CN105349535A - 扬子鳄抗病毒潜力检测的ⅰ类mhc基因的特异性引物及分型方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及用于一套扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类主要组织相容性复合物基因序列的单位点特异性引物及分型方法，引物的具体序列如SEQ？ID？NO.1～SEQ？ID？NO.8所示。本发明的扩增引物，在扬子鳄种群内具有稳定的单位点特异扩增能力，其扩增得到产物可以通过后续的单链构象多态性检测(single？strand？conformation？polymorphism,SSCP)实验对不同的个体进行基因分型，实现对种群中扬子鳄个体Ⅰ类MHC基因多态性的评估，检测其抵抗病毒性疾病的潜力，为扬子鳄保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。

Description

扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的特异性引物及分型方法

技术领域

本发明公开多对用于扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)基因序列的单位点特异性引物及分型方法。

背景技术

扬子鳄(Alligatorsinensis，Fauvel)属于爬行纲，鳄目，鼍科，短吻鳄亚科，鼍属，是一种古老的动物，起源于二亿三千万年前的三叠纪，被称为爬行动物中的“活化石”，为我国特有珍稀濒危动物、国家一级重点保护动物(1972)，在《濒危动植物国际贸易公约》(CITES)中被列入附录Ⅰ，同时被世界自然保护联盟(IUCN)归为极度濒危物种，是现存鳄类中受到威胁最大、最为濒危的物种之一。目前野生扬子鳄的数量仅约100条。

约2.3亿年前，扬子鳄的祖先与地球曾经的霸主恐龙生活在同样的环境中。然而，强大的恐龙在6500万年前神秘消失，鳄鱼却奇迹般生存了下来，并繁衍至今。作为一种古老的爬行动物，扬子鳄无论是形态还是行为上都保留着爬行类祖先的许多特征，是古生物学、物种演化过程研究中不可或缺的一个物种。

主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)为存在于脊椎动物染色体特定区域的一组连锁基因群，在脊椎动物免疫系统中起到关键作用，其编码的免疫细胞表面受体种类丰富，是免疫系统中呈递抗原和调节机体免疫应答反应过程中的重要作用因子。根据所呈递抗原类型的不同，MHC可以分为两大类：Ⅰ类和Ⅱ类，其中Ⅰ类MHC基因所编码蛋白的抗原结合区主要识别并结合内源性抗原(如病毒)的多肽，将其呈递给CD8+T细胞，并启动后续的免疫反应。因此，Ⅰ类MHC的抗原结合区(外显子2和3)普遍具有高度多态性，Ⅰ类MHC抗原结合区多态性高的个体能够更好的抵抗病毒的入侵。通过评估种群中Ⅰ类MHC多态性，保护工作者在进行新建种群选择奠基者与野外放归选择适应性能力强的个体等工作时，可以根据多态性高低进行科学地选择，在圈养种群进行人工配对时，亦可以选择具有不同等位基因的个体配成一对从而提高子代的多态性，增强子代对病毒性疾病的抵抗力。

在已有的扬子鳄MHC文献中，均是利用通用引物进行MHC基因的位点交叉扩增，其结果只能用于简单的进化分析。本而发明涉及的多对Ⅰ类MHC引物均经过大量实验重复验证，不仅能在扬子鳄种群中顺利扩增，展现出稳定的单位点特异性扩增能力，还能通过后续的单链构象多态性(SSCP)对扬子鳄Ⅰ类MHC基因进行基因分型，有效帮助我们评估种群中个体Ⅰ类MHC多态性，给扬子鳄保护工作带来了极大的便利。

发明内容

本发明目的是提供多对用于扩增扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因序列的引物及其分型方法。

一套用于扩增扬子鳄Ⅰ类MHC基因的单位点特异性引物，其引物具体序列为

引物对一：上游引物I1327E2F：GTGGGTAAGCGGCCCTCTGC(如SEQIDNO:1所示)；

下游引物I1327E2R：CTGCCCTCCCTGCCCCCCCCG(如SEQIDNO:2所示)；

引物对二：上游引物I1327E3F：AGGGGCCTGGATCTGTGTTTG(如SEQIDNO:3所示)；

下游引物I1327E3R：CCTGGTTAGTGCTGCCGTTA(如SEQIDNO:4所示)；

引物对三：上游引物I20E2F：GCCCGCTAGTGCTGACCATC(如SEQIDNO:5所示)；

下游引物I20E2R：CCTGCTCACACCTGCCTGCTA(如SEQIDNO:6所示)；

引物对四：上游引物I20E3F：TCAGCCTGGAAGCCCTCAA(如SEQIDNO:7所示)；

下游引物I20E3R：GGCGGGAATTGCCTGGGT(如SEQIDNO:8所示)；

本发明还公开了一种扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的分型方法，即采用上述各对引物，用10μLPCR体系在特定扩增条件下进行目标片段扩增，然后将扩增产物分别利用SSCP进行基因分型。

