CN115976265A - 与大豆百粒重相关的caps标记及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种与大豆百粒重相关的CAPS标记及其应用。本发明与大豆百粒重相关的CAPS标记含有大豆Glyma.19G194500基因如SEQ ID NO:1所示序列第673bp处的多态性为A或C的核苷酸序列。根据该标记，建立了鉴定和选育大豆百粒重品种的方法，通过检测Glyma.19G194500基因的基因型可选择出携带该基因大粒等位变异的材料，可避免耗时耗力的表型鉴定，通过基因型对育种材料进行筛选，极大提高了育种过程中大粒品种的选择效率、缩短育种时间，对于大粒品种的培育效果显著。

Description

与大豆百粒重相关的CAPS标记及其应用

技术领域

本发明涉及分子标记和植物遗传育种技术领域，具体地说，涉及一种与大豆百粒重相关的CAPS标记及其应用。

背景技术

大豆(Glycine max(L.)Merr.)是世界上重要的粮饲兼用作物。近年来我国大豆消费量快速增长，在耕地面积有限的条件下，如何有效提升单产是大豆育种中亟待解决的重大课题。亩株数、株荚数、荚粒数和百粒重是产量的主要构成因子。纵观大豆的选育历程，从野生到地方再到改良品种，籽粒不断加大，产量不断提升，表明百粒重与产量密切相关。

百粒重是典型的多基因调控的数量性状，利用传统育种方法培育大粒高产品种不但需要花费很长的时间，而且难于成功，不能够满足当前育种的发展，急需一种更为准确、高效的鉴定大豆粒重的方法。随着分子标记的开发和使用，分子标记辅助选择(Molecularmarker-assisted selection，MAS)成为可以节约人力、物力和加速育种进程的有效方法。MAS的最大优点是在不需要评估表型特征的情况下，通过确认是否带有目标基因而鉴定出大粒高产品种，能增加育种工作的效率和速度。

发明内容

本发明的目的是提供一种与大豆百粒重相关的CAPS标记及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种与大豆百粒重相关的CAPS标记，所述标记含有大豆Glyma.19G194500基因如SEQ ID NO:1所示序列第673bp处的多态性为A或C的核苷酸序列。

进一步地，标记所含多态性位点的基因型为AA，对应的大豆百粒重较小(5.57-33.84g)，若基因型为CC，对应的大豆百粒重较大(12.50-45.77g)。

第二方面，本发明提供用于扩增所述标记的引物，包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。

第三方面，本发明提供含有所述引物的检测试剂或试剂盒。

第四方面，本发明提供所述标记、所述引物或含有所述引物所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于大豆百粒重性状选育；

(2)用于大豆百粒重性状的早期预测；

(3)用于大豆Glyma.19G194500基因分型。

第五方面，本发明提供检测大豆百粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测大豆总DNA；

2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

优选地，步骤2)使用的PCR反应体系为：60ng基因组DNA、10×PCR缓冲液2μL，2mMdNTPs 1.5μL，2mM上、下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH₂O补足体积到20μL。

优选地，PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸10min。

前述的方法，步骤3)包括：利用DraIII-HF内切酶对PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为785bp目的条带，则待测大豆携带AA等位基因，对应的大豆百粒重较小；若酶切产物为676bp和109bp的两个目的条带，则待测大豆携带CC等位基因，对应的大豆百粒重较大。

优选地，酶切体系为：PCR扩增产物5μl、0.4U DraIII-HF内切酶、1.5μL NEB缓冲液，ddH₂O补足体积到10μL。

酶切条件：37℃酶切40min。

本发明提供的鉴定和选育大豆百粒重品种的方法，通过检测Glyma.19G194500基因的基因型可选择出携带该基因大粒等位变异的材料，可避免耗时耗力的表型鉴定，通过基因型对育种材料进行筛选，极大提高了育种过程中大粒品种的选择效率、缩短育种时间，对于大粒品种的培育效果显著。

