CN112094917A

CN112094917A - 中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点snp标记及应用

Info

Publication number: CN112094917A
Application number: CN202010956915.5A
Authority: CN
Inventors: 乔瑞敏; 徐盼; 王小女; 张晨; 聚明明; 李明; 李新建
Original assignee: Henan Agricultural University; Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Current assignee: Henan Agricultural University; Jiangsu Agri Animal Husbandry Vocational College
Priority date: 2020-09-12
Filing date: 2020-09-12
Publication date: 2020-12-18
Anticipated expiration: 2040-09-12
Also published as: CN113881780B; CN113881780A; CN112094917B; CN113930517A; CN113930517B

Abstract

本发明涉及一种中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记及应用。所述标记为下列突变中的至少一种：国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体第2096738位碱基（rs81439116）处，由A到G的点突变，第2129234位碱基（rs81439242）处，由C到T的点突变，第2145858位碱基（rs81439307），由T到C的点突变。本发明所述提供SNPs标记均是由西方猪血缘渗入中国地方猪中，且均与体长极显著关联(P<0.01)，可用于中国地方猪体长分子标记辅助选择育种，可以更有效的加快选育速度、提高选育准确度，具有重要的经济效益与社会价值。

Description

中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记及应用

技术领域

本发明涉及猪标记辅助选择（MAS）技术领域，具体涉及一种中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记及应用。

背景技术

我国是全球家猪最早的驯化地之一。全国各地气候多样、地形复杂，形成了大量优良地方猪种，全世界1/3的地方猪种出自我国。我国地方猪种以肉质鲜美、母性好、耐粗饲、抗病性强著称，但普遍存在背膘厚、瘦肉率低的缺点。2012年，我国农业部发布《全国畜禽遗传资源保护和利用“十三五”规划》数据显示我国一共有90个地方品种，其中国家级保护品种42个，省级保护品种32个，其它品种15个。这些地方猪种被列入了《国家级畜禽遗传资源保护名录》当中。根据猪种的特征及原产区的气候和地理位置，我国的地方猪种分为六大类型：华北型、江海型、华中型、西南型、高原型、华南型。

当前，全球生猪市场的主流商业猪种为杜洛克猪、长白猪、大白猪、巴克夏、皮特兰、汉普夏猪，通称为西方商业猪种，分为瘦肉型、脂肪型、兼用型。与中国地方猪种相比，西方商业猪种普遍具有生长速度快、繁殖力强、瘦肉率高、体格高大、体躯长等特点。其中，美国的杜洛克猪具有生长速度快、效率高饲料转化率高、背膘薄等特点；英国的长白猪和大白猪以繁殖性能优良著称；比利时的皮特兰猪瘦肉率极高；英国的巴克夏肉质优良，兼具优秀的繁殖性能；英国的汉普夏猪的体驱长、背膘薄、眼肌面积大。

全世界的家猪主要由欧洲大陆的野猪和亚洲大陆的野猪，独立驯化而来，但历史上中西方猪种之间经历了多次血缘交流。有文献记载，早在清乾隆年间，广州开放为通商口岸，华南猪曾漂洋过海到欧洲，进而影响了欧洲猪种的基因组。新年中国成立后，1979年法国曾引进梅山猪、枫径猪、嘉兴猪、金华猪。1989年美国也曾引进民猪、梅山猪进而枫泾猪。而今，基因组分析显示大白猪和长白猪里也混有中国地方猪种的血缘。与此同时，我国在十九世纪初开始正式引进西方猪种。新中国成立后，苏大白、巴克夏、长白、大白、杜洛克、汉普夏等都被大量引入我国，为此专门兴建有国有外贸种猪场。随着我国居民消费习惯向瘦肉型猪肉转变，大量的中国地方猪与西方猪种进行了杂交育种。

西方猪种血缘的渗入，影响了中国地方猪的性状表现。因此，通过检测西方猪向中国地方猪种的渗入信号，分析其影响的表型，开发相关分子标记，有利于通过提高渗入位点标记的基因型，提高种群的相应经济性状。其中，体长就是一种数量性状，其与屠宰率、产肉量等重要经济性状密切相关。与西方猪种相比，中国地方猪的体长不占优势，普遍相对短小。目前利用常规选育手段并没有取得很好的效果。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记，并将其在基因型鉴定、遗传育种等方面加以应用，以解决中国地方猪的体长不占优势，普遍相对短小的问题。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

筛选得到一组中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记：

位于国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体中的，

第一SNP标记，第2096738位碱基由A到G的点突变及其互补突变由T到C（对应于SEQ ID：1所示序列中的第539bp处），记为突变位点rs81439116；

