CN108588240B

CN108588240B - 扬子鳄微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

Info

Publication number: CN108588240B
Application number: CN201810578028.1A
Authority: CN
Inventors: 方盛国; 万秋红; 马美英; 夏金全
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-06-05
Filing date: 2018-06-05
Publication date: 2019-09-13
Anticipated expiration: 2038-06-05
Also published as: CN108588240A

Abstract

本发明提供了一种扬子鳄微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列，及在此基础上筛选出的13对特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.26所示。鉴定扬子鳄微卫星多态位点的方法利用扬子鳄基因组筛选出微卫星位点及高质量引物；将扬子鳄基因组测序read数据比对到扬子鳄参考基因组鉴定INDEL，根据INDEL鉴定结果和微卫星筛选结果，筛选出具有多态性的微卫星位点。本发明所提供的13对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地用于扬子鳄的亲子鉴定，有助于对扬子鳄种群进行家族谱系重建和信息完善，从而制定科学的管理方案指导扬子鳄的后期保护工作。

Description

扬子鳄微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

技术领域

本发明属于扬子鳄微卫星多态位点鉴定领域，具体涉及扬子鳄微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列。

背景技术

扬子鳄，俗称土龙、猪婆龙，1996年被世界自然保护联盟(IUCN)红色名录列为极危，是中国特有的珍稀爬行动物。扬子鳄曾广泛分布于全国各地，随着时间的推移，扬子鳄分布北界逐渐南移，时至19世纪中叶，扬子鳄主要分布于长江中下游流域。接下来的一百年，是扬子鳄种群的急速衰退期。20世纪初的一项调查显示，野生扬子鳄已不足130条，主要集中在保护区中。

为了保护扬子鳄，使其免遭灭绝，中国政府迅速制定并实施了多项保护措施，先后在浙江长兴和安徽宣城建立了扬子鳄保护、研究中心。经过数十年的努力，扬子鳄野生种群数量基本得以稳定，活动范围亦有扩大的迹象。安徽圈养种群数量已逾万条，且每年快速增加，长兴种群数量相对较少但也超过5000条，这为野外放归工作的开展储备了充足的资源。

尽管如此，扬子鳄保护工作依旧面临着诸如野生扬子鳄数目较少、栖息地片段化、圈养种群缺乏完整谱系、遗传多样性丧失等难题。长兴扬子鳄保护区在建立之初仅有11条扬子鳄奠基者，虽然在当地居民和科研工作人员的不懈努力下，保护区扬子鳄数量逐渐增减，初级保护工作卓见成效，但是由于鳄类具有多重交配机制，保护区内存在子代与亲本间的亲缘关系复杂的问题。为了更好地保护扬子鳄的遗传多样性，揭示种群内个体间的亲缘关系，需要对保护区参与繁殖的亲本及子代个体进行家族谱系的重建。科学有效的指导和管理扬子鳄的繁育工作，对该种群起到更好的保护作用。

微卫星是分子生态、分子进化、遗传育种以及保护遗传学等研究领域中最为重要的分子标记之一。它是指DNA短串联重复序列(simple sequence repeat，SSR)，由核心序列与两侧的侧翼序列构成。核心序列是2-6个核苷酸，通常微卫星核心序列的重复数与该位点的等位基因数有很强的正相关，核心序列重复数越大，其变异性越大，则该微卫星微点的等位基因数目就越多。微卫星具有数量多，在基因组内分布均匀，多态性信息丰富，易于检测等特点，在单个微卫星位点上可做共显性的等位基因分析。目前微卫星技术已经被作为优良的遗传标记而得到广泛应用。近年来，随着对濒危动物保护遗传学研究的日益重视和加强，微卫星分子标记已被用来解释濒危物种的进化历史、种群遗传结构分析、辅助种群调查、亲缘关系鉴定和近缘物种及杂交个体鉴别等保护生物学所特别关注的论题。这些研究所得的遗传数据提供了制定物种保护的可靠依据，证实了微卫星分子标记在保护遗传学研究中所占据的重要位置，微卫星微点多态性的高低在一定程度上反映了该物种所面临的生存困境。尽管如此重要，目前的微卫星分子标记在使用上仍然有一些不足。例如，虽然有研究发现微卫星DNA侧翼序列在近缘物种间具有一定的保守性，然而对一些珍稀物种，尤其是在进化上地位特殊的物种来说，当缺乏相关近缘物种微卫星序列信息参考的情况下，则需要进行微卫星微点的筛选和特异引物的开发。而且，濒危物种普遍具有较低的遗传多样性，因此获得多态性的微卫星位点的显得更困难而且更重要。幸运的是，越来越多的物种的参考基因组已经完成测序并发布，这为我们在全基因组水平上大批量得获取微卫星数据提供方便。然而，前人使用物种参考基因组筛选微卫星的方法，存在两方面的缺陷：1、引物设计特异性较差，容易产生非特异性扩增；2、筛选的位点多态性较低,后续需要花费较多的时间和成本进行进一步筛选。本发明利用已经公开的扬子鳄参考基因组序列，通过多轮比对筛选，确保引物具有较高特异性；同时使用可公开获取的基因组测序原始序列进行比对筛选，使用一个个体的基因组数据，便可获得多态性更高的扬子鳄微卫星位点信息并设计特异引物。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供了一种扬子鳄微卫星多态位点的鉴定方法及引物序列。

