CN101724629A - 植物组成型启动子Lip3及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种新的植物组成型启动子，特别是来源于拟南芥的假定型脂肪酶启动子Lip3，分离它的方法，包含它的重组表达载体以及其用于改善农产品特性的用途。本发明的植物组成型启动子可用于诱导组成型基因(如除草剂抗性基因和指示基因)表达，因为它可以表达与它的表达位点无关的外源基因。此外，它可以广泛地用于开发改善其有用特性的转基因植物。

Description

植物组成型启动子Lip3及其制备方法
技术领域
本发明涉及一种新的植物组成型启动子，特别是涉及来源于拟南芥属(Arabidopsis)的假定型脂肪酶启动子Lip3，分离它的方法，包含它的重组表达载体以及其用于改善农产品特性的用途。本发明的组成型启动子可应用于诱导组成型基因(如除草剂抗性基因和指示基因)表达，因为它可以表达与其表达位点无关的外源基因。而且，它可被广泛地用于研制改善其有用特性的转基因植物。
背景技术
通常针对转化，用于组成性或者组织-特异性的表达植物基因的启动子，按照它们的功能分类如下：
第一，诱导组成型基因表达的启动子。一种在植物中适宜的组成型启动子可以是来源于花椰菜花叶病毒(CaMV)的35S RNA基因启动子并且被用作双子叶植物的主要启动子。此外，稻类植物的肌动蛋白启动子和谷类的泛素启动子通常用作适合单子叶植物的组成型启动子。最近，稻类植物的细胞色素C(OsOcl)启动子也被国内研究人员研制出来并利用(韩国专利登记编号NO.10-0429335)。这些组成型启动子大多被引入用于植物转化的基本载体，以促进用作选择标记的抗生素抗性基因、除草剂抗性基因和指示基因的表达。因此，在研究方面阐明植物内部靶基因的功能时，它们被绝对优先考虑。
第二，种子-特异性启动子。种子-特异性启动子可以是稻类植物的主要贮藏蛋白启动子。实际上，稻类植物的谷蛋白启动子已被用于研制金色稻米并被广泛地应用于诱导单子叶植物的种子-特异性表达。而且，所述诱导双子叶植物基因表达的种子-特异性启动子可以是来源于豌豆的植物凝集素启动子、来源于卷心菜的napin启动子、来源于胡萝卜的DC-3启动子等。通过诱导拟南芥属植物种子中γ-生育酚甲基转移酶(γ-TMT)的基因表达，该DC-3启动子被用于增加维生素E的产生。此外，还尝试用来源于绿色紫苏的油质蛋白启动子促进种子-特异性表达并且已经申请了专利(韩国专利申请号NO.10-2006-0000783)。这些种子-特异性启动子在种子本身作为食粮、食品或者作为食物原料的种子作物中用于有用蛋白的积累以及有用物质的生成。
第三，在根部表达的特异性启动子。根部-特异性启动子还没有被商品化。然而，来源于拟南芥属植物的过氧化物酶(prxEa)已被分离并确定其在根部特异性地表达。此外，在从来源于甘薯的mads基因(ibMADS)和可诱导葡萄糖的ADP葡萄糖焦磷酸酶(AGPase)分离之后，一些启动子是最近报道与特异性的根部表达有关的。而且，这些启动子被证实可以促进短暂基因在胡萝卜和萝卜根部-特异性地表达，并且已经登记专利(韩国专利登记号NO.10-0604186和韩国专利登记号NO.10-0604191)。因此，可以预期这些根部-特异性启动子应该用在根部本身作为食粮、食品或者作为食物原料的根部作物中用于有用蛋白的积累以及有用物质的生成。
第四，对其它组织(如叶子)具有特异性的启动子。所述组织-特异性启动子可包括二磷酸核酮糖羧化酶/氧合酶小亚基(rbcS)启动子，其来源于稻类植物和谷类并强烈地诱导只在光合组织(如叶子)中的基因表达；RolD启动子，来源于土壤杆菌(Agrobacterium)并在植物中诱导根部-特异性表达；patatin启动子，来源于马铃薯并诱导块茎-特异性表达；八氢番茄红素合酶(PDS)启动子，来源于番茄并在成熟植物中诱导果实-特异性表达，和oleocin启动子，来源于卷心菜并确定可促进卷心菜花中花粉-特异性表达。本发明人也试图通过使用绒毡层(tapetum)特异性BcA9启动子来诱导细胞毒素Bt蛋白的基因表达。而且，我们已开发了雄性不育植株并申请了专利(韩国专利登记号No.10-0435143)。
如上所述，已经从植物的各种组织中发现了很多启动子并且报道了它们实现的效果。目前，正将它们在工业上研究和开发。然而，已经商品化或通过植物研究人员应用的大多数通用启动子仅仅属于上述提到的情况。因此，根据开发的意向，未来需要积极地开发更精确地控制基因表达的新的启动子。
