CN116411124A - 鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记和引物及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物基因工程技术领域，提供鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记SWU‑sdA03和引物及其应用，所述分子标记位于甘蓝型油菜A03染色体上的BnaA03.IAA7基因，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第856位碱基存在C/T突变；当分子标记的基因型为TT时，甘蓝型油菜为半矮秆，选择基因型为TT的甘蓝型油菜用于后续育种。可以进行精准的矮化分子标记辅助选择育种、减少基因聚合育种中的繁琐操作，加快甘蓝型油菜优良株型育种的进程。
Description
技术领域
本发明属于植物基因工程技术领域，具体涉及鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记SWU-sdA03和引物及其应用。
背景技术
甘蓝型油菜作为世界上重要的油料作物，菜籽油在食用油产业有着举足轻重的地位。但由于长时间的人工选择和对产量的不断追求，目前长江流域甘蓝型油菜主栽区的油菜品种大多具有植株高大、角果层厚重的特点，加上油菜本身扎根浅，所以倒伏就成了限制油菜生产的最大因素。鉴于水稻和小麦中“绿色革命”取得的成功，近年来油菜育种家也做了很多类似的的尝试，控制油菜株高的基因和QTL区间被不断报道。
甘蓝型油菜(AACC,n＝19)是由白菜(AA,n＝10)与甘蓝(CC,n＝9)通过自然种间杂交后双二倍化进化而来的一种复合种，其基因组庞大，基因结构组成复杂；A亚基因组和C亚基因组的高度相似性加大了分子标记的开发局限性。株高作为最直接的表型之一，是典型的多基因控制的数量性状，其发育除同时受到多个遗传位点调控以外，还极大程度地受到外部环境的影响，这也给标记的利用增加了难度。利用传统育种从不同亲本汇集多个相关QTL以满足育种需求难度很大，工作过程也很繁琐。虽然大量的与株高相关的QTL被发现，但是已经明确控制株高的基因大多具有一因多效，在降低株高的同时会带来一系列的负面效应并最终导致产量大大降低。控制株高性状的QTL被育种家通过多种群体发现，但却少有用于实际生产，主要原因就是缺乏与候选基因紧密连锁的且具有稳定筛选效果的分子标记。因此寻找合适的矮化、半矮化育种资源，挖掘新的控制株高的遗传变异位点对加快油菜产业更好发展至关重要。
发明内容
为解决上述技术问题，鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记SWU-sdA03和引物及其应用，可以进行精准的矮化分子标记辅助选择育种、减少基因聚合育种中的繁琐操作，加快甘蓝型油菜优良株型育种的进程。
本发明提供的技术方案如下：
鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记在育种中的应用，其特征在于，所述分子标记位于甘蓝型油菜A03染色体上的BnaA03.IAA7基因，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第856位碱基存在C/T突变；当分子标记的基因型为TT时，甘蓝型油菜为半矮秆，选择基因型为TT的甘蓝型油菜用于后续育种。所述分子标记的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示。所述分子标记的CDS序列如SEQ ID NO.3所示。所述分子标记的编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
本发明还提供一种引物，所述引物用于扩增上述分子标记。
进一步的，所述引物的序列为：
SWU-sdA03F1:
GCCAACATAGTTAAAATAGTAATTAATTATAACTAAATA；
SWU-sdA03R1:CTCGTAGCTTGGAACATATTCGGAACTGTTCAAC；
SWU-sdA03F2:CTATAATGAAGCCAACATAGTTAAAATAG；
SWU-sdA03R2:
CTTGTCTTCTGCTGAGTCATCATGTTCTTCCTGTAGTTCCCTGCA。