本发明公开了一种扬子鳄微卫星多态位点的鉴定方法，包括如下步骤：

1)利用扬子鳄参考基因组筛选出微卫星位点，并经过多轮的引物设计和筛选流程，针对扬子鳄微卫星位点序列设计PCR扩增引物；

2)并将扬子鳄基因组测序read数据比对到扬子鳄参考基因组，鉴定扬子鳄基因组上的INDEL位点；

3)根据扬子鳄INDEL鉴定结果与扬子鳄微卫星鉴定结果，筛选出具有多态性的扬子鳄微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

优选的，所述利用扬子鳄参考基因组筛选微卫星位点的过程具体为：

鉴定扬子鳄基因组上的微卫星序列，对于重复单元为2-6bp的微卫星序列的基序需满足如下要求：

对于二碱基的基序，要求其重复次数大于或等于6次；对于三碱基、四碱基、五碱基和六碱基的基序，其重复单元的重复次数要求大于或等于4次；

由此鉴定扬子鳄基因组上的微卫星序列，并提取微卫星核心序列左右两侧各150bp的侧翼序列。

优选的，所述的步骤1)中，对于筛选得到的PCR扩增引物对，如果PCR扩增引物对中的任何一条引物包含核心序列，则过滤掉该PCR扩增引物对及其对应的微卫星位点。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

通过blastn将经过筛选得到的候选微卫星点序列的引物序列比对回扬子鳄参考基因组，blastn参数为：-F F-b 10000-v 10000；

对于比对到扬子鳄参考基因组的引物对序列，要求5’端的错配不超过3个碱基，3’端的错配不超过1个碱基；对不满足条件的引物对序列进行过滤；

挑选位于同一条scaffold上的引物序列，且要求这些引物对的正向引物和反向引物不存在overlap；

保留在扬子鳄基因组上存在唯一位置的引物对序列；如果引物对序列在基因组上有多个位置信息且这些引物产生的最终产物序列长度与之前微卫星产物长度的差大于2000bp，那么这样的引物对序列也保留下来。

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

根据得到的引物位置信息，提取其在扬子鳄基因组上的产物序列，并将这些产物序列用SSRIT重新进行微卫星预测，如果基于某一个位置的产物序列有多种微卫星序列，则过滤掉这类引物序列，从而得到的结果是每个引物都能扩增产生唯一类型的微卫星序列。

优选的，所述的步骤2)具体为：将扬子鳄基因组测序read数据通过SOAP软件比对到扬子鳄参考基因组，比对参数如下：-min 100–max 900–gap 30–mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

优选的，所述的步骤3)之后还包括步骤4)，所述的步骤4)为利用实验方法对引物有效性和微卫星位点多态性进行鉴定和筛选；

所述的实验方法为利用PCR技术检测，检验引物的灵敏度和特异性，保留扩增条带单一、清晰、明亮且条带大小符合预期的微卫星位点及相应的PCR扩增引物；利用单链构象多态性技术或荧光扫描技术中的一种或两种技术分析位点的多态性，保留多态的微卫星位点及相应的PCR扩增引物。

本发明所提供的13对微卫星引物，均为多态性位点，具有较强的分辨能力。利用这套微卫星引物，可经济、快速、正确地用于扬子鳄的亲子鉴定，有助于对扬子鳄种群进行家族谱系重建和信息完善，从而制定科学的管理方案指导扬子鳄的后期保护工作。

