CN117737233A

CN117737233A - 用于检测hla-a29等位基因的uap寡核苷酸、试剂盒和方法

Info

Publication number: CN117737233A
Application number: CN202410191735.0A
Authority: CN
Inventors: 王露楠; 姬慧敏; 冯凯豪; 常乐; 闫颖; 孙慧珍
Original assignee: Beijing Hospital
Current assignee: Beijing Hospital
Priority date: 2024-02-21
Filing date: 2024-02-21
Publication date: 2024-03-22

Abstract

本发明公开用于检测HLA‑A29等位基因的UAP寡核苷酸、试剂盒和方法。本发明利用基于UAP的寡核苷酸，识别HLA‑A29等位基因的特异性单核苷酸多态性位点，达到检测HLA‑A29的目的。此外，本发明还设计HLA‑B基因保守区的特异性引物及探针，作为检测体系的内参。本发明将目的基因和内参基因的特异性引物和探针加入同一管中进行双重荧光PCR，该方法简单、快速、特异性和灵敏度较高，可以作为鉴定人基因组是否携带HLA‑A29等位基因的检测方法，协助临床诊断鸟射脉络膜视网膜病变。

Description

用于检测HLA-A29等位基因的UAP寡核苷酸、试剂盒和方法

技术领域

本发明涉及基因检测领域，具体地涉及用于检测HLA-A29等位基因的UAP寡核苷酸、试剂盒和方法。

背景技术

人类白细胞抗原（HLA）是由HLA基因复合体所编码的产物，定位于第6染色体短臂上。HLA系人类组织相容性复合体（MHC）的表达产物，具有识别自我与非我判断的免疫调节功能，是构成移植排斥及抗原抗体反应的重要物质。

HLA按其编码基因分布和功能分为Ⅰ类抗原、Ⅱ类抗原和Ⅲ类抗原。其中HLAⅠ类抗原包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，其在疾病与免疫反应中具有重要意义。目前，多项研究表明，一些自身免疫性疾病、肿瘤免疫、器官移植、生殖免疫等研究中，与特定HLA I类分子的基因亚型具有高度相关性。

鸟射脉络膜视网膜病变（BSCR）是一种双侧慢性眼部炎症，无眼外表现，其临床症状是慢性双侧后葡萄膜炎，以多个乳白色脉络膜斑点为特征，常出现视物模糊、眼睛干涩、眼红、眼痛和眼球震颤等症状，预后不良可导致威胁视力的进行性脉络膜视网膜萎缩。BSCR由于发病隐蔽，多数患者因诊断延迟而导致治疗不及时，从而面临重大视力丧失的风险。多项研究表明，HLA-A29与BSCR的发生具有很强的相关性，超过95%的BSCR患者携带HLA-A29等位基因，且已知无其他具有更强的HLA等位基因关联。但BSCR的发病机理目前尚不清楚，有研究认为5号染色体上编码的内质网氨基肽酶ERAP-1和ERAP-2，在结合HLA I类分子前具有肽片段修饰功能，而在HLA-A29阳性的BSCR患者中，ERAP-1和ERAP-2联合多态性显示出最大的疾病风险。因此，认为ERAP-1、ERAP-2和HLA-A29共同驱动BSCR的发病，HLA-A29的ERAP依赖性抗原呈递是BSCR的关键疾病途径。国际合作组织葡萄膜炎命名标准化（SUN）工作组将HLA-A29列为BSCR的诊断标准之一。然而，在临床及科研应用中，针对BSCR疾病相关的HLA-A29检测仍局限于抗原检测及NGS检测，检测成本较高、操作复杂、耗时较长，目前也没有针对BSCR疾病诊断的HLA-A29分型试剂盒。迫切需要建立一种简便、快速、准确的检测方法检测HLA-A29，以期协助临床诊断BSCR。

目前用于HLA分型的主要技术包括血清学分型及等位基因分型检测两类。血清学分型是基于补体依赖性细胞毒性（CDC）和固相分析（SPA）的方法，其中CDC是检测抗HLA抗体的金标准方法，利用补体系统活性，通过特异性抗体与靶淋巴细胞上HLA分子结合，激活补体系统，导致细胞溶解。CDC检测方法相对简单，但检测灵敏度低，会出现假阴性结果，同时由于需要细胞培养，实验流程费时费力。SPA方法是将已知HLA抗原固定，与待测样本中的HLA抗原结合，通过加入特异性抗体和显色剂等检测特定HLA抗原。虽然SPA方法特异性和灵敏度相对较高，但操作过程复杂且无法检出稀有HLA抗原。等位基因分型方法包括聚合酶链式反应-序列特异性引物（PCR-SSP）、聚合酶链式反应-序列特异性寡核苷酸（PCR-SSO）、实时聚合酶链式反应（Real Time-PCR）、基于测序的分型（SBT）和下一代测序（NGS）。PCR-SSP基于特定的等位基因序列设计引物，而PCR-SSO测定依赖于HLA多态性区域中的位点特异性设计，这两种检测方式简单、快速，适用于对单个样本进行分型，但由于等位基因数量及基因亚型数量的增加，使得检测引物需要不断更新。SBT法已成为目前高分辨率HLA分型和识别新等位基因的方法，但价格昂贵且耗时较长，且由于HLA-A为等位基因，为了准确鉴定基因分型势必增加工作流程和测序费用。NGS是利用高通量测序技术对HLA基因进行全基因组或特定区域的测序，然后通过比对HLA参考序列进行HLA基因型的鉴定，该方法通量大、分辨率高且可以覆盖多个HLA基因位点，但是NGS产生的数据量大，需要进行复杂的数据分析和解读，且设备和试剂的购买和维护成本较高，不利于临床大量分型工作。

