CN115885896A - 一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，其特征在于：选取体长为40‑70mm的鳗鱼苗；间隔一天采用含有染料木黄酮的水体，浸泡所述鳗鱼苗6‑8小时，共浸泡3‑5次；然后对鳗鱼苗进行正常培育，养至第二年性成熟，筛选雌性鳗鱼。该方法实现在短时间内人工诱导鳗鱼雌性化，获得高比例的雌性鳗鱼。
Description
技术领域
本发明具体涉及一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法。
背景技术
鳗鱼，也称鳗鲡，是鳗鲡属(Anguilla)鱼类的统称，在分类学上隶属于硬骨鱼纲(Osteichethyes)、鳗鲡目(Angui，liformes)、鳗鲡科(Anguillidae)。鳗鲡肉质鲜美、营养丰富、经济价值很高。鳗鲡属种类繁多，分布广泛，其主要分布在印度洋及太平洋区域，除少数欧洲鳗鲡(A.anguilla)及美洲鳗鲡(A.rostrata)分布在大西洋。在我国国内的鳗鱼种类主要为日本鳗鲡，分布在长江、闽江、珠江流域、海南岛及江河湖泊中。我国是世界上鳗鱼养殖产量最高的国家，据统计2021年国内鳗鱼养殖产量25.53万吨，比2020年增长1.82％，鳗鱼全产业链年产值超300亿元，在中国水产养殖业中可谓举足轻重。然而，鳗鱼人工繁殖技术虽然取得了显著进展，但是离产业化大规模繁育生产鳗苗的需求还有很大距离，目前养殖所需的苗种全部依靠天然捕捞。因此，开展鳗鱼人工繁殖相关技术研究对保护天然资源和养鳗产业的可持续发展尤为重要。
鳗鱼出生时性别未定，体长超过30厘米后才明确性别。有研究表明，体长在600毫米以上者全为雌性鳗鱼，体长400毫米以下这全为雄性鳗鱼；而且雄性鳗鱼的鱼身和鱼皮容易变硬，通常出货时的重量仅有200至250克(不超过300克)；相较于雄性鳗鱼，雌性鳗鱼成长极限大，即使重量超过300克，也能够保持肉质软嫩地继续成长；换言之，对于养殖业而言，雌性鳗鱼的经济价值更高。然而，在人工养殖环境下，大部分鳗鱼苗会变成雄性鳗鱼，获得雌性鳗鱼的几率却只有10-20％。
在现有技术中，对于人工诱导获得雌性鳗鱼的方法有以下报道：①在玻璃鳗鱼长至小鳗鱼时期，向其投喂添加了17-β)雌二醇的配方饲料；②在玻璃鳗鱼长至小鳗鱼时期，向其投喂添加了大豆异黄酮的配方饲料，如专利CN115052486A。由于上述两种方法都需要长期投喂，因此有以下不足之处：一方面是安全问题，动物雌激素及植物雌激素是一种可导致鱼类生长减缓的物质，长期投喂会导致鱼生长缓慢，甚至死亡，另一方面是环境问题，长期投喂容易造成水体激素污染，对养殖周边水体环境造成影响。
发明内容
本发明目的在于提供一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，实现在人工养殖的环境下获得高比例的雌性鳗鱼。
为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，其特征在于：
选取体长为40-70mm的鳗鱼苗；
间隔一天采用含有染料木黄酮的水体，浸泡所述鳗鱼苗6-8小时，共浸泡3-5次；
然后对鳗鱼苗进行正常培育，养至第二年性成熟，筛选雌性鳗鱼。
发明人经过大量的实验确定，鳗鱼苗在体长40-70mm时期，此时鳗鱼苗体重为90-180mg，为性腺对外源激素高度敏感的时期；而且在该时期，采用含有染料木黄酮的水体浸泡鳗鱼苗，即可在短时间内诱导鳗鱼雌性化，而且获得雌性鳗鱼的比例高。
此外，染料木黄酮属于植物雌激素，主要存在于大豆、鹰嘴豆和扁豆等豆类中能够发挥类雌激素样的作用，但其毒性比动物性雌激素低，还能够清除自由基，促进细胞增殖。
作为本发明的一个实施例，本发明采用染料木黄酮浓度为400-1000μg/L的水体浸泡鳗鱼苗。优选地，采用染料木黄酮浓度为800-1000μg/L的水体浸泡鳗鱼苗。
