CN105316408B - 朱鹮抗病毒潜力检测的i类mhc基因的特异性引物及分型方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一套用于扩增朱鹮MHC Ⅰ类基因经典座位序列的引物及基因分型方法，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.10所示。采用本发明的扩增引物，可以有效扩增出朱鹮Ⅰ类MHC各经典座位的核苷酸序列，并通过后续的SSCP-HD或测序技术对每个个体进行基因分型。本发明具有特异性强、操作过程简便快速的优点，通过对朱鹮Ⅰ类MHC基因经典座位进行分型，可以评估朱鹮个体Ⅰ类MHC基因经典座位的多态性高低，检测其抵抗病毒性疾病的潜力，为朱鹮保护工作中的新种群奠基者选择、野化放归个体选择以及人工配对等工作提供重要参考。
Description
技术领域
本发明提供了用于扩增朱鹮Ⅰ类MHC各位点基因序列的引物及在此基础上的利用单链构象多态性(Single-StrandConformationPolymor-phism，SSCP)技术进行基因分型的方法。
背景技术
朱鹮，世界濒危物种及国家以及重点保护动物，隶属鸟纲鹈形目鹮科朱鹮属，是一种中等体型的涉禽，曾经广泛分布于东亚的中国、俄罗斯、日本和朝鲜半岛等地区。19世纪末20世纪初，由于人类活动等原因朱鹮种群数量大幅减少，俄罗斯、朝鲜半岛和日本的野生个体相继绝迹，直到1981年科研人员在我国陕西省洋县秦岭山中重新发现了7只野生朱鹮，这7只个体也成为了当前全球范围内所有已知个体的奠基者。
为了保护这一物种，中国政府及研究机构商讨制定了以就地保护为主，异地保护兼并的朱鹮拯救计划。1986年中国建立了陕西省朱鹮保护观察站进行就地保护，北京、河南、浙江等地也相继展开了异地保护。经过几十年的保护工作，虽然朱鹮种群数量在逐步回升，但仍未走出濒危的现状，由于目前全球范围的已知个体均为1981年重新发现的两对朱鹮亲本的后代，近亲交配严重，存在繁殖能力低下、幼鸟死亡残疾率较高等问题。
主要组织相容性复合体(majorhistocompatibilitycomplex,MHC),作为脊椎动物免疫系统中的关键角色，包含一系列多基因家族成员，其中Ⅰ类MHC基因能够识别细胞质中的内源性抗原(如病毒)的多肽，并将其呈递给CD8+T细胞或自然杀伤性细胞，从而引发后续的免疫反应。I类MHC分为经典基因和非经典基因，经典I类基因负责呈递抗原，而非经典基因的呈递抗原能力退化或功能转变成辅助经典I类基因的抗原肽呈递。经典Ⅰ类MHC基因的抗原结合区由外显子2与外显子3共同编码组成，由于其负责识别抗原肽，因此通常在抗原结合区上具有显著的多态性，其抗原结合区多态性高的个体能够更好的抵抗病毒的入侵。通过评估人工种群中Ⅰ类经典MHC基因的多态性，保护工作者在进行新建种群选择奠基者与野外放归选择适应性能力强的个体等工作时，可以根据多态性高低进行科学地选择，在圈养种群进行人工配对时，可以选择具有不同等位基因的个体配对从而提高子代的多态性，增强子代对病毒性疾病的抵抗力。
发明内容
本发明提供了扩增朱鹮Ⅰ类MHC基因各经典座位的特异性引物及在此基础上的SSCP基因分型方法，使用本发明提供的引物能够有效扩增各位点核苷酸序列，并以此PCR产物为基础运用SSCP-HD技术进行基因型分型。
用于朱鹮Ⅰ类MHC基因序列扩增的引物组包含5对引物，引物对的引物序列如下：
引物对一：上游引物如SEQIDNO.1所示；
下游引物如SEQIDNO.2所示；
引物对二：上游引物如SEQIDNO.3所示；
下游引物如SEQIDNO.4所示；
引物对三：上游引物如SEQIDNO.5所示；
下游引物如SEQIDNO.6所示；
引物对四：上游引物如SEQIDNO.7所示；
下游引物如SEQIDNO.8所示；
引物对五：上游引物如SEQIDNO.9所示；
下游引物如SEQIDNO.10所示。
一种朱鹮Ⅰ类MHC基因分型方法采用所述的五对引物分别进行PCR扩增，每对引物均在10uLPCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增，然后运用SSCP分型方法进行基因分型。
所述的10uLPCR体系是：
所述的特定的PCR扩增条件是：1)95℃预变性5分钟；2)95℃变性30秒；3)在退火温度下下退火；4)72℃复性30秒；5)重复步骤2)至步骤4)32次；6)72℃延伸5分钟；其中不同引物对使用的退火温度和退火时间不同，第一对引物的退火温度为61℃，退火时间为30秒；第二对引物的退火温度为67℃，退火时间为30秒；第三对引物的退火温度为60℃，退火时间为25秒；第四对引物的退火温度为61℃，退火时间为20秒；第五对引物的退火温度为60℃，退火时间为25秒。
所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。
所述的SSCP分型方法是：
1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
8)读取条带，确定基因型。
本发明提供的引物SEQIDNO.1～SEQIDNO.10可以有效扩增朱鹮MHCⅠ类经典基因的UAA、UBA、UCA1和UCA2四个位点的抗原肽结合区(peptide-bindingregion，PBR)序列，本研究初期尝试采用巢式特异性PCR，但未得到清晰单一并可用于SSCP分型的PCR结果，主要问题在于位点间的交叉扩增。因此，考虑到PBR外显子的旁侧内含子序列相似度高，且之前对朱鹮种群的各项遗传结构研究均显示低水平的遗传多样性，遂最终主要采用一轮位点通用引物结合SSCP-HD技术对Ⅰ类位点进行多位点同步分型。