为了解决上述问题，本发明人已经尝试开发新的植物组成型启动子。结果，现已确定来源于拟南芥属植物的脂肪酶启动子Lip3来组成性地表达外源基因。然后，通过使用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的低聚核苷酸引物组来扩增Lip3启动子区域。而且，包含所述启动子的重组表达载体已经构建并转化为拟南芥属植物。现已用组织化学染色和GUS活性的荧光测定、GUS转录等来研究得到的拟南芥属植物，以测定组成型表达的程度。所以，证实了本发明的组成型启动子会诱导与其表达位点无关的组成型表达。因此，本发明已经成功地完成。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种新的植物组成型启动子，其制备方法以及其用于改善农产品特性的用途。
为了实现上述提到的目的，本发明提供一种植物组成型启动子Lip3，其包含SEQ.ID.NO：1的部分或全部核苷酸序列。
另外，本发明提供包含所述植物组成型启动子的重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3(登记号：KACC 95086P)。
另外，本发明提供一种用于制备所述植物组成型启动子Lip3的方法，所述植物组成型启动子Lip3是通过用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的低聚核苷酸引物进行聚合酶链反应得到的。
此外，本发明提供一种用于在植物内组成性地表达靶蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)通过使用所述组成型启动子构建表达外源基因的植物表达载体；(2)用所述植物表达载体转化植物载体；和(3)将所述植物载体引入植物以表达外源基因。
本发明的其它优点、目的和特征将部分在随后的说明书中阐述，而部分内容在审查以下内容或学习本发明的实践部分后对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
很自然的是本发明的其它目的和优点可以通过特别是在编写说明书和权利要求以及附图中指出的结构来实现和获得。
附图说明
本发明的上述及其它目的、特征以及其它优点将从以下结合附图的详细描述更清楚地了解，其中：
图1描述了与阳性对照组相比较的本发明的AtLip3启动子基因，本发明的AtLip3启动子基因是在分别从拟南芥的根、叶、茎、花和长角果组织分离后通过使用具有特异性引物的总RNAs来扩增的(M：1Kb正型DNA梯度标示；AtLip3：拟南芥的脂肪酶基因；Co10：未转化的拟南芥；和EF1α：拟南芥的延长因子1α基因)；
图2描述了植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3的构建图(LB：左侧边缘；Tnos：nos终止子；BAR：除草剂抗性基因；Pnos：nos启动子；PAtLip3：脂肪酶启动子；P35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；Egfp：绿色荧光蛋白基因；GUS：蓝染色β-葡萄糖醛酸酶基因；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子；和RB：右侧边缘)；
图3描述了作为对照组的植物表达载体pBGWFS7-P35S的构建图；
图4描述了用所述植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3植物转化的拟南芥在由幼苗长成成熟植物期间的GUS活性的组织化学染色(Co10：未转化的拟南芥；P35S::GUS：作为对照组的转基因的拟南芥；PAtLip3::GUS：用植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的拟南芥；7D：7天大的拟南芥幼苗；21D：21天大的拟南芥植株；和42D：42天大的拟南芥植株)；
图5本发明的由AtLip3启动子表达GUS的转基因拟南芥与阳性对照组的定量荧光GUS试验的比较；
图6分别从用植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的拟南芥的根、叶、茎、花和长角果组织分离后通过使用具有特异性引物的总RNAs来扩增的本发明的启动子基因，与阳性对照组和GUS基因的比较。
具体实施方式
在下文，下面对本发明的进行如下的详细说明。
本发明提供一种用于植物组成型启动子的假定型脂肪酶基因启动子。
特别是提供包含SEQ.ID.NO：1的部分或全部核苷酸序列的植物组成型启动子Lip3。所述植物组成型启动子可包括来源于拟南芥物种(Arabidopsis sp.)的所有组成型启动子，但优选来源于拟南芥(Arabidopsis thaliana)的组成型启动子。
这种组成型启动子是一种尚未阐明其功能的新的基因启动子，并且可能相当于假定型脂肪酶基因中编码区上游的1,981bp序列。核苷酸序列SEQ.ID.NO：1可包含一个或多个被部分取代、删减或添加的修饰序列，但优选应具有大于90％序列同源性。