附图说明

图1显示的是引物对一扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图2显示的是引物对二扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图3显示的是引物对三扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图4显示的是引物对四扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图5显示的是引物对五扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图6显示的是引物对六扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图7显示的是引物对七扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图8显示的是引物对八扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图9显示的是引物对九扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图10显示的是引物对十扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图11显示的是引物对十一扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图12显示的是引物对十二扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

图13显示的是引物对十三扩增的微卫星位点片段荧光扫描峰图。

具体实施方式

本发明提供了一种用于鉴定扬子鳄微卫星多态位点的方法，及在此基础上,运用PCR、SSCP和荧光扫描技术筛选出的13对特异引物序列和对应的位点。

所述的多轮的引物设计和筛选流程具体为：

更进一步的，所述的步骤1)还包括如下步骤：

2)并将扬子鳄基因组测序read数据比对到扬子鳄参考基因组，鉴定扬子鳄基因组上的INDEL位点；优选的，所述的步骤2)具体为：将扬子鳄基因组测序read数据通过SOAP软件比对到扬子鳄参考基因组，比对参数如下：-min 100–max 900–gap 30–mis 3，得到SOAP比对的结果文件；将上一步比对的结果文件作为输入，使用SOAPInDel软件，得到该个体的INDEL位点信息。

利用本发明用于鉴定扬子鳄微卫星多态位点的方法所得到引物对中，随机挑选40对引物进行合成，其中二碱基、四碱基、五碱基和六碱基重复的微卫星序列的引物各10对，每对引物均在10μLPCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下对随机选择的20个扬子鳄个体基因组DNA进行PCR扩增。

所述的10μL PCR体系是：

10×PCR Buffer1μl

浓度为2.5mM的dNTPs 0.8μl

浓度为10μM的上游引物 0.3μl

浓度为10μM的下游引物 0.3μl

浓度为5U/μM的Ex-Taq酶 0.1μl

gDNA 1μl

ddH₂O 6.5μl。

所述的特定的PCR扩增条件是：第一步，95℃预变性5分钟；第二步，95℃变性30秒；第三步，在退火温度下退火30秒；第四步，72℃复性30秒；第五步，重复第二步～第四步，34个循环；第六步，72℃延伸5分钟。其中，引物的退火温度通过梯度PCR确定。

使用琼脂糖凝胶(1％)电泳对PCR扩增产物进行检测，出现单一且清晰的目的条带的引物及相应的条件则通过此步骤初步筛选，用于后续研究。

在此步骤中，发现3对引物扩增出非特异性条带、1对引物扩增效果不稳定，因此舍弃，剩余36对引物用于后续研究。

利用上述方法得到36对引物序列，所获得的36对引物继续SSCP分型方法做进一步筛选，其步骤是：

1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；

2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；

3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；

4)样品电泳，吸取8uL PCR产物，加入4uL 2×loading buffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；

5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；

7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；

8)读取条带，确定基因型。

结果发现，36对引物均可扩增出较为清晰的条带。

上述36对引物所获得的多态性结果通过荧光扫描技术做进一步筛选和确认，其具体的流程是：

1)选择上述36对PCR扩增条带单一清晰且SSCP实验中条带清晰的引物，合成5’端具有荧光修饰的上游引物，荧光种类为FAM、HEX、TAMRA三种荧光修饰的任意一种。

2)利用下游引物和上述具有荧光标记的上游引物，运用上述一种扬子鳄SSR序列PCR扩增方法，以浙江长兴100条亲代扬子鳄的基因组DNA样品为模板进行群体PCR克隆。

3)利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

结果发现，在上述36个位点中，有3个位点呈现单态性，而另外33个位点呈现多态性。

微卫星标记的统计和筛选评估

33个微卫星标记，各位点的等位基因数目为2或3，平均等位基因数为2.330；各位点的多态信息含量(polymorphism information content,PIC)为0.020-0.585，平均PIC为0.290。