与传统的PCR相比，实时荧光PCR法可在不进行电泳等繁琐后续操作的情况下快速检测目的基因。其中，TaqMan法利用Taq聚合酶的5´-3´核酸外切酶活性，在杂交过程中切割双标记探针，基于切割基团的荧光检测来提高定量PCR的特异性，从而对扩增的产物进行定量或定性分析。然而，目前没有基于实时荧光PCR法来很好的检测HLA-A29等位基因的方法。

背景技术中的信息仅仅在于说明本发明的总体背景，不应视为承认或以任何形式暗示这些信息构成本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容

针对现有技术中存在的至少部分技术问题，发明人开发了基于U型锚定引物（U-anchoring primer，UAP）的特定寡核苷酸进行HLA-A29等位基因的实时荧光PCR检测的方法，本发明的寡核苷酸具有极高的特异性，从而能够有效地特异性检测HLA-A29等位基因，而不会受到其他等位基因的干扰。具体地，本发明包括以下内容。

本发明的第一方面，提供用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中，所述第一寡核苷酸包含能够与靶基因第一区域特异性结合的第一结合区和第二结合区以及用于连接所述第一结合区和所述第二结合区的非结合区，所述第一结合区的长度大于所述第二结合区的长度，且所述第二结合区对应的靶序列包含HLA-A29等位基因的特异性SNP位点。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，所述第二寡核苷酸包含能够与靶基因第二区域特异性结合的第三结合区和第四结合区以及用于连接所述第三结合区和所述第四结合区的非结合区，所述第三结合区的长度大于所述第四结合区的长度，且所述第四结合区对应的靶序列为HLA-A29等位基因的特异区序列。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，所述特异性SNP位点为HLA基因的G649A或G689C；所述特异区序列包含GCGAACC或ACCTCTC。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，所述第一寡核苷酸的非结合区和所述第二寡核苷酸的非结合区的长度各自分别为4-10nt；

所述第一结合区和所述第二结合区之间的长度和所述第三结合区和所述第四结合区之间的长度各自分别小于或等于对应的非结合区的长度。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸扩增得到的片段的长度为25-350bp，优选50-250bp。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，所述第一结合区的序列选自SEQ ID NO: 1或8中的至少一部分连续序列，所述第二结合区的序列选自GGCACCG或CTGCAGA中的至少部分连续序列；

所述第三结合区的序列选自SEQ ID NO: 16或24中的至少一部分连续序列，所述第四结合区的序列选自GGTTCGC或GAGAGGT中的至少部分连续序列。

在某些实施方案中，根据本发明所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其中，进一步包括第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能够特异性结合至靶基因的第一区域和第二区域之间的至少一部分连续序列，且所述第三寡核苷酸包含荧光基团。

在某些实施方案中，本发明第三寡核苷酸的序列如SEQ ID NO：43或52所示。

本发明的第二方面，提供一种用于检测HLA-A29等位基因的试剂盒，其包括第一方面所述的寡核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒进一步包括内参引物和/或探针。优选地，其为针对HLA-B的保守区段设计的引物和探针。

本发明的第三方面，提供一种用于检测HLA-A29等位基因的方法，其包括使用本发明所述的寡核苷酸进行实时荧光PCR的步骤。

本发明利用特异的UAP寡核苷酸，识别HLA-A29等位基因的特异性单核苷酸多态性位点，达到检测HLA-A29的目的。此外，本发明还设计HLA-B基因保守区的特异性引物及探针，作为检测体系的内参引物或探针。本发明将目的基因和内参基因的特异性引物和探针加入同一管中进行双重荧光PCR，该方法简单、快速、特异性和灵敏度较高，可以作为鉴定人基因组是否携带HLA-A29等位基因的检测方法，协助临床诊断鸟射脉络膜视网膜病变。

