CN104328214A - 一种多胎羊的检测方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种多胎羊的检测方法，具体步骤为：DNA的提取；引物和探针的设计；PCR-LDR反应；取1μLLDR连接产物与1μLABIGS500ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准，进行数据分析和基因分型。本发明利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，以碱基错配为基础，使用特异性引物和探针对特定片段DNA进行识别，具有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。

Description

一种多胎羊的检测方法
技术领域
本发明涉及分子生物技术领域，具体是一种多胎羊的检测方法。
背景技术
绵羊育种主要是改善其生长和繁殖性状。迄今为止已发现了一些控制这些生长和繁殖性状的基因，比如，BMPR-IB、BMP15和GDF9已被确认为绵羊的高繁殖力主效基因；黑素皮质素受体-4(melanocortin-4receptor，MC4R)是一类G-蛋白偶联受体，主要在下丘脑表达，在体重、能量平稳和采食量的调控中发挥重要作用；钙蛋白酶抑制蛋白(calpastatin，CAST)是钙蛋白酶系统的主要成员之一，它是钙激活蛋白酶的抑制因子，可以通过激活钙蛋白酶或降低钙蛋白酶抑制蛋白的活性来提高肌肉的嫩度，改善肉质。
随着分子遗传学的发展，利用分子标记辅助选择育种技术可以快速提高一些单胎品种双胎率，或者提高其胎产羔数，从而大幅度提高其繁殖力。分子标记辅助选择是通过分子生物学技术直接分析DNA分子的一些突变位点，可以准确判断基因型，而且不受时间的限制，可以做到早期选择。
目前检测DNA突变位点的方法一般采用限制性片段长度多态性技术和单链构象多态性技术，这两种方法依靠肉眼进行结果的观察，有时会出现判断错误，从而影响检测结果的可靠性。
发明内容
本发明的目的在于提供一种多胎羊的检测方法，利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，检测绵羊繁殖候选基因在绵羊中的多态性，从而判断出多胎羊。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种多胎羊的检测方法，具体步骤如下：
(1)DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20℃冻存后，采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA；
(2)引物和探针的设计：根据基因序列设计引物，同时根据LDR探针设计原则设计探针；
(3)PCR-LDR反应，分为PCR反应和LDR反应；
(4)数据分析和基因分型：取1μL LDR连接产物与1μL ABI GS 500 ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；进行数据分析和基因分型。
作为本发明进一步的方案：所述步骤(1)还包括采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
作为本发明进一步的方案：所述PCR反应包括以下小步骤：
1)准备20uL体系PCR Master Mix
在1.5ml离心管中分别加入10×PCR-buffer200ul，100mM Mg2+60ul，20mM/each dNTP200ul，5U/ul Taq酶20ul，4×Q-solution400ul，5pM primer40ul，最后加入980ul去离子水，充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ul基因组DNA；
2)将PCR反应管放入PCR仪进行反应，反应程序为：95℃变性15m，35个循环，每个循环有3个温度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；
3)反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功；
4)剩余样品保存于-20℃。
作为本发明进一步的方案：所述LDR反应包括以下小步骤：
1)准备10ul体系连接反应Mix
在PCR反应产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板；
2)在1.5ml离心管中分别加入10×buffer100ul，100ul Probe Mix，5ul连接酶，695ul去离子水，充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ulPCR反应产物；
