CN106255762A - Hcv基因分型算法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于使用下一代测序、特别是离子半导体测序测定样品、例如临床样品中存在的病原体的基因型的方法。本发明还涉及包含用于实施本文公开的基因分型方法的计算机单元以及适合于执行本文公开的方法的软件产品的装置。

Description

HCV基因分型算法
本发明涉及用于使用下一代测序、特别是离子半导体测序测定样品、例如临床样品中鉴定的基因型的方法。本发明还涉及包含用于实施本文公开的基因分型方法的计算机单元的装置以及适合于执行本文公开的方法的软件产品。
背景
许多病原体与大量个人痛苦和重要的社会-经济后果诸如医疗费用等相关。病原体诸如细菌和病毒经常作为不同的株系、基因型或亚型存在。个体株系、基因型或亚型可以或多或少易受可用治疗例如抗生素或抗病毒药物影响。近年来，抗生素耐受细菌的发展和未受或较少受已知抗病毒药物影响的病毒的发展是主要关注来源。例如，渐增数目的无法用过去足够有效的抗生素治疗的金黄色葡萄球菌菌株、结核分支杆菌菌株等被以下匹配：较高数目的死亡率和相关的社会-经济后果，例如，数天住院治疗、从感染恢复所需天数的总体增加。
此外，人的重要病毒病原体，例如HIV、HCV和HBV，也值得较高注意，这是由于目前已知的抗病毒药物，例如γ干扰素、抗逆转录病毒药物等未充分消除病毒变体的发展。这些病毒具有可改变药物结合位点、从而赋予针对已知药物的部分或完全抗性的基因突变的高比率。这导致具有对于受害个体和社会两者的后果的受影响患者中的耐受病原体的较高滴度。
对于社会-经济重要和已知发展引起针对一些抗病毒药物的耐受性的突变的病毒一个实例是丙型肝炎病毒(HCV)。该病毒是说明本发明的一个实例。
HCV涉及黄病毒科含RNA病毒家族，并引起具有肝硬化和肝癌的最常见并发症的感染过程(CDC Report N°61；Younossi Z,Kallman J,Kincaid J.The effects of HCVinfection and management on health-related quality of life；Hepatology.2007Mar；45(3):806-16)。在2005年，地球上估计数目超过1.7亿人受该疾病折磨(Robert-Koch-Institut:Epidemiologisches Bulletin.46/2005)，并且受影响的人数仍在上升。
HCV的急性感染(所有急性肝炎感染的20％)经常导致慢性肝炎(所有慢性肝炎病例的70％)和终末期肝硬化。据估计，多达20％的HCV慢性携带者可经约20年的时间段发展肝硬化，并且每年1至4％的具有肝硬化的HCV慢性携带者处于发展肝癌的风险中(Shiffman1999；Lauer和Walker 2001)。
增加HCV引起的终末期肝病的寿命的一个选项是肝移植(全世界所有肝移植中的30％是由于HCV-感染)。
此外，当肝移植不适应或不可行时，当代广泛的HCV治疗的趋势是使用联合疗法，其包括共同注射大剂量的干扰素与含有常见抗病毒制剂和一种或两种HCV复制抑制剂(特定蛋白酶-解旋酶和/或RNA聚合酶抑制剂)两者的鸡尾酒混合物(例如，Toniutto P,FabrisC,Bitetto D,Fomasiere E,Rapetti R,Pirisi M.Valopicitabine dihydrochloride；aspecific polymerase inhibitor of Hepatitis C virus.Curr Opin InvestigDrugs.2007Feb；8(2):150-8；)。这些鸡尾酒混合物增加恢复的百分比，然而不可避免地导致适应性的抑制剂耐受的HCV突变体的形成。
HCV具有高突变率，这被认为帮助病毒逃脱其宿主的免疫系统。高突变率反映于受感染的个体中被称为准种的许多不同的HCV基因组序列的存在(Bukh等人1995；Farci等人1997)。准种由病毒编码的NS5B RNA依赖的RNA聚合酶的活性所导致，所述NS5B RNA依赖的RNA聚合酶，由于其缺乏校对功能，固有地是低保真酶。准种的可能生物后果包括：(i)发展对体液免疫和细胞免疫的逃逸突变体，导致持续性感染的建立；(ii)可变细胞嗜性(例如，嗜淋巴细胞vs嗜肝)；(iii)疫苗失败，和(iv)快速发展耐药性。
