CN105296627B - 朱鹮抗细菌潜力检测的ii类mhc基因的特异性引物及分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用于扩增朱鹮Ⅱ类MHC基因序列的特异性引物及基因分型方法，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7所示。采用本发明的扩增引物，可以有效扩增出朱鹮Ⅱ类MHC各位点的核苷酸序列，并通过后续的SSCP‑HD技术对每个个体进行基因分型。本发明具有特异性强、操作过程简便快速的优点，通过对Ⅱ类MHC基因进行基因分型，可以评估朱鹮个体Ⅱ类MHC基因的多态性高低，检测其抵抗细菌性疾病的潜力，为朱鹮保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。
Description
技术领域
本发明提供了用于扩增朱鹮MHCⅡ类各位点基因序列的引物及在此基础上的利用单链构象多态性(Single-Strand Conformation Polymor-phism，SSCP)技术进行基因分型的方法。
背景技术
朱鹮，世界濒危物种及国家以及重点保护动物，隶属鸟纲鹈形目鹮科朱鹮属，是一种中等体型的涉禽，曾经广泛分布于东亚的中国、俄罗斯、日本和朝鲜半岛等地区。19世纪末20世纪初，由于人类活动等原因朱鹮种群数量大幅减少，俄罗斯、朝鲜半岛和日本的野生个体相继绝迹，直到1981年科研人员在我国陕西省洋县秦岭山中重新发现了7只野生朱鹮，这7只个体也成为了当前全球范围内所有已知个体的奠基者。
为了保护这一物种，中国政府及研究机构商讨制定了以就地保护为主，异地保护兼并的朱鹮拯救计划。1986年中国建立了陕西省朱鹮保护观察站进行就地保护，北京、河南、浙江等地也相继展开了异地保护。经过几十年的保护工作，虽然朱鹮种群数量在逐步回升，但仍未走出濒危的现状，由于目前全球范围的已知个体均为1981年重新发现的两对朱鹮亲本的后代，近亲交配严重，存在繁殖能力低下、幼鸟死亡残疾率较高等问题。
主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex,MHC),作为脊椎动物免疫系统中的关键角色，包含一系列多基因家族成员，其中Ⅱ类MHC基因的抗原结合区能够识别并结合外源性抗原(如细菌等)的多肽，然后将其呈递给CD4+T细胞，从而引发后续的免疫反应。Ⅱ类MHC基因的蛋白产物由一个α链和一个β链组成，其抗原结合区由α基因的外显子2和β基因的外显子2共同编码组成。由于Ⅱ类MHC基因负责识别外来细菌性抗原，其抗原结合区通常具有显著的多态性，且抗原结合区多态性高的个体能够更好的抵抗细菌性疾病。通过评估人工种群中Ⅱ类MHC的多态性，保护工作者在进行新建种群选择奠基者与野外放归选择适应性能力强的个体等工作时，可以根据多态性高低进行科学地选择，在圈养种群进行人工配对时，可以选择具有不同Ⅱ类MHC等位基因的个体配对从而提高子代的多态性，增强子代对细菌性疾病的抵抗力。
发明内容
本发明提供了扩增朱鹮MHCⅡ类各位点基因序列的特异性引物及在此基础上的SSCP基因分型方法，使用本发明提供的引物能够有效扩增各位点核苷酸序列，并以此PCR产物为基础运用SSCP-HD技术进行基因型分型。
用于朱鹮Ⅱ类MHC基因序列扩增的引物组包括4对引物对，所述引物对的引物序列如下，
引物对一：上游引物如SEQ ID NO.1所示；
下游引物SEQ ID NO.2所示；
引物对二：上游引物如SEQ ID NO.3所示；
下游引物如SEQ ID NO.4所示；
引物对三：上游引物如SEQ ID NO.5所示；
下游引物如SEQ ID NO.6所示；
引物对四：上游引物如SEQ ID NO.7所示；
下游引物如SEQ ID NO.6所示。
一种朱鹮Ⅱ类MHC基因序列PCR扩增方法是采用所述的四对引物分别进行PCR扩增，每对引物均在10uL PCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增，然后运用SSCP分型方法进行基因分型。
所述的10uL PCR体系是：
所述的特定的PCR扩增条件是：第一步，95℃预变性5分钟；第二步，95℃变性30秒；第三步，在退火温度下下退火30秒；第四步，72℃复性30秒；第五步，重复第二步～第四步，32个循环；第六步，72℃延伸5分钟；其中不同引物使用的退火温度不同，第一对引物的退火温度为60℃；第二对引物的退火温度为64℃；第三对引物的退火温度为57℃；第四对引物的退火温度为63℃。
所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。
所述的SSCP分型方法是：
1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
4)样品电泳，吸取8uL PCR产物，加入4uL 2×loading buffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
8)读取条带，确定基因型。
本发明涉及的引物SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7可以有效扩增朱鹮MHC的4个二类α基因及4个二类β基因的抗原肽结合区(peptide-binding region，PBR)外显子，4个α基因分别命名为DAA，DBA1，DBA2和DBA3，4个β基因分别命名为DAB，DBB1，DBB2和DBB3。
由于Ⅱ类区具有更高水平的序列相似性，故将8个Ⅱ类位点共分为4个group，分别为A1、A2、B1、B2，其中A1包含位点DAA，A2包含位点DBA1、DBA2和DBA3，B1包含位点DAB，B2包含位点DBB1、DBB2和DBB3。四个组别中，A2和B2各自的三个位点均具有相同的内含子1和内含子2，且A2包含的三个位点具有几乎一致的全长序列(仅两处SNP)，而B2中的DBB2和DBB3两个位点具有相同的外显子2，故对A1和B1的外显子2采用位点特异扩增及分型；对A2和B2的外显子2采用组内三个位点同步扩增及分型，因此此步还无法确定A2和B2所扩增出的外显子2序列各自所属位点。
扩增各group对应的引物如下表所示，其中，ⅡB1和ⅡB2共用同一条下游引物。
从分型结果看，A1和A2所有个体的单链构象均一致，且双链区仅有一条同源双链带，表示我们所分型的所有个体均为纯合，故4个α基因位点均为单态。此外，在分型结果中还发现，某些个体无法扩增到A2的外显子2，经多种实验反复验证，判断为位点缺失。
B1的分型结果显示，DAB位点为多态位点，外显子2共有4条等位基因，所有个体共有九种不同的带型，其中三种为纯合，六种为4条等位基因两两组合的杂合子带型。
B2组内的三个位点的同步分型结果显示，所有个体的PCR产物中存在最多两条序列，且两条序列在基因组中的拷贝数目不同，因此PCR产量存在明显差异，导致其中一条带姓偏弱。带型一仅存在一条序列，即DBB2和DBB3的外显子2形成的带型；带型二存在两条序列，即DBB1的外显子2与DBB2的外显子2(同DBB3的外显子2)形成的带型。另外还发现，在缺失A2基因的个体中，同样无法扩增到B2基因，经反复多种实验的验证，判断为连锁位点缺失。综上，B2组内三个位点的外显子2均为单态。