另外，本发明提供一对由SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的低聚核苷酸组成的引物并用于扩增所述组成型启动子。所述引物由分别具有32bp的正向引物和反向引物组成，以便特异性地扩增所述组成型启动子Lip3。所述引物可通过在现有技术中已经公开的低聚核苷酸的合成步骤来生产。除此之外，可在商业化合成之后购买它们。所述引物可以包含一个或多个在某一核苷酸序列内被部分修饰的核苷酸。上述修饰的核苷酸序列可以是基本上与通过用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的非修饰引物进行聚合酶链反应(PCR)所制备的，甚至经过删减、取代或添加的核苷酸序列相似的核苷酸序列。
另外，本发明提供一种用于制备所述植物组成型启动子Lip3的方法，所述植物组成型启动子Lip3是通过用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的低聚核苷酸引物进行聚合酶链反应得到的。
另外，本发明提供一种包含所述组成型启动子的重组表达载体。特别是提供包含SEQ.ID.NO：1的组成型启动子的重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3。
所述重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3已经存放到国家农业生物技术学会Genebank，一个国际存放组织(登记号码：KACC 95086P)。
除了SEQ.ID.NO：1的组成型启动子之外，所述重组表达载体也可包含一个或多个除草剂抗性基因和/或指示基因。所述除草剂抗性基因可以是BAR基因等，而所述指示基因可以是Egfp:gus基因等。
另外，本发明提供一种用包含所述植物组成型启动子的重组表达载体转化的植物转化体。特别是提供用包含SEQ.ID.NO：1的组成型启动子的重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的植物。所述植物可包括拟南芥属植物、根部作物如胡萝卜、甘薯和萝卜，药用植物如人参和土党参(Codonopsis lanceolata)，饲料作物如谷类，和粮食作物如稻类植物。而且，所述植物可包括各种双子叶植物。
另外，本发明提供从用包含所述组成型启动子的重组表达载体转化的植物中获得的种子。所述植物可包括拟南芥属植物、根部作物如胡萝卜、甘薯和萝卜，药用植物如人参和土党参，饲料作物如谷类，和粮食作物如稻类植物。而且，所述植物可包括各种双子叶植物。
此外，本发明提供一种用于在植物内组成性地表达靶外源蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)通过使用所述组成型启动子构建一个表达外源基因的植物表达载体；(2)用所述植物表达载体转化植物载体；和(3)将所述植物载体引入植物以表达所述外源基因。
能够通过组成型启动子被表达的外源基因可以是所有植物基因，但包括一个或多个除草剂抗性基因、选择性标记基因和/或指示基因。它可以包括任何改善食用植物遗传特性的有用基因，并进一步地用于在比较启动子能力等方面的各种研究。
按照以下实施例所示举例说明本发明的实际和目前优选的实施方案。
但是，应理解的是本领域的技术人员在考虑本公开后可在本发明的精神和范围内做出修饰和改进。
未在以下实施例中清楚地描述的一般性实验步骤应当参照“MolecularCloning”(Sambrook等人，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，第二版，1989年)。
实施例1、来源于拟南芥的假定型脂肪酶基因的表达模式的分析
为了检验来源于拟南芥的假定型脂肪酶基因的表达模式，从根、叶、茎、花和豆荚(包括生长的种子)分离总RNAs并通过进行逆转录酶-聚合酶链反应(RT-PCR)进行分析。用于分离总RNAs的方法更清楚地描述如下。将大约1g的各样品用搅拌缸超声处理并转入1.5ml试管。然后，加入500μl的RNA提取缓冲液(50mM乙酸钠(pH值5.5)、150mM LiCl、5mM EDTA、0.5％SDS)和500μl的苯酚并在各个试管中混合。该混合物在65℃反应10分钟，在旋转振荡器中反应15分钟，然后在4℃下以10,000转/分的速度离心10分钟。将得到的上层清液小心地倒入新试管并与500μl的氯仿混合均匀。然后，再次离心以收集上清液。之后，加入0.6容量的8M氯化锂(LiCl)并在20℃储存超过2小时。然后，将反应产物在4℃下以12,000转/分的速度再次离心20分钟。分别用4M LiCl和80％乙醇洗涤最终的RNA小球并溶于50μl蒸馏水中。