附图说明

图1 寡核苷酸引物（UAP引物）优化结果。A~D为A29靶点1（G649A）优化引物5~8a结果，E~H为A29靶点2（G689C）优化引物5~8a结果；橙色线为不同优化引物扩增HLA-A29质粒标准品结果；蓝色线为扩增除HLA-A29外其余质粒混合物标准品结果；绿色线为阴性对照结果。

图2 引物特异性及检测体系特异性结果。A：基于寡核苷酸引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点1；B：基于普通引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点1；C：基于寡核苷酸引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点2；D：基于普通引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点2。图中绿色线为检测HLA-A29质粒标准品结果，橙色线为检测非HLA-A29质粒标准品结果。

图3临床gDNA样本特异性检测。红色虚线为等位基因HLA-A29阳性样本，橙色实线为等位基因HLA-A29阴性样本。A、B为基于寡核苷酸引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点1、2；C、D为基于普通引物的实时荧光PCR方法检测HLA-A29靶点1、2。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为具体公开了该范围的上限和下限以及它们之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

本文中，术语“特异区”指多种不同核苷酸序列之间各自明显不同或完全不相同的核苷酸序列的片段，其与所选定的不同核苷酸序列的范围或不同核苷酸序列组成的组相关的一个相对概念。本文中，特异区优选是指在同一基因簇或基因家族内不同基因(如HLA基因、HLA-A基因等)之间序列不完全相同的片段。可选地，在同一基因簇或基因家族内的不同基因(如HLA基因、HLA-A基因等)中，小部分基因存在相同序列，而在另外大部分基因的对应序列不同的情况，也属于本文中所述的特异区。

本文中，术语“特异区序列”是指在本文所述的特异区内存在的由连续的多个核苷酸组成的序列。特异区序列可以是在来源于受试者的生物样本中存在的不同核酸分子、不同基因或不同核苷酸序列片段之间特有的序列。优选地，本申请的“特异区序列”是指在HLA-A全部基因亚型的小部分亚型中存在，而大部分亚型中不存在的序列。

本文中，术语“特异性SNP位点”是指在所有HLA基因或HLA-A基因的不同亚型之间不同，仅在特定亚型内存在的单碱基不同的位置。即特异性SNP位点并不是个体特定的位点，而是特定亚型内不因个体不同而变化的独特的SNP位点。

本文中，术语“结合区”是指能够与靶基因的一部分连续序列特异性结合的寡核苷酸内的部分区域，其为由连续的多个核苷酸组成的序列。

本文中，术语“特异性结合”，也称作“特异性杂交”，其包括以下含义：(1)在一个模板中与寡核苷酸杂交的靶基因或目标DNA区域仅为一个，且寡核苷酸中的每个碱基均与靶基因或目标DNA的对应碱基配对。即，寡核苷酸与目标DNA完全匹配；(2)在适于PCR反应的条件下，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸与同一模板杂交后，仅能得到一个长度为25-350bp之间的可检测片段。

[用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸]

本发明的第一方面，提供用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，本文有时简称为“本发明的寡核苷酸”，其至少包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，可选地，进一步包括第三寡核苷酸，下面详细说明。

本发明中，第一寡核苷酸设计为用于结合HLA-A29等位基因的特异性SNP位点。由于不同HLA-A亚型之间碱基差异较小，且个体之间也存在大量SNP位点，因此很难设计传统引物通过PCR来区分不同亚型，特别是对于亚型数量众多的HLA-A基因来说，难度更大。为了提高第一寡核苷酸的结合特异性，其设计为包括相对独立的两个结合区，即第一结合区和第二结合区，并且在两个结合区之间设计非结合区。优选地，非结合区由连续的核苷酸序列组成，非结合区通过共价键分别连接到第一结合区和第二结合区。还优选地，组成非结合区的核苷酸采用结合力弱的分子如脱氧腺嘌呤核苷酸，从而使其具有较低的熔解温度。在非结合区内的此类核苷酸可以相同，也可以不同，只要不与靶基因(特别是靶基因第一位点内的任何序列)结合即可。在某些实施方案中，非结合区由多个脱氧腺嘌呤核苷酸连接组成。非结合区内核苷酸的数量不限定，一般为4-10nt，如5、6、7、8、9、10nt等。

在某些实施方案中，第一结合区位于第一寡核苷酸的5’端侧，第二结合区位于第一寡核苷酸的3’端侧，此时，优选第一结合区的长度大于第二结合区的长度，从而当在进行PCR时较长的5’端侧第一结合区优先与模板DNA结合，3’端第二结合区的长度较短，将SNP位点设计到该区域，只有当3’端引物序列与靶位点完全结合时，才可启动引物的扩增。相反，当模板序列与3’端引物序列不完全互补时，则无法启动扩增反应。由此进一步提高结合特异性。