作为本发明的另一个实施例，浸泡时鳗鱼苗的密度为15尾/L。
作为本发明的一个具体实施例，每次采用含有染料木黄酮的水体浸泡鳗鱼苗后，更换养殖用水，投喂适口饲料。
更具体地，在9:00开始浸泡鳗鱼苗，下午15:00-17:00停止浸泡，然后更换养殖用水，投喂适口饵料。
由于仅凭肉眼观察鳗鱼性腺判别鳗鱼性别准确率较低，所以作为本发明的一个实施例，所述筛选的具体方法为：
(1)对养至性成熟的鳗鱼，分别进行电子标签标记后测量体长L及体重W，记录相关数据；
(2)对鳗鱼性别进行判别：体长大于600mm全是雌性鳗鱼；体长小于400mm全是雄性鳗鱼；然后通过“判别函数”进一步判别体长在400-600mm范围内、不能明显区分性别的鳗鱼；判别函数是根据体重与体长关系用直线方程式W＝a+bL来表示的，其中满足W＝1.156L-376.73的鳗鱼为雌性鳗鱼，满足W＝0.887L-280.02的鳗鱼为雄性鳗鱼。
通过所述筛选的方法，能够在不处死鳗鱼的情况下，使雌雄判别准确率达90％，在鳗鱼的规模化生产中十分适用。
本发明在进行筛选后，可以通过性腺组织石蜡切片准确鉴定雌性鳗鱼，计算获得雌性鳗鱼的比率，以及判断所述筛选的准确率。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明通过选取特定大小的鳗鱼苗，采用含有染料木黄酮的水体浸泡，实现在短时间内人工诱导鳗鱼雌性化，获得高比例的雌性鳗鱼，雌性鳗鱼的比例能够达到约90％；本发明提供了一种新的途径解决高密度人工养殖鳗鱼雄性鳗鱼比率高，经济效益低的问题。
(2)本发明利用低浓度染料木黄酮短时浸泡鳗鱼诱导雌性化，这种直接的方法简便快捷高效低毒性，避免了通过长期投喂性激素的诱导方式，养殖水体中会积累大量性激素导致鳗鱼生长缓慢、污染环境等问题；
而且，本发明方法并不会对人工养殖鳗鱼的存活率造成负面影响。
(3)本发明的筛选方法通过鳗鱼体长与体重关系“判别函数”筛选雌性鳗鱼，该方法通过直接测量即可判别出雌性鳗鱼，操作简便省时省力，雌雄判别准确率高，适用于鳗鱼的规模化生产。
附图说明
图1为各体长组雄雌鳗鱼出现比率(A)和各体重组雄雌鳗鱼出现比率(B)；
图2为雌鳗鱼性腺石蜡切片图，黑色箭头所指为初级卵母细胞。
具体实施方式
以下实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以下实施例。所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容和各参数所取范围，均可实现本发明的目的。
以下具体实施例中，染料木黄酮采用麦克林G810424金雀异黄酮(分析标准品，≥98％)，其他试剂或材料均来源于商业渠道。
实施例1
一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，包括以下步骤：
1、购买鳗鱼苗，选取全长40-70mm(体重90-180mg)，共300尾，于7‰低盐度的海水暂养，待稳定后于淡水中养殖；鳗鱼培育所用塑料圆桶的规格为直径650mm×高度820mm，每个圆桶放置三个充气石，保证供氧充足；培育温度为28-32℃，溶氧量6.0-7.5mg/L，pH值7.5-8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别＜0.1mg/L和＜0.05mg/L；
2、染料木黄酮诱导雌性化：
(1)染料木黄酮溶液母液的配制：计算出所需染料木黄酮和无水乙醇的总剂量，在棕色玻璃瓶将染料木黄酮完全溶解于无水乙醇得到浓度为10mg/mL的母液A，然后置于4℃冰箱中储存；
(2)将上述鳗鱼苗放置于含20L水的塑料圆桶中，密度为15尾/升，然后加母液A，使最终水体中染料木黄酮浓度为1000μg/L；
于9:00开始浸泡，下午17:00停止浸泡，排掉含有染料木黄酮的水，换常规养殖用的水，投喂适口饵料；隔天浸泡一次，浸泡5次；
(3)浸泡完毕后，正常培育，养至第二年性成熟。