得到的RNA洗提液通过用UV分光光度计在260/280nm下测定光密度来定量。5μg用于模板的总RNA用50μM低聚dT引物，在50℃处理50分钟，并在85℃处理5分钟，然后在冰中冷却。之后，加入1μl的核糖核酸酶H并在37℃处理20分钟，以合成互补DNA(10X RT缓冲液、25mM MgCl2、0.1MDTT、核糖核酸酶OUT、SuperScriptTM RT)。将得到的互补DNA用作模板并利用对脂肪酶基因具有特异性的AtLip3引物，即，SEQ.ID.NO：2的Lip3-F引物和SEQ.ID.NO：3的Lip3-R引物进行PCR反应。为了均衡RNAs的相对量，使用对拟南芥的延长因子1α基因有特异性的引物，即，同时使用SEQ.ID.NO：4的EF1α-F引物和SEQ.ID.NO：5的EF1α-R引物进行所述PCR。在如下条件下进行连续的RT-PCR：在95℃下变性7分钟；95℃下进行30秒；在60℃退火30秒；72℃下进行30秒，重复40个循环；然后，在72℃反应7分钟。
结果，确定了在叶、茎、花和包括种子的豆荚的所有组织中发现有来源于拟南芥并组成性地表达的脂肪酶基因的转录物。在这种情况下，通过使用对拟南芥的延长因子1α有特异性的引物来调节RNA的相对量。
图1描述了与阳性对照组相比较的本发明的AtLip3启动子基因，本发明的AtLip3启动子基因是在分别从拟南芥的根、叶、茎、花和长角果组织分离后通过使用具有特异性引物的总RNAs来扩增的。此时，M是1Kb正型DNA梯度标示；AtLip3：拟南芥的脂肪酶基因；Co10：未转化的拟南芥；和EF1α：拟南芥的延长因子1α基因。
实施例2：包含脂肪酶基因lip3启动子的植物表达载体的构建
通过实施例1描述的步骤检验拟南芥的各个组织的表达模式。通过使用在拟南芥中已经公开的全部核苷酸序列来筛选对应于组成性地表达蛋白的脂肪酶基因。同样地，分离脂肪酶基因的起始密码子上游包括TATA box等的大约1.98kb区域(SEQ.ID.NO：1)。然后，通过使用Gateway载体pBGWFS7(从比利时的Gent University购买)，利用它构建用于分析PAtLip3启动子功能的重组载体。将从转化的拟南芥制备的少量叶组织加入到微量离心管并用基因组DNA纯化试剂盒(I.J.BIO DNA系统)提纯。通过用UV分光光度计测定A260/A280来定量得到的DNA洗提液。为了从拟南芥的基因组DNA特异性地扩增PAtLip3序列，所述拟南芥的基因组DNA可以包括当细菌被噬菌体感染时对细菌有特异性的部分重组体序列，按照下表1的描述构建SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的引物组(PLip3-B1引物和PLip3-B2引物)。然后，通过使用引物组，进行PCR(聚合酶链反应)以分离大约1.98kb的启动子区域。
<表1>
  引物   核苷酸序列
  PLip3-B1   5′-AAAAAGCAGGCTTAAGGAAGTTGAAGAGCTGG-3′
  PLip3-B2   5′-AGAAAGCTGGGTAGAGAGCTGAAGGTTGGTCT-3′
  PLip3-B1   5′-AAAAAGCAGGCTTAAGGAAGTTGAAGAGCTGG-3′
  PLip3-B2   5′-AGAAAGCTGGGTAGAGAGCTGAAGGTTGGTCT-3′
为了比较PAtLip3区域与通常用于转化双子叶植物的P35S启动子的启动子活性，构建包括部分细菌特异性核苷酸序列并扩增P35S启动子的SEQ.ID.NO：8和SEQ.ID.NO：9引物组(35S-F引物和35S-R引物)，以分离所述P35S区域。之后，将上述扩增的PCR产物通过使用SEQ.ID.NO：10和SEQ.ID.NO：11的引物组(B1接合引物和B2接合引物)进行PCR来再次扩增，所述引物可以包括当细菌被噬菌体感染时对细菌具有特异性的全部核苷酸序列。
另外，将第二次扩增的PCR产物通过BP重组反应引入到克隆载体pDONR221，该克隆载体可以包括对噬菌体感染具有特异性的核苷酸序列。然后，将其构建成重组克隆载体pDONR-PAtLip3和pDONR-P35S。为了完成用于植物转化的载体，将两种上述多克隆的载体经过LR重组，最后构建成重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3和pBGWFS7-P35S。在这一步骤中，将包含连接Egfp基因和Gus基因的内在指示系统的植物表达载体pBGWFS7用作二元载体。它同样包括用于微生物选择的壮观霉素抗性基因和用于植物选种的除草剂抗性基因Bar。通过用液氮进行重组质粒转化脓杆菌(Agrobacteria)转化，将上述制备的重组载体转入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV3101菌株(Holster等人，Freeze-thaw method，1978年)。然后，通过使用基于碱裂解的重组质粒转化脓杆菌快速筛选法将它们引入土壤杆菌(Agrobacterium)。
