CN108460246A - 一种基于三代测序平台的hla基因分型方法 - Google Patents

一种基于三代测序平台的hla基因分型方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对；(4)比对后对测序错误进行矫正；(5)分相得到单体型序列；(6)分型判断。相比于现有的HLA基因分型方法，本发明的HLA分型方法对计算资源要求少、分型快、分辨率高，对临床移植组织配型、群体遗传学、人类学和进化学等应用和基础研究工作具有重要价值。

Description

一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法
技术领域
本发明属于生物信息学领域，具体涉及基于三代测序平台的HLA基因分型方法。
背景技术
人类白细胞抗原系统是人类主要组织相容性复合体(Major histocompatibilitycomplex，MHC)的别称。它位于人类6号染色体短臂，由一系列紧密连锁的基因座构成。HLA基因是人类基因组中多态性最高，迄今为止人类最复杂的遗传系统之一。HLA基因编码的蛋白具有识别自体与非体，调节免疫应答等作用。匹配上正确而又高精度的HLA型别对骨髓移植、器官移植是否成功起着决定性的作用。HLA I类(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和HLAII类(HLA-DRB1、HLA-DPB1、HLA-DQB1)在配型中扮演主要角色。此外，HLA基因的型别还与强直性脊椎炎、糖尿病等许多疾病密切相关。
HLA分型的分辨率可以分为以下四类：
a.2位为等位基因；
b.4位为特定HLA蛋白质；
c.6位为特定HLA编码序列(CDS)；
d.8位为特定的HLA基因序列包括未翻译区和内含子。
HLA系统研究从70年代到80年代末期主要是血清学研究；90年代以来，HLA进入了分子水平研究阶段。HLA分型技术同样走过了这一历程。建立于60年代的血清学及细胞学分型技术主要侧重于分析HLA产物特异性。1991年第11届国际HLA专题讨论上提出了HLA的DNA分型方法，随着测序技术的突飞猛进，基于DNA序列的分型方法已经取代了传统的血清学及细胞学分型方法。现DNA分型方法主要分为两种：基于核酸序列识别的方法和基于序列分子构型的方法。基于核酸序列识别的方法主要有：PCR-RFLP,PCR-SSO,PCR-SSP和PCR-SBT(Sequence Based Typing，测序分型技术)。其中PCR-SBT测序方法是现世界卫生组织(WHO)推荐的HLA分型方法的“金标准”。
PCR-SBT方法通过PCR扩增相应HLA的基因区域，对扩增产物测序，测序结果经过专业的软件分型，从而得到HLA的基因型别信息。可达到四位的分辨率，并能检测到新的等位基因。相对之前传统的方法，其分辨率、准确度较高，可达到4位的分辨率。然而，PCR-SBT仍存在以下技术缺陷：(1)成本高，时间相对较慢；(2)PCR-SBT分型方法主要针对多态性位点比较集中的2、3、4号外显子的测定来确定其基因型，而对第1、5、6、7号外显子不进行测序，由于HLA高度遗传多态性，在第1、5、6、7外显子上也有一定的多态性，因此现有的方法测定2-4外显子多态性，可能引起部分等位基因无法指定，存在歧义的结果，严重影响临床工作；(3)无法获得基因全长序列，对内含子和UTR区的序列无法获得；(4)具有一定的随机、推断引入的错误；(5)对可变剪切位点的变异判别不敏感；(6)分型结果只能达到“4位分辨率”。
基于二代测序的分型方法，对HLA基因目的片段进行捕获或PCR扩增，将二代测序短序列进行拼接或组装，根据序列间重叠和连锁关系，构建单体型，对外显子区域进行序列或SNV/Indel的判定；和数据库的序列比较，分型。相对于之前基于一代测序的PCR-SBT方法，该方法降低了成本，提高了多样品的分型速度。二代测序易造成错误比对，很难跨越重复序列，并且由于PCR造成的GC偏好往往导致GC富集区域的错误覆盖，影响变异检测的准确性。测序读长短，需要依赖拼接和组装、连锁分相等可能引入错误，尤其是SNP较少的区域，很难保证分相的准确性。无法获得基因全长，无法全面地揭示HLA的多态性。
三代单分子测序(Single Molecule Real-Time(SMRT)Sequencing)平台，SMRT测序提供具有10-15kb读数的单分子读长，能够跨越大多数HLA I类和部分II类基因。通过目标区域测序(Targeted sequencing)方法，对HLA区域进行扩增。
LAA(Long Amplicon Analysis软件)分相技术对HLA目标区域进行扩增，进行三代PacBio Sequel测序，对原始reads(读长)基于最大似然法进行粗聚类，用基于Quiver的算法对聚类后的序列分相，然后用Quiver算法对单倍型矫正，获得一致性序列。LAA分相的技术缺陷有：(1)在高深度的情况下，成百上千条Reads进行聚类，耗用内存非常大、计算量非常大，耗用时间长(耗用时间由扩增子大小决定，2-3k的扩增子要耗用3个小时，耗用内存由扩增子大小和测序深度决定)；(2)聚类只能采用是原始的Reads，HLA为人类基因组中多态性最高的遗传系统，对该区域分型，得到真实的SNV/Indel非常关键，LAA真实的SNV/InDel和三代测序错误引进的SNV/InDel未作区分，即进行聚类，影响结果准确性；在没有矫正错误率的情况下，聚类出的单体型和真实的单体型有一定程度的出入；(3)对单个SNV/InDel不敏感，根据固定算法聚类分相，操作不够灵活。
基于三代测序的依赖最大深度的HLA分型技术，其技术方案为基于原始下机Nanopore数据，对blast比对后的I类的HLA基因计算每种深度，深度最高的为其HLA型别。