本发明中，第二寡核苷酸设计为能够与HLA-A29等位基因的特异区序列特异性结合。由于HLA基因类型或不同亚型众多，对于某种特定的亚型很难存在唯一或特异的SNP位点。为此，发明人在设计第二寡核苷酸时选择特异区序列。本文中，特异区序列是指在HLA基因之间或不同亚型之间相对特异的序列。优选地，特异区序列是指在HLA-A全部基因亚型中小部分亚型中存在，而大部分亚型中不存在的序列。特异区序列与特异性SNP位点的距离一般为25-600bp之间，优选30-500bp之间，更优选40-450bp之间，还优选45-400bp之间。在某些实施方案中，特异区序列在特异性SNP位点的下游即3’端。

在某些实施方案中，本发明的特异区序列包含GCGAACC或ACCTCTC中的至少一部分连续序列。

在某些实施方案中，本发明的第二寡核苷酸与第一寡核苷酸类似，包含能够与靶基因第二位点特异性结合的第三结合区和第四结合区以及用于连接第三结合区和第四结合区的非结合区。即第三结合区和第四结合区是相对独立的区域，从而提高第二寡核苷酸的结合特异性。优选地，第三结合区的长度大于第四结合区的长度，且与第一寡核苷酸不同的是，第四结合区设计为能够特异性结合至特异区序列。第二寡核苷酸中的非结合区与第一寡核苷核中的非结合区相同，并且可以采用相同的设计，也可以采用不同的设计。

在某些实施方案中，本发明的第一结合区的序列选自SEQ ID NO:1和/或8中所示序列中的至少一部分连续序列。第一结合区的示例性序列如SEQ ID NO:1-15所示。

在某些实施方案中，本发明的第二结合区的序列选自GGCACCG和/或CTGCAGA中的至少一部分连续序列。第二结合区的示例性序列如下：

GGCACCG；

CTGCAGA。

在某些实施方案中，本发明的第三结合区的序列选自SEQ ID NO: 16和/或24中所示序列中的至少一部分连续序列。第三结合区的示例性序列如SEQ ID NO:16-31所示。

在某些实施方案中，本发明的第四结合区的序列选自GGTTCGC和/或GAGAGGT中的至少一部分连续序列。第三结合区的示例性序列如下：

GGTTCGC；

GAGAGGT。

本发明中，优选地，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸两者组成适于进行PCR扩增的引物对。为此目的，第一寡核苷酸与第二寡核苷酸扩增得到的对应靶序列的长度一般为25-350nt，优选30-300nt，更优选40-250nt，进一步优选50-200nt等。

本发明的第三寡核苷酸为可选的成分，其能够特异性结合至对应于靶基因第一位点与第二位点之间，且第三寡核苷酸包含荧光基团。

本发明的第三寡核苷酸的长度优选地使其适于与互补DNA杂交，以提供稳定的杂交体。通常，第三寡核苷酸的长度是10-50 nt，优选15-30 nt，如20nt、25nt等。需要说明的是虽然优选第三寡核苷酸能够与其杂交的DNA完全互补，但是在有些情况下，第三寡核苷酸也可与其杂交的DNA不完全互补。

本发明中，荧光基团优选标记于核苷酸残基上，且优选地，用荧光团标记的核苷酸残基中至少2个被至少2个非标记的核苷酸残基分隔。通常有2、3、4、5或6个未标记的核苷酸残基来分隔标记的核苷酸残基。特别优选地，2个未标记的残基分隔标记的残基。另外特别优选地，所有的标记核苷酸探针被至少2个未标记核苷酸残基分隔。优选地，分隔荧光基团从而避免荧光基团间的直接“接触”淬灭。接触淬灭产生于荧光基团间的物理接触，且通常使用物理分隔来避免接触淬灭，即荧光团标记的碱基间至少有2个核苷酸残基。

本发明的第三寡核苷酸中，各核苷酸残基经常衍生自天然的核苷A、C、G和T。然而，也可在本发明的第三寡核苷酸的一个或多个位置使用核苷酸类似物。此类核苷酸类似物例如在碱基部分和/或糖部分和/或磷酸键被修饰。碱基修饰(例如，丙炔基dU (dT类似物)和2-氨基dA)一般改变了杂交特性并使得具有少于15个核苷酸残基的寡核苷酸的应用更有吸引力。对于含丙炔基dU的寡核苷酸，它们的长度大约为10个残基，并根据所需的与靶序列的解链温度而变化。

在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸中使用相同的荧光基团。可使用任何能结合核苷酸残基的荧光基团，只要其不阻止寡核苷酸与其靶序列杂交即可。

本发明的荧光基团的实例包括但不限于基于荧光素的荧光团，例如FAM(6-羧基荧光素)、TET(四氯荧光素)、HEX(六氯荧光素；基于罗丹明的荧光团，例如ROX (6-羧基-X-罗丹明)和TAMRA(6-羧基四甲基罗丹明)；Cy染料家族，尤其是Cy3和Cy5。

