65℃温浴1h。LAMP反应产物分析：取10μl LAMP产物，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外灯下观察，具有DNA扩增条带的为遗传上的雌性个体，没有扩增产物的为遗传上的雄性个体。
2.LAMP反应时间的确定
选取实验室保存并且已知性别的半滑舌鳎DNA，雌雄个体各一个，浓度为100ng/μL。将雌性个体LAMP反应时间分别设置为10min、20min、30min、40min、50min、60min、70min、80min、90min(图3)，雄性个体LAMP反应时间为60分钟，然后对LAMP产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。通过图3，我们可以发现，在雌性个体，LAMP反应在30～90min时都可以扩增出DNA产物，达到检测水平，其中50～80分钟的扩增产物最多，效果最好。而雄性对照个体在60min后仍然没有扩增产物。图3中的10～90分别表示LAMP反应时间min，♂表示雄性个体阴性对照。
3.LAMP反应特异性分析；
选取已知生理性别的半滑舌鳎DNA样品，雄性3个个体，雌性3个个体，浓度为50-150ng/μL，对其进行LAMP分析，检测LAMP的特异性，结果如图4所示。图4中3个雌性个体都扩增出了预期产物，而雄性个体中却没有。证明了我们设计的引物组合及筛选出的LAMP条件，可以有效鉴定半滑舌鳎的遗传性别，其特异性强。
4、LAMP方法在半滑舌鳎遗传性别鉴定上的应用
我们用LAMP方法检测26个已知性别的个体，其中雌性个体为15个，都有特异扩增产物出现，而在11个雄性个体中没有产生扩增产物，如图5所示。
由此表明本发明建立的方法可以用于半滑舌鳎遗传性别的规模化检测，可以用于半滑舌鳎性别控制和全雌苗种生产。
图5A中1～11号为11个不同雄性个体的LAMP结果，M为DNA分子量标记，♀表示雌性个体阳性对照。
图5B中的1～15号为15个不同雌性个体的LAMP结果，M为DNA分子量标记。
序列表
Claims (3)
1.一种半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，其特征是包括以下步骤：
1)半滑舌鳎DNA的快速提取；
2)特异引物的设计与合成；
3)LAMP方法建立及遗传性别检测。
2.按照权利要求1所述的半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，其特征是所述的半滑舌鳎DNA的快速提取，包括，
①剪取半滑舌鳎成鱼个体鳍条，保存于无水乙醇中；
②从步骤①无水乙醇中取出鳍条，另放入新鲜的无水乙醇中，在95℃～100℃水浴中处理，去除乙醇，得到处理后的鳍条；
③向步骤②处理后的鳍条，加入1M NaOH，在95℃～100℃水浴中处理，得到均一的透明溶液；
④向步骤③得到的溶液中，加入1M pH值为8.0的Tris-HCl和1M HCl，混匀，12000rpm离心，取上清液作为半滑舌鳎DNA模板备用。
3.按照权利要求1所述的半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，其特征是所述的特异引物的设计与合成，包括，
根据半滑舌鳎雌性特异标记序列，设计了六条特异引物，共识别该序列的8个位点，所用的引物序列如下：
BIP 5-GTCCTAAGTAAACTGAACCTGGAGTCTTTTACATCAACGTTCTTATATGCCAA
CAG-3
FIP 5-GAGCAACATCTTATCGCCTCAAGTTTTTAACCCACTGTGTCACCTGAGA-3
B3 5-AAGTTAGGCAGTTCGCTGAG-3
F3 5-CACCATCATTGTAAAACTAGTCTCG-3
LP1 5-AACAAATATGACACATAATTCTTGGCTTCT-3
LP2 5-CCAGGGCTGGAGAAAGCAG-3
这些特异引物在半滑舌鳎雌性特异DNA序列中的位置如下：
B3 B2
CCGCTTCAAT CCGTCAAGCG ACTCAGGTCA CGTTTGTAGT TGCAAGAATA TACGGTTGTC
61 ACTTTAGAAG CCAAGAATTA TGTGTCATAT TTGTTTTGAC TCCAGGTTCA GTrrACTTAG
LP1 F1 B1
CTGTTTGAGT CCCTAAACTT TACTGCTCGT TGTAGAATAG CGGAGTTCAc GTGTACCCAT
LP2
F2
241 GGCCGAGACT AGTTTTACAA TGATGGTGCC ACAAAAAAAG AAAGGGAAAC TCTATGAGTG
F3
301 GACACAGACT GAGA
CTGTGTCTGA CTCT
其中，引物BTP为序列图中的B1和B2序列连接而成，引物FIP为序列图中的F1和F2序列连接而成。
4.按照权利要求1所述的半滑舌鳎遗传性别快速鉴定方法，其特征是所述的LAMP反应和检测，包括，
采用LAMP原理，利用本实验室筛选到的半滑舌鳎雌性特异标记的序列，设计特异引物，在恒温条件下进行30～60min的核酸扩增，扩增出雌性特异的DNA片段；具体是取DNA模版，99℃变性，快速冰浴，作为LAMP反应模板；
LAMP反应体系为12.5～25μl，包含：
pH值为8.8的Tris-HCl 20mM；10mM KCl；10mM(NH4)2SO4；2mM MgSO4；0.5mM MgCl2；0.6M甜菜碱；0.1％吐温X-100；0.2μM引物F3；0.2μM引物B3；0.8μM引物FIP；0.8μM引物BIP；0.4μM引物LP1；0.4μM引物LP2；0.5mM dNTP，4单位Bst DNA聚合酶和1μl LAMP反应模板，然后置于65℃温浴1h；
所述的LAMP产物检测是指取LAMP反应产物，经1.0％琼脂糖凝胶电泳，EB染色，观察并记录扩增出的雌性特异DNA片段，能扩增出特异DNA片段的为遗传上的雌性个体，不能扩增出DNA片段的为遗传上的雄性个体。
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