基于三代测序的依赖最大深度的HLA分型技术方案缺陷：
1)经过blast比对，对不完全比对的结果进行计数，方法不严谨；
2)分型准确率低；
发明内容
本发明利用新的三代测序技术进行全长测序(外显子以及内含子，UTR区域)，并且用开发的程序进行超高分辨率的HLA分型，可得到基因全长序列，可达到6位或8位的高精度分型。
本发明公开了一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：
(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；
(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；
(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对，所述参考基因序列为IPD-IMGT/HLA数据库中的一条最长序列；
(4)比对后采用如下程序对测序错误进行矫正：
(4.1)编码原始比对矩阵
经过和参考序列的比对，所述HLA基因组成了由碱基构成的特有矩阵；使用samtools软件的tview命令，输出文本格式的碱基与参考基因序列的比对矩阵；以参考基因的位置为横坐标、以i表示，以深度为纵坐标、以j表示，矩阵组成单元以x表示；
设置初始阈值y，所述y表示默认的错误率，所述错误率为测序错误占总深度的比例，所述错误率为10％；
每个i位置的碱基纵向的总深度为Dep_total[i]；
统计每个i位置对应的所有j位置x的数量Num(x)，并计算x对应的深度Dep(x)；
(4.2)纯合、杂合位点的可视化矫正
(4.2.1)设置初始错误率阈值y，所述y为10％；
(4.2.2)确定扩增子杂合等位型j位置及比例；
对于每个i位置，当Dep(x)>y，使用Dep(x1)代表最大深度碱基类型的深度，仅次于Dep(x1)的深度，用Dep(x2)表示，若有第三大碱基类型的深度，为Dep(x3)；
对整个扩增子的杂合比例进行计算，当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))<20％时，假设其为纯合子；当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))>＝20％时，假设其为杂合二倍型别，选取SNV等位型杂合比最接近0.5的四个点，该四个点依照以下规则选取：
以δi衡量SNV等位型杂合比与0.5的接近程度，
δi＝(Dep(x1)/Dep_total[i]-0.5)2+(Dep(x2)/Dep_total[i]-0.5)2；选取δi最小的四个i位置；
且该四个位置前后两个位置的Dep(*)小于总深度的20％，否则继续根据δi筛选；
根据该四个i位置确定矩阵中每个j位置的连锁相：
(4.2.2.1)对于矩阵中该四个杂合位点，第一个杂合位点i位置最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2，确定第一个杂合位点的不需要矫正的j坐标的相位；
(4.2.2.2)第二个杂合位点的相位根据第一个杂合位点的每一个j坐标的相位情况确定：
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的第二大深度Dep(x2)的碱基类型，则最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x2)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，则第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若满足以上两个条件，则根据该方法确定其它杂合位点的连锁相；若以上两个条件不都满足，继续根据第三个位点分别和第一个杂合位点、第二个杂合位点进行判断；满足(4.2.2.2)所述要求的位点，共同确定连锁相，不满足要求的位点被作为纯合位点；第四个i位置，依照此方法，对前面三个点进行验证和对不确定相位的j位置补缺；
对于该四个杂合位点，相位1对应的j位置组成数组j(phase1)，相位2对应的j位置组成数组j(phase2)。以相位1对应的基因型的深度为Dep(phase1)，以相位2对应的基因型的深度为Dep(phase2)，计算杂合基因型的比例Rh：
Rh＝Dep(phase1)/[Dep(phase1)+Dep(phase2)]；
(4.2.3)确定纯合位点与杂合位点；
对于每个i位置，满足以下任意一种情况，则为杂合位点：
①Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)；
②Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)；
否则为纯合位点；
根据矩阵中杂合位点j位置的连锁相的判断，对纯合、杂合位点再次验证调整；初步确定该扩增子或基因为纯合单体型还是杂合二倍型；
(4.2.4)碱基矫正
对于纯合位点，该i位置调整y＝Dep(x2)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基类型；
对于杂合位点，该i位置调整y＝Dep(x3)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标将根据其连锁相，从而决定该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基或第二大深度Dep(x2)的碱基；
(4.2.5)输出后验矩阵
(5)分相得到单体型序列
对矫正后的矩阵进行序列读取；