3、通过鳗鱼体长与体重关系初步筛选步骤二中的雌性鳗鱼：
(1)在上述经过染料木黄酮浸泡的鳗鱼个体，对其分别进行电子标签标记后测量体长L，及体重W，并记录相关数据；
(2)对雌雄鳗鱼进行判别：雌性鳗个体大，体长600毫米以上全是雌鳗；雄性鳗个体小，体长400毫米以下全是雄鳗；
而体长400-600毫米范围内的鳗鱼，雌雄均有出现，在这个范围的鳗鱼内，体重与体长关系可以用直线方程式，W＝a+bL来表示，经计算，满足W＝1.156L-376.73为雌鳗；满足为W＝0.887L-280.02则为雄鳗。
通过上述筛选，雄性鳗鱼共27尾，雌性鳗鱼共207尾，雌性鳗鱼比例达88.5％。
4、通过性腺组织切片筛选鉴定雌性化鳗鱼，以及计算其比率：
(1)随机挑选群数量5-10％(本实施例挑选25尾)，通过解剖取性腺样品，保存于波恩氏液固定过夜；
(2)将固定好的样品转移到75％的酒精，进行后续石蜡切片的制作及苏木精-伊红染色；
具体地，石蜡切片制作具体步骤如下：
a.梯度脱水：将保存于70％乙醇的性腺样品用镊子夹出，进行以下步骤进行梯度脱水：
80％乙醇，30min；
90％乙醇，30min；
95％乙醇，30min两次；
100％乙醇，30min两次；
b.二甲苯透明：
二甲苯∶无水乙醇1∶1，15min；
二甲苯，15min两次；
c.浸蜡包埋：提前在熔蜡烘箱中将石蜡熔化，根据样品大小叠好合适的包埋盒，用镊子将二甲苯中透明的样品夹入包埋盒内；浸入石蜡，3h以上；将装有样品的包埋盒从烘箱用镊子夹出，然后室温放置冷却至凝固，可以室温保存。
d.切片：将包埋好的性腺组织蜡块修成合适的形状，在Leica RM2235型切片机上以5μm的厚度连续切片，并用30％乙醇42℃水浴展片，随后42℃烘过夜。
苏木精-伊红染色的步骤如下：将烘干的切片进行染色，其复水脱水染色程序：
二甲苯，15min→100％乙醇，5min；→95％乙醇5min；→80％乙醇5min；→70％乙醇5min；→50％乙醇5min；→苏木精染色30s，流水中冲洗，15min；→50％乙醇5min；→70％乙醇5min；→80％乙醇5min；→95％乙醇5min；→伊红染色10s；→95％乙醇10s；→100％乙醇，5min两次；→二甲苯，10min；将载玻片从二甲苯中取出，迅速滴加中性树脂并用盖玻片封片，42℃通风橱过夜。
(3)将制作好的石蜡切片玻片置于莱卡显微镜下观察，并在10倍、20倍以及40倍镜下进行拍摄，保存合适的照片。
(4)通过切片性腺中展示的细胞类型来判断性腺为精巢或是卵巢，进而鉴定鳗鱼性别；
若切片图含有大量的初级卵母细胞则为卵巢(如图2所示)，该个体为雌性鳗鱼，若切片图不含有初级卵母细胞则为精巢。
由此得到的结果：25尾鳗鱼样本中有21尾雌性鳗鱼、4尾雄性鳗鱼，雌性鳗鱼比率为84％；可见，本发明筛选方法的雌雄判别准确率超过90％。
实施例2
一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，包括以下步骤：
1、购买鳗鱼苗，选取体长为40-70mm、70-100mm、100-130mm的鳗鱼苗，各200尾，并分别分为实验组和对照组，共600尾，于7‰低盐度的海水暂养，待稳定后于淡水中养殖；每个长度组分实验组和对照组，各100尾，鳗鱼培育所用塑料圆桶的规格为直径650mm×高度820mm，每个圆桶放置三个充气石，保证供氧充足；培育温度为28-32℃，溶氧量6.0-7.5mg/L，pH值7.5-8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别＜0.1mg/L和＜0.05mg/L；
2、实验组进行染料木黄酮诱导雌性化：
(1)染料木黄酮溶液母液的配制：计算出所需染料木黄酮和无水乙醇的总剂量，在棕色玻璃瓶将染料木黄酮完全溶解于无水乙醇得到浓度为10mg/mL的母液A，然后置于4℃冰箱中储存；