本发明还可使用其他荧光素，例如具有不同发射光谱的荧光素，如NED和JOE。可使用其他荧光基团，例如Alexa、Atto、Dyomics、Dyomics Megastokes和Thilyte染料家族中的荧光基团。

在本发明的某些实施方案中，分别使用C6 FAM dT或荧光素dT在尿嘧啶/胸腺嘧啶碱基处标记寡核苷酸(在本文中，dT和dU的结构是相同的，因此这两个术语可交换使用)。可将FMOC保护的亚磷酰胺包含在寡核苷酸内部的T位置，并作为多种荧光染料结合的位点，这些荧光染料包括但不局限于FAM、TET、HEX、ROX、TAMRA、VIC、Cy3和Cy5。寡核苷酸合成后，可从2’-保护的尿苷上去除FMOC基团，如适当保护的6-羧基荧光素亚磷酰胺的荧光团亚磷酰胺可偶联到游离的2’-羟基基团。在另一具体实施方式中，在A、C或G位置标记寡核苷酸，而标记的核苷酸或在固相寡核苷酸合成期间作为亚磷酰胺而被纳入，或在寡核苷酸合成后使用保护的亚磷酰胺(例如8-胺烷基-dA、7-胺烷基7-deaza-dA、N(4)-胺烷基dC和5-胺烷基-dC)与荧光基团结合。

在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸中包含相同的荧光团。在另外的某些实施方案中，在本发明的同一第三寡核苷酸中包含不同荧光基团。特别优选第三寡核苷酸包含2种荧光基团，其中一个是ROX而另一个是FAM。

在某些实施方案中，本发明的第三寡核苷酸包括选自SEQ ID NO:43或52所示序列。

本发明的寡核苷酸既包括仅一种类型寡核苷酸的形式，也可包括多种不同类型寡核苷酸的组合形式。在组合的情况下，其组合实例包括但不限于两种以上不同类型的第一寡核苷酸的组合，或一种类型的第一寡核苷酸和一种类型的第二寡核苷酸的组合，或者第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和第三寡核苷酸的组合等。在多种不同类型寡核苷酸组合的情况下，可以称作寡核苷酸组合物，其存在形式不特别限定，可以干粉或溶液形式存在。可以是全部寡核苷酸组成的混合物形式，也可以是第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和可选的第三寡核苷酸分别为单独存在的形式。优选地，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以混合物的形式存在，第三寡核苷酸单独存在。第一寡核苷酸与第二寡核苷酸的混合比不特别限定。优选地，第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以1:1的摩尔比的混合物形式存在。

本发明的寡核苷酸组合物中，可以使用上述任意的第一寡核苷酸和第二寡核苷酸以及可选的任意第三寡核苷酸。第一寡核苷酸、第二寡核苷酸和可选的第三寡核苷酸的组合形式不特别限定。例如，由序列如SEQ ID NO:41所示的第一寡核苷酸和序列如SEQ IDNO:42所示的第二寡核苷酸组成的寡核苷酸组合物，由序列如SEQ ID NO:46所示的第一寡核苷酸和序列如SEQ ID NO:47所示的第二寡核苷酸组成的寡核苷酸组合物。

本发明的第二方面，提供用于检测HLA-A29等位基因的试剂盒，其包含本发明第一方面所述的寡核苷酸。关于寡核苷酸的说明如上所述，在此不再赘述。

除了寡核苷酸之外，本发明的试剂盒还可包括与调控制造、使用或销售诊断试剂盒相关的注意事项。另外，本发明的试剂盒还可提供有使用、储存和故障排除的详细说明书。试剂盒还可任选地设置在适合的优选用于以高通量设置的机器人操作的装置中。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分(例如，寡核苷酸)可提供为干粉。当试剂和/或组分提供为干粉时，粉末可通过添加适合的溶剂来恢复原状。预期该溶剂还可设置于另一容器中。容器通常会包括至少一种小瓶、试管、烧瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中可选等分地放置溶剂。试剂盒还可包括用于包含无菌、药学上可接受的缓冲液和/或其它溶剂的第二容器的手段。

在某些实施方案中，本发明的试剂盒的组分可以溶液形式提供，例如水溶液的形式提供。在以水溶液状态存在的情况下，这些成分的浓度或含量是本领域技术人员能够根据不同需求而方便地确定的。例如，用于储存的目的时，例如寡核苷酸的浓度可以较高的形式存在，当处于工作状态或使用时，可通过例如稀释上述较高浓度的溶液来将浓度降低至工作浓度。

本发明的试剂盒可进一步包含其他试剂或成分。例如，用于进行PCR所需的DNA聚合酶、各类dNTP和离子如Mg²⁺等。这些其他试剂或成分是本领域技术人员已知的，并且可通过例如冷泉港的《分子克隆实验指南》第四版等公开出版物容易地获知。

