CN117106802A - 一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因及其鉴定和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因及其鉴定和应用，甘蓝型油菜高裂角抗性基因的序列如序列表Seq ID NO.1所示，所述分子标记为dCAPS标记，利用前述分子标记筛选甘蓝型油菜裂角高抗材料的步骤包括：利用所述dCAPS标记的引物对，选择一个或多个甘蓝型油菜材料DNA进行PCR扩增；将所述PCR扩增产物进行酶切，酶切产物进行电泳检测；电泳检测条带以低带呈现的甘蓝型油菜为裂角高抗材料。本发明基于全基因组关联分析、单倍型分析，开发dCAPS标记，通过该标记为今后甘蓝型油菜抗裂角性资源的筛选和分子标记辅助选育抗裂角、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。

Description

一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因及其鉴定和应用

技术领域

本发明属于作物遗传育种领域，涉及甘蓝型油菜高裂角抗性基因，筛选所述甘蓝型油菜高裂角抗性材料的分子标记，以及使用该标记筛选甘蓝型油菜高裂角抗性材料的方法，以及利用所述标记筛选目标株系辅助育种的方法。

背景技术

油菜是世界上最重要的油料作物之一，是我国继水稻、小麦、玉米和大豆之后的第五大农作物，除了是重要的优质食用植物油来源，油菜也是重要的工业原料和未来可再生能源的主要生物资源。但油菜易受多种因素影响导致角果裂角落粒，我国大部分现有油菜品种在角果成熟脱水后易裂角落粒，易造成产量损失，影响机械化作业程度，且落地子粒在条件适宜时会萌发形成自生苗，影响下茬作物生长，极大地制约了油菜产业发展。

油菜角果裂角抗性为典型的数量性状，自然种质中存在有限的遗传变异。抗裂角性是油菜机械化品种选育中的重要性状，油菜裂角抗性遗传改良对于开展抗裂育种具有重要意义。

传统育种技术对油菜裂角抗性的改良效率低、周期长，而采用分子标记辅助选择育种可以缩短育种年限，加速育种进程，提高育种效率。

目前油菜角果裂角抗性研究主要是通过QTL定位和关联分析挖掘抗性候选基因，并取得了相应的进展。开发抗裂性相关的分子标记，利用分子标记辅助选择改良甘蓝型油菜裂角抗性，对开展抗裂育种工作具有促进作用，有助于培育抗裂油菜新品种。而目前公开报道的与甘蓝型油菜裂角抗性相关的分子标记较少，甘蓝型油菜抗裂性育种进展缓慢。

发明内容

鉴于此，本发明目的之一在于提供一种油菜角果裂角抗性数量性状基因。

本发明的目的之二在于一种能够鉴定出甘蓝型油菜品种中抗裂角材料的分子标记引物对。

本发明的目的之三在于提供一种鉴定甘蓝型油菜抗裂角性的方法。

本发明的目的之四在于提供一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因的用途。

本发明的目的之五在于提供所述分子标记引物对的应用。

本发明的目的之六在于提供一种抗裂角型甘蓝型油菜育种方法。

为解决以上技术问题，本发明提供的技术方案是，提供一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因，包含选自下组的核苷酸序列：