图2描述了植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3的构建图。此时，LB是左侧边缘；Tnos：nos终止子；BAR：除草剂抗性基因；Pnos：nos启动子；PAtLip3：脂肪酶启动子；P35S：花椰菜花叶病毒35S启动子；Egfp：绿色荧光蛋白基因；GUS：蓝染色β-葡萄糖醛酸酶基因；T35S：花椰菜花叶病毒35S终止子，和RB：右侧边缘。
实施例3、拟南芥属植物的转化和培养
通过以下步骤，用实施例2中构建的用于植物转化的表达载体转化拟南芥属植物。首先，将Columbia野生型拟南芥播种并在22℃培养(白天16小时/夜间8小时)大约4周。然后，除去最初的芽，其次生成最少3-4个芽。之后，用含0.5％蔗糖和2,500ppm吐温20的溶液将培养液稀释至大约OD 0.8，所述培养液包含用用于植物转化的重组载体转化的重组质粒转化脓杆菌。将得到的细胞悬浮液喷涂在花芽上以感染重组质粒转化脓杆菌。将感染的重组质粒转化脓杆菌在黑暗条件下培养过夜，并保持足够的湿度。然后，将它们用22℃的保温箱再培养4-5天(白天16小时/夜间8小时)。之后，在用相同步骤培养和稀释之后，将得到的重组质粒转化脓杆菌再次喷涂在花芽上。然后，将它们在黑暗条件下培养过夜，同时保持足够的湿度。进一步地，将它们在22℃的保温箱内培养大约3-5周(白天16小时/夜间8小时)，直到长角果组织完全成熟并变成棕色，然后收集种子。再次播种所述种子并在第10天第一次用0.3％BASTA喷涂和在第17天第二次用0.3％BASTA喷涂，以便选择T1代转化体。用22℃的保温箱将得到的T1转化植物培养大约2个月(白天16小时/夜间8小时)，直到长角果组织完全成熟并变成棕色，然后收集T2种子。
实施例4、转基因的拟南芥植物的GUS活性的组织化学染色
通过使用GUS染色经过以下过程来检验上述转化的拟南芥的组成型基因表达。首先，将用本发明的PAtLip3启动子及P35S启动子转化的T2种子播种、培养，并在第10天第一次用0.3％BASTA喷涂和在第17天第二次用0.3％BASTA喷涂。检查上述转化所得到的拟南芥植物，以根据各个组织(包括叶、茎、根、花、长角果等)的成长阶段观察GUS染色。作为对照组的未转化的拟南芥植物，在没有处理BASTA的情况下发芽。在播种7天、21天和42天后，将转基因的拟南芥植物浸泡在GUS试验缓冲液[溶液I：X-gluc(环己基铵盐)20mM；溶液II：NaH2PO4H2O 100mM、NaEDTA 10mM、Triton-X100 0.1％，pH值7.5]中并在37℃处理24小时。然后，用70％乙醇处理以除去叶绿素。使用光学显微镜观察得到的植物。
结果，P35S启动子转化体和PAtLip3启动子转化体从7天大的幼苗开始，在植物体全身被观察到GUS染色。与此相反，未转化的拟南芥完全没有出现GUS染色。即使是21天大的幼苗和42天大的植物，未转化的拟南芥也完全没有出现GUS染色，而发现P35S转化体和PAtLip3转化体在植物体全身出现了GUS染色。因此，证实了PAtLip3启动子是与P35S启动子一样是组成型启动子。
图4描述了用所述植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的拟南芥，在幼苗至成熟植物期间的GUS活性的组织化学染色。此时，Co10：未转化的拟南芥；P35S::GUS：作为对照组的转化的拟南芥；PAtLip3::GUS：用植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的拟南芥；7D：7天大的幼苗；21D：21天大的幼苗；和42D：42天大的拟南芥植株。
实施例5、转基因拟南芥的GUS酶活性的定量
经过以下过程使用荧光GUS试验来量化经上述转化的拟南芥的组成性表达。首先，为了测定本发明的PAtLip3启动子的GUS酶活性程度，分别从两种T2代拟南芥(用PAtLip3启动子转化的和用P35S启动子转化的拟南芥)以及未转化的拟南芥的叶、根、茎、豆荚和花中分离总蛋白。使用液氮用搅拌缸超声处理组织样品。将大约50mg的各样品转入1.5ml试管并与100μl蛋白质提取缓冲液[50mM磷酸钠(pH值7.0)、10mM二硫苏糖醇(DTT)、1mM乙二胺四乙酸二钠、0.1％SDS、0.1％Triton X-100]剧烈混合。得到的混合物在4℃下以15,000转/分的速度离心5分钟。将得到的上清液收集到一个新的试管中。然后，在调节到37℃后，将50μl所述上清液与50μl试验缓冲液(1.2mMMUGlu、10.0mM β-巯基乙醇的1X反应缓冲液；FluorAce β-葡萄糖醛酸酶指示器试验试剂盒，Bio-Rad)混合，并在37℃水浴条件下反应30分钟。进一步地，将各样品的反应产物与100μl的1X停止缓冲液均匀混合，并用荧光分光计分析(激发滤光器355nm，发射滤光器460nm)以测定其GUS活性。图5描述了与阳性对照组相比较，由本发明的AtLip3启动子表达的GUS酶活性的定量分析。结果，证实了PAtLip3启动子是能够将外源基因表达至几乎相同或大于P35S启动子水平的组成型启动子。