所述的10μLPCR体系为：扬子鳄血液DNA0.8μL，上下游引物各0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。

所述扩增引物I1327E2F/I1327E2R，I20E3F/I20E3R的PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环，最后72℃延伸10分钟。

所述扩增引物I1327E3F/I1327E3R，I20E2F/I20E2R的PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环，最后72℃延伸10分钟。

PCR结束后，均使用1％的琼脂糖凝胶加DL2000marker对PCR产物进行电泳检测，合格的产物存放于4℃冰箱。

所述引物I1327E2F/I1327E2R的扩增片段长度为366bp。

所述引物I1327E3F/I1327E3R的扩增片段长度为342bp。

所述引物I20E2F/I20E2R的扩增片段长度为323bp。

所述引物I20E3F/I20E3R的扩增片段长度为417bp。

所述对扬子鳄Ⅰ类MHC序列特定位点利用单链构象多态性(SSCP)基因分型的方法是：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，35W，电泳6-7h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

采用上述技术方案，可以有效扩增得到扬子鳄MHC经典基因座位，而且不会交叉扩增不同座位的等位基因或者产生无效等位基因。对扬子鳄不同群体、同一群体内不同个体进行MHC基因分型，其扩增得到产物可以通过后续的单链构象多态性检测(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)实验对不同的个体进行基因分型，实现对种群中扬子鳄个体Ⅰ类MHC基因多态性的评估，检测其抵抗病毒性疾病的潜力，为扬子鳄保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。另外，采用本技术方案，在涉及样本数较多的情况下，能迅速、高效地对不同个体Ⅰ类MHC等位基因进行SSCP分型，然后再对其中带型不同个体的基因进行测序，既避免了大规模测序所带来的浪费，也能缩短实验周期。

附图说明

图1是本发明对不同扬子鳄个体进行PCR扩增的电泳检测结果。图中所示泳道1-4、5-8、9-12分别表示利用I1327E2F/I1327E2R、I1327E3F/I1327E3R、I20E2F/I20E2R、I20E3F/I20E3R四对引物对三个不同的扬子鳄个体血液DNA进行PCR扩增所得产物片段。参照分子量标注依次是2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp。

图2是引物I1327E2F/I1327E2R、I20E3F/I20E3R扩增六个不同扬子鳄个体MHC基因所得产物进行SSCP分型后得到的电泳结果。图中所示泳道1-6表示这六个扬子鳄个体I1327E2F/I1327E2R扩增位点PCR产物的SSCP分型结果，泳道7-12表示表示对这六个扬子鳄个体I20E3F/I20E3R扩增位点PCR产物的SSCP分型结果。

图3是对十二个不同扬子鳄个体MHC基因的I1327E3F/I1327E3R扩增位点PCR产物进行SSCP分型后所得电泳结果。

图4是对十二个不同扬子鳄个体MHC基因的I20E2F/I20E2R扩增位点PCR产物进行SSCP分型后所得电泳结果。

具体实施方式

本发明的多对用于扩增扬子鳄Ⅰ类主要组织相容性复合物(majorhistocompatibilitycomplex,MHC)基因序列的引物，其基础为前期通过BAC测序所获得的MHC基因片段，根据MHC基因内含子有较大差异性的特点，使用PrimerPremier5设计位点特异性引物。我们研究重心放在MHC基因编码抗原结合区域的外显子2及外显子3上，在内含子1、2、3上设计引物，扩增完整的外显子2及外显子3序列。在过程中曾设计出多对引物，经实验结果表明本发明的一套引物为最优。

应用本套引物扩增扬子鳄MHC基因并进行基因分型的具体方法如下：

1、通过酚-氯仿抽提法提取待测扬子鳄血液样品的DNA，作为模板；

2、将提取合格的DNA进行PCR扩增，10μLPCR反应体系为：扬子鳄血液基因组DNA0.8μL，上下游引物各0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，退火时间30秒，各对引物相应的退火温度为：引物对I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/I20E3R为66℃，引物对I1327E3F/I1327E3R以及I20E2F/I20E2R为63℃。然后在72℃条件下延伸30秒，上述反应程序为34个循环，最后72℃延伸10分钟，产物4℃保存备用。

3、对扩增产物进行分离检测，其具体操作步骤如下：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，

将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，35W，电泳6-7h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