根据(4.2.3)确定的确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，若为纯合单体型，输出最大深度的一条单体型序列；否则根据(4.2.3)确定的每个j位置的连锁相，对校正后的序列按照相位1和相位2归类；输出最大深度的两条单体型序列，以两条单体型序列深度为单位，和对应(4.2.2.2)中的Dep(phase1)、Dep(phase2)进行卡方检验，确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，输出一致性序列；
(6)分型判断
(6.1)根据比对位置，确定单体型序列的每个外显子编号及对应的碱基序列；对于每条单体型序列，根据外显子匹配度输出完全匹配结果result1，否则输出最佳匹配的6位分型结果result1，同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别，作为result1；
(6.2)进一步对单体型全长匹配打分
若IPD-IMGT/HLA数据库中基因全长序列文件hla_gen.fasta，有result1的分型，则将单体型中内含子的序列，与数据库中的参考序列进行匹配打分；
给出最佳8位分型结果result2，若突变则同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别result2。
根据本发明的实施方式，上述步骤(4.1)中所述深度Dep(x)表示如下：
匹配：Num(,)+Num(.)＝Dep(match)
不匹配：Num(*)＝Dep(*)
断开无匹配：Num()＝Dep(space)
A突变或插入：Num(A)＝Dep(A)
T突变或插入：Num(T)＝Dep(T)
C突变或插入：Num(C)＝Dep(C)
G突变或插入：Num(G)＝Dep(G)
x的类型和samtools tview的输出结果类型一致，Dep(match)表示矩阵中该位点测序序列和参考基因组匹配的深度，分别包括反向匹配和正向匹配，Num(,)表示矩阵中该位点反向匹配的数量，Num(.)表示矩阵中该位点正向匹配的数量；Dep(*)表示矩阵中测序序列及参考序列间该位点无匹配的深度，Num(*)表示不匹配的数量；Dep(space)表示矩阵中该位点没有序列覆盖的深度，Num()表示矩阵中该位点空格的数量；Dep(A)、Dep(T)、Dep(C)、Dep(G)分别表示A、T、C、G突变或插入的深度。
上述步骤(1)中所述HLA基因可为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1或HLA-DPB1中的任意一种或几种。
根据本发明的实施方式，扩增HLA-A所用的引物序列如SEQ ID No：1～2所示，扩增HLA-B所用的引物如SEQ ID No：3～4所示，扩增HLA-C所用的引物如SEQ ID No：5～6所示，扩增HLA-DRB1所用的引物序列如SEQ ID No：7～10所示，扩增HLA-DQB1所用的引物序列如SEQ ID No：11～12所示，扩增HLA-DPB1所用的引物序列如SEQ ID No：13～16所示。
上述HLA基因可来自单个样品。
上述HLA基因可来自多个样品，HLA基因的引物的5’端加有用于区分样品的Barcode(条形码)序列。
根据本发明的实施方式，上述Barcode序列可为如SEQ ID No：17～28所示的序列。
根据本发明的实施方式，其中步骤(3)中所述长序列比对为长序列Blasr比对。
根据本发明的实施方式，上述步骤(2)中可对原始数据进行css矫正，随后步骤(3)中用css矫正后的数据与所述参考基因序列进行长序列Blasr比对。
根据本发明的实施方式，上述css矫正所用软件为smrtlink v5.0软件包中的ccs软件。
在本发明中，三代测序平台可以是但不限于PacBio Sequel、Nonopore或pacbioRSII。
有益效果
近年来随着测序技术的发展，越来越多的HLA基因被命名。二代测序易造成错误比对，很难跨越重复序列，并且由于PCR造成的GC偏好往往导致GC富集区域的错误覆盖，影响变异检测的准确性。
三代在检测HLA基因多样性的优势：准确、快速、长读长。实现无插补等位基因分离，检测5'UTR内含子和3'UTR内调节区的变体，真正的揭示了HLA等位基因多样性。
然而三代测序具有较高的错误率，若直接用来分型；会造成由于错误率引入的SNV/InDel和真正的SNV/InDel区分不开。本发明根据三代错误率特点，有效的矫正了错误的SNV/InDel，确保了分型的准确性。可视化的错误纠正。对HLA分相、分型更清晰。
应用本发明所描述的方法对HLA进行分型，可占用较小的内存，高速、批量的完成HLA分型。
附图说明
图1为部分样品HLA基因PCR扩增产物实验胶图。
图2为HLA基因分型的数据矫正的示意图。
图3为总的HLA分型流程图。
具体实施方式
取30例单体型不完全一致的外周血全基因组DNA样品，用于HLA I类(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和HLAII类(HLA-DRB1、HLA-DPB1、HLA-DQB1)分型。
实施例1
30例样品的6个HLA基因(HLAI类(HLA-A、HLA-B、HLA-C)和HLAII类(HLA-DRB1、HLA-DPB1、HLA-DQB1))加Barcode进行混样上机测序并分型，实验步骤如下：
1、样品制备和扩增
1.1试剂准备
1.1.1引物设计