附图说明
图1显示的是第二对引物扩增的Ⅱ-A1位点基因序列。
图2显示的是第四对引物扩增的Ⅱ-B1位点基因序列。
图3显示的是第二对引物所扩增的Ⅱ-A1位点的分型条带图。
图4显示的是第四对引物所扩增的Ⅱ-B1位点的分型条带图。
具体实施方式
本发明提供的朱鹮MHCⅡ类PBR外显子引物筛选及基因分型分为以下步骤：1、根据已得的朱鹮MHC基因序列设计Ⅱ类的特异性引物；2、通过PCR扩增检测各位点引物的有效性；3、运用SSCP-HD技术进行基因分型。
下面结合实例来对本发明作进一步说明：
实例一：
1.样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工种群。
2.DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。
3.引物合成：根据已得的朱鹮Ⅱ-类MHC基因序列设计Ⅱ-A1位点的特异性引物扩增外显子2，用于改位点的基因分型，华大基因合成引物。引物序列如下表：
4.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热循环退火温度范围为64℃。
5.扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果如图1所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小均处于350bp，可用于后续的SSCP-HD实验从而进行基因分型。
6.引物扩增体系：5ul 2×GC buffer Ⅰ,0.8ul dNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物(10uM),0.3ul下游引物(10uM)，1ul gDNA，0.1ul Ex-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总体积10ul。
7.引物扩增条件：
8.在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：
(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
(4)样品电泳，吸取8uL PCR产物，加入4uL 2×loading buffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。
(8)读取条带，如图3所示，此位点为单态。
实例二：
1.样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工种群。
2.DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。
3.引物合成：根据已得的朱鹮Ⅱ类MHC基因序列设计Ⅱ-B1位点的特异性引物扩增外显子2，华大基因合成引物。引物序列如下表：
4.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热循环退火温度范围为63℃。
5.扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果如图2所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小为150bp，此PCR产物用于后续的SSCP分型。
6.引物扩增体系：5ul 2×GC bufferⅠ,0.8ul dNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物(10uM),0.3ul下游引物(10uM)，1ul gDNA，0.1ul Ex-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总体积10ul。
7.引物扩增条件：
8.在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：
(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
(4)样品电泳，吸取8uL PCR产物，加入4uL 2×loading buffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。
(8)读取条带，如图4所示，此位点为多态。
Claims (1)
1.用于朱鹮Ⅱ类MHC基因序列扩增的引物组，其特征在于包括4对引物对，所述引物对的引物序列如下，
引物对一：上游引物如SEQIDNO.1所示；
下游引物如SEQIDNO.2所示；
引物对二：上游引物如SEQIDNO.3所示；
下游引物如SEQIDNO.4所示；
引物对三：上游引物如SEQIDNO.5所示；
下游引物如SEQIDNO.6所示；
引物对四：上游引物如SEQIDNO.7所示；
下游引物如SEQIDNO.6所示。
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| CN201510737927.8A CN105296627B (zh) | 2015-11-03 | 2015-11-03 | 朱鹮抗细菌潜力检测的ii类mhc基因的特异性引物及分型方法 |
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| CN201510737927.8A CN105296627B (zh) | 2015-11-03 | 2015-11-03 | 朱鹮抗细菌潜力检测的ii类mhc基因的特异性引物及分型方法 |
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Family Applications (1)
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-
2015
- 2015-11-03 CN CN201510737927.8A patent/CN105296627B/zh active Active
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "朱鹮基因组BAC文库及MHC基因组精细物理图谱的构建";陈礼诚等;《中国博士学位论文全文数据库》;20131231;参见第55－74页 * |
| "朱鹮线粒体DNA及MHC II类B基因的多态性研究";张蓓等;《中国优秀博士学位论文全文数据库》;20051231;第36页－69页 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
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| CN105296627A (zh) | 2016-02-03 |
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