在试剂盒中存在超过一种组分的情况下，该试剂盒还通常会包含可单独放置另外的组分的第二、第三或其它另外的容器。另外，可在容器中包含各多种组分的组合。

本发明的试剂盒还可包括保持或维持DNA的组分，例如抗核酸降解的试剂。此类组分可为例如或无RNase或具有抗RNase的保护的核酸酶。本文所述的任何组合物或试剂可为试剂盒中的组分。

本发明的寡核苷酸可用于构建检测HLA-A29等位基因的反应液，其中，反应液包括第一方面所述的寡核苷酸和缓冲液。本发明的缓冲液为适于PCR反应的缓冲液，缓冲液的组成在本领域内是已知的，不特别限定。本发明的反应液进一步包括反应酶如Taq酶和dNTP。可选地，本发明的反应液进一步包括待测样品。

示例性地，本发明的反应液包含Tris (pH=8.5)、KCl、MgCl₂、dNTP、Tween20、甘油、反应酶。优选地，反应液包含20 mM Tris (pH=8.5)、100 mM KCl、12 mM MgCl₂、0.4 mMdNTP、0.2% Tween20、10%甘油、1 U/T Taq热启动酶。

在优选的实施方案中，本发明的反应液同时包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，优选地，反应液中的第一寡核苷酸包括两种以上不同类型或具有不同序列的寡核苷酸，同时反应液中的第二寡核苷酸包括两种以上不同类型或具有不同序列的寡核苷酸。

在某些实施方案中，本发明的反应液进一步包括内参基因引物和/或探针，优选为在HLA-B的保守区段设计的引物和探针。

本发明的第三方面，提供用于检测检测HLA-A29等位基因的方法，本文有时简称为“本发明的检测方法”，其包括非诊断目的的商业性实验性检测，也包括用于诊断目的检测，特别是用于鸟射脉络膜视网膜病变即BSCR的诊断或检测。诊断目的的检测方法可以理解为诊断用途。

本发明的检测方法中只要使用本发明第一方面所述的寡核苷酸或第二方面所述的试剂盒，则不特别限定具体过程或步骤。在示例性方法中，本发明的方法包括PCR扩增步骤，特别是实时荧光PCR扩增步骤。其具体实例包括SYBR Green实时荧光定量PCR方法、Taqman探针定量PCR方法、MGB实时荧光定量PCR方法和微滴数字PCR。

在示例性实施方案中，本发明的方法为定性检测方法。优选地，在这种情况下，本发明的方法包括将第一寡核苷酸作为正向引物，将第二寡核苷酸作为反向引物进行核酸扩增的步骤。进一步还优选包括检测、确认或鉴定核酸扩增产物的步骤。例如，通过在支承体(如琼脂糖)上的电泳鉴定核酸扩增产物的步骤。

在另外的示例性实施方案中，本发明的方法为定量检测方法。优选地，本发明的方法包括将第一寡核苷酸作为正向引物，将第二寡核苷酸作为反向引物，将第三寡核苷酸作为探针进行核酸扩增的步骤。此时，本发明的方法也称作实时荧光定量PCR方法。

本发明的方法中，样品的类型不特别限定。优选为血液样品，例如，血清或血浆样品。

实施例

1、构建不同HLA-A亚型质粒标准品

将已知HLA-A基因亚型的人类gDNA作为模板，设计一对扩增HLA-A基因的通用引物，通过普通PCR方法扩增HLA-A基因的全长序列，并将扩增的序列连接到T或B载体上，以此作为方法学建立的检测模板。表1显示了测序结果正确的19种HLA-A亚型质粒的信息。

扩增HLA-A全长的引物序列如下：

上游引物HLA-A-31F-22bp：5’-GTTTCTCCCTTGTTTCTCAGAC-3’（SEQ ID NO:33）

下游引物HLA-A-3687R-22bp：5’-TTAACTCATCAACCTCTCATGG-3’（SEQ ID NO:34）

表1. 构建的HLA-A亚型质粒的具体信息

2、HLA-A序列分析及HLA-A29引物设计及优化

收集HLA实时数据库(http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/ipd/imgt/hla/和http://hla.alleles.org/nomenclature/index.html)（2022年12月）发布的序列信息，针对全球已发现的7712个HLA-A等位基因进行序列迭代分析，发现HLA-A29亚型序列上存在的两个特异性SNP位点：G649A、G689C，这两个SNP位点可以区分出所有的HLA-A29亚型，据此设计特异性引物。同时，进一步发现在G649A位点下游存在相对保守的区域，即该区域是几个HLA-A亚型共有的T碱基，但是在整体HLA-A序列中，这个位点是反向C碱基。在G689A位点下游同样存在相对保守的区域，即这个位点是几个HLA-A亚型共有的A碱基，但是在整体HLA-A中，这个位点是反向G碱基。本发明中，所述第一对寡核苷酸引物可以识别91.6%的HLA-A29亚型，第二对寡核苷酸引物可以识别96.8%的HLA-A29亚型，两对引物探针分别与内参基因混合进行检测时可以识别100%的HLA-A29亚型。