(2)将上述鳗鱼苗分别放置于含20L水的塑料圆桶中，密度为15尾/升，然后加母液A，使最终水体中染料木黄酮浓度为800μg/L；
于9:00开始浸泡，下午15:00停止浸泡，排掉含有染料木黄酮的水，换常规养殖用的水，投喂适口饵料；隔天浸泡一次，浸泡4次；
(3)浸泡完毕后，正常培育，养至第二年性成熟。
对照组则用常规方法养至第二年性成熟。
3、通过鳗鱼体长与体重关系初步筛选步骤二中的雌性鳗鱼，操作方法参照实施例1，统计结果如表1所示：
表1
4、通过性腺组织切片筛选鉴定雌性化鳗鱼，以及计算其比率：
(1)随机挑选群数量5-10％(本实施例各组挑选9尾)，通过解剖取性腺样品，保存于波恩氏液固定过夜；
(2)将固定好的样品转移到75％的酒精，进行后续石蜡切片的制作及苏木精-伊红染色；具体步骤参照实施例1；
(3)将制作好的石蜡切片玻片置于莱卡显微镜下观察，并在10倍、20倍以及40倍镜下进行拍摄，保存合适的照片；
(4)通过切片性腺中展示的细胞类型来判断性腺为精巢或是卵巢，进而鉴定鳗鱼性别；由此得到的结果如表2所示：
表2
上述实施例的变量是鳗鱼苗的体长，本实施例在鳗鱼苗浸泡6小时、浸泡4次、染料木黄酮浓度为800μg/L的条件下，得出的结果为鳗鱼苗全长为40-70mm的范围人工诱导雌性率最高，达88％以上。
实施例3
一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，包括以下步骤：
1、购买鳗鱼苗，选取体长40-70mm，共1600尾，于7‰低盐度的海水暂养，待稳定后于淡水中养殖；设置0μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L、1200μg/L，共8组，每组200尾。鳗鱼培育所用塑料圆桶的规格为直径650mm×高度820mm，每个圆桶放置三个充气石，保证供氧充足；培育温度为28-32℃，溶氧量6.0-7.5mg/L，pH值7.5-8.5，总氨氮和亚硝酸盐含量分别＜0.1mg/L和＜0.05mg/L；
2、染料木黄酮诱导雌性化：
(1)染料木黄酮溶液母液的配制：计算出所需染料木黄酮和无水乙醇的总剂量，在棕色玻璃瓶将染料木黄酮完全溶解于无水乙醇得到浓度为10mg/mL的母液A，然后置于4℃冰箱中储存；
(2)将上述鳗鱼苗分别放置于含20L水的塑料圆桶中，加母液A，使最终水体染料木黄酮浓度依次为0μg/L、100μg/L、200μg/L、400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L和1200μg/L；
于9:00开始浸泡，下午17:00停止浸泡，排掉含有染料木黄酮的水，换常规养殖用的水，投喂适口饵料；隔天浸泡一次，浸泡5次；
(3)浸泡完毕后，正常培育，养至第二年性成熟。
3、通过鳗鱼体长与体重关系初步筛选步骤二中的雌性鳗鱼，操作方法参照实施例1，统计结果如表3所示：
表3
4、通过性腺组织切片筛选鉴定雌性化鳗鱼，以及计算其比率：
(1)随机挑选群数量5-10％(本实施例各组挑选18尾)，通过解剖取性腺样品，保存于波恩氏液固定过夜；
(2)将固定好的样品转移到75％的酒精，进行后续石蜡切片的制作及苏木精-伊红染色；具体步骤参照实施例1；
(3)将制作好的石蜡切片玻片置于莱卡显微镜下观察，并在10倍、20倍以及40倍镜下进行拍摄，保存合适的照片；
(4)通过切片性腺中展示的细胞类型来判断性腺为精巢或是卵巢，进而鉴定鳗鱼性别；由此得到的结果如表4所示：
表4
| 组别(μg/L) | 雌性 | 雄性 | 雌性比率(％) |
| 0 | 2 | 16 | 11.11 |
| 100 | 6 | 12 | 33.33 |
| 200 | 7 | 11 | 38.89 |
| 400 | 13 | 5 | 72.22 |
| 600 | 14 | 4 | 77.78 |
| 800 | 15 | 3 | 83.33 |