A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；

B、与A所述序列互补的核苷酸序列；

C、与A所述序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

本发明还提供了一种用于鉴定前述甘蓝型油菜高裂角抗性基因的分子标记引物对，所述分子标记引物对为dCAPS标记引物对，碱基序列如下：

上游引物F：5’-TGGCTTTGAAGGAGTTGAATATTTT-3’；

下游引物R：5’-GTAAACCCTCAGCTATCAATC-3’。

本发明还提供了一种基于前述dCAPS标记引物对鉴定甘蓝型油菜裂角抗性的方法，包括如下步骤：

S1.1提取一个或多个甘蓝型油菜的植株DNA；

S1.2使用所述dCAPS标记引物对，进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

S1.3用限制性内切酶酶切所述PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；

S1.4将S1.3酶切所得片段进行电泳检测；

以高带呈现的电泳检测条带为非高裂角抗性基因片段；

以低带呈现的电泳检测条带为高裂角抗性基因片段。

根据本发明筛选甘蓝型油菜抗裂角材料的方法的一个实施方式，所述PCR扩增具体操作如下：

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物SWU_BnGELP9dCAPSF：TGGCTTTGAAGGAGTTGAATATTTT和10μM反向引物SWU_BnGELP9dCAPSR：GTAAACCCTCAGCTATCAATC各1μL，100ng/μLDNA模板2μL，ddH₂O补齐至25μL；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸10min。

根据本发明筛选甘蓝型油菜抗裂角材料的方法的一个实施方式，所述酶切的具体操作如下：

酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，PCR扩增产物10μL，MseI限制性内切酶2μL，ddH₂O补齐至20μL，37℃酶切反应15min。

根据本发明筛选甘蓝型油菜抗裂角材料的方法的一个实施方式，所述电泳检测的具体操作为：

取7μL酶切产物在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，45分钟。

根据本发明筛选甘蓝型油菜抗裂角材料的方法的一个实施方式，所述高裂角抗性基因片段序列如序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列。

本发明还提供了一种前述甘蓝型油菜高裂角抗性基因的用途，用于培育高裂角抗性甘蓝型油菜。

本发明还提供了前述dCAPS标记引物对在对甘蓝型油菜裂角抗性的高低进行选择、鉴定和/或预测中的应用以及裂角高抗型甘蓝型油菜新品种选育的分子标记辅助育种中的应用。

本发明还提供了一种裂角高抗型甘蓝型油菜育种方法，利用前述筛选甘蓝型油菜抗裂角材料的方法选择出BnGELP9基因中的SNP基因型为腺嘌呤的甘蓝型油菜，即为筛选出的目标株系，对所述目标株系执行回交转育程序。

根据本发明抗裂角型甘蓝型油菜育种方法的一个实施方式，利用所述分子标记引物组合在甘蓝型油菜苗期鉴定植株的基因型，选取纯合子基因型裂角高抗型植株，执行回交转育程序。

与现有技术相比，上述技术方案具有如下优点：

a)本发明基于全基因组关联分析、单倍型分析首次发现了一个油菜角果裂角抗性数量性状基因，并开发了dCAPS标记引物对。

b)利用dCAPS标记，为今后甘蓝型油菜裂角高抗种质资源的筛选和分子标记辅助选育裂角高抗、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。

c)本发明针对特定基因开发dCAPS标记，通过标记对育种材料进行低世代的标记选择，有助于在低世代对育种材料中的裂角高抗优异基因聚集，降低高世代育种选择工作量，缩小育种规模，缩短育种年限。

d)本发明提供的分子标记为共显性标记，能够区分纯合子和杂合子。利用本标记在甘蓝型油菜苗期就可以鉴定植株的基因型，省去回交渗入过程中每代自交的步骤。

e)该分子标记可以根据PCR产物或酶切产物条带特征即可判断裂角抗性高低，无需测序或繁杂的聚丙烯酰胺凝胶电泳操作，检测的准确率较高，且具有扩增稳定、检测方便、快速等优点。

本发明提供的一种分子标记引物组合具有重要的应用价值，利用此标记组合可以进行精准的抗裂角分子标记辅助选择育种、可以提高基因聚合育种中的应用效率，大大加快甘蓝型油菜抗裂角分子育种的进程。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是候选基因关联分析结果。

图2是本发明涉及基因的单倍型分析。

图3是4种单倍型蛋白序列多重比对结果。

图4是4种单倍型BnGELP9蛋白三维结构预测模型。

图5是BnGELP9同源基因表达模式分析。图5中，a为BnGELP9基因在裂角抗性极端材料中的表达量分析；b为ZS11(中等裂角抗性)角果皮15个时期中的表达模式分析。