Ⅰ类MHC基因的分型除采用上述的同部分性方法外，由于某些位点等位基因仅具有单间及差异，以及不同位点间等位基因序列相同的情况，又进一步结合位点特异性引物扩增、SSCP分型以及测序技术对这些特殊位点进行了基因型确认，即精密分型。
扩增各位点对应的引物如下表所示：
同步分型引物为SEQIDNO.1与SEQIDNO.2引物对，以及SEQIDNO.3与SEQIDNO.4引物对，前者同步扩增各位点的外显子2，后者同步扩增外显子3。外显子2的分型结果显示，SSCP带型双链区包含了各位点等位基因两两结合形成的多条异源双链条带，每种条带组合即为一种带型，共3种带型，两种纯合带型，一种杂合带型，分别对应了二态位点UAA在外显子2上的三种基因型，可以发现两种纯合子带型互补，杂合子为它们的叠加。通过测序发现，UCA1与UCA2的外显子2序列一致。外显子3的分型结果显示，二态位点UAA造成了三种最主要的带型，两种纯合子带型和一种杂合子带型，杂合子带型为纯合子带型的叠加。二态位点UBA造成了三种差异较小的带型，为减少分型误差，在后续对这一位点进行精密分型。由于二态位点UDA的一个等位基因UCA2*01与单态位点UCA1具有一致的外显子3序列，因此UDA位点只有两种SSCP带型，也需要后续进一步精密分型。
对于上述需要进行精密分型的UBA(SEQIDNO.7和SEQIDNO.8)态位点，通过单链构象比较进行了精密分型。分型结果与随机抽样调查的测序结果一致，证明其可靠性。UBA的分型结果显示了三种带型，两种纯合子和一种杂合子，杂合子为纯合子带型的叠加。UCA2的分型分为外显子3(SEQIDNO.5和SEQIDNO.6)和内含子1(SEQIDNO.9和SEQIDNO.10)两个部分，均为单个碱基差异，由于UCA1的干扰，只能通过外显子3的SSCP带型辨别出UCA2位点是否含有与UCA1位点等位基因不一致的等位基因UCA2*02，需要再通过内含子1上的差异碱基测序进一步辨别UCA2*01/*02和UCA2*02/*02两种基因型。
附图说明
图1显示的是第一对引物扩增的目的片段大小为310bp的Ⅰ-E2位点基因序列。
图2显示的是第四对引物扩增的目的片段大小为150bp的Ⅰ-UBA-E3位点基因序列。
图3显示的是第一对引物所扩增的位点Ⅰ-E2的SSCP分型条带图，一共有三种带型。
图4显示的是第四对引物所扩增的位点Ⅰ-UBA-E3的SSCP分型条带图，一共有三种带型。
具体实施方式
本发明提供的朱鹮MHCⅠ类PBR外显子引物筛选及基因分型分为以下步骤：1、根据已得的朱鹮MHC基因序列设计特异性引物；2、通过PCR扩增检测各位点引物的有效性；3、运用SSCP-HD技术进行基因分型。
下面结合实例来对本发明作进一步说明：
实例一：
1、样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工种群。
2、DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。
3、引物合成：根据已得的朱鹮MHC基因序列设计位点通用引物扩增外显子2，用于UAA位点的分型，华大基因合成引物。引物序列如下表：
4、引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热循环退火温度范围为61℃。
5、扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果如图1所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小均处于310bp，可用于后续的SSCP-HD实验从而进行基因分型。
6、引物扩增体系：5ul2×GCbufferⅠ,0.8uldNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物(10uM),0.3ul下游引物(10uM)，1ulgDNA，0.1ulEx-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总体积10ul。
7、引物扩增条件：
8、在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：
(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
(4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。
(8)读取条带，如图3所示，共有三种带型,分别为aa,cc和ac。
实例二：
1.样品准备：朱鹮血液和组织样品来自德清、佐渡、北京、河南、洋县和楼观台等人工种群。
2.DNA提取：酚氯仿法提取血液和组织DNA。
3.引物合成：根据已得的朱鹮MHC基因序列设计UBA位点外显子3的特异性引物，华大基因合成引物。引物序列如下表：
4.引物扩增：将上述扩增引物分别应用于PCR，扩增所提取的样品DNA。设置PCR热循环退火温度范围为61℃。
5.扩增结果检测：取2ul上述PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，胶浓度为1.5％。结果如图2所示，此引物可以有效扩增目的条带，目的条带的片段大小均处于150bp，将此PCR产物送交华大测序，根据测序结果得出基因型。
6.引物扩增体系：5ul2×GCbufferⅠ,0.8uldNTP(2.5Mm)，0.3ul上游引物(10uM),0.3ul下游引物(10uM)，1ulgDNA，0.1ulEx-Taq(5U/ul),2.5ul双蒸水。体系总体积10ul。