第二SNP标记，第2129234 位碱基由C到T的点突变及其互补突变由G到A（对应于SEQID：2所示序列中的第598bp处），记为突变位点rs81439242；

第三SNP标记，第2145858位碱基由T到C的点突变及其互补突变由A到G（对应于SEQ ID：3所示序列中的第453 bp处），记为突变位点rs81439307。

设计用于对应检测上述SNP标记的引物对：

（1）检测第一SNP标记的引物对：

上游引物为：ggagacccacctgtgaaacc，

下游引物为：gacgagactggaactacgagca；

（2）检测第二SNP标记的引物对：

上游引物为：taccgttgtcagcgatggag，

下游引物为：ttgagcagcgtaggacttca；

（3）检测第三SNP标记的引物对：

上游引物为：tctgacctgacctctgggaact，

下游引物为：cgtgacctcgtcggtaagtg。

用于检测上述的SNP标记的试剂盒，包含上述引物对中的至少一对。

所述引物或试剂盒在筛选体长相关的生猪品系中的应用。

开发一种分子标记，以含有所述SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以中国地方猪和西方猪种及中西方杂交猪种DNA为模板进行PCR扩增所得到的DNA序列。

分别以上述引物进行PCR扩增，可得到如下分子标记序列：

如SEQ ID：1所示，所述第一SNP标记位点位于该序列的第539位，且该位点存在A/G多态性；

如SEQ ID：1所示，所述第二SNP标记位点位于该序列的第598位，且该位点存在C/T多态性；

SEQ ID：3所示，所述第三SNP标记位点位于该序列的的第453位，且该位点存在T/C多态性；

且AA、CC、TT基因型个体的体长分别显著长于GG、TT、CC基因型个体。

设计一种检测所述与体长性状相关的SNP位点的方法，包括以下步骤：

（1）取生猪的组织样品并提取基因组DNA；

（2）以生猪基因组DNA为模板，使用上述对应的引物进行PCR扩增；

（3）对扩增产物进行测序，分别查看SEQ ID NO：1第539位，判读该位点的A/G多态性；SEQ ID NO：2第598位，判读该位点的C/T多态性；SEQ ID NO：3第453位，判读该位点的T/C多态性。

所述分子标记在筛选体长相关的生猪品系中的应用；具体应用于筛选高体长生猪品系，包括如下步骤：

（1）检测待选生猪基因组中突变位点rs81439116、rs81439242或/和rs81439307的基因型；

（2）选育rs81439116核苷酸位点AA基因型个体、rs81439242核苷酸位点CC基因型个体或/和rs81439307核苷酸位点TT基因型个体作为种猪。

与现有技术相比，本发明的主要有益技术效果在于：

本发明提供的SNP标记与生猪体长显著相关，基于该SNP开发的分子标记及引物可用于SNP的检测；因此，可以通过鉴定该SNP标记来筛选体长较长的生猪品系，所得体长较长的生猪品系具有重要的经济效益与社会价值。

本发明分子标记应用于生猪品系选择育种中，可以更有效的加快选育速度、提高选育准确度。

说明书附图

图1为中西方猪种间渗入信号位点的Fst图和其所在纯合区段进化树图，及渗入信号位点在中、西方猪种中的等位基因频率分布图，最显著的位点为12号染色体rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点；

图2为图1中b部分的放大图。

图3为12号染色体rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点的PCR扩增凝胶电泳图。

图4为12号染色体rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点的测序分型图示例。

图5为12号染色体rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点对苏姜猪体长的影响效应（基因型和体长对应的分布图）。

具体实施方式

下面结合实施例来说明本发明的具体实施方式，但以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中所涉及的仪器设备如无特别说明，均为常规仪器设备；所涉及的试剂及原材料如无特别说明，均为市售常规产品；所涉及的试验方法，如无特别说明，均为常规方法。

实施例一：SNP标记的获取

利用929头40个中国地方猪种及165头6个西方猪种的SNP芯片扫描数据（来自公共数据库的下载的878个个体及申请人检测的216个个体），进行ADMIXTURE群体遗传结构分析。结果显示，其中的8个猪种为中国地方猪种的代表性猪种：包括代表江海型的二花脸猪和梅山猪、代表华南型的陆川猪和五指山猪、代表华中型的赣西两头乌猪和沙子岭猪、代表西南型的内江猪和蓝塘臧猪，而确山黑猪虽然传统上被划分为华中型猪种，却很大程度上受到了西方猪种血缘的渗入影响。