表2所示为经过优化设计后的8对针对不同SNP位点的引物和探针序列。

表2. HLA-A29基因检测UAP引物及探针序列

“a”表示插入的脱氧腺嘌呤核苷酸，加粗标记的碱基表示识别HLA-A29特异性SNP位点的碱基。

对以上设计优化引物进行筛选，利用HLA-A29质粒标准品及不含HLA-A29的其他亚型质粒混合物进行检测。如图1及表3所示，结果显示，在A29靶点1中引物A29-UAP-F1R1-8a的△CT最大（非A29质粒混合物检测CT值-A29质粒检测CT值），引物检测效果最好；而A29靶点2中引物A29-UAP-F2R2-6a的检测效果最好。

表3. UAP引物优化检测结果

3、内参质粒构建及内参引物探针设计

通过一对扩增HLA-B基因的通用引物扩增出HLA-B基因的全长序列，并将其连接至B载体上，以此作为内参体系建立的模板；同时在HLA-B的保守区段设计引物和探针，表4所示为筛选之后的内参基因的引物和探针序列。

扩增HLA-B全长的引物序列如下：

上游引物B-genome-F：5’-CCAGTTCARGGACAGGGATTC-3’（SEQ ID NO:53）

下游引物B-genome-R：5’-AACAGACTCAGCACAGCRAAC-3’（SEQ ID NO:54）

表4. 内参基因HLA-B引物和探针序列

4、建立双重PCR体系检测HLA-A29等位基因

1）采用北京天根公司生产的磁珠法血液基因组DNA提取试剂盒（DP329），按照说明书提取待检样本中的gDNA，浓度>20 ng/μL，OD260nm/OD280nm:1.7~2.0。

2）采用2×Eagle Premix (PCR)反应液（品牌：北京金诺美，货号：SJ-PCR002），本预混液包含有除了引物、Taqman探针和模板以外的所有反应所需的成分：20 mM Tris (pH=8.5)、100 mM KCl、12 mM MgCl₂、0.4 mM dNTP、0.2% Tween20、10% 甘油、1 U/T Taq热启动酶。将HLA-A29的靶点1或靶点2的引物和探针与预混液、内参基因HLA-B引物探针按照下表5的浓度放在同一管PCR体系中，对待检样本进行扩增。

表5. HLA-A29等位基因检测反应体系

实验反应条件如表6所示。

表6. 实验反应条件

结果判读如下表7所示。

表7. 结果判读

6、性能验证

（1）双重PCR体系扩增效率验证：

将HLA-A29和内参基因HLA-B的引物和探针按照上述浓度放在同一PCR管体系中，用经过数字PCR定量的10⁵-10²copies/μL的质粒标准品进行扩增（每个稀释度重复3次），结果如表8所示，内参基因HLA-B和HLA-A29以不同质粒浓度为模板进行单独检测和同时检测时的平均Ct值具有良好的一致性，且与单独检测时的扩增效率E相比，双重PCR反应不影响靶标的扩增效率，说明双引物双探针在同一孔中反应不受彼此影响，扩增效率较好。

表8. HLA-A29靶点1、2双重PCR检测性能验证结果

（2）检测灵敏度（LOD）：

1）检测质粒标准品LOD：

将数字PCR定量的HLA-A29、HLA-B标准品质粒稀释，并制备HLA-A29和HLA-B的混合质粒；对混合质粒标准品进行2倍比稀释，对混合质粒进行检测；每天重复测定8次，连续测定3天，将检测结果利用Probit概率法进行分析，确定LOD。

结果显示：HLA-A*29靶点1双重PCR体系中检测HLA-A*29和HLA-B内参质粒标准品的LOD分别为1.05 copies/μL和3.01 copies/μL；HLA-A*29靶点2双重PCR体系中检测HLA-A*29和HLA-B内参质粒标准品的LOD分别为4.78 copies/μL和5.66 copies/μL。

表9.质粒检测反应体系检测限LOD结果

2）检测A29阳性样本gDNA的LOD：

将数字PCR定量的HLA-A29阳性gDNA样本进行2倍比梯度稀释，从原始提取浓度连续稀释10个梯度，并对样本进行检测，每天重复测定8次，连续测定3天，共计测定24次/各浓度样本，将检测结果Probit概率分析，确定LoD。