3)将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应，反应程序为：95℃变性2m，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30s，50℃2m。
作为本发明进一步的方案：所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、MC4R基因和CAST基因。
作为本发明进一步的方案：所述方法还包括卡方检验、遗传参数和最小二乘方差分析。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性；同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低；具有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。
附图说明
图1是全血基因组DNA抽提结果电泳图；
图2是巴音布鲁克羊多羔小群谱系图；
图3是巴音布鲁克羊单羔家系谱系图；
图4是巴音布鲁克羊BMPR1B基因FecB突变位点的荧光-构象敏感凝胶电泳图；
图5是GDF9基因G1突变位点的荧光-构象敏感凝胶电泳图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一、主要仪器和设备：
PCR仪；PERKIN ELMER Gene Amp PCR system 9600、MJ PTC-200Gradient Cycler，爱普拜斯应用生物系统上海有限公司；
测序仪；ABI PRISM 377DNA Sequencer、ABI PRISM 3100DNA Sequencer，爱普拜斯应用生物系统上海有限公司；
电泳系统：电泳仪型号：JY600+，北京君意东方电泳设备有限公司；FR-200A全自动紫外与可见分析装置、生物电泳图像分析系统，上海复日科技有限公司；Agrose LE，上海捷倍思基因技术有限公司；
普通台式离心机、电热鼓风干燥箱；Axygene PCR microplate 96well；Axygene PCRtubes(0.2mL)；Eppendorf移液器(各量程)。
二、主要试剂：
AxyPrep-96全血基因组DNA试剂盒(AXYGEN，美国)；
PCR系统：Qiagen hotstar Taq酶体系(酶5u/ul，buffer，Q-solution，Mg2+)，Qiagen Hotstar，德国；dNTP(promega，2mM/each)，Promega，美国；
LDR系统：NEB Taq DNA ligase酶体系(酶5u/ul，buffer)，NEB，英国；
10M NaOH：取40gNaOH于灭RNase处理的烧杯，加入约70ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，定容到100ml，4℃保存；
1MTris-HCl(PH8.0)：取12.1gTris于灭RNase处理的烧杯，加入约80ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，浓盐酸调PH8.0，定容到100ml，4℃保存；
0.5M EDTA(PH8.0)：取18.61gEDTA于灭RNase处理的烧杯，加入约70ml无RNase的ddH2O，充分搅拌溶解，用10M NaOH调PH8.0，定容到100ml，4℃保存；
TE缓冲液：10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH8.0，4℃保存；
75％乙醇：取新开瓶无水乙醇75ml，加入经过灭RNase处理的试剂瓶，加入ddH2O25ml，4℃保存；
5×上样缓冲液：溴酚兰0.125g，32g甘油，灭菌水定容至50ml；
EB(10mg/ml)：50mgEB，加DEPC水5ml，分装成0.5ml的包装，避光保存；
5×TBE：Tris 54g，硼酸27.5g，20ml0.5mol/L的EDTA(pH8.0)，定容至1000ml。
三、检测对象
将新疆巴州和静县八棵树乡牧民的巴音布鲁克羊多羔家系20只羊的亲缘小群标记为群A，其谱系如图2所示，双羔率100％，将从新疆博湖县巴州种畜场的一个300多只巴音布鲁克羊母羊群中随机选出的100只成年母羊标记为群B，其谱系如图3所示，均产单羔；从内蒙古纯种德美种羊场选择2岁至7岁有产羔记录的德国肉用美利奴羊成年母羊254只(产羔记录包括1-6胎的数据，双羔率150％)、成年公羊27只；在新疆巴州和静、焉耆、库尔勒三个多浪羊养殖户中选择有产羔记录的多浪羊母羊83只(双羔率170％)。
实施例1BMPR-IB基因检测
一种多胎羊的检测方法，具体步骤如下：
(1)DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20℃冻存后，采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA，采用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性，如图1所示；