图6是亲本Hap3材料苏油1号与Hap4材料2359的抗裂角指数。

图7是F₂群体裂角抗性频率分布直方图。

图8是dCAPS标记扩增部分极端材料的琼脂糖凝胶电泳结果图。

图9是F₂群体极端材料酶切表型图。

具体实施方式

下面结合附图与一个具体实施例进行说明。

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式中的附图，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。因此，以下对在附图中提供的本发明的实施方式的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施方式。

实施例1

本发明是基于全基因组关联分析、单倍型分析，开发抗裂角相关位点dCAPS标记，通过该标记为今后甘蓝型油菜抗裂角种质资源的筛选和分子标记辅助选育抗裂角、农艺和品质性状优良的育种材料或品种提供新方式。

本实施例中，对分子标记的流程进行详细描述，这些描述使本领域技术人员能够特别容易理解本发明的技术构思和所采用的技术手段。

1、随机碰撞鉴定

每份甘蓝型油菜材料随机选取20个完好的角果，放入圆柱型塑料容器内，容器内径为15cm、高7.4cm，内置8个直径为14mm的钢珠，将容器置于改装摇床上，每个摇床可放置8个塑料容器,将摇床振荡时间设置为2min,震荡速度设置为280rpm,使钢珠与角果碰撞，每震荡2min记录一次破裂角果数，以角果从果柄处断裂到果喙的1/2以上或者能看见油菜籽粒作为角果破裂的标准，共记录3次，每次记录时取出已破裂的角果，每一份材料3次技术重复，取每个材料3次重复的平均值作为该材料的抗裂角指数(Shatter Resistance Index,SRI)。以角果抗裂角指数为指标衡量材料角果裂角抗性，按公式计算抗裂角指数，其中Xi为第i次破损的角果数，1≤i≤3。

2、BnGELP9基因与甘蓝型油菜裂角抗性关联

发明人在前期研究中，对国内外收集的608份种质资源进行了抗裂角指数(SRI)调查统计，结合608份重测序数据(5×)对SRI进行了全基因组关联分析(K+P模型)，

后续分析中，发明人在A07上显著位点附近检测到一个重要的候选基因BnGELP9。

为进一步了解BnGELP9基因是否存在与甘蓝型油菜裂角抗性关联的遗传变异，发明人基于全基因组重测序结果，在BnGELP9基因内部及启动子区域(起始密码子上游1.5kb)共检测到23个SNP(图1)。根据这些SNP数据和三年的自然群体SRI表型数据进行候选基因关联分析，结果显示K+Q模型下共有13个SNP在不同年份均与SRI显著相关(P<0.01，图1)。

根据重测序在在BnGELP9中检测到的23个SNP，发明人进行了单倍型分析，共获得4个主要的单倍型(Hap)(图2中a图)，每个单倍型材料均多于10份。利用自然群体三年的表型数据比较这些单倍型的SRI，结果发现Hap3的SRI均显著高于Hap1、Hap2和Hap4，Hap1的SRI均显著高于Hap4(P<0.05)，Hap2属于中间类型(图2中b、c和d)。

在同一单倍型内进一步分析不同单倍型基因型发现，极端表型的两种单倍型Hap3和Hap4的差异主要集中在基因内的18个SNP上，其中2个位于内含子上，3个位于3'UTR区域，13个位于外显子上(图2中a)。结合BnGELP9候选基因关联分析结果发现其中10个位于外显子上的SNP在不同年份均与SRI显著相关(P<0.01)(图2中a和图1)。

氨基酸序列分析表明，位于第五个外显子上的SNP变异会导致编码的氨基酸序列发生变异(图3)。进一步蛋白序列分析结果表明，SNP位点S7_8460619的变异导致BnGELP9氨基酸序列的第333位氨基酸在Hap3材料中为天冬酰胺(N)，在Hap1、Hap2和Hap4材料中为天冬氨酸(D)(图3)。