实施例6、通过进行RT-PCR在转基因的拟南芥植物中检测组成性表达
经过以下过程进行逆转录酶-聚合酶链反应来检验上述转化的拟南芥的组成性表达。首先，将上述转化的全部T 2种子播种并在培养后的第10天第一次用0.3％BASTA喷涂和在第17天第二次用0.3％BASTA喷涂。然后，从上述转化的拟南芥植物收集各种组织，如叶、茎、根、花和长角果(包括开花后3周的种子)。之后，经过与实施例1中描述的相同步骤，将10μg萃取的总RNA用作模板并用50μM低聚dT引物在50℃处理50分钟，在85℃处理5分钟，然后在冰中冷却。然后，再次加入1μl的核糖核酸酶H并在37℃处理20分钟，以便合成互补DNA(10X RT缓冲液、25mM MgCl2、0.1M DTT、核糖核酸酶OUT、SuperScriptTM RT)。将得到的互补DNA用作模板与对蓝染色基因具有特异性的GUS引物，即，SEQ.ID.NO：12的GUS-F引物和SEQ.ID.NO：13的GUS-R引物进行PCR反应。为了均衡RNAs的相对量，利用对拟南芥的延长因子1α基因具有特异性的引物，即，利用SEQ.ID.NO：4的EF1α-F引物和SEQ.ID.NO：5的EF1α-R引物进行所述PCR。在如下条件下进行连续的RT-PCR：在95℃变性7分钟；95℃下进行30秒；在60℃退火30秒；72℃下进行30秒，重复40次循环；然后在72℃反应7分钟。
结果，确定了在用PAtLip3启动子转化并组成性表达的拟南芥植物的叶、茎、花和长角果(包括种子)的所有组织中发现GUS基因的转录物。在这种情况下，通过使用对拟南芥的延长因子1α有特异性的引物来调节RNA的相对量。
图6描述了与阳性对照组和GUS基因相比较的本发明的启动基因，本发明的启动基因是在分别从用植物表达载体pBGWFS7-PAtLip3转化的拟南芥的根、叶、茎、花和种子组织分离后通过使用具有特异性引物的总RNAs来扩增的。此时，M是1Kb正型DNA梯度标示；GUS，β-葡萄糖醛酸酶基因；EF1α，拟南芥的延长因子1α基因；1、未转化的拟南芥的叶子；2、未转化的拟南芥的花；3、未转化的拟南芥的茎；4、未转化的拟南芥的种子；5、未转化的拟南芥的根；6、用PAtLip3基因转化的拟南芥的叶子；7、用PAtLip3基因转化的拟南芥的花；8、用PAtLip3基因转化的拟南芥的茎；9、用PAtLip3基因转化的拟南芥的种子；10、用PAtLip3基因转化的拟南芥的根；11、用P35S基因转化的拟南芥的叶子；12、用P35S基因转化的拟南芥的花；13、用P35S基因转化的拟南芥的茎；14、用P35S基因转化的拟南芥的种子；和15、用P35S基因转化的拟南芥的根。
如上举例说明和证实，本发明涉及一种新的植物组成型启动子，特别是来源于拟南芥的脂肪酶启动子Lip3，分离它的方法，包含它的重组表达载体以及其用于改善农产品特性的用途。本发明的组成型启动子可用于诱导组成型基因(如除草剂抗性基因和指示基因)表达，因为它可以表达与其表达位点无关的外源基因。而且，在未来它可被广泛地应用于开发改善其有用特性的转基因植物。
本领域的技术人员应当理解在上述说明书中公开的概念和具体实施方案可以容易地用作修饰或设计用于进行本发明相同目的的其它实施方案的基础。
本领域的技术人员还应当理解所附的权利要求中阐述的同等实施方案没有脱离本发明精神和范围。
以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。
序列表
<110>韩国(管理部门：农业发展管理机构)
<120>组成型启动子Lip3
<130>PA080071
<160>13
<170>Kopatent In 1.71
<210>1
<211>1981
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>1
taaggaagtt gaagagctgg taccgtttgt gatcgctact atttcttctg caatcacggt     60
aaacattctt gatcagccag ttccgggaat gactaaaaca tatttgtatc tacgctgata    120
attagtttgg taagaaaaaa cacatgtaca tgttacgttg ttttgaaact gaatgttgaa    180
ttcaggaatt ggtttgcatg ggaggaagaa cattcctagt tcctggaaat ttcccgatcg    240