本发明还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含上述引物。
本发明还提供上述引物在鉴定半矮化甘蓝型油菜中的应用。
本发明还提供一种鉴定甘蓝型油菜株高性状的方法，检测待测甘蓝型油菜基因组中上述分子标记的基因型。
进一步的，采用上述引物对待测甘蓝型油菜的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行酶切并进行多态性分析。
进一步的，检测结果为单一200bp条带的为半矮秆油菜。
进一步的，利用SWU-sdA03F1/R1引物对亲本、F1代和F2代单株基因组DNA进行第一轮PCR扩增，利用第一轮PCR产物做模板，SWU-sdA03F2/R2引物对进行第二轮PCR扩增，对第二轮PCR产物进行酶切并进行多态性分析。
本发明还提供一种培育半矮秆甘蓝型油菜的方法，对甘蓝型油菜的基因型进行鉴定，筛选上述分子标记中基因型为TT的甘蓝型油菜，所述基因型为TT的甘蓝型油菜通过上述方法鉴定得到。
本发明利用BSA-seq技术、图位克隆和转录组测序技术，精准选择候选SNP位点并设计dCAPS分子标记用于辅助选育甘蓝型油菜矮化新种质。
本发明指出一个存在于BnaA03.IAA7基因内部的SNP位点；并基于该位点开发了分子标记。该分子标记与株高性状在所用群体中完全连锁，具有准确区分杂交后代株高性状的能力。使用该标记选择出在该位点基因型为TT的后代，即为半矮化筛选目标，将目标株系用于下一步育种工作，即完成所述的甘蓝型油菜矮化分子标记育种。
上述SNP位点的检测方法是基于结合巢式PCR技术和dCAPS标记实现的。第一轮PCR反应使用引物对SWU-sdA03F1/R1对各材料基因组DNA进行扩增得到特异位于A03染色体上长度为694bp的目标片段。以第一轮PCR反应产物为模板，使用SWU-sdA03F2/R2引物对做第二轮PCR扩增得到包含设计PstI酶切位点的200bp目标片段。第二轮PCR反应产物经限制性内切酶PstI酶切后形成dCAPS标记。琼脂糖凝胶电泳显示只有159bp条带的为正常株高材料，基因型为CC；只有200bp条带的为半矮化材料，基因型为TT；同时具有两条带的为中间型材料；基因型为C/T。
上述用于检测与甘蓝型油菜株高相关的dCAPS标记在分子标记辅助选择育种中的应用。
有益效果
为了实现油菜产业的飞跃性发展，本发明根据油菜株高相关基因Bna.A03.IAA7提供了一个变异位点并设计相关dCAPS标记。该标记特异性靶向本发明提供的变异位点，利用该标记可以在其杂交后代中广泛筛选鉴定半矮化甘蓝型油菜株系。得益于该位点对表型的贡献率大，避免了多个QTL聚合的过程，可以有效降低选择工作量，缩小育种规模，缩短育种年限。
本发明基于BSA-seq、图位克隆和转录组测序技术确定了一个与油菜株高完全连锁的SNP位点并设计分子标记SWU-sdA03，利用该标记可以准确鉴定特异位于A03染色体上的遗传位点并在其杂交后代中的筛选半矮化甘蓝型油菜株系。该位点对表型的贡献率大，单个位点即可实现矮化育种，避免了聚合育种的繁琐过程；同时该位点有效减少或避免了外部环境的影响，降低了选择工作量和选择难度，加快了育种进程。
本发明指出的SNP位点对甘蓝型油菜株高的影响明显，具备单独用于半矮化育种的潜力。本发明公布的分子标记是基于候选SNP位点设计的，与株高性状完全连锁，实现了基因型与表型的完全统一。此外，该标记是共显性标记，可以区分杂合基因型，且操作简单，只需要两次PCR和一次酶切反应即可进行琼脂糖电泳观察。
由于甘蓝型油菜基因组中存在BnaA03.IAA7的多个同源基因，且在候选SNP附近序列高度一致；本发明基于巢氏PCR原理设计了两对引物用于特异性扩增候选SNP附近的片段；且第二轮PCR产物的长度适合进一步设计dCAPS标记。
由于本发明指出的SNP位点在不同油菜品种中非常保守，所以对应的分子标记具有非常广的适应性，在本发明使用的3个F2代群体中都表现出非常好的基因型区分效果。
因此，本发明提供的一个与甘蓝型油菜株高完全连锁的SNP位点及配套的鉴定该位点的dCAPS标记具有重要的应用价值。利用该位点和配套的鉴定标记可以进行精准的矮化分子标记辅助选择育种、减少基因聚合育种中的繁琐操作，加快甘蓝型油菜优良株型育种的进程。
附图说明
图1：sdA03半矮化油菜与中双11的表型图。