因此，为了获得西方猪种对中国地方猪种的血缘渗入信号，利用这8个中国代表性猪种和确山黑猪的SNP芯片扫描数据，计算它们之间的Fst值，取前1%作为阈值线；同时在确山黑猪群体内部进行选择信号分析。取这两项结果间共有的显著SNP位点为候选渗入位点，结果共获得3个SNP位点，位于12号染色体的rs81439116，rs81439242，rs81439307（参见图1a，图1b）。基因型分析显示，这3个SNP位点在这8个中国地方猪种的139个个体中几乎全为纯合子（AA，TT和TT），而在165个西方猪种个体则不同（AG，CT，TC）（参见图1c）。

实施例二：SNP标记的克隆及基因型验证

1. 试验动物来源

江苏省苏姜猪种猪场：供试猪种为苏姜猪，其是由中国地方猪种姜曲海和西方猪种杜洛克猪，采用横交固定、继代选育的方法培育而成的瘦肉型黑色母系品种。苏姜猪同时具有西方猪种生长速度快、胴体瘦肉率高的优点，同时具有中国地方猪繁殖力高、肉质优良的特点。因此，苏姜猪适于用来评估中西方猪种之间的基因交流效应。

2. 提取苏姜猪基因组DNA

采集365头苏姜猪组织样本，提取DNA；使用TIANGEN TIANamp Genomic DNA Kit（DP304-03）提取猪耳组织DNA，根据说明书操作步骤如下：

① 先在缓冲液GD和漂洗液PW中分别加入68mL和200mL无水乙醇，充分混匀。

②采集组织样约10-20mg置于2mL EP管内，完全剪碎后加200uL缓冲液GA，振荡至彻底悬浮。

③ 加入20μL蛋白酶K溶液，混匀后放在56℃水浴锅中2-3h，直至耳样组织溶解，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

④ 加入200uL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃水浴10min，溶液应变清亮，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑤ 加人200uL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心以去除管盖内壁的水珠。

⑥ 将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱CB3中，吸附柱放入收集管中，随后以12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

⑦ 向吸附柱CB3中加入500uL缓冲液GD，12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑧向吸附柱CB3中加入600uL漂洗液PW，以12,000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑨ 重复操作步骤⑧。

⑩ 将吸附柱CB3放回收集管中，12,000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑪ 将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200uL洗脱缓冲液TE，室温放置2-5min，12,000rpm离心2min，将溶液收集到离心管中。

⑫ 经过Nanodrop-100分光光度计检测质量与浓度后，质检合格后，将浓度稀释到20ng/uL于-20℃下保存备用。

3. 目的片段PCR扩增与测序分型

以提取的DNA为模板，根据设计的引物（SEQ ID：4至SEQ ID：9），进行PCR扩增：

（1）PCR扩增体系：10 μl反应体系包括 2×Es Taq MasterMix (Dye) 5μl（康为世纪），引物SEQ ID NO：4～5各0.3μl (10pmol/μl)，DNA 0.5μl (20ng/μl)，双蒸水补充至10μl。PCR扩增条件：94℃ 5 min； 94℃ 30 s, 70℃ 30 s, 72℃ 50 s, 30 个循环； 72℃10min; 4℃保存。

（2）PCR扩增体系：10 μl反应体系包括 2×Es Taq MasterMix (Dye) 5μl（康为世纪），引物SEQ ID NO：6～7各0.5μl (10pmol/μl)，DNA 0.5μl (20ng/μl)，双蒸水补充至10μl。

PCR扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s, 66.6 ℃ 30 s, 72℃ 50 s，30 个循环；72℃ 10min； 4℃保存。

（3）PCR扩增体系：10 μl反应体系包括 2×Es Taq MasterMix (Dye) 5μl（康为世纪），引物SEQ ID NO：8～9各0.3μl (10pmol/μl)，DNA 0.5μl (20ng/μl)，双蒸水补充至10μl；PCR扩增条件：94℃ 5 min； 94℃ 30 s, 68℃ 30 s，72℃ 50s， 30 个循环； 72℃10min； 4℃保存。

PCR扩增产物经1.2％凝胶电泳检测合格后，送往测序公司测序。

经检测，扩增的目的片段大小分别829bp，1102bp，812bp，电泳图见图3。

分别读取测序结果中rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点的基因型，测序峰图见图4，图4分别展示了这3个位点的3种基因型代表性个体的测序峰图，如图所示：rs81439116位点3种基因型个体的测序结果从上到下依次为AA、AG、GG（图4a）；rs81439242位点3种基因型个体的测序结果从上到下依次为CC、CT、TT（图4b）；rs81439307位点3种基因型个体的测序结果从上到下依次为TT、TC、CC（图4c）。