由8个扩增子富集HLA-A,B,C,DRB1,DQB1,DPB1六个HLA基因(其中DRB1，DPB1分开两段进行扩增)的5’UTR和3’UTR区域设计引物，并在引物的5’端加上Barcode序列。Barcode序列是为了区分样品，每个样品针对各个基因加的Barcode一样，但是引物序列不一样。采用Asymmetric Barcode，即上游引物和下游引物使用不同的Barcode。具体编号组合见表1Barcode编号与引物编号组合，其中BC后面的数字代表Barcode编号，A和an代表HLA-A的DNA的扩增子，B和bn代表HLA-B的DNA的扩增子，C和cn代表HLA-C的DNA的扩增子，3-DRB1和rn3代表DRB1的DNA的3’端的扩增子，5-DRB1和rn5代表DRB1的DNA的5’端的扩增子，qn代表DQB1的DNA的扩增子，3-DPB1和pn3代表DPB1的DNA的3’端的扩增子，5-DPB1和pn5代表DPB1的DNA的5’端的扩增子，f代表上游引物，r代表下游引物。引物和Barcode序列见表2。
表1实验Barcode编号与引物编号组合
表2引物和Barcode序列
1.1.2模板DNA
1.1.3 PrimeStar GXL(TAKARA)
1.1.4 PCR水
1.2实验室仪器及耗材准备
1.2.1 Eppendorf移液器(0.5-2.5ul，l-10ul,2-20ul,10-100ul,20-200ul,100-1000ul)及吸头(0.5-10ul，20-200ul,100-1000ul)
1.2.2 1.5mL离心管，0.2mLPCR管，离心管架，96孔PCR管架
1.2.3冰箱(4-℃20,℃)
1.2.4振荡器1台
1.2.5离心管离心机和PCR管离心机各1台
1.2.6 PCR仪
1.2.7酒精喷壶(75％酒精)，剪刀，垃圾箱与垃圾袋，吸水纸，镊子，酒精棉球
1.2.8一次性无粉乳胶手套
1.3操作步骤
1.3.1 PCR反应体系配制
按表3配制PCR反应试剂体系。
表3 PCR反应体系表
组分 用量ul
5x Primestar GXL缓冲液 4
dNTP(每种2.5mM) 1.6
F(10pmol/ul) 0.8
R(10pmol/ul) 0.8
Primestar GXL 0.4
模板DNA 10ng
水 至20ul
1.3.2 PCR反应程序
按表4的PCR反应程序进行。
表4 PCR反应程序表
1.3.3扩增片段电泳检测
1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增片段。5-DRB1可能出现两条带或一条带，其它扩增子都应产生单一条带。
1.3.4纯化PCR产物
1.3.4.1在96孔PCR板上，每个孔中加入8ul XP磁珠。
1.3.4.2吸取10ul PCR产物，加入相应的已加入磁珠的孔中，并小心吹吸混匀。
1.3.1.3室温结合5分钟后，将96孔板放在96孔磁力架上静置2分钟，吸出上清丢弃。
1.3.4.4每个孔中加入新鲜配制的70％乙醇200ul，清洗磁珠30秒，在磁力架上吸出70％乙醇丢弃。重复本步骤一次。
1.3.4.5取下96孔板，室温晾干残留的乙醇。
1.3.4.6每个孔加入8ul水或EB缓冲液，吹吸混匀磁珠，洗脱5分钟。
1.3.4.7将96孔板放回磁力架上，吸附2分钟。
1.3.4.8吸取上清至新的96孔板。
1.3.4.9 nanodrop测浓度，根据附表5计算摩尔浓度。
表5摩尔浓度计算公式表
1.3.5混合纯化后的PCR产物
1.3.5.1根据表6的比例，混合每个样品所得到的8个PCR产物(其中DRB1与DPB1两个基因分别分为两段扩增)。
表6 PCR产物混合比例表
扩增子名称 比例％
A 6％
B 6％
C 6％
5-DRB1(包含1号外显子) 10％
4-DRB1(包含2,3,4号外显子) 26％
DQB1 26％
5-DPB1(包含1,2号外显子) 10％
4-DPB1(包含3,4,5号外显子) 10％
表6的上样量，是根据基因长度和基因特异性、基因扩增效率等综合因素，在多次实践摸索中得到的结果，在充分考虑了上述因素后，以扩增子ABC(3K左右)为基数，其余较长的片段增加为1.5-4倍，其比例按照长度增加而相应增加；5-DRB1由于其扩增特异性及扩增难度，亦上调上样量至基数的1.5倍。
本次实验胶图部分如图1所示，图1中，“RN3”代表DRB1的DNA的3’端的扩增子；“RN5”代表DRB1的DNA的5’端的扩增子；“QN”代表DQB1的DNA的扩增子；“PN3”代表DPB1的DNA的3’端的扩增子；“PN5”代表DPB1的DNA的5’端的扩增子。
1.3.5.2根据样品的数目，芯片的产出，需要的数据量，按需求混合不同的样品，用于三代测序文库构建。
2、三代测序文库构建完成，检测合格后，进行上机测序。
3、对下机数据进行评估，获得5.8G的数据。
4、通过smrtlink v5.0软件包中的bam2bam软件，根据Barcode拆分不同样品，每个样品原始数据通过smrtlink v5.0软件包中的ccs软件进行序列之间的矫正(或不进行)。
5、将ccs矫正后的数据(或下机数据)与参考序列从IPD-IMGT/HLA数据库中每种HLA基因取一条最长序列作为参考序列)进行长序列Blasr比对；
6、比对后采用如下程序批量对每个样品每种基因进行矫正：
6.1、编码原始比对矩阵
ccs经过和参考序列的比对，每个样品的每个基因均组成了由碱基构成的特有矩阵；使用samtools软件，输出文本格式的碱基与参考基因序列的比对矩阵。以参考基因的位置为横坐标、以i表示，以深度为纵坐标、以j表示；
根据三代错误率的规律，设置初始阈值y(y表示默认的错误率10％，即测序错误/占总深度的比例)；
每个i位置的碱基纵向的总深度为Dep_total[i]；
统计每个i位置对应的所有j位置x的数量Num(x)，并按如下表示x对应的深度Dep(x)：
匹配：Num(,)+Num(.)＝Dep(match)
不匹配：Num(*)＝Dep(delition)
断开无匹配：Num()＝Dep(space)