结果显示：HLA-A29靶点1双重PCR体系检测HLA-A29阳性gDNA样本的A29靶点及内参LOD分别是0.664 copies/μL和1.045 copies/μL，即全血提取gDNA样本稀释625倍仍可有效检出；HLA-A29靶点2双重PCR体系检测HLA-A29阳性gDNA样本的A29靶点及内参LOD分别是8.007 copies/μL和1.271 copies/μL，即80倍稀释gDNA样本仍可有效检出。

表10. A29阳性样本gDNA检测反应体系检测限LOD结果

（3）精密度：

选取低和高两种浓度的质粒标准品样本以及高和低两种浓度的gDNA样本进行精密度验证，所有样本连续检测3天，每天进行6次重复实验，计算批间和批内精密度。结果显示，不论是质粒样本还是gDNA样本HLA-A29靶点1和靶点2以及内参基因的批内和批间精密度均小于5%，

表11. 质粒标准品检测精密度结果

表12. A29阳性样本gDNA检测精密度结果

（4）特异性与符合率：

1）质粒标准品检测：

将所有非HLA-A29质粒分别稀释至1×10³copies/μL，利用HLA-A29靶点1和2检测体系进行型别特异性验证；设计靶点1和2的普通引物进行同步实验，验证基于UAP引物的实时荧光PCR方法的特异性，检测结果如图2所示。图2A、C结果显示，HLA-A29靶点1和2能够特异性识别HLA-A29亚型；同时，普通引物设计下实时荧光PCR方法无法区分非HLA-A29质粒，如图2B、D结果所示，因此UAP引物能够提供更好的引物特异性。

2）临床gDNA样本检测：

以Sanger测序为金标准，对55例样本的HLA-A等位基因进行分型，同时，分别使用基于UAP引物的实时荧光PCR方法和基于UAP引物的实时荧光PCR方法对55例gDNA样本进行检测，结果如图3所示，用UAP引物进行检测时，所有样本内参基因CT值均<30，结果有效；其中4例测序结果含有A29等位基因样本的CT值均<35，因此判定为A29等位基因阳性，其余51例不含有A29等位基因的样本的CT值均>35，判定为阴性，因此，该基于UAP引物的实时荧光PCR方法的阴、阳性符合率均为100%；普通引物检测结果显示，全部样本CT值均<35，非A29样本均有CT值检出，与Sanger测序结果不符，因此证明UAP引物能够提供更好的A29亚型检测特异性。具体结果见图3、表13、表14。

表13. 基于UAP引物的实时荧光PCR方法符合率结果

表14. 基于普通引物的实时荧光PCR方法符合率结果

尽管本发明已经参考示例性实施方案进行了描述，但应理解本发明不限于公开的示例性实施方案。在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的示例性实施方案做多种调整或变化。权利要求的范围应基于最宽的解释以涵盖所有修改和等同结构与功能。

Claims

1.用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，包括第一寡核苷酸和第二寡核苷酸，其中，所述第一寡核苷酸包含能够与靶基因第一区域特异性结合的第一结合区和第二结合区以及用于连接所述第一结合区和所述第二结合区的非结合区，所述第一结合区的长度大于所述第二结合区的长度，且所述第二结合区对应的靶序列包含HLA-A29等位基因的特异性SNP位点。

2.根据权利要求1所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，所述第二寡核苷酸包含能够与靶基因第二区域特异性结合的第三结合区和第四结合区以及用于连接所述第三结合区和所述第四结合区的非结合区，所述第三结合区的长度大于所述第四结合区的长度，且所述第四结合区对应的靶序列为HLA-A29等位基因的特异区序列。

3.根据权利要求2所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，所述特异性SNP位点为HLA基因的G649A或G689C；所述特异区序列包含GCGAACC或ACCTCTC。

4.根据权利要求2所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，所述第一寡核苷酸的非结合区和所述第二寡核苷酸的非结合区的长度各自分别为4-10nt。

5.根据权利要求2所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸扩增得到的片段的长度为25-350bp。

6. 根据权利要求2所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，所述第一结合区的序列选自SEQ ID NO: 1或8中的至少一部分连续序列，所述第二结合区的序列选自GGCACCG或CTGCAGA中的至少部分连续序列；

7.根据权利要求2所述的用于检测HLA-A29等位基因的寡核苷酸，其特征在于，进一步包括第三寡核苷酸，所述第三寡核苷酸能够特异性结合至靶基因的第一区域和第二区域之间的至少一部分连续序列，且所述第三寡核苷酸包含荧光基团。

8.一种用于检测HLA-A29等位基因的试剂盒，其特征在于，包括根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸。

9.根据权利要求8所述的用于检测HLA-A29等位基因的试剂盒，其特征在于，进一步包括内参引物和/或探针；

其中，所述内参引物和/或探针为针对HLA-B基因保守区的特异性引物或探针。

10.一种用于检测HLA-A29等位基因的方法，其特征在于，包括使用根据权利要求1-7任一项所述的寡核苷酸进行实时荧光PCR的步骤。