gatactcagc atcctatttg acattataca aaacatcaaa caaggaagag tatgatcctc    300
taacaggatg tttgaaatgg cttaacgatt tctcagaata ctacaataag cagcttcagg    360
aagaactcaa cggactcagg aagttgtacc ctcatgtcaa catcatatat gctgattact    420
acaacgcttt gttgcgcctt ttccaagaac cagccaaatt cggttaggct tcttgaatcc    480
tccaagagat ttcttcacaa ccaagtcact catttgattc actaattaat taaccgattt    540
tattatccaa tcagggttta tgaacagacc cttgcccgct tgttgcggtg taggaggatc    600
ttacaacttc aactttagta gaagatgtgg gagtgtagga gttgaatact gcgatgatcc    660
ttcacagtat gtgaattatg atggcattca tatgacggag gcggcataca gattgatatc    720
tgagggctta ctcaagggac cgtatgctat tcctcctttc aagtggtctt gcctcagctc    780
cgagattatg aataagatgt cattagatac tcagattctt gatgaacagc tactacaagg    840
ttgtctgaaa gtttgagaga caagagaaag agtggaaaaa acatataggt tcttaagtgt    900
ttgtgtcttc ttcttttttg ttccgggtaa cggtgttaat tagccttagg tgcatcatgc    960
atgtgttgga tcatgtatta tctttgtatt gtattgtttt cgttagtttg ggtaagagtt   1020
agtatcctta attgttggac catgtacact gtcatatata atttaactat atacaaaaca    1080
attaaatgca taatttacgc atcgcgtggc caaatttcta gaatcaaata tggttttatg    1140
gtaagaaatc agaacactat gtaaatttga ttaacgatgg gactaattca gaaaaataaa    1200
taaatactaa gtctaaagaa atagttggga actggcggaa aaaaaaaagt tggagagtct    1260
ttaggtctaa acacatgtta catgtataaa aggaatttaa caaggttgta tacgtagtta    1320
cgtacattag gtgtttctct gttcgtgtgt acaaccgcat atttttaatc tttggatcat    1380
atagtgttga tgaatgtgta catcaactat tggagatata atgtattatg ctgtatacgt    1440
acaacagaat gttccaaaaa tctttcttct tttttttatt ttattttaaa tcggccccaa    1500
tggtgctata ataaacgaga aagccaaaaa tactacaaat aaaagcctca gtgatgggtt    1560
tatcgtttaa gcgaaagtga cgaaagagag gaaactagac agatacgaca gtaagttttg    1620
gtcatcgaag atacgtattg ggatccgctc acaagaattt gttgtgtgtc tttttgctaa    1680
aaggccaata cgaaaatcgt tgataattcg tttcatctac cgcaatcact ttatccttga    1740
ccaaaaaaag aaagaaataa ctcaaatatc aattttataa tcaaataaaa acttaaataa    1800
tcaaccaata tacccgtgtg tgtcaaacca tactgcatcc caataattga tcttttaatc    1860
attctttatt atcttatcct tggtattgtg gctagtgggg tattttcaaa agactttttt    1920
gacaaatcaa catcacacta ttaaaaaagg gatctcgacg gagaccaacc ttcagctctc    1980