(2)引物和探针的设计：根据绵羊BMPR-IB基因序列(AF；312016)设计1对引物检测FecB突变，引物均采用Primer 5.0软件进行设计，同时根据LDR探针设计原则设计探针，PCR反应引物序列及LDR反应探针序列，如表1-表2所示。所有引物与探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
表1PCR反应引物序列
引物 引物序列(5′–3′) 产物长度/bp 退火温度/℃
FecB up GTCGCTATGGGGAAGTTTGGATG 142 53℃
FecB low TGTTGATGAGGCATGAAAACATCTTG
表2LDR反应探针序列
(3)PCR-LDR反应
PCR反应：
1)准备PCR Master Mix(20uL体系)
在1.5mleppendorf离心管中分别加入200ul PCR-buffer(10×)，60ul Mg2+(100mM)，200ul dNTP(20mM/each)，20ul Taq酶(5U/ul)，400ul Q-solution(4×)，40ul primer(5pM)，最后加入980ul去离子水。充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ul基因组DNA；
2)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：95℃变性15m，35个循环，每个循环有3个温度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；将PCR反应管放入PCR仪进行反应；
3)反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功；
4)剩余样品保存于-20℃。
LDR反应：
1)准备连接反应Mix(10ul体系)
在PCR反应产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板；
2)在1.5mleppendorf离心管中分别加入100ul buffer(10×)，100ul Probe Mix，5ul连接酶，695ul去离子水。充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ulPCR反应产物；
3)在Perkin-Elmer Gene Amp PCR Systems 9600上设置如下程序：95℃变性2m，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30s，50℃2m；将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应；
(4)数据分析和基因分型
取1μL LDR连接产物与1μLABI GS 500ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5％聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，应用GENESCANTM672软件进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；应用Genemapper软件进行数据分析和基因分型。剩余样品保存于-20℃。
(5)统计分析方法
哈代一温伯格平衡性检验检测基因型处于平衡状态或偏离平衡状态的程度。x2检验的适合性测定公式：
x 2 = Σ i = 1 n ( O i - E i ) 2 E i
式中，Ei-理论值，Oi-实际观察值，n-等位基因数。
遗传纯合度(Homozygosity，HO)：表示某一群体中特定位点上等位基因纯合程度的指标。
H O = Σ i = 1 n P i 2
其中：i为第i个等位基因，Pi为等位基因频率，n为等位基因数。
遗传杂合度(Heterozygosity，He)：与遗传纯合度相对，表示群体中某一特定位点上杂合子的比例，反映群体遗传变异程度的大小。
H e = 1 - Σ i = 1 n P i 2
其中：i为第i个等位基因，Pi为等位基因频率，n为等位基因数。
有效等位基因数(Effective Number of Alleles，Ne)：基因纯合度的倒数，反映等位基因间的相互影响，是衡量基因纯合度的另一指标。
N e = 1 / Σ i = 1 n P i 2
其中：Pi为某一位点上第i个等位基因的频率，n为等位基因个数。
多态信息含量(polymorphism information content，即PIC)：用于对标记基因多态性的估计。当PIC＞0.5时为高度多态，0.5＞PIC＞0.25时为中度多态，PIC＜0.25时为低度多态。