4. 相关性分析

利用方差分析，分析位点的基因型与体长的关系，对由实施例一所获得的3个西方猪种渗入位点，在中国地方猪种和西方猪种的杂交品种-苏姜猪中开展基因型和体长的相关性分析，苏姜猪饲养于江苏农牧科技职业学院的保种场，基因型和体长数据均为该场提供，研究结果显示这3个位点均与苏姜猪的体长呈显著相关（P=0.04），见图5。

由图5可知，rs81439116位点、rs81439242位点、rs81439307位点与体长均成极显著相关（P =0.04，P<0 .01)，选育rs81439116位点的AA型个体、rs81439242位点的CC型个体、rs81439307位点的TT型个体，均可逐步提高体长，达到提高苏姜猪体长性能的目的。

上面结合实施例对本发明作了详细的说明；但是，所属技术领域的技术人员能够理解，在不脱离本发明构思的前提下，还可以对上述实施例中的各个具体参数进行变更，或者进行相关方法或步骤的等同替代，从而形成多个具体的实施例，均为本发明的常见变化范围，不再赘述。

序列表

<110>河南农业大学

江苏农牧科技职业学院

<120>中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记及应用

<210>1

<211> 829

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

ggagacccac ctgtgaaacc agcaaggcct ggtcgcccat ccccagcctg ttctggatgt 60

agtcattcaa gggcatgttc ggatccccgc cagccgtgct cagaaacccc aaggcgacct 120

cgatggcaga cagagcctca caggcgtcgc tgtaggactg cagctgtcct ctgatggcgc 180

cgatgaccga gttggggagg gggtgctagg aaatcaaagg caggagcggg tccgtggcgg 240

gtcgctgcct gataagcgtg cttaccttct ccacggccaa ggccccgggt gggacggact 300

ctgatagcag cagcagcgga caccccgagc ttgctcaggg ccagcgccgt tcagggactt 360

tacagaaagt gagatgaagt ggctgactcc tcagaacatc tcggtgaggg cgtgtgcacg 420

gacacgcata cgtgcacacc acagacacat cacacgtgcg cacaccccaa gcacaacaca 480

cgtaactcac aaaagcagga ctaaacgagc tctccgggct ttctgaccag cccacagaat 540

cctgccatca tcgctaagca cccactgccc gagtcccctc tgctgatcct caacaggaaa 600

acgcctgctg acctgccgtc ccgcccgccc tctggaaaga gccctgggct cggggaccgg 660

ggggaggccc cgaaacgccg ctgctcacag caaatgctgg agcagctggg acagtcctga 720

cacgggaacc ctcggacagg acgggcgcgt gtgctcgtga gaagacagat cacctggggc 780

atcttgttcc tgatttccat gaagagatgc tcgtagttcc agtctcgtc 829

<210> 2

<211> 1102

<212> DNA

<213>人工序列（Artificial Sequence）

<400> 2

taccgttgtc agcgatggag gcgcttctgc ggaaaaccag ctttgccaca tggacaagta 60

gagacggtaa aactgtttag gcttcgctga tgactactga ggctgagcct ttttccccgt 120

gttttctgga atctgtataa ttatcctgtt aacagttagt atttaacttt cattcatttt 180

taaaacttag gggatttact tgattcctaa gaatcctttt tttttttaat taacccttaa 240

tcatgcgatt gtatgttctc ctcaaatctg tcagtttcct tttttacaca ctgaaagttg 300

aaatcttcaa tcttcccact gaaatttcaa ttattgctgc ggtccgttaa atatttagct 360

aaaacattta agaaggggtc acgggaaaat cagaggtggg cttctcgtta ataaaggctc 420

cgtgtttttc ggggggctgg gcagtggctt gagcgtccag ctctgagggt ccccgggggg 480

catttcctca cgccccgtcc tctgagccca cattccgttc caacatcaca gctctggaag 540

ctgaggaaga gctcccacgc tggcatcctg tggatgtcgc accagctcgc ggggccccca 600

tgccaggacc tacctctaac tcctcctggg tggacactct ggtggtcagc agaaggaaat 660

cccgcaggta gccctgaaga aggtcctgcc tctggtgggc agagagctga gcaagaaacc 720

tgcccagcgg cgtctgacga aagagctcca ccaacttctc agccgggcct gcagggaggg 780

gatgagggga ggggacagag aggggcttgg gatgagcgcg gcgaccctgc ctgccttcca 840

cgcggaaggc aggaacgagg ccagggttct gagaaggctg cctcggggtc attgctgtgt 900

catcgtctct ggacactaat tctcccagcg ggagagcagg aacaaaggca gaaggggtgt 960