t                                                                    1981
<210>2
<211>24
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>2
ccgtaggtag gaaatgtggg actg                                           24
<210>3
<211>28
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>3
atgaacatga tccaagacaa tactaagg         28
<210>4
<211>25
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>4
gtttcacatt aacattgtgg tcatt            25
<210>5
<211>24
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>5
gaggtaccag taatcatgtt cttg             24
<210>6
<211>32
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>6
aaaaagcagg cttaaggaag ttgaagagct gg    32
<210>7
<211>32
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>7
agaaagctgg gtagagagct gaaggttggt ct    32
<210>8
<211>29
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>8
Aaaaagcagg ctggtcccca gattagcct            29
<210>9
<211>29
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>9
Agaaagctgg gtcccgggga tcctctaga            29
<210>10
<211>29
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>10
ggggacaagt ttgtacaaaa aagcaggct            29
<210>11
<211>29
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>11
ggggaccact ttgtacaaga aagctgggt            29
<210>12
<211>24
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>12
acctgcgtca atgtaatgtt ctgc                 24
<210>13
<211>20
<212>DNA
<213>拟南芥
<400>13
ctccctgctg cggtttttca                      20

Claims (7)

1.一种植物组成型启动子Lip3，其包含SEQ.ID.NO：1的部分或全部核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的植物组成型启动子，其特征在于，所述组成型启动子是来源于拟南芥的植物组成型启动子Lip3。
3.一种制备权利要求1所述的植物组成型启动子Lip3的方法，该方法是通过用SEQ.ID.NO：6和SEQ.ID.NO：7的低聚核苷酸引物进行聚合酶链反应得到所述植物组成型启动子Lip3。
4.一种重组表达载体，其包含权利要求1所述的植物组成型启动子。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，其是重组表达载体pBGWFS7-PAtLip3。
6.用权利要求4所述的重组表达载体转化的植物转化体。
7.一种用于在植物内组成性地表达外源蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：(1)通过使用权利要求1所述的组成型启动子构建表达外源基因的植物表达载体；(2)用所述植物表达载体转化植物载体；和(3)将所述植物载体引入植物以表达所述外源基因。
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