PIC = 1 - Σ i = 1 n P i 2 - Σ i = 1 m - 1 Σ j = i + 1 m 2 P i 2 P j 2
其中：pi和pj分别为第i和第j个等位基因在群体中的频率，m为等位基因数。
根据实验结果计算该位点的基因频率与基因型频率，对该位点基因型的分布进Hardy-Weinberg平衡的卡方适合性检验，并计算出遗传参数，用用卡方独立性检验对各群有突变位点的基因型间是否独立进行显著性检验。
请参阅图4，在BMPR-1B基因A746G突变位点(FecB)，巴音布鲁克羊的多羔小群(群A)得到了3种长度的LDR产物，表明了三种基因型的存在，而在对照组(群B)只得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态。图4中的左侧单峰表示BMPR1B基因FecB位点的纯合子AA基因型，中间双峰表示BMPR-1B基因FecB位点的杂合子AG基因型，右侧单峰表示BMPR-1B基因FecB位点的纯合子GG基因型，下方数字代表LDR的长度，值得注意的是，由于本实施例采用毛细管电泳，其信号较之平板电泳，均向左移约2bp，图4中各位点信号与其理论信号位置有所偏移。
BMPR-1B基因FecB位点的基因型及等位基因频率，如表3所示。
表3巴音布鲁克羊BMPR1B基因FecB位点的基因型及基因频率
由表3可以看出，群A以GA基因型分布为主，G和A等位基因频率分别为0.5和0.5，基因突变型与多羔性状存在一一对应关系，在该位点上群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(χ2＝0.16，P﹥0.1)；而群B都是AA基因型。
在巴音布鲁克羊A群，BMPR-1B基因FecB位点在群体中的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量，如表4所示，多态信息含量>0.5为高度多态，0.25<多态信息含量<0.5为中度多态，多态信息含量<0.25为低度多态。在该位点处，群体属于中度多态。
表4BMPR-1B基因FecB位点杂合度、有效等位基因数和多态信息含量
纯合度 杂合度 有效等位基因数 多态信息含量
群A 0.5 0.5 2.0 0.375
巴音布鲁克羊的群A与群B独立性检验结果，如表5所示，由表可知，FecB多态位点对巴音布鲁克羊群体的产羔性能具有极显著影响。(χ2＝98.75，P﹤0.005)
表5巴音布鲁克羊群A与群B的BMPR-1B基因FecB位点基因型独立性检验结果
在BMPR-1B基因A746G突变位点(FecB)，德国美利奴羊只得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态。
在BMPR-1B基因A746G突变位点(FecB)，多浪羊只得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态。
实施例2BMP15基因检测
一种多胎羊的检测方法，具体步骤为：
(1)DNA的提取：与实施例1相同；
(2)引物和探针设计
根据BMP15基因序列(NM-001114746)，及同一基因位置邻近突变合并检测的原则，对FecXH，FecXI，FecXL设计为同一引物序列，共设计4对引物检测FecXI、FecXH、FecXB、FecXL、FecXG、FecXR突变，引物均采用Primer 5.0软件进行设计，同时根据LDR探针设计原则设计探针，对于缺失突变位点(FecXR)不需另外设计特异性探针，只需对上游引物5’端进行FAM修饰。PCR反应引物序列及LDR反应探针序列，如表6-表7所示。所有引物与探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
表6PCR反应引物序列
表7LDR反应探针序列
续表7LDR反应探针序列
(3)PCR-LDR反应：与实施例1相同；
(4)数据分析和基因分型
对巴音布鲁克羊BMP15基因第二外显子上的6个突变位点片段的LDR结果进行分析，发现在FecXI、FecXH、FecXB、FecXL、FecXG、FecXR位点，LDR的长度分别是92bp(代表该位点的核苷酸是T)、87bp(代表该位点的核苷酸是C)、102bp(代表该位点的核苷酸是G)、99bp(代表该位点的核苷酸是G)、82bp(代表该位点的核苷酸是C)、189bp(代表该位点没有17bp的缺失)，每个突变位点只有一种长度的LDR产物，不存在多态。
对德国美利奴羊BMP15基因第二外显子上的6个突变位点片段的LDR结果进行分析，发现在FecXI、FecXH、FecXB、FecXL、FecXG、FecXR位点，LDR的长度分别是92bp(代表该位点的核苷酸是T)、87bp(代表该位点的核苷酸是C)、102bp(代表该位点的核苷酸是G)、99bp(代表该位点的核苷酸是G)、82bp(代表该位点的核苷酸是C)、189bp(代表该位点没有17bp的缺失)，每个突变位点只有一种长度的LDR产物，不存在多态。
