CN108077120A - 一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及小黄鱼育种技术领域，具体涉及一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，将孵化13～15日性腺未分化的小黄鱼稚苗置于含有1～10µg/L的低浓度雌激素的海水中浸浴，每天浸浴2小时，并连续浸浴60天，可选用的雌激素为雌酮、大豆异黄酮、雌二醇、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮，可使小黄鱼群体全部雌化，其中雌二醇效果更加明显，1µg/L雌二醇可使小黄鱼群体96.6%雌化，10µg/L雌二醇可使小黄鱼群体100%雌化，诱导率高，可操作性强，不受自然环境限制，可为小黄鱼大规模人工繁育提供雌性亲鱼保障，为小黄鱼性别控制及单性育种研究开辟技术途径，也是解决小黄鱼野生群体雌性偏少的一种途径。
Description
技术领域
本发明涉及小黄鱼育种技术领域，具体涉及一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法。
背景技术
小黄鱼（Larimichthys polyactis）是我国“四大海产”中的重要经济鱼类。由于过度捕捞、环境污染和气候环境变化等原因，捕获的小黄鱼表现出个体日趋小型化现象，种质资源退化相当严重，小黄鱼捕捞量急剧下降，已经无法满足人们的消费需求。在对黄海南部小黄鱼渔获群体结构与繁殖特征的初步研究中发现，小黄鱼自然群体出现雌雄比例大约在1:3的现象，且发现小黄鱼性成熟年龄较早，一般为1龄。浙江省海洋水产研究所在2015年实现了人工繁殖小黄鱼的重大突破。但是随着小黄鱼人工繁育取得成功，人工养殖试验过程中逐渐暴露出诸多问题，其中雌雄性别比例不平衡、雄性比例偏多且略高于自然群体调查结果。而鱼类的性别分化受到遗传与环境双重因素的影响，在1年龄性成熟小黄鱼繁育过程中雌性亲鱼数量偏少将对大规模人工繁育小黄鱼后代带来不利影响。因此如何提高小黄鱼群体中雌性亲鱼的数量对人工繁殖小黄鱼技术的发展具有重要影响。而现在还未见提高小黄鱼群体中雌性亲鱼比例的研究报道。
发明内容
针对人工繁殖小黄鱼群体中雌性亲鱼比例偏低的问题，本发明的目的在于提供一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，对性腺未分化的小黄鱼进行诱导雌化，获得高比例的雌性小黄鱼，提高雌性小黄鱼在群体中的数量比例，具有诱导率高，可操作性强，不受自然环境限制等优点，为小黄鱼大规模人工繁育提供雌性亲鱼保障。
本发明提供如下的技术方案：
一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取定量的雌激素溶解于95%乙醇溶液中得到雌激素溶液；
（2）在容积500L的养殖缸中加入350～450L的海水，并向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将300～500尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中；
（4）向养殖缸中加入雌激素溶液至雌激素在海水的浓度为1～30µg/L，保持小黄鱼稚苗在含有雌激素的海水中浸浴2小时；
（5）通过流动的海水更换养殖缸中的海水至流出的海水中无雌激素检出；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续60～65天。
作为本发明方法的一种改进，所用雌激素为雌酮、大豆异黄酮、雌二醇、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮中的一种或者多种。
作为本发明方法的一种改进，所用雌激素为雌二醇。
作为本发明方法的一种改进，雌激素在海水中的浓度为1～10µg/L。
作为本发明方法的一种改进，雌激素在海水中的浓度为1µg/L。
作为本发明方法的一种改进，雌激素在海水中的浓度为10µg/L。
作为本发明方法的一种改进，所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后13～15日龄的小黄鱼稚苗。
作为本发明方法的一种改进，每天重复步骤（4）和步骤（5）操作一次并持续60天。
作为本发明方法的一种改进，养殖缸中的海水温度18～28℃，海水盐度28‰～31‰。
作为本发明方法的一种改进，雌化方法适用于性腺未分化的大黄鱼和黄姑鱼的雌化。