合适的标记及数目，既可节约时间减轻工作量，又能减少实验成本，同时还可以使累积排除概率达到标准，满足亲子关系鉴定的要求。由于两碱基重复微卫星标记各等位基因间仅存在两个碱基的差异，在扩增过程及峰图检测结果中容易呈现出不稳定，因此不纳入最终选择的分子标记中。此外，为排除不同碱基重复微卫星遗传上的差异性，本研究中分别从三、四、五碱基重复微卫星标记中各选取部分位点，其PIC>0.25且在实验中扩增效果较好，共13个位点组合成一套分子标记。13个微卫星位点的平均等位基因数为2.380，平均PIC为0.388。

本发明筛选出的13对扬子鳄卫星多态位点特异引物序列，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.26所示。13对扬子鳄微卫星多态位点特异引物序列对应的13个扬子鳄微卫星多态位点，从位点一至位点十三的序列依次如SEQ ID NO.27～SEQ ID NO.39所示。位点与特异引物序列的关系，等位基因数目见表1。

表1

下面利用本发明提供的13对特意引物序列，对来自浙江长兴扬子鳄保护区的扬子鳄DNA样品进行扩增和荧光扫描，以验证本发明提供的13对特异引物序列所扩增的微卫星位点的多态性。

1、样品准备：扬子鳄血液样品来自浙江长兴扬子鳄保护区。

2、DNA提取：利用酚氯仿法从扬子鳄血液样品中提取DNA。

3、引物合成：上游引物5’端具有荧光修饰，下游引物则是普通引物。

4、PCR扩增：

所述的10μL PCR体系是：

10×PCR Buffer1μl

浓度为2.5mM的dNTPs 0.8μl

浓度为10μM的上游引物 0.3μl

浓度为10μM的下游引物 0.3μl

浓度为5U/μM的Ex-Taq酶 0.1μl

gDNA 1μl

ddH₂O 6.5μl

5、利用ABI3730基因分析仪对PCR扩增产物进行分型，通过Genemapper 4.1软件对原始数据进行等位基因分析。

6、读取微卫星位点片段荧光扫描峰图，如图1-13所示，13个位点均为多态性位点，证明了本发明提供的扬子鳄微卫星多态位点的鉴定方法及特异引物序列的有效性。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 扬子鳄微卫星多态位点、鉴定方法及特异引物序列

<160> 39

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

agttaaatca gaatccccca gcat 24

<210> 2

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

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<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

aaggcataac tgatcttggc tgac 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

agtgttgttc tggaaaattc aggg 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

cacttaatga gttttgggga cctg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

gtggtgagct acagttctgg tgaa 24

<210> 7

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

gtagattgca caaatgcctt agca 24

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

tgcagtctca aatgcagata ggtc 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

agctctgtct tgaggaggca atac 24

<210> 10

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cagtccctgg tgtaatactg gctt 24

<210> 11

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atccaaagtc tgacgtgcaa ataa 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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cctagtcaag ggcaaggcta tttt 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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taagcaattt ccctgaccta tcca 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttttagtgt gctttgagct gcc 23

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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tttttatcag atggggctca gatg 24

<210> 16

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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attcataact taggggttgg cagc 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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atcgaaaaga agattttcca agcc 24

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<212> DNA

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tagggctaca ggcaatctga aaac 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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aaattttcat ttctgggtaa gccac 25

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<212> DNA

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tgaccctcaa taaacatgct caga 24

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<212> DNA

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gtattctgcc atttggaggc tact 24

<210> 22

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

ttaagctggt gctcattatt gctg 24

<210> 23

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<212> DNA

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<212> DNA

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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agtgtgggat agggggactc taag 24

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<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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ctttgtgaca gaaatgtcca ccag 24

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<211> 326

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

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caaaatggct gaaactggtt gaagataaac ctggttgaat gtaatatcag ccttaactga 60

cttgggtcaa actggtttat ggaatgtctg tcccagaccc cttcctggtt taagttaaat 120

cagaatcccc cagcatccca gatattttgc atgggctggg ctgggctggg ctgggctatc 180

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ttgcaagcat agcaatgtct gcctgacttc cccctgcccc atccccctgc tacttgctac 300

tcaagcaggg atccctctct ccttct 326

<210> 28

<211> 321

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 28

acatcattgc tgagaggtct ttatttaaat aaaaggaata ataaactatt ggtatgaaat 60

actgttcctg ttgcaatctg ggttcaaatt tacatcagta aaatcccaag gcataactga 120

tcttggctga catcaaaatc aggataatat aacgttacgt tacgttacgt ttcccctgaa 180

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ttctttttgt agaagtttta gagaggtcag tttatctttt cacagtcagg tttatgggaa 300

agaatgtttt ctgccaaact g 321

<210> 29

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<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