ccattcagcc tcgacagccc accagcccca gagaaaacac agactaggac agagcaagtt 1020

catgtcaacc aagccatcag gcgcctggga gccaggaccc aagcgggccg ccttccaggg 1080

gctgaagtcc tacgctgctc aa 1102

<210>3

<211> 812

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 3

tctgacctga cctctgggaa ctagaattct cccttgtgtg tgtgtgtgtg tgtgtgtgag 60

agagagagag agagcgagag cataaaaccc ccttttgata acaaactgct ataaccaaag 120

cctcctcccc aagttagcgc cattaagaaa gacggtgctt caggcaggta cgctttctgc 180

attccgagca ccacgggcat ttaacctgga cccacagcat ccatcccaaa gggaacaaaa 240

ccaatttaag acaccgttaa tgaacaaaag agcgttttta tgccaggcat tattccaaaa 300

taaacttaaa gactgttttt tccttactaa cacggaactc agctactctg cagagacaca 360

gcggggaatc acagaagcat ctcgaagccc gcccccccgc ccacacacag tggcatcaaa 420

gtgccctgac acacaccagc ttcgagggcc tctgaggcag ggcggaactc ctttccagga 480

tttcaacgac atataaatgg cacgggttcc gaagccacat cttcccattt atgtccatta 540

agtactgaag aatgaggagt ttgaaaagaa acatcccaac tccagtccgt acctaaagac 600

acaatcacgc gggtgtgtaa acacacggaa ggcggcagct ctcccaaccc gaaggctctc 660

ttattcggct ttttggtatg atgaaaaagc atcactacgt gtagaaaaaa gaaagtcttt 720

atactgggag ggggcagggc cggaggtggc agcgaggcct tccgactcag ccactcagct 780

ggaggccgag ggcacttacc gacgaggtca cg 812

<210>4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 4

ggagacccac ctgtgaaacc 20

<210>5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 5

gacgagactg gaactacgag ca 21

<210>6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 6

taccgttgtc agcgatggag 20

<210>7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 7

ttgagcagcg taggacttca 20

<210>8

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 8

tctgacctga cctctgggaa ct 22

<210>9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 9

cgtgacctcg tcggtaagtg

Claims

1.一种中国地方猪中与体长相关的西方猪血缘渗入位点SNP标记，其特征在于，包含位于国际猪基因组11.1版本参考序列猪12号染色体中的下列标记的至少一种：

第一SNP标记，第2096738位碱基由A到G的点突变及其互补突变由T到C，记为突变位点rs81439116；

第二SNP标记，第2129234 位碱基由C到T的点突变及其互补突变由G到A，记为突变位点rs81439242；

第三SNP标记，第2145858位碱基由T到C的点突变及其互补突变由A到G，记为突变位点rs81439307。

2.一种用于检测权利要求1所述SNP标记的引物，其特征在于，包含下述引物对中的至少一对：

（1）检测第一SNP标记的引物对：

上游引物为：ggagacccacctgtgaaacc，

下游引物为：gacgagactggaactacgagca；

（2）检测第二SNP标记的引物对：

上游引物为：taccgttgtcagcgatggag，

下游引物为：ttgagcagcgtaggacttca；

（3）检测第三SNP标记的引物对：

上游引物为：tctgacctgacctctgggaact，

下游引物为：cgtgacctcgtcggtaagtg。

3.一种用于检测权利要求1所述的SNP标记的试剂盒，其特征在于，包含权利要求3所述引物对中的至少一对。

4.权利要求2所述引物或权利要求3所述试剂盒在筛选体长相关的生猪品系中的应用。

5.一种分子标记，其特征在于，其是以含有权利要求1所述SNP标记的核苷酸序列为基础序列，设计引物对，以中国地方猪和西方猪种及中西方杂交猪种DNA为模板进行PCR扩增所得到的DNA序列。

6.根据权利要求5所述的分子标记，其特征在于，以权利要求2所述引物进行PCR扩增，得到如下分子标记序列中的至少一种：

7.权利要求5或6所述分子标记在筛选体长相关的生猪品系中的应用。

8.一种检测权利要求1中所述的与体长性状相关的SNP位点的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）取生猪的组织样品并提取基因组DNA；

（2）以生猪基因组DNA为模板，使用权利要求3所述引物进行PCR扩增；

9.一种筛选高体长生猪品系的方法，其特征在于，包括如下步骤：