对多浪羊BMP15基因第二外显子上的6个突变位点片段的LDR结果进行分析，发现在FecXI、FecXH、FecXB、FecXL、FecXG、FecXR位点，LDR的长度分别是92bp(代表该位点的核苷酸是T)、87bp(代表该位点的核苷酸是C)、102bp(代表该位点的核苷酸是G)、99bp(代表该位点的核苷酸是G)、82bp(代表该位点的核苷酸是C)、189bp(代表该位点没有17bp的缺失)，每个突变位点只有一种长度的LDR产物，不存在多态。
实施例3GDF9基因检测
一种多胎羊的检测方法，具体步骤为：
(1)DNA的提取：与实施例2相同；
(2)引物和探针设计
表8PCR反应引物序列
根据GDF9基因序列(AF；078545)，及同一基因位置邻近突变合并检测的原则，对G8，FecTT设计为同一引物序列，共设计2对引物检测G1，G8，FecTT突变，引物均采用Primer5.0软件进行设计。PCR反应引物序列及LDR反应探针序列，如表8-表9所示。所有引物与探针均由上海生工生物工程有限公司合成。
表9LDR反应探针序列
(3)PCR-LDR反应：与实施例2相同；
(4)数据分析和基因分型：与实施例2相同；
(5)统计分析方法：与实施例2相同；
1)卡方检验、遗传参数：与实施例2相同；
2)最小二乘方差分析
配合下列模型进行最小二乘方差分析，比较母羊产羔数在标记基因型之间的差异；Yijk＝μ+yeari+parityj+markerk+eijk
其中Yijk-个体表型的记录值；μ-群体平均值；yeari-第i个年固定效应；parityj-为第j个胎次固定效应；markerj-标记基因型效应；eijk-随机误差。
用SPSS 13.0软件GLM(General Linear Model)中的univariate过程完成。
请参阅图5，对巴音布鲁克羊的GDF9基因第一外显子的G1突变位点、第二外显子的G8突变位点和FecTT突变位点的LDR结果进行分析，发现G1突变位点有三种长度的LDR产物，而GDF9基因的G8位点得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是C)的LDR产物，只有纯合子基因型CC，不存在多态；GDF9基因的FecTT位点得到一种长度为117bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态；对德国美利奴羊的GDF9基因第一外显子的G1突变位点、第二外显子的G8突变位点和FecTT突变位点的LDR结果进行分析，发现G1突变位点有三种长度的LDR产物，而GDF9基因的G8位点得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是C)的LDR产物，只有纯合子基因型CC，不存在多态；GDF9基因的FecTT位点得到一种长度为117bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态；对多浪羊的GDF9基因第一外显子的G1突变位点、第二外显子的G8突变位点和FecTT突变位点的LDR结果进行分析，发现G1突变位点得到一种长度为109bp(代表该位点的核苷酸是G)的LDR产物，只有纯合子基因型GG，不存在多态；GDF9基因的G8位点得到一种长度为77bp(代表该位点的核苷酸是C)的LDR产物，只有纯合子基因型CC，不存在多态；GDF9基因的FecTT位点得到一种长度为117bp(代表该位点的核苷酸是A)的LDR产物，只有纯合子基因型AA，不存在多态。
巴音布鲁克羊GDF9基因G1位点的基因型及等位基因频率，如表10所示。
由表10可以看出，巴音布鲁克羊在GDF9基因G1位点以GG基因型分布为主，G和A等位基因频率在群A和群B分别为0.975、0.025；0.93、0.07，在该位点上群A与群B均处于Hardy-Weinberg平衡状态(χ2＝0.1486，P﹥0.1)。
巴音布鲁克羊的群A与群B独立性检验结果，如表11所示。由表11可知，群A与群B的GDF9基因G1多态位点对巴音布鲁克羊群体的产羔性能没有影响，χ2＝0.865，P﹥0.1。
表10巴音布鲁克羊GDF9基因G1位点的基因型及等位基因频率
表11巴音布鲁克羊群A与群B的GDF9基因G1位点位点基因型独立性检验
表12德国美利奴羊GDF9(G1)基因型频率及等位基因频率
德国美利奴羊GDF9基因G1位点基因型频率及等位基因频率，如表12所示。由表12可以看出，德国美利奴羊以GG基因型分布为主，G和A等位基因频率分别为0.79和0.21，在该位点上德国美利奴羊群体处于Hardy-Weinberg平衡状态(χ2＝0.0165，P﹥0.1)。
GDF9(G1)基因的多态位点在群体中的杂合度、有效等位基因数和多态信息含量，如表13所示，在该位点处，群体属于中度多态。
表13GDF9(G1)基因杂合度、有效等位基因数和多态信息含量