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aattgatgag ccatttgata agatgggatt cttttaggtc tgatatgaga ggctcagttg 60

ttaagattct gaggtcttag tgcagggatg ggcaattatt ttgcctgggc cacttaatga 120

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<210> 30

<211> 325

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

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gcatctgaaa gggaaactaa ctcaactctt ttcccttggt taaatgatac ccaccctctg 60

cttcccctgg aaactgtgct gacttctagc agtagggact gttatgtaga ttgcacaaat 120

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gatactaacc cgtgcatgag cttgc 325

<210> 31

<211> 337

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 31

atgggcaccc cgacagaaag aggaaatagt gtgtgggggg catcatttaa gagaagcttt 60

ttcacactca aagtaacaaa aacgtgcttg cagtttcaaa aaacatgaac aagcccagct 120

ctgtcttgag gaggcaatac ttcattttga gacaaacaaa caaacaaaca aacaaacaaa 180

caaacaatta cattttgcta aagccaggtg taaagccagt attacaccag ggactgttcg 240

aagcccacct acctcctata tatttattta ttcacctact gaccagtaag cacaggtgga 300

ggcagaaaag ggacgggacg gtgaaacatc ctttcca 337

<210> 32

<211> 325

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 32

gggaaaaaaa gagtattttt tttcatattt gacaattaca ttttccacta ctttagacaa 60

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ttttagatac ggtatatgat taagagtctt cctatctatc tatctatcta tctatctact 180