图2：BSA测序定位候选区间BnaSD.A03。a：F2代群体中高/矮两种极端混池的SNP-index值。b：确定位于A03染色体上的候选区间BnaSD.A03。
图3：候选基因的图位克隆。
图4：BnaA03.IAA7的基因结构和候选SNP位点分析。
图5：本发明提供的分子标记对本发明指出的SNP位点三种不同基因型的区分效果(部分展示)。1、2和3泳道分别表示以ZS11、sdA03和它们的F1基因组DNA为模板进行第二轮PCR扩增的产物。4-24泳道表示以不同模板进行第二轮PCR扩增的产物经酶切后的电泳效果。4-10泳道表示以ZS11基因组DNA为模板；11-17泳道表示以sdA03基因组DNA为模板；18-24泳道表示以ZS11和sdA03的杂交F1代基因组DNA为模板。
图6：本发明提供的分子标记对本发明指出的SNP位点在3个不同F2代群体中的基因型区分效果(部分展示)。a、b和c分别代表本发明提供的分子标记对中双11、资源种18Z020和20Z289与sdA03突变体杂交并自交获得的F2群体中三种株高类型单株的基因型区分效果。图a、b和c中的1-8泳道代表F2群体中正常株高的单株，9-16泳道代表明显半矮化的单株，17-24泳道代表中间型株高的单株。
具体实施方式
实施例1
甘蓝型油菜半矮化突变体sdA03的遗传定位
ZS11(中双11，成熟期株高为189.3±3.7cm)种子经EMS(甲基磺酸乙酯)诱变后，筛选纯化得到稳定遗传的半矮化突变体sdA03，成熟期株高为123±1.5cm(图1)。选择具有正常株高的资源品种17Z330与sdA03杂交得到F1代，然后F1代自交得到F2代，同时选择17Z330与F1代回交得到BC1代。通过考察F1、F2和BC1群体中单株的性状，经卡方检测发现，sdA03半矮化性状受一对等位基因不完全显性控制。通过测量F2代群体中单株的成熟期株高，选择高/矮两种极端单株各30株提取DNA并等量混匀构建混池。同时构建两个亲本池，一起进行全基因组测序。对鉴定出的SNP位点进行统计分析计算其SNP-index值，结合高/矮两种极端混池的SNP-index值，计算Δ(SNP-index)并作图。如图2所示，在A03染色体上存在唯一的候选区间，区间长2.57Mb。
通过在候选区间内选择设计SSR(Simple Sequence Repeats)和InDel(insertion-deletion)分子标记对候选区间进行验证并缩小。该过程使用的群体材料是上述F2群体中具有正常株高的350个单株，一共使用了7个多态性分子标记，包括2个SSR标记和5个InDel标记。最终候选基因被定位在一个0.59Mb的区间内，标记InDel 6和InDel 7与候选基因在所用群体中完全连锁(图3)。
实施例2
转录组测序
为进一步了解sdA03矮化的原因，我们同时取发芽7天的ZS11和sdA03幼苗下胚轴做转录组测序。分析结果显示，两个材料之间一共有1027个差异表达基因，其中567个基因在sdA03幼苗下胚轴中上调表达，460个基因下调表达。通过KEGG(Kyoto Encyclopedia ofGenes and Genomes)富集分析发现下调基因显著富集在植物激素信号转导途径。将富集到的基因在多个激素途径中进一步划分发现，大多数基因与生长素转导相关。
实施例3
候选基因分析
通过前期的基因定位工作发现候选基因位于A03染色体上一个0.59Mb的区间内。结合转录组测序的结果，我们筛选了候选区间内与生长素相关的基因，一共有三个，分别是BnaA03g36940D(IAA2)、BnaA03g36950D(IAA7)和BnaA03g36890D(AGG2)。克隆测序并比对组合亲本间的序列差异发现，两个亲本只有在BnaA03g36950D(IAA7)的ORF区域存在一个非同义替换(C→T)，导致编码的氨基酸由脯氨酸变成亮氨酸(P→L)(图4)，位于SEQ ID NO.4的第87位。综合上述分析，BnaA03.IAA7被认为是候选基因，其包含的SNP位点被认为是引起植株矮化的原因。
实施例4
dCAPS标记SWU-sdA03的开发
在前期得到sdA03突变体中基因BnaA03g36950D(IAA7)存在SNP位点的基础上，我们设计了结合巢式PCR的dCAPS标记来区分该位点的基因型。比较发现BnaA03g36950D(IAA7)在油菜基因组上有多个同源且各同源在候选SNP位点附近序列高度一致。为了避免其他同源基因的干扰，我们根据候选SNP位点信息，结合同源基因在附近区域的序列比对结果，通过引物设计软件Primer Premier5设计了特异扩增A03染色体该区域的引物，引物对碱基序列如下：