利用SWISS-MOEDLL网站和Chimera软件对两种类型的BnGELP9蛋白进行三维结构预测(28-356)和结构比对，结果显示保守结构域的氨基酸变异导致其蛋白质三维空间结构发生了变化(图4)。极端材料不同时期转录组测序数据显示候选基因BnGELP9在裂角高抗材料中均显著上调表达(图5中a)，且随着角果的发育表达量逐渐降低(图5中a和b)。

这些结果表明BnGELP9基因与甘蓝型油菜裂角抗性关联且基因内部存在与甘蓝型油菜裂角抗性差异相关的遗传变异。

3、F₂群体构建

利用裂角抗性较高的甘蓝型油菜苏油1号(Hap3材料)与裂角抗性较低的甘蓝型油菜2359(Hap4材料)(图6)杂交获得F₁，F₁自交得到F₂群体。利用随机碰撞法对91个F₂群体单株角果进行裂角抗性鉴定(图7)。

4、dCAPS标记开发

利用重测序获得的BnGELP9在不同品种间的序列差异，发明人在该基因编码区的第1451个碱基处发现存在SNP(G/A)，且该SNP会导致第333个氨基酸由天冬氨酸(D)变为天冬酰胺(N)，进一步扩增不同品种发现裂角抗性较差的品种在该SNP位点基因型为G，裂角抗性较强的Hap3在该SNP位点基因型为A。该SNP位点处不存在限制内切酶酶切位点，无法开发CAPS标记，因此发明人利用dCAPS Finder 2.0网站(http://helix.wustl.edu/dcaps/ dcaps.html)设计dCAPS标记。

提取该SNP位点上下游各30bp序列导入WT序列框，然后手动将该序列中SNP位点的G改为A后导入Mutant序列框，选择错配碱基数目为1，进行引物设计，共获得21条引物信息及其相应的限制性内切酶。

发明人选取限制性内切酶MseI作为开发对象，引入一个错配碱基T形成MseI酶切位点TTAA，获得上游引物F(5’-TGGCTTTGAAGGAGTTGAATATTTT-3’)，如序列表Seq ID NO.3所示；在该SNP位点下游70～100bp处设计下游引物R(5’-GTAAACCCTCAGCTATCAATC-3’)，如序列表Seq ID NO.4所示。该引物对即为本发明开发的dCAPS标记引物对。

利用dCAPS标记进一步筛分甘蓝型油菜裂角抗性材料的具体操作如下。

利用该dCAPS标记，对F₂群体中各10株的极端抗性材料DNA进行PCR扩增，用限制性内切酶MseI酶切PCR扩增产物进行酶切扩增多态性分析。

所述PCR扩增具体操作如下：

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物SWU_BnGELP9dCAPSF和10μM反向引物SWU_BnGELP9dCAPSR各1μL，100ng/μLDNA模板2μL，ddH₂O补齐至25μL；

PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸10min。

PCR扩增反应产物用限制性内切酶MseI酶切的反应体系为：酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，PCR扩增产物10μL，MseI限制性内切酶2μL，ddH₂O补齐至20μL，37℃酶切反应15min。

取7μL酶切产物在2.0％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为90V，45分钟。

电泳检测结果如图8所示，所述SNP位点基因型为A的单株(裂角高抗)PCR扩增产物经MseI酶切后为单一的80bp片段，序列见序列表Seq ID NO.1，电泳检测条带以低带(图8的第1、3-12泳道)呈现；基因型为G的单株PCR扩增产物经MseI酶切后为单一的约104bp片段，序列见序列表Seq ID NO.2，电泳检测条带以高带(图8的第2、13-22泳道)呈现。以上所述Hap3和Hap4材料裂角抗性差异达到极显著水平(图9)。