下面结合实例对发明做进一步说明：

实施例1

利用I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/I20E3R两对引物对不同扬子鳄个体MHC基因进行扩增并对PCR产物进行SSCP分型：

1.DNA提取：从-20℃冰箱中取出加有EDTA抗凝的扬子鳄血液样品，解冻，取20μL于1.5mL离心管中，消化过夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液样品中的基因组DNA。用分光光度计检测提取所得DNA溶液的浓度，用1％琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测提取所得DNA片段的长度范围及质量，取些许DNA原液稀释至浓度约为200ng/μL的稀释液，-20℃条件下保存。

2.PCR扩增：以合格的DNA稀释液为模板，利用本发明设计的I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/I20E3R两对引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为10μL：扬子鳄基因组DNA稀释液0.8μL，上下游引物各0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，66℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环，最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测扩增产物的质量，两对引物均能在扬子鳄DNA样品中顺利扩增得到明亮的单一条带，展现了稳定的位点特异扩增能力。

3.对PCR产物进行SSCP分型，操作如下：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，35W功率下电泳6h30min；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

4.SSCP分型结果如图2所示，扬子鳄MHC基因在I1327E2F/I1327E2R以及I20E3F/I20E3R的扩增位点上均显示相同的SSCP带型，即呈单态。

实施例2

利用I1327E3F/I1327E3R，120E2F/I20E3R两对引物对不同扬子鳄个体MHC基因进行扩增并对PCR产物进行SSCP分型：

1.DNA提取：从-20℃冰箱中取出加有EDTA抗凝的扬子鳄血液样品，解冻，取20μL于1.5mL离心管中，消化过夜后，用酚-氯仿抽提法提取血液样品中的基因组DNA。用分光光度计检测提取所得DNA溶液的浓度，用1％琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测提取所得DNA片段的长度范围及质量，取些许DNA原液稀释至浓度约为200ng/μL的稀释液，-20℃条件下保存。

2.PCR扩增：以合格的DNA稀释液为模板，利用本发明设计的I1327E3F/I1327E3R，120E2F/I20E3R两对引物进行PCR扩增。PCR扩增体系为10μL：扬子鳄基因组DNA稀释液0.8μL，上下游引物各0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。PCR反应程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，63℃退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环，最后72℃延伸10分钟。用1％琼脂糖凝胶电泳配合DL2000DNAmarker检测扩增产物的质量，三对引物均能在扬子鳄DNA样品中顺利扩增得到明亮的单一条带，展现了稳定的位点特异扩增能力。

3.对PCR产物进行SSCP分型，操作如下：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，35W功率下电泳6h30min；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

4.SSCP分型结果图3、图4所示，扬子鳄MHC基因在I1327E3F/I1327E3R，120E2F/I20E3R扩增位点上均显示出三种不同的带型，根据带型可分为AA型，BB型以及AB型。

Claims (7)

1.一种用于扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的单位点特异性扩增引物组，其特征在于，引物组共包含四对特异性引物，每对引物的名称、具体引物序列如下：

引物对一：上游引物I1327E2F：GTGGGTAAGCGGCCCTCTGC；

下游引物I1327E2R：CTGCCCTCCCTGCCCCCCCCG；

引物对二：上游引物I1327E3F：AGGGGCCTGGATCTGTGTTTG；

下游引物I1327E3R：CCTGGTTAGTGCTGCCGTTA；

引物对三：上游引物I20E2F：GCCCGCTAGTGCTGACCATC；

下游引物I20E2R：CCTGCTCACACCTGCCTGCTA；

引物对四：上游引物I20E3F：TCAGCCTGGAAGCCCTCAA；

下游引物I20E3R：GGCGGGAATTGCCTGGGT。

2.一种扬子鳄抗病毒潜力检测的Ⅰ类MHC基因的分型方法，其特征在于采用权利要求1所述PCR引物对，进行PCR反应，每对引物均在10μLPCR体系中进行目标片段扩增，然后将扩增产物分别利用SSCP进行基因分型。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的10μLPCR体系为：扬子鳄个体基因组DNA0.8μL，上游引物0.2μL，下游引物0.2μL，超纯水4.4μL，2×UltraTaqMasterMix4.4μL。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述PCR反应的程序为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒，各引物对相应退火温度退火30秒，72℃延伸30秒，共34个循环，最后72℃延伸10分钟。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述PCR反应程序中，所述引物对一、引物对四的退火温度为66℃；所述引物对二、引物对三的退火温度为63℃。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于所述SSCP分型的方法是：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取7uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性4min30s后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，35W，电泳6-7h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。