附图说明

图1为本发明较佳实施例中引物I扩增4种材料DNA的结果；其中，1-4分别代表Williams82、东农50、大黄豆4和中特1号4个品种。

图2为本发明较佳实施例中PCR产物酶切后电泳结果；其中，1-4分别代表Williams82、东农50、大黄豆4和中特1号4个品种。

图3为本发明较佳实施例中48个品种PCR产物酶切后电泳结果。

图1～图3中，M为DNA Marker。

具体实施方式

本发明提供大豆基因组SNP位点的单核苷酸多态性或用于检测大豆基因组中如下SNP位点的单核苷酸多态性的物质在鉴定或辅助鉴定大豆百粒重中的应用。

本发明还提供一种用于鉴定或辅助鉴定大豆百粒重的试剂(包括SEQ ID NO:2-3所示引物)。

本发明还提供培育高产大豆新品种的新方法，即利用功能标记筛选优异等位基因，为基因聚合培育高产大豆新品种提供标记。

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1大豆百粒重相关CAPS标记的开发及应用

1、引物设计及标记开发

从phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)下载Glyma.19G194500基因序列，利用Primer5.0软件设计引物对I。利用在线软件CAPS Finder2.0(http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html)将SNP开发为CAPS标记(本发明所选取的标记位点信息如表1所示)，选用酶DraIII-HF(北京拜尔迪生物技术有限公司，货号：DE-R3510V)进行酶切分析。引物对I的PCR扩增产物长度约为785bp(SEQ ID NO:1)。本发明所选取的SNP位点在大豆基因组中对应于序列表中序列1所示核苷酸序列的第673位；所述SNP位点处的核苷酸A或C。当所述SNP位点处的核苷酸为C(对应表1中的等位变异基因型CC)时，引物对I的PCR扩增产物经DraIII-HF酶切后理论上可获得676bp和109bp两个片段。当所述SNP位点处的核苷酸为A(对应表1中的等位变异基因型AA)时，引物对I的PCR扩增产物不能被DraIII-HF酶切，产物大小为785bp。

引物对I：

F：5’-GGAGGAAGCATTAATTAGGAGTC-3’(SEQ ID NO:2)；

R：5’-CTCACTGCACCAACATGC-3’(SEQ ID NO:3)。

表1标记位点信息

标记类型	变异类型(SNP)	所在基因	染色体	等位变异基因型
					CAPS	A/C	Glyma.19G194500	19号染色体	AA、CC

2、利用已知大豆百粒重品种建立利用CAPS标记检测大豆百粒重的方法

供试待测大豆：4份已知大豆百粒重品种，Williams82、东农50、大黄豆4和中特1号。

(1)提取基因组DNA

按照快速DNA提取试剂盒(MBI Fermentas公司，货号：K0512)的操作指南提取大豆叶片DNA，提取待测大豆基因组DNA。

(2)PCR扩增

以各待测大豆基因组DNA为模板，用步骤(1)中的引物对I进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。

上述PCR反应体系为20μL，包括60ng基因组DNA、10×PCR缓冲液2μL，2mM dNTPs1.5μL，2mM引物2μL和1U Taq DNA聚合酶0.2μL(全式金生物技术有限公司，货号：AP112)，用ddH₂O补足体积到20μL。

上述PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，优化退火温度57℃30s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸10min；于4℃保存。上述PCR反应在ABI(AppliedBiosystems，美国)公司的PCR扩增热循环仪上进行扩增。

上述引物对I对应的PCR产物采用1％琼脂糖凝胶电泳检测，4份已知基因型Williams82、东农50、大黄豆4和中特1号大豆品种的DNA进行PCR扩增，所有4份材料均获得了785bp的与目标片段长度大小相近的单一PCR产物(图1)。