tcaaatttct ctccaaatac ctttgaagaa aacaatttat tgagaaaaat agccttgccc 240

ttgactagga tcaaagccct ctacctctta ctgacactgc ctttcccatt tcacggagat 300

gttgatcact tctgcattgc accat 325

<210> 33

<211> 329

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 33

gttgcacttc caacactagc tgaccaatct cagttgatta caagctgaag tctaatggca 60

aaatatgaca tataaccaac atataagcaa tttccctgac ctatccatcc ccagtttcca 120

gaggcagatt aacacttatt tttttgcaaa aatctatcta tctatctatc tatctatctc 180

cacttccaac actctgccaa gtggcccttg tggttcactt ggcagctcaa agcacactaa 240

aaaaaacaaa cgttacacag tttgcaccgt gcatccatgc acctatctct atactcataa 300

ccccactcac tgccctcctc agagggtct 329

<210> 34

<211> 329

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 34

cgcatttgtt ttctttgcag ggcgatgact taatgttttt aaaagttatc atctgtttta 60

catcatgaaa tgttggttta attatggtcg ggaagatatt tttttatcag atggggctca 120

gatgccatgc tgatgccaga tgcatataag aatctatcta tctatctatc tatctatcta 180

tcgtctcaca aaccttggcc agctaagtga ggccaagagg atttagcaat gctgccaacc 240

cctaagttat gaatatggaa acccaggtag tgatctgtca ttctctctaa tataacgatg 300

agaaaagtga acctagacac aatgattag 329

<210> 35

<211> 337

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 35

aatcaggtct gggaggctct ttgccccccc tctgtgtggg gcagggccag ccctgcccag 60

cccttacctg actggtggat gggctccacc aatcgaaaag aagattttcc aagcctgttc 120

gagtcgggcc atgtcagtaa gtccaccact ttatctatct atctatctat ctatctatct 180

atctatcagt tttcagattg cctgtagccc tatctgaaca ccttgatggt atctgattgc 240

ctggactctg agcaccattt cctgctagga gggtctgatt cctgcaatca ttccctgtct 300

tgtagcagga tcttcctctc cgtttcagaa actgaga 337

<210> 36

<211> 316

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 36

gcatgtagcc aatgagcgta tatcagcaaa ttggattgta tgaatcattg ttttctgctc 60

gtagaccttt tctactcatt gaaacccaca cagctaatct tagtgctact gcttagaata 120

taaattttca tttctgggta agccactaga tagcagcagc agcagcaaca gctaaagcaa 180

ccagctacac caagagatgt ctaagctcaa aagagtatta gattaatgta cttcacttgg 240

atctgagcat gtttattgag ggtcaccaca cagtattgtg gggctagaac tgagtgcttt 300

gaccagctta gtggta 316

<210> 37

<211> 331

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 37

aaaaaaaaac acacacacac aaaacaaaca ccaccaccac atcccgtaca aaccagcttt 60

cagtaagcag ccctctgcct aaaataaatt gcccgcccct gctacaaaaa cttgctttgt 120

attctgccat ttggaggcta ctaggtagct ctaataataa taataataat aataataata 180

ataggcagag gtactaggta cctctactag gttacagcaa taatgagcac cagcttaact 240

aatgaagtct gtcatgctaa tagctaggca ggccgagtgc cattttccct tgtagtgcta 300

ttggaacacc caggtgtcca gaagttcctc a 331

<210> 38

<211> 319

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 38

cagtgcctgg cttgtactac ttaaatttat ttttgaactc ttctagaaaa acttgaagta 60

aaggacactt cctttttgcc tctagtttgt ggctatcttt ttaatatggt ccattctctg 120

agttaattgg agaacagaag cttactgtca ctgttgttgt tgttgttgtt gaagtaacaa 180

gttggtgtgc aacccttgta ctgacttcag gtaaggagga acaagcatag cattggaagg 240

aggtaaactg ctaaactctg cctattgtga ttcactgctg atgcataaat tgtcttgaat 300

actatccatg aaactcttt 319

<210> 39

<211> 316

<212> DNA

<213> 扬子鳄(Alligator sinensis)

<400> 39

tgggttcagg ttaacaatcc aaatatatac ccagaggccc caggctttta aaattctctc 60

tgatgtctgt gccacctgca agcttgtata gagcctgact tgataggacc ccagtgtggg 120

atagggggac tctaagacac actggaagac taacaacaac aacaacaaaa caaccctcta 180

attcatccca ctgccaaaca ggggtggtac acagctttcc cgggaactgg tggacatttc 240

tgtcacaaag caagcattgg ctggaagtta gacctcaaga atcttgagga aattaacatt 300

aacaaggcaa agctat 316

Claims

1.一种扬子鳄微卫星多态位点的扩增引物对组合物，其特征在于包括下述13对引物对，引物对的引物序列如下：

引物对一：上游引物如SEQIDNO.1所示；

下游引物如SEQIDNO.2所示；

引物对二：上游引物如SEQIDNO.3所示；

下游引物如SEQIDNO.4所示；

引物对三：上游引物如SEQIDNO.5所示；

下游引物如SEQIDNO.6所示；

引物对四：上游引物如SEQIDNO.7所示；

下游引物如SEQIDNO.8所示；

引物对五：上游引物如SEQIDNO.9所示；

下游引物如SEQIDNO.10所示；

引物对六：上游引物如SEQIDNO.11所示；

下游引物如SEQIDNO.12所示；

引物对七：上游引物如SEQIDNO.13所示；

下游引物如SEQIDNO.14所示；

引物对八：上游引物如SEQIDNO.15所示；

下游引物如SEQIDNO.16所示；

引物对九：上游引物如SEQIDNO.17所示；

下游引物如SEQIDNO.18所示；

引物对十：上游引物如SEQIDNO.19所示；

下游引物如SEQIDNO.20所示；

引物对十一：上游引物如SEQIDNO.21所示；

下游引物如SEQIDNO.22所示；

引物对十二：上游引物如SEQIDNO.23所示；

下游引物如SEQIDNO.24所示；

引物对十三：上游引物如SEQIDNO.25所示；

下游引物如SEQIDNO.26所示。

2.一种扬子鳄微卫星多态位点分子标记组合，其特征在于包括下述13个微卫星位点，位点序列如下：

引物一对应对的微卫星：如SEQIDNO.27；

引物二对应对的微卫星：如SEQIDNO.28；

引物三对应对的微卫星：如SEQIDNO.29；

引物四对应对的微卫星：如SEQIDNO.30；

引物五对应对的微卫星：如SEQIDNO.31；

引物六对应对的微卫星：如SEQIDNO.32；

引物七对应对的微卫星：如SEQIDNO.33；

引物八对应对的微卫星：如SEQIDNO.34；

引物九对应对的微卫星：如SEQIDNO.35；

引物十对应对的微卫星：如SEQIDNO.36；

引物十一对应对的微卫星：如SEQIDNO.37；

引物十二对应对的微卫星：如SEQIDNO.38；

引物十三对应对的微卫星：如SEQIDNO.39。