A突变或插入：Num(A)＝Dep(A)
T突变或插入：Num(T)＝Dep(T)
C突变或插入：Num(C)＝Dep(C)
G突变或插入：Num(G)＝Dep(G)
6.2、纯合、杂合位点的可视化矫正
6.2.1、设置初始错误率阈值y(10％)
6.2.2、确定扩增子杂合等位型j位置及比例；
(4.2.2)确定扩增子杂合等位型j位置及比例；
对于每个i位置，当Dep(x)>y，使用Dep(x1)代表最大深度碱基类型的深度，仅次于Dep(x1)的深度，用Dep(x2)表示，若有第三大碱基类型的深度，为Dep(x3)；
对整个扩增子的杂合比例进行计算，当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))<20％时，假设其为纯合子；当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))>＝20％时，假设其为杂合二倍型别，选取SNV等位型杂合比最接近0.5的四个点，该四个点或n个点依照以下规则选取：
以δi衡量SNV等位型杂合比与0.5的接近程度，
δi＝(Dep(x1)/Dep_total[i]-0.5)2+(Dep(x2)/Dep_total[i]-0.5)2；选取δi最小的四个i位置；
且该四个位置前后两个位置的Dep(*)小于总深度的20％，否则继续根据δi筛选；
根据该四个i位置确定矩阵中每个j位置的连锁相：
6.2.2.1、对于矩阵中该四个杂合位点，第一个杂合位点i位置最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2，确定第一个杂合位点的不需要矫正的j坐标的相位；
6.2.2.2、第二个杂合位点的相位根据第一个杂合位点的每一个j坐标的相位情况确定：
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的第二大深度Dep(x2)的碱基类型，则最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x2)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，则第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若满足以上两个条件，则根据该方法确定其它杂合位点的连锁相；若以上两个条件不都满足，继续根据第三个位点分别和第一个杂合位点、第二个杂合位点进行判断；满足(6.2.2.2)所述要求的位点，共同确定连锁相，不满足要求的位点被作为纯合位点；第四个i位置，依照此方法，对前面三个点进行验证和对不确定相位的j位置补缺。
对于该四个杂合位点，相位1对应的j位置组成数组j(phase1)，相位2对应的j位置组成数组j(phase2)。以相位1对应的基因型的深度为Dep(phase1)，以相位2对应的基因型的深度为Dep(phase2)，计算杂合基因型的比例Rh：
Rh＝Dep(phase1)/[Dep(phase1)+Dep(phase2)]；
6.2.3、确定纯合位点与杂合位点；
对于每个i位置，满足以下任意一种情况，则为杂合位点：
①Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)；
②Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)；
否则为纯合位点；
根据矩阵中杂合位点j位置的连锁相的判断，对纯合、杂合位点再次验证调整；初步确定该扩增子或基因为纯合单体型还是杂合二倍型；
6.2.4、碱基矫正
对于纯合位点，该i位置调整y＝Dep(x2)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基类型；
对于杂合位点，该i位置调整y＝Dep(x3)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标将根据其连锁相，从而决定该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基或第二大深度Dep(x2)的碱基；
6.2.5、输出后验矩阵
矫正后的矩阵，呈现无杂点，具有明显的一致性。
7、分相(phasing)得到单体型序列
对矫正后的矩阵进行序列读取；
根据(6.2.3)确定的确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，并根据(6.2.3)确定的每个j位置的连锁相，对校正后的序列按照相位1和相位2归类；
根据(6.2.3.3)确定的确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，若为纯合单体型，输出最大深度的一条单体型序列；否则根据(6.2.3.3)确定的每个j位置的连锁相，对校正后的序列按照相位1和相位2归类；输出最大深度的两条单体型序列，以两条单体型序列深度为单位，和对应(6.2.2.2)中的Dep(phase1)、Dep(phase2)进行卡方检验，确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，输出一致性序列；
8、分型判断
8.1对分相后的单体型序列加刻度，同时对参考序列(IPD-IMGT/HLA数据库中每个型别的全套外显子序列文件hla_nuc.fasta)加刻度。
每个外显子用exon表示，每个内含子用intron表示；每个外显子/或内含子的碱基位置用k表示。此时，同种基因的刻度相同。
8.2分相后的单体型序列和参考序列进行匹配打分。
①优先对单体型中外显子刻度的序列进行匹配打分