本发明的性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，将小黄鱼置于添加有低浓度雌激素的海水中浸浴。首先与直接投食相比，低浓度雌激素浸浴更加温和，对小黄鱼稚苗器官尤其是消化器官的刺激小，通过每天重复浸浴连续缓慢影响小黄鱼性腺的发育和分化，效果更加持久且不可逆。选用的雌激素为雌酮、大豆异黄酮、雌二醇、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮中的一种或者多种，其中雌酮、雌二醇和雌三醇为天然动物雌激素，大豆异黄酮、豆雌酚和金雀异黄酮为天然植物雌激素，安全性能高，控制合适的浓度范围不会对小黄鱼造成伤害，而且通过研究发现，上述雌激素尤其是雌二醇诱导小黄鱼雌化的效果明显，当雌二醇浓度达到1µg/L时可使小黄鱼群体雌化率达到96.6%，当雌二醇浓度达到10µg/L及以上时可使小黄鱼群体雌化率达到100%。但过高的雌激素浓度则在诱导小黄鱼性腺组织雌化的同时引起小黄鱼性腺的畸形发育以及个体短小，当雌二醇浓度达到50µg/L时这种消极的畸形雌化现象表现极为明显，因此雌激素的浓度不易过高。雌化选用孵化13～15日龄的小黄鱼稚苗，此时小黄鱼的组织处于快速发育阶段，可塑性好，日龄过小雌激素容易引起小黄鱼稚苗不适，日龄过大时导致小黄鱼已出现性腺的分化，最适宜的日龄为15日。另外由于大黄鱼、黄姑鱼和小黄鱼均属于石首鱼科，性状相近，本发明的诱导性腺未分化的小黄鱼雌化的方法也适用于大黄鱼和黄姑鱼的雌化，但应选用性腺未分化的大黄鱼和黄姑鱼的稚苗。本发明的小黄鱼诱导雌化方法可使性腺未分化的小黄鱼群体全部雌化，是一种经济高效获得小黄鱼全雌化群体的方法。
本发明的有益效果如下：
本发明的方法利用雌激素尤其是雌二醇诱导小黄鱼未分化性腺发育为卵巢，可实现性腺未分化小黄鱼群体的全部雌化，为小黄鱼性别决定与分化提供了良好的研究模型，可以获得高比例的雌性小黄鱼，提高雌性小黄鱼在群体中的数量比例，具有诱导率高，可操作性强，不受自然环境限制等优点，可以为小黄鱼大规模人工繁育提供雌性亲鱼保障，为小黄鱼性别控制及单性育种研究开辟技术途径，也是解决小黄鱼野生群体雌性偏少的问题的一种途径。
附图说明
图1是小黄鱼解剖示图。
图2是小黄鱼的性腺组织切片示图。
图中：E2-1表示1µg/L雌二醇浸浴组小黄鱼性腺情况；E2-10表示10µg/L雌二醇浸浴组小黄鱼性腺情况；Testis表示对照组中雄性小黄鱼性腺情况；Ovary表示对照组中雌性小黄鱼性腺情况。
具体实施方式
下面就本发明的具体实施方式作进一步说明。
如无特别说明，本发明中所采用的原料均可从市场上购得或是本领域常用的，如无特别说明，下述实施例中的方法均为本领域的常规方法。
实施例1
一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取雌二醇0.25g溶解与95%乙醇溶液中得到浓度1mg/ml的雌二醇溶液；
（2）在容积500L的养殖缸中加入350L的海水，海水温度为18℃，海水盐度为28‰，然后向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将300尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中，其中所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后13日龄的小黄鱼稚苗；
（4）向养殖缸中加入0.35mL的雌二醇溶液使雌二醇在海水的浓度为1µg/L，保持小黄鱼稚苗在含有雌二醇的海水中浸浴2小时；
（5）通过流动的海水更换养殖缸中的海水至流出的海水中无雌二醇检出；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续60天。
实施例2
一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取雌二醇0.25g溶解与95%乙醇溶液中得到浓度1mg/ml的雌二醇溶液；
（2）在容积500L的养殖缸中加入400L的海水，海水温度为23℃，海水盐度为30‰，然后向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将400尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中，其中所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后15日龄的小黄鱼稚苗；
（4）向养殖缸中加入4mL雌二醇溶液使雌二醇在海水的浓度为10µg/L，保持小黄鱼稚苗在含有雌二醇的海水中浸浴2小时；
（5）通过流动的海水更换养殖缸中的海水至流出的海水中无雌二醇检出；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续60天。
实施例3
一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取雌二醇0.25g溶解与95%乙醇溶液中得到浓度1mg/ml的雌二醇溶液；
（2）在容积500L的养殖缸中加入450L的海水，海水温度为28℃，海水盐度为31‰，然后向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将500尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中，其中所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后14日龄的小黄鱼稚苗；
（4）向养殖缸中加入10.5mL雌二醇溶液使雌二醇在海水的浓度为30µg/L，保持小黄鱼稚苗在含有雌二醇的海水中浸浴2小时；