因此，HCV样本的基因型和亚型的鉴定对于检测治疗反应、评估抗病毒疗法的持续时间和效力和建立病毒传播的途径的目的具有显著重要性。取决于亚型的基因型，患者目前用基于干扰素的药物(其可用于治疗基因型2、3、5和6的感染)治疗，而基因型1和4对基于干扰素的治疗不那么响应。现在公认，HCV在不同HCV分离株间作为独特基因型存在，其中每种基因型流行于特定地理位置。目前，HCV变体主要分为6种基因型，代表由核心/E1和NS5B亚基因组序列以及完整基因组序列的系统发育分析定义的6种基因组。在每种基因型内，HCV变体可进一步分为亚型(Simmonds等人.1994)。HCV基因型的命名法的当前统一系统的概述由Simmonds等人(2005)给出。
用当前标准FDA批准的与利巴韦林组合的聚乙二醇化干扰素α的抗病毒疗法，仅约一半对于该治疗合格的基因型-1HCV感染的个体实现持续的病毒学响应(Manns等人，2001)。因为严重的副作用和其它医疗并发症，目前从治疗排除多达75％的HCV患者。因此，目前正在开发和早期临床试验中的新的抗HCV药物目的在于采用新的目标，诸如HCV内部核糖体进入位点(IRES)、HCV NS3丝氨酸蛋白酶和HCV NS5B RNA依赖的RNA聚合酶(参见例如Tan等人2002；De Francesco等人2003)。
然而，预期HCV的高突变率和变异性有利于耐药性的出现，限制了这些抑制剂的临床有用性。事实上，已经在体外实验和初始临床试验过程中发现耐药性突变。例如，HCV亚基因组复制子已经用于研究病毒对核苷和非核苷NS5B抑制剂以及NS3/4A蛋白酶抑制剂两者的耐受性(Kukolj等人2005；Mo等人2005；综述于:Tomei等人2005)。HCV耐受性突变体的理解将朝着有效的治疗HCV进一步进展。换言之，评估现有药物耐受性突变体对不同类别的抗病毒剂的敏感性对于新药的开发至关重要。此外，探索组合治疗对耐药性的影响可以提供对未来HCV治疗策略的见解。所有这都使得能够快速开发和/或改变适当的治疗方案。因此，用适当(即，活性)药物治疗HCV-感染的患者将变得可行得多。
为了跨越HCV基因型进行此类精确耐药性概况分析，需要有效地分析HCV核酸序列的方法。尽管HCV充当响应于治疗干预而进化的病原体的实例，但类似的关注也适用于变得对某些药物(例如HIV、抗生素耐受的细菌(例如MRSA)等)更加响应的其它病原体。
本发明解决该需求以可靠和准确地确定病原体(例如病毒诸如HCV)的基因型或亚型，并提供用于使用下一代测序确定病毒基因型的新方法和装置。
下一代测序是在疾病(例如感染性疾病诸如病毒感染)的诊断中变得越来越重要的方法。下一代测序允许测定核酸(例如病毒核酸)的序列，并且为医师当选择用于个体的正确治疗时提供重要信息。
下一代测序基于巨量(例如，数千或数百万)序列的同时并行测序。目前，使用各种类型的下一代测序方法，Roche的454焦磷酸测序、Illumina测序、SOLiD测序和离子半导体测序是最先进的测序方法。几家公司已经在市场上引入允许以自动方式进行下一代测序方法的装置。下一代测序是该领域中的技术专家已知的，且主要基于从来源(例如临床来源，诸如临床样品)分离核酸，生成具有几百至几千碱基对的大小的核酸的短片段。将这些短片段克隆入文库，然后将序列个别引入其中测序反应发生的分开反应容器中。存在用于测序核酸的不同方法，例如基于磷酸盐的释放、荧光的释放或带正电的氢离子的检测的方法。
本发明提供分析在下一代测序方法的过程中获得的数据的方式。相当经常地，仅测序期望的基因组区域的短片段，并且必须组装成覆盖必需的所有目的基因组区域的重叠群。
此外，临床样品可含有对于怀疑存在于临床样品中的特定病毒的基因型代表性的不同类型的期望的目标基因组区域(例如，病毒基因组区域)，找出目标基因(例如，病毒基因)的基因型的确切性质以找到受影响的患者的正确治疗是重要的。
当使用下一代测序方法诸如离子半导体测序方法测序特定长度(例如，约1000个碱基对)的基因，覆盖整个基因组区域的巨量片段必须在测序之后重新组装以形成连续序列(重叠群)。
本发明提供用于组装在巨量个别测序反应中获得的信息并以非常高效率将获得的信息与先前收集的信息(例如，以基因数据库诸如含有关于已知HCV基因型和亚型的信息的数据库的形式)进行比较的令人惊讶有效的方法。
定义
如说明书和权利要求中所使用，单数形式“一个/种(a)”和“一个/种(an)”也包括相应的复数，除非上下文另有明确说明。
在本发明的上下文中的术语“约”表示本领域技术人员将理解仍确保讨论中的特征的技术效果的精确度的区间。该术语通常表示与所示数值的±10％、优选±5％的偏差。
需要理解的是，术语“包含”不是限制性的。为了本发明的目的，术语“由...组成”被认为是术语“包含”的一个优选实施方案。如果组群在下文被定义为包含至少特定数目的实施方案，这也意指涵盖优选仅由这些实施方案组成的组群。
如本文所使用的术语“检测存在”应当在“检测存在或不存在”的含义中理解。如本申请中请求保护的方法中所提及，待分析的样品被怀疑包含核酸，所述核酸包含表明病原体的存在的共有核酸序列(其也可以指定为目标序列)。