对扩增子的所有外显子的碱基打分，基因的第2个外显子发生突变或gap均减3分，第3、4号外显子发生突变或gap(空位)均减2分；其他外显子突变或gap均减1分，匹配加1分；
对于每条单体型序列，给出最高得分为最佳6位分型result1，若无扣分，则与数据库的分型完全匹配；否则同时打印该基因突变或gap处的刻度和突变类型，并标记为新的型别，作为result1。例如：新:A*11:01:01:01:外显子3,7bp.A-T表示该单体型和A*11:01:01:01基因最相似，在第三个外显子的第7个碱基处发生了A-T的突变。
②进一步对单体型全长匹配打分
若IPD-IMGT/HLA数据库中基因全长序列文件hla_gen.fasta，有result1的分型，则将单体型中内含子的序列，与数据库中的参考序列进行匹配打分；
给出最佳8位分型结果result2，若突变则同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别result2。
所有同刻度下错配或gap均减1分，匹配加1分；
对于每条单体型序列，若内含子减分次数小于3次，给出最高得分为最佳8位分型result2，同时打印该基因突变或gap处的刻度和突变类型，并标记为新的型别result2；否则保留result1。
9、分型结果
在三十个样品的分型中，我们将本发明得到的6位的分型结果和一代测序检测的4位分辨率的分型结果进行了比对，准确率达到100％，结果如表7所示(表7中从左到右第一列为样品编号，第二列为一代分型结果，第三列为三代分型结果)。
表7本发明的分型方法与一代测序分型方法结果比对
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 北京希望组生物科技有限公司
<120> 一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgtcgggttt ccagagaagc 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtgggaagag ggtcatggtg 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
acgcacccac ccggactca 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
acaaagggga ggmgtgaaga 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
cgtccccaat tcccactcc 19
<210> 6
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aggctcttga agtcacaaag ga 22
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
tcagatgctg attsgttctc caacac 26
<210> 8
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tccaatcccc acagagtagc taga 24
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
ggccatcrct ttcactgctc tt 22
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ctgyaggcca caagctatta tgct 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
tgacagcaat tttctctccc ctga 24
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ygtgacagcc actgtaggac t 21
<210> 13
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
actctgtcca atcccagggt 20
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
cccctgacaa gctccagatg 20
<210> 15
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
ggtactggtg gcagagatcc aa 22
<210> 16
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
gggtcctatc aggcagattt gcagt 25
<210> 17
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
catagcgact atcgtg 16
<210> 18
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
catcactacg ctagat 16
<210> 19
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
cgcatctgtg catgca 16
<210> 20
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
tatgtgatcg tctctc 16
<210> 21
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