纯合度 杂合度 有效等位基因数 多态信息含量
群体 0.6682 0.3318 1.497 0.2768
德国美利奴羊产羔数与年度及胎次的相关性，如表14所示。
表14不同年度及胎次的德国美利奴羊产羔数的最小二乘均值及标准误
由表14可知：德国美利奴羊各年度的产羔数有差异，最低1.38只，最高1.75只，但差异不显著(P﹥0.05)；各胎次的产羔数有差异，最高1.88，最低1.34，其中第1胎与第2、3、4、6胎之间差异极显著(P﹤0.01)。
不同GDF9(G1)基因型德国美利奴羊产羔数的最小二乘均值及标准误，如表15所示。
表15不同GDF9(G1)基因型德国美利奴羊产羔数的最小二乘均值及标准误
基因型 样本数 最小二乘均值及标准误
GG 400 1.55±0.048
AG 279 1.59±0.053
AA 21 1.77±0.125
由表15可见，AA(突变型)德国美利奴羊平均产羔数比GG(野生型)多0.22只，但差异不显著(P>0.05)，AG(杂合型)德国美利奴羊平均产羔数比GG(野生型)多0.04只，但差异不显著(P>0.05)，结果表明GDF9基因的G1突变对德国美利奴羊繁殖力没有显著影响。
本发明利用连接酶检测反应技术及生物信息学技术，以碱基错配为基础，使用特异性探针对特定片段DNA进行识别，具有很高的准确性；同时，靶序列由引物和探针双重控制，特异性好、假阳性低；具有准确度高、通用性强、通量大、操作简单、成本低等优点。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (6)

1.一种多胎羊的检测方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）DNA的提取：从羊的颈静脉采血2ml，EDTA抗凝，血液充分混匀后-20℃冻存后，采用细胞裂解和蛋白去除液从冻存的抗凝全血中得到基因组DNA；
（2）引物和探针的设计：根据基因序列设计引物，同时根据LDR探针设计原则设计探针；
（3）PCR-LDR反应，分为PCR反应和LDR反应；
（4）数据分析和基因分型：取1μL LDR连接产物与1μL ABI GS 500 ROX荧光标记分子量标准和1μL去离子甲酰胺上样液混合，95℃加热变性2min，冰中骤冷，于含有5mol/L尿素的5%聚丙烯酰胺凝胶中电泳2.5h，进行数据收集、泳道线校正、迁移片段大小测量和校正内在分子量标准；进行数据分析和基因分型。
2.根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述步骤（1）还包括采用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA的完整性。
3.根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述PCR反应包括以下小步骤：
1）准备20uL体系PCR Master Mix
在1.5ml离心管中分别加入10×PCR-buffer200ul，100mM Mg2+ 60ul，20mM/each dNTP 200ul，5U/ul Taq酶20ul，4×Q-solution400ul，5pM primer40ul，最后加入980ul去离子水，充分混匀后离心，再取19ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ul基因组DNA；
2）将PCR反应管放入PCR仪进行反应，反应程序为：95℃变性15m，35个循环，每个循环有3个温度，94℃30s，56℃1m，72℃1m，最后在72℃延伸7m；
3）反应结束后，取2μl反应产物在3.0％琼脂糖胶，0.5×TBE中电泳，检测反应是否成功；
4）剩余样品保存于-20℃。
4.根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述LDR反应包括以下小步骤：
1）准备10ul体系连接反应Mix
在PCR反应产物中加入等体积ddH2O稀释，作为连接反应的模板；
2）在1.5ml离心管中分别加入10×buffer100ul，100ul Probe Mix，5ul连接酶，695ul去离子水，充分混匀后离心，再取9ul分装在200ul的PCR反应管中，最后再加入1ulPCR反应产物；
3）将PCR反应管放入PCR仪进行连接反应，反应程序为：95℃变性2m，35个循环，每个循环有2个温度，94℃30s，50℃2m。
5.根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述基因序列包括但不限于BMPR-IB基因、BMP15基因、GDF9基因、MC4R基因和CAST基因。
6.根据权利要求1所述的多胎羊的检测方法，其特征在于，所述方法还包括卡方检验、遗传参数和最小二乘方差分析。
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