上述结果表明dCAPS标记具有很高的特异性和辨识度以及较广的适用性，其能够清晰地将裂角抗性较高的甘蓝型油菜(Hap3材料)与裂角抗性较低的区别开。利用本发明所述的dCAPS标记按本发明方法检测，可预测杂交后代的裂角抗性水平，大大提高甘蓝型油菜裂角高抗材料的选择效率。

本发明分子标记是基于基因内部的SNP位点开发的，本发明甘蓝型油菜材料筛分方法是通过检测甘蓝型油菜基因组中BnGELP9基因编码序列第1451个碱基处的SNP基因型实现的。

利用该标记进行育种，选择出BnGELP9基因中的SNP S7_8460619基因型为A的甘蓝型油菜材料，即为筛选出的目标株系，对该目标株系进行育种，执行回交转育程序，即完成所述的提高甘蓝型油菜裂角抗性的分子标记育种。在回交转育程序中，选取纯合子基因型裂角高抗植株回交，获得裂角高抗回交后代，最后通过自交获得目标材料。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种甘蓝型油菜高裂角抗性基因，其特征在于，包含选自下组的核苷酸序列：

A、序列表Seq ID NO.1所示核苷酸序列；

B、与A所述序列互补的核苷酸序列；

C、与A所述序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

2.一种用于鉴定权利要求1所述甘蓝型油菜高裂角抗性基因的分子标记引物对，其特征在于，所述分子标记引物对为dCAPS标记引物对，碱基序列如下：

上游引物F：5’-TGGCTTTGAAGGAGTTGAATATTTT-3’；

下游引物R：5’-GTAAACCCTCAGCTATCAATC-3’。

3.一种基于权利要求2所述dCAPS标记引物对鉴定甘蓝型油菜裂角抗性的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.1提取一个或多个甘蓝型油菜的植株DNA；

S1.2使用所述dCAPS标记引物对，进行PCR扩增，得PCR扩增产物；

S1.3用限制性内切酶酶切所述PCR扩增产物，进行酶切扩增多态性分析；

S1.4将S1.3酶切所得片段进行电泳检测；

以高带呈现的电泳检测条带为非高裂角抗性基因片段；

以低带呈现的电泳检测条带为高裂角抗性基因片段。

4.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述PCR扩增具体操作如下：

PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM正向引物SWU_BnGELP9dCAPSF：TGGCTTTGAAGGAGTTGAATATTTT和10μM反向引物SWU_BnGELP9dCAPSR：GTAAACCCTCAGCTATCAATC各1μL，100ng/μLDNA模板2μL，ddH₂O补齐至25μL；PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸10s，35个循环；72℃延伸10min。

5.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述酶切的具体操作如下：

酶切的反应体系为：10×FastDigest Buffer 2μL，PCR扩增产物10μL，MseI限制性内切酶2μL，ddH₂O补齐至20μL，37℃酶切反应15min。

6.根据权利要求3所述方法，其特征在于，所述高裂角抗性基因片段序列如序列表SeqID NO.1所示核苷酸序列。

7.一种权利要求1所述甘蓝型油菜高裂角抗性基因的用途，其特征在于，用于培育高裂角抗性甘蓝型油菜。

8.权利要求2所述的dCAPS标记引物对在对甘蓝型油菜裂角抗性的高低进行选择、鉴定和/或预测中的应用以及裂角高抗型甘蓝型油菜新品种选育的分子标记辅助育种中的应用。

9.一种裂角高抗型甘蓝型油菜育种方法，其特征在于，利用权利要求3～6任一所述方法选择出BnGELP9基因中的SNP基因型为腺嘌呤的甘蓝型油菜，即为筛选出的目标株系，对所述目标株系执行回交转育程序。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，利用所述分子标记引物组合在甘蓝型油菜苗期鉴定植株的基因型，选取纯合子基因型裂角高抗型植株，执行回交转育程序。