SWU-sdA03F1:GCCAACATAGTTAAAATAGTAATTAATTATAACTAAATA(SEQ ID NO.5)
SWU-sdA03R1:CTCGTAGCTTGGAACATATTCGGAACTGTTCAAC(SEQ ID NO.6)
利用该引物对，可特异扩增位于A03染色体上的目标区段，排除同源区段的干扰。
由于候选SNP位点处不存在直接的限制内切酶识别位点，无法开发CAPS标记，因此利用dCAPS Finder 2.0网站(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)设计dCAPS标记。提取候选SNP位点上下游各30bp序列导入WT序列框，然后手动将该序列中SNP位点的C改为T后导入Mutant序列框，选择错配碱基数目为3，进行引物设计，并从中选取实验室常用的限制性内切酶PstI作为开发对象，引入错配碱基CTG形成PstI酶切位点CTGCAG，获得反向引物SWU-sdA03R2。在该SNP位点上游154bp处设计正向引物SWU-sdA03F2。引物对碱基序列如下：
SWU-sdA03F2:CTATAATGAAGCCAACATAGTTAAAATAG(SEQ ID NO.7)
SWU-sdA03R2:
CTTGTCTTCTGCTGAGTCATCATGTTCTTCCTGTAGTTCCCTGCA(SEQ ID NO.8)
上述引物对即为本发明开发的结合巢式PCR的dCAPS标记。
利用该特异性标记筛分甘蓝型油菜半矮化材料的具体操作如下。
利用SWU-sdA03F1/R1引物对亲本、F1代和F2代单株基因组DNA进行第一轮PCR扩增，利用第一轮PCR产物做模板，SWU-sdA03F2/R2引物对进行第二轮PCR扩增，对第二轮PCR产物进行酶切并进行多态性分析。
所述第一轮PCR扩增具体操作如下：
第一轮PCR反应体系：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM的引物SWU-sdA03F1/R1各1μL，100ng/μLDNA模板1μL，ddH2O补齐至25μL；
第一轮PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环；72℃延伸10min。
所述第二轮PCR扩增具体操作如下：
第二轮PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 12.5μL，10μM引物SWU-sdA03F2/R2各1μL，上述第一轮PCR扩增产物1μL，ddH2O补齐至25μL；
第二轮PCR反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸10s，25个循环；72℃延伸5min。
所述酶切具体操作如下：
第二轮PCR反应产物用限制性内切酶PstI酶切的反应体系为：10×FastDigestBuffer 1μL，PCR产物3μL，PstI限制性内切酶1μL，ddH2O补齐至10μL；
酶切反应程序：37℃酶切2h；65℃终止10min
取5μl酶切产物在2.5％的琼脂糖凝胶上进行电泳检测，电泳条件为160V，25分钟。
电泳检测结果如图5所示，所述SNP位点基因型为CC的品种(正常株高)PCR扩增产物经PstI酶切后为单一的159bp片段，电泳检测条带以低带(第4-10泳道)呈现；基因型为TT的品种PCR扩增产物经PstI酶切后为单一的200bp片段，电泳检测条带以高带(第11-17泳道)呈现，杂交所得F1代(中间型株高)PCR扩增产物经PstI酶切后为双带，即159bp和200bp条带共存(第18-24泳道)。上述结果表明标记SWU-sdA03具有很高的特异性和辨识度，其能够清晰准确地将该位点的3种基因型区别开。
实施例5
dCAPS标记的应用
为进一步检验并应用本发明提供的分子标记对候选位点的区分效果。我们分别以中双11，资源种18Z020，20Z289分别与sdA03突变体杂交获得F1代，然后自交获得3个F2代群体，在苗期单株取叶片冻存于-20℃备用。根据成熟期株高的测量结果，从三个群体中分别选择正常株高、中间型和半矮化材料各30株提取DNA做基因型检测。