（5）通过流动的海水更换养殖缸中的海水至流出的海水中无雌二醇检出；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续65天。
对照组
（1）在容积500L的养殖缸中加入400L的海水，海水温度为23℃，海水盐度为30‰，然后向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将400尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中，其中所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后15日龄的小黄鱼稚苗；
（4）向养殖缸加入4mL的95%乙醇溶液，小黄鱼稚苗在海水中浸浴2小时；
（5）按照实施例2中的更换方法通过流动的海水更换养殖缸中的海水；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续90天。
小黄鱼性别的组织学鉴定：
从实施例1、实施例2和对照组浸浴处理的小黄鱼中随机挑选30尾进行解剖，如图1所示。然后取出小黄鱼的性腺，波恩试液固定，石蜡切片，经各级乙醇脱水、二甲苯透明和石蜡包埋，做连续横切5μm切片，H&E染色，光学显微镜下观察其性腺结构。结果如图2所示。其中，实施例1随机挑选的30尾小黄鱼中有29尾小黄鱼的性腺组织中含有大量各级卵母细胞的情况，见图1E2-1和图2E2-1，说明性腺组织已分化为卵巢，即经浓度1μg/L的雌二醇连续60天浸浴2小时后的性腺未分化的小黄鱼群体的雌化率为96.6%；实施例2随机挑选的30尾小黄鱼的性腺组织中均含有大量各级卵母细胞的情况，图1E2-10和图2E2-10，说明性腺组织已分化为卵巢，即经浓度10μg/L的雌二醇连续60天浸浴2小时后的性腺未分化的小黄鱼群体的雌化率为100%，小黄鱼实现全雌化；对照组未经雌二醇浸浴，30尾小黄鱼有8条雌性、22条雄性，雌性与雄性比例为4:11，基本与野生统计结果的1:3相符，其中雌性小黄鱼的性腺中含有大量各级卵母细胞，说明性腺已分化为卵巢，见图1Ovary和图2Ovary；雄性小黄鱼性腺组织中可见性腺充满精原细胞，但仍然未开始减数分裂，发育较为迟缓，见图1 Testis和图2 Testis。
以上结果说明，经过雌二醇溶液浸浴后的小黄鱼稚苗,的雌化率远高于对照组的小黄鱼自然雌化结果。经过1μg/L的雌二醇连续60天浸浴2小时后可使性腺未分化的小黄鱼群体的雌化率达到96.6%，经过10μg/L的雌二醇连续60天浸浴2小时后可使性腺未分化的小黄鱼群体的雌化率达到100%。
需要说明的是，也可选用雌酮、大豆异黄酮、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮中的一种，或者雌酮、大豆异黄酮、雌二醇、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮中两种或两种以上复配替代雌二醇实现诱导性腺未分化的小黄鱼雌化。
由于大黄鱼和黄姑鱼与小黄鱼性状、特点相近，且同属石首鱼科，本发明的雌化方法也适用于性腺未分化的大黄鱼和黄姑鱼的诱导雌化。
Claims (10)
1.一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）称取定量的雌激素溶解于95%乙醇溶液中得到雌激素溶液；
（2）在容积500L的养殖缸中加入350～450L的海水，并向养殖缸中曝气保持氧含量充足；
（3）将300～500尾性腺未分化的小黄鱼稚苗投放在步骤（2）的养殖缸中；
（4）向养殖缸中加入雌激素溶液至雌激素在海水的浓度为1～30µg/L，保持小黄鱼稚苗在含有雌激素的海水中浸浴2小时；
（5）通过流动的海水更换养殖缸中的海水至流出的海水中无雌激素检出；
（6）每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续60～65天。
2.根据权利要求1所述的诱导雌化方法，其特征在于，所用雌激素为雌酮、大豆异黄酮、雌二醇、雌三醇、豆雌酚和金雀异黄酮中的一种或者多种。
3.根据权利要求1或2所述的诱导雌化方法，其特征在于，所用雌激素为雌二醇。
4.根据权利要求1所述的雌化方法，其特征在于，雌激素在海水中的浓度为1～10µg/L。
5.根据权利要求1或4所述的诱导雌化方法，其特征在于，雌激素在海水中的浓度为1µg/L。
6.根据权利要求1或4所述的诱导雌化方法，其特征在于，雌激素在海水中的浓度为10µg/L。
7.根据权利要求1所述的诱导雌化方法，其特征在于，所选用性腺未分化的小黄鱼稚苗为孵化后13～15日龄的小黄鱼稚苗。
8.根据权利要求1所述的诱导雌化方法，其特征在于，每天重复步骤（4）和步骤（5）的操作一次并持续60天。
9.根据权利要要求1所述的诱导雌化方法，其特征在于，养殖缸中的海水温度为18～28℃，海水盐度为28‰～31‰。
10.根据权利要求1所述的诱导雌化方法，其特征在于，所述的诱导雌化方法适用于性腺未分化的大黄鱼和黄姑鱼的诱导雌化。
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