| 1000 | 16 | 2 | 88.89 |
| 1200 | 14 | 4 | 77.78 |
上述实施例的变量是染料木黄酮浸泡的浓度，本实施例在鳗鱼苗浸泡8小时、浸泡5次、鳗鱼苗全长为40-70mm的范围的条件下，得出的结果染料木黄酮浓度为400μg/L、600μg/L、800μg/L、1000μg/L存活率在90％以上，人工诱导雌性率在70％以上，染料木黄酮浓度为800μg/L和1000μg/L时人工诱导雌性率达80％以上。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。本发明的上述实施例都只能认为是对本发明的说明而不是限制。因此凡是依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何细微修改、等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
Claims (7)
1.一种人工诱导获得雌性鳗鱼的方法，其特征在于：
选取体长为40-70mm的鳗鱼苗；
间隔一天采用含有染料木黄酮的水体，浸泡所述鳗鱼苗6-8小时，共浸泡3-5次；
然后对鳗鱼苗进行正常培育，养至第二年性成熟，筛选雌性鳗鱼。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：采用染料木黄酮浓度为400-1000μg/L的水体浸泡鳗鱼苗。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：采用染料木黄酮浓度为800-1000μg/L的水体浸泡鳗鱼苗。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：浸泡时鳗鱼苗的密度为15尾/L。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：每次采用含有染料木黄酮的水体浸泡鳗鱼苗后，更换养殖用水，投喂适口饲料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：在9:00开始浸泡鳗鱼苗，下午15:00-17:00停止浸泡，然后更换养殖用水，投喂适口饵料。
7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于：所述筛选的具体方法为：
(1)对养至性成熟的鳗鱼，分别进行电子标签标记后测量体长L及体重W，记录相关数据；
(2)对鳗鱼性别进行判别：体长大于600mm全是雌性鳗鱼；体长小于400mm全是雄性鳗鱼；然后通过判别函数进一步判别体长在400-600mm范围内的鳗鱼，所述判别函数用直线方程式W＝a+bL来表示，其中满足W＝1.156L-376.73的鳗鱼为雌性鳗鱼，满足W＝0.887L-280.02的鳗鱼为雄性鳗鱼。
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| KR20140140692A (ko) * | 2013-05-29 | 2014-12-10 | 구골홀딩스 주식회사 | 민물뱀장어 치어의 자성화 유도방법 |
| CN108077120A (zh) * | 2017-12-18 | 2018-05-29 | 浙江省海洋水产研究所 | 一种性腺未分化小黄鱼的诱导雌化方法 |
| CN109258541A (zh) * | 2018-11-12 | 2019-01-25 | 南京师范大学 | 一种基于比例性状鉴定东方鲀属鱼类性别的方法 |
| CN115052486A (zh) * | 2020-01-30 | 2022-09-13 | 共立制药股份有限公司 | 鳗鱼雌性化诱导方法、鳗鱼饲养方法、鳗鱼雌性化剂、及鳗鱼用饲料 |
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