用CTAB法提取植株DNA，用Nanodrop分光光度计检测DNA浓度，加ddH2O将所有DNA浓度调整为100ng/μL。按照本发明提供的引物序列和检测程序对候选SNP位点基因型进行检测。部分检测结果如图6所示：在三个群体中拥有正常株高的单株都表现出159bp单带基因型，类似亲本的半矮化单株都表现出200bp单带基因型，中间型单株则统一表现为159bp和200bp条带共存。这说明基于本发明提供的SNP位点及对应的分子标记可以准确预测杂交后代株高性状，显著提高该材料在油菜矮化育种上的选择速度。
BSA的全称是bulked segregant analysis，中文名叫集群分离分析法，是指利用目标性状存在极端表型差异的两个亲本构建家系，在子代分离群体中，选取两组表型差异极端的个体分别构建混合池，结合高通量测序技术对混合样本测序，检测与目标性状相关联的位点并对其进行注释。
dCAPS标记：针对CAPS标记的不足而优化改进的一种标记，对PCR扩增的DNA片段的限制性内切酶识别位点内引入SNP进行限制性酶切分析。它是根据EST或已发表的基因序列等设计特异引物，将特异PCR与限制性酶切相结合而检测多态性的一种技术。
SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.2
SEQ ID NO.3
SEQ ID NO.4
MIGQLMNLNATELCLGLPGGTKAVESPAKSSVRNKRGFSETMDLMLNLQCNKEETVDLNNATASKEKTLLKDPAKPPAKAQVVGWPPVRNYRKNMMTQQKTSGEEEASSEKAGNGGGAALVKVSMDGAPYLRKVDLTMYKSYQDLSDALAKMFSSFTMGNYGAQGMIDFMNESKLMNLLNSSEYVPSYEDKDGDWMLVGDVPWEMFVQSCKRLRIMKGSEAIGLAPRAMEKYCKNRS。
Claims (10)
1.鉴定半矮化甘蓝型油菜的分子标记在育种中的应用，其特征在于，所述分子标记位于甘蓝型油菜A03染色体上的BnaA03.IAA7基因，所述分子标记的序列如SEQ ID NO.1所示，所述SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列自5’端起第856位碱基存在C/T突变；当分子标记的基因型为TT时，甘蓝型油菜为半矮秆，选择基因型为TT的甘蓝型油菜用于后续育种。
2.一种引物，其特征在于，所述引物用于扩增权利要求1所述的分子标记。
3.根据权利要求2所述的引物，其特征在于，所述引物的序列为：
SWU-sdA03F1:
GCCAACATAGTTAAAATAGTAATTAATTATAACTAAATA；
SWU-sdA03R1:CTCGTAGCTTGGAACATATTCGGAACTGTTCAAC；
SWU-sdA03F2:CTATAATGAAGCCAACATAGTTAAAATAG；
SWU-sdA03R2:
CTTGTCTTCTGCTGAGTCATCATGTTCTTCCTGTAGTTCCCTGCA。
4.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求2或3所述的引物。
5.权利要求2或3所述的引物在鉴定半矮化甘蓝型油菜中的应用。
6.一种鉴定甘蓝型油菜株高性状的方法，其特征在于，检测待测甘蓝型油菜基因组中权利要求1所述的分子标记的基因型。
7.根据权利要求6所述的鉴定甘蓝型油菜株高性状的方法，其特征在于，采用权利要求2或3所述的引物对待测甘蓝型油菜的基因组DNA进行PCR扩增，对PCR产物进行酶切并进行多态性分析。
8.根据权利要求6所述的鉴定甘蓝型油菜株高性状的方法，其特征在于，检测结果为单一200bp条带的为半矮秆油菜。
9.根据权利要求7所述的鉴定甘蓝型油菜株高性状的方法，其特征在于，利用SWU-sdA03F1/R1引物对亲本、F1代和F2代单株基因组DNA进行第一轮PCR扩增，利用第一轮PCR产物做模板，SWU-sdA03F2/R2引物对进行第二轮PCR扩增，对第二轮PCR产物进行酶切并进行多态性分析。
10.一种培育半矮秆甘蓝型油菜的方法，其特征在于，对甘蓝型油菜的基因型进行鉴定，筛选权利要求1所述分子标记中基因型为TT的甘蓝型油菜，所述基因型为TT的甘蓝型油菜通过权利要求6～9任一项方法鉴定得到。
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