gtacacgctg tgacta 16
<210> 22
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
cgtgtcgcgc atatct 16
<210> 23
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
tatgcatgac tgatat 16
<210> 24
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
cgagactgtc gatctc 16
<210> 25
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
cgcgcgtgtg tgcgtg 16
<210> 26
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
cacacgcgcg tgctcg 16
<210> 27
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
atctgtgcga gactac 16
<210> 28
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
acgcgcacag agtctc 16

Claims (16)

1.一种基于三代测序平台的HLA基因分型方法，包括以下步骤：
(1)对需要分型的HLA基因进行PCR扩增；
(2)PCR所得产物检测合格后，进行三代测序，获得原始数据；
(3)将原始数据与参考基因序列进行长序列比对，所述参考基因序列为IPD-IMGT/HLA数据库中的一条最长序列；
(4)比对后采用如下程序对测序错误进行矫正：
(4.1)编码原始比对矩阵
经过和参考序列的比对，所述HLA基因组成了由碱基构成的特有矩阵；使用samtools软件的tview命令，输出文本格式的碱基与参考基因序列的比对矩阵；以参考基因的位置为横坐标、以i表示，以深度为纵坐标、以j表示，矩阵组成单元以x表示；
设置初始阈值y，所述y表示默认的错误率，所述错误率为测序错误占总深度的比例，所述错误率为10％；
每个i位置的碱基纵向的总深度为Dep_total[i]；
统计每个i位置对应的所有j位置x的数量Num(x)，计算x对应的深度Dep(x)；
(4.2)纯合、杂合位点的可视化矫正
(4.2.1)设置初始错误率阈值y，所述y为10％；
(4.2.2)确定扩增子杂合等位型j位置及比例；
对于每个i位置，当Dep(x)>y，使用Dep(x1)代表最大深度碱基类型的深度，仅次于Dep(x1)的深度，用Dep(x2)表示，若有第三大碱基类型的深度，为Dep(x3)；
对整个扩增子的杂合比例进行计算，当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))<20％时，假设其为纯合子；当Dep(x2)/(Dep(x1)+Dep(x2))>＝20％时，假设其为杂合二倍型别，选取SNV等位型杂合比最接近0.5的四个点，该四个点依照以下规则选取：
以δi衡量SNV等位型杂合比与0.5的接近程度，
δi＝(Dep(x1)/Dep_total[i]-0.5)2+(Dep(x2)/Dep_total[i]-0.5)2；选取δi最小的四个i位置；
且该四个位置前后两个位置的Dep(*)小于总深度的20％，否则继续根据δi筛选；
根据该四个i位置确定矩阵中每个j位置的连锁相：
(4.2.2.1)对于矩阵中该四个杂合位点，第一个杂合位点i位置最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2，确定第一个杂合位点的不需要矫正的j坐标的相位；
(4.2.2.2)第二个杂合位点的相位根据第一个杂合位点的每一个j坐标的相位情况确定：
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的第二大深度Dep(x2)的碱基类型，则最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若相位1对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x2)的碱基类型，且相位2对应的碱基类型有80％为该i位置的最大深度Dep(x1)的碱基类型，则第二大深度Dep(x2)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位1，最大深度Dep(x1)的碱基类型对应的矩阵的j位置为相位2；
若满足以上两个条件，则根据该方法确定其它杂合位点的连锁相；若以上两个条件不都满足，继续根据第三个位点分别和第一个杂合位点、第二个杂合位点进行判断；满足(4.2.2.2)所述要求的位点，共同确定连锁相，不满足(4.2.2.2)所述要求的位点被作为纯合位点；第四个i位置，依照此方法，对前面三个点进行验证和对不确定相位的j位置补缺；
对于该四个杂合位点，相位1对应的j位置组成数组j(phase1)，相位2对应的j位置组成数组j(phase2)；以相位1对应的基因型的深度为Dep(phase1)，以相位2对应的基因型的深度为Dep(phase2)，计算杂合基因型的比例Rh：
Rh＝Dep(phase1)/[Dep(phase1)+Dep(phase2)]；
(4.2.3)确定纯合位点与杂合位点；
对于每个i位置，满足以下任意一种情况，则为杂合位点：
①Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)；