(3)酶切分析

引物对I得到的PCR产物经DraIII-HF内切酶完全酶切(酶足量)。

上述酶切反应体系10μL，PCR产物5μL、0.2μL DraIII-HF内切酶、1.5μL NEB缓冲液，用ddH₂O补足体积到10μL。酶切反应体系放入37℃保温箱或水浴锅中，酶切40min后取出，得到酶切产物。将DraIII-HF酶切产物采用2％琼脂糖凝胶电泳检测。若酶切产物为785bp目的条带，则待测大豆携带AA等位基因，若酶切产物为676bp和109bp的两个目的条带(测序检测大小)，则待测大豆携带CC等位基因(图2)。

4份已鉴定材料用引物对1的结果如图2所示。

小粒品种Williams82酶切产物785bp(即携带AA等位基因)；

小粒品种东农50酶切产物785bp(即携带AA等位基因)；

大粒品种大黄豆4(23.75g)酶切产物676bp和109bp(即携带CC等位基因)；

大粒品种中特1号(24.68g)酶切产物676bp和109bp(即携带CC等位基因)；

由以上结果可知，若所述待测大豆携带AA等位基因，Williams82和东农50百粒重较小，分别为19.51g和8.38g；若所述待测大豆携带CC等位基因，大黄豆4和中特1号则百粒重较大，分别为23.75g和24.68g。

实施例2CAPS标记检测大豆百粒重的具体应用

采用实施例1步骤2的方法对表2中的大豆品种分别进行PCR扩增和酶切试验。酶切结果如图3所示。

进一步对图3中的各大豆品种分别进行百粒重测定，结果如表2所示。

结果表明，可以用本发明的引物对I和方法对待测大豆进行大豆百粒重检测，鉴定准确。

表2结果显示，48个大豆品种中27个品种的目标扩增产物酶切后，只有一个785bp的片段，等位基因基因型为AA；21个大豆品种中酶切产物为676bp和109bp两个片段，等位基因基因型为CC。该结果与重测序数据一致，证明上述方法可以用于鉴定待测大豆百粒重基因型。

表2大豆品种SNP位点基因型

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.与大豆百粒重相关的CAPS标记，其特征在于，所述标记含有大豆Glyma.19G194500基因如SEQ ID NO:1所示序列第673bp处的多态性为A或C的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的标记，其特征在于，标记所含多态性位点的基因型为AA，对应的大豆百粒重较小，若基因型为CC，对应的大豆百粒重较大。

3.用于扩增权利要求1或2所述标记的引物，其特征在于，包括如SEQ ID NO:2所示的上游引物和如SEQ ID NO:3所示的下游引物。

4.含有权利要求3所述引物的检测试剂或试剂盒。

5.权利要求1或2所述标记、权利要求3所述引物或权利要求4所述检测试剂或试剂盒的以下任一应用：

(1)用于大豆百粒重性状选育；

(2)用于大豆百粒重性状的早期预测；

(3)用于大豆Glyma.19G194500基因分型。

6.检测大豆百粒重的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)提取待测大豆总DNA；

2)以DNA为模板，利用SEQ ID NO:2-3所示引物进行PCR扩增；

3)分析PCR扩增产物。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)使用的PCR反应体系为：60ng基因组DNA、10×PCR缓冲液2μL，2mM dNTPs 1.5μL，2mM上、下游引物各1μL，1U Taq DNA聚合酶0.2μL，ddH₂O补足体积到20μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤2)使用的PCR扩增程序为：94℃预变性4min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，36个循环；最后72℃延伸10min。

9.根据权利要求6-7任一项所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：利用DraIII-HF内切酶对PCR扩增产物进行酶切，若酶切产物为785bp目的条带，则待测大豆携带AA等位基因，对应的大豆百粒重较小；若酶切产物为676bp和109bp的两个目的条带，则待测大豆携带CC等位基因，对应的大豆百粒重较大。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，酶切体系为：PCR扩增产物5μl、0.4UDraIII-HF内切酶、1.5μL NEB缓冲液，ddH₂O补足体积到10μL；

酶切条件：37℃酶切40min。

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