7.引物扩增条件：
8.在上述的PCR扩增产物基础上，利用SSCP-HD技术进行基因分型，步骤如下：
(1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
(2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
(3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
(4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8-11h；
(5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
(6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
(7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次。
(8)读取条带，如图4所示，共有三种带型。
Claims (6)
1.用于朱鹮Ⅰ类MHC基因序列扩增的引物组，其特征在于，引物组包含5对引物，引物对的引物序列如下：
引物对一：上游引物如SEQIDNO.1所示；
下游引物如SEQIDNO.2所示；
引物对二：上游引物如SEQIDNO.3所示；
下游引物如SEQIDNO.4所示；
引物对三：上游引物如SEQIDNO.5所示；
下游引物如SEQIDNO.6所示；
引物对四：上游引物如SEQIDNO.7所示；
下游引物如SEQIDNO.8所示；
引物对五：上游引物如SEQIDNO.9所示；
下游引物如SEQIDNO.10所示。
2.一种朱鹮Ⅰ类MHC基因分型方法，其特征在于采用权利要求1所述的引物对进行PCR扩增，每对引物均在10uLPCR体系中，并在特定的PCR扩增条件下进行目标片段扩增，然后运用SSCP分型方法进行基因分型。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的10uLPCR体系是：
4.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的特定的PCR扩增条件是：1)95℃预变性5分钟；2)95℃变性30秒；3)在退火温度下退火；4)72℃延伸30秒；5)重复步骤2)至步骤4)32次；6)72℃延伸5分钟；其中不同引物对使用的退火温度和退火时间不同，第一对引物的退火温度为61℃，退火时间为30秒；第二对引物的退火温度为67℃，退火时间为30秒；第三对引物的退火温度为60℃，退火时间为25秒；第四对引物的退火温度为61℃，退火时间为20秒；第五对引物的退火温度为60℃，退火时间为25秒。
5.如权利要求2所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法中，固定后、银染后以及显色后应分别使用双蒸水洗胶4次，以获得清晰的SSCP条带。
6.如权利要求2或5所述的方法，其特征在于所述的SSCP分型方法是：
1)用玻璃洗涤剂清洗大小玻璃板，沥水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精挥发后装板，将间隔条置于大小玻璃板间，并用专用架将两边夹紧，固定于模具上；
2)制备12％的非变性聚丙烯酰胺凝胶胶液，将胶液混匀后慢慢注入大小玻璃板间，确认无气泡存在后插入梳子，常温平置；
3)待胶凝固后，从模具上卸下并架于电泳装置上，用琼脂糖封胶；取下梳子，并用装满0.5×TBE的注射器冲洗点样孔；放入电泳槽中，倒入0.5×TBE，预电泳20min；
4)样品电泳，吸取8uLPCR产物，加入4uL2×loadingbuffer，快速离心混合，95℃变性7min后迅速置于冰上，并用枪及时加入点样孔内，4℃，30W，电泳8‐11h；
5)将胶从玻璃板间卸下，加入500mL固定液，于摇床上固定30min，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
6)加入500mL银染液，于摇床上银染30min，倒掉银染液，使用500mL双蒸水迅速洗胶4次；
7)加入500mL预冷的显影液，于摇床显影，等待条带清晰后倒去显影液，加入500mL固定液终止显影，倒掉固定液，倒入500mL双蒸水洗胶4次；
8)读取条带，确定基因型。
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Non-Patent Citations (2)
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| Major Histocompatibility Complex Variation in the Endangered Crested Ibis Nipponia nippon and Implications for Reintroduction;Bei Zhang，等;《Biochemical Genetics》;20060430;第44卷(第3/4期);第113-123页 * |
| 朱鹮I、II类MHC多位点单倍型及其适应性进化研究;蓝泓;《中国博士学位论文全文数据库(农业科技辑)》;20150131(第1期);第18-26页 * |
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