②Dep(x1)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase2)，Dep(x2)对应的碱基j位置至少80％属于数组j(phase1)；
否则为纯合位点；
根据矩阵中杂合位点j位置的连锁相的判断，对纯合、杂合位点再次验证调整；初步确定该扩增子或基因为纯合单体型还是杂合二倍型；
(4.2.4)碱基矫正
对于纯合位点，该i位置调整y＝Dep(x2)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基类型；
对于杂合位点，该i位置调整y＝Dep(x3)；当Dep(x)<＝y，则该处ij坐标将根据其连锁相，从而决定该处ij坐标的碱基被矫正为最大深度Dep(x1)的碱基或第二大深度Dep(x2)的碱基；
(4.2.5)输出后验矩阵
(5)分相得到单体型序列
对矫正后的矩阵进行序列读取；
根据(4.2.3)确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，若为纯合单体型，输出最大深度的一条单体型序列；否则根据(4.2.3)确定的每个j位置的连锁相，对校正后的序列按照相位1和相位2归类；输出最大深度的两条单体型序列，以两条单体型序列深度为单位，和对应(4.2.2.2)中的Dep(phase1)、Dep(phase2)进行卡方检验，确定该扩增子为纯合单体型或杂合二倍型，输出一致性序列；
(6)分型判断
(6.1)根据比对位置，确定单体型序列的每个外显子编号及对应的碱基序列；对于每条单体型序列，根据外显子匹配度输出完全匹配结果result1，否则输出最佳匹配的6位分型结果result1，同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别，作为result1；
(6.2)进一步对单体型全长匹配打分
若IPD-IMGT/HLA数据库中基因全长序列文件hla_gen.fasta，有result1的分型，则将单体型中内含子的序列，与数据库中的参考序列进行匹配打分；
给出最佳8位分型结果result2，若突变则同时打印该基因突变或gap处的位置和突变类型，并标记为新的型别result2。
2.根据权利要求1所述的HLA基因分型方法，其中步骤(4.1)中所述深度Dep(x)表示如下：
匹配：Num(,)+Num(.)＝Dep(match)
不匹配：Num(*)＝Dep(*)
断开无匹配：Num()＝Dep(space)
A突变或插入：Num(A)＝Dep(A)
T突变或插入：Num(T)＝Dep(T)
C突变或插入：Num(C)＝Dep(C)
G突变或插入：Num(G)＝Dep(G)
x的类型和samtools tview的输出结果类型一致，Dep(match)表示矩阵中该位点测序序列和参考基因组匹配的深度，分别包括反向匹配和正向匹配，Num(,)表示矩阵中该位点反向匹配的数量，Num(.)表示矩阵中该位点正向匹配的数量；Dep(*)表示矩阵中测序序列及参考序列间该位点无匹配的深度，Num(*)表示不匹配的数量；Dep(space)表示矩阵中该位点没有序列覆盖的深度，Num()表示矩阵中该位点空格的数量；Dep(A)、Dep(T)、Dep(C)、Dep(G)分别表示A、T、C、G突变或插入的深度。
3.根据权利要求1所述的HLA基因分型方法，其中步骤(1)中所述HLA基因为HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DRB1、HLA-DQB1或HLA-DPB1中的任意一种或几种。
4.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-A所用的引物序列如SEQ IDNo：1～2所示。
5.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-B所用的引物如SEQ ID No：3～4所示。
6.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-C所用的引物如SEQ ID No：5～6所示。
7.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-DRB1所用的引物序列如SEQID No：7～10所示。
8.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-DQB1所用的引物序列如SEQID No：11～12所示。
9.根据权利要求3所述的HLA基因分型方法，其中扩增HLA-DPB1所用的引物序列如SEQID No：13～16所示。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的HLA基因分型方法，其中所述HLA基因来自单个样品。
11.根据权利要求1至9中任一项所述的HLA基因分型方法，其中所述HLA基因来自多个样品。
12.根据权利要求11所述的HLA基因分型方法，其中所述HLA基因的引物的5’端加有用于区分样品的Barcode序列。
13.根据权利要求12所述的HLA基因分型方法，其中所述HLA基因的上游引物和下游引物所加Barcode序列不同。
14.根据权利要求13所述的HLA基因分型方法，其中所述Barcode序列如SEQ ID No：17～28所示。
15.根据权利要求1所述的HLA分型方法，其中步骤(3)中所述长序列比对为长序列Blasr比对。
16.根据权利要求1所述的HLA分型方法，其中所述三代测序平台为PacBio Sequel、pacbio RSII或Nonopore。
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