在本发明的上下文中，“表明病原体的存在的共有核酸序列”或“目标序列”表示给定病原体对于所述病原体特异性的基因组区域。基因组区域的扩增(例如使用(RT-)PCR)和扩增产物的测序允许确定给定病原体是否存在于由其获得扩增的核酸的样品。术语“共有”意指基因组区域允许特异性确定给定病原体的核酸序列是否存在于样品中，但考虑存在多于一种核酸序列变体，即所述病原体的多于一种基因型、亚型或株系。例如，HCV的NS5B基因组区域允许鉴定样品中存在HCV。然而，存在该基因组区域的几种基因型和亚型，即尽管基因组区域包含表明所有HCV基因型的共有序列，但这些个别基因型和亚型具有不同的核酸序列或所述核酸序列的变体。
在本发明的上下文中，术语“核酸”是指单链或双链形式的天然存在的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物。该核酸可以特别是双链DNA和单链RNA。
如本文所使用的术语“序列”是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物中的碱基的连续存在，其中脱氧核糖核苷酸聚合物中发现的碱基选自A、T、G和C且核糖核苷酸聚合物中发现的碱基选自A、U、G和C。脱氧核糖核苷酸聚合物中的碱基的序列因此可以是例如GGAAGCAAGCCT，而核糖核苷酸聚合物中的碱基的序列可以例如是GGAAUCGAU。
如本文所使用，术语“样品”是指可以针对包含目标序列的核酸的存在进行测试的来自任何人或兽医受试者的任何生物样品。所述样品可以包括从任何器官获得的组织，例如，肺组织；和从任何器官获得的流体，诸如例如，血液、血浆、血清、淋巴液、滑液、脑脊液、羊水、羊膜脐带血、泪液、唾液和鼻咽洗涤液。如上所列出，样品也可以源自机体中的特定区域，例如呼吸道；来自呼吸道样品的样品包括咽喉拭子、咽喉洗涤液、鼻拭子和来自下呼吸道的样本。
所述样品可尤其源自人或兽医受试者。因此，“患者”可以是人或兽医受试者。如果提及“临床样品”，这表明所述样品来自怀疑被具有包含目标序列的核酸的病原体感染的患者。
如本文所使用，术语“扩增”是指能够产生数十亿拷贝的核酸目标的酶介导的程序。本领域已知的酶介导的目标扩增程序的实例包括PCR。
用于扩增DNA的“PCR反应”已经由Mullis等人的美国专利号4,683,195和Mullis的美国专利号4,683,202首先描述，并且是本领域普通技术人员众所周知的。在PCR技术中，将DNA的样品在溶液中与摩尔过量的至少两种寡核苷酸引物(制备为与DNA双链体的每条链的3'末端互补)(参见上文，正向和反向引物)；摩尔过量的核苷酸碱基(即，dNTP)；和热稳定的DNA聚合酶(优选Taq聚合酶)(其催化由寡核苷酸引物和dNTP形成DNA)混合。所述引物中，至少一种是正向引物，其将在5'至3'方向结合至变性的DNA分析物的一条链(在上述定义中，无义链)的3'末端，且另一种是反向引物，其将在3'至5'方向结合至变性的DNA分析物的另一条链(在上述定义中，有义链)的5'末端。将溶液加热至约94-96℃，以便将双链DNA变性为单链DNA。当溶液冷却下来且达到所谓的退火温度时，引物结合至分离链且DNA聚合酶通过将dNTP接合至引物而催化分析物的新链。当重复该过程且将从所述引物合成的延伸产物与其互补物分离时，各延伸产物充当用于从另一引物合成的互补延伸产物的模板。由于序列在各循环后被扩增一倍，所以在重复该过程几小时会后可获得巨量拷贝的理论扩增；因此，可以在相对短的时间内使用PCR扩增极小量的DNA。
当用于PCR反应的起始材料是RNA时，经由逆转录从RNA合成互补DNA(“cDNA”)。然后使用上述PCR方案扩增所得cDNA。本领域普通技术人员已知逆转录酶是逆转录病毒中发现的酶，其可以从mRNA序列作为模板合成DNA的互补单链。用于扩增RNA产物的PCR被称为逆转录酶PCR或“RT-PCR”。
术语“测序”在本文中以其在分子生物学中的通常含义使用。因此，确定核酸序列中的碱基的确切连续存在。
如本文所使用的术语“病原体”以其最广泛的含义使用。因此，病原体可以是任何类型的细菌、古细菌、原生生物、真菌和病毒。明确地提及的是，病毒落在如本文所使用的“微生物”的定义下。
本发明的实施方案
在一个方面，本发明涉及(i)确定或检测样品中的病原体的存在或不存在，和(ii)确定样品中的病原体的基因型和/或亚型的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供怀疑含有病原体的样品，
b.选择表明存在所述病原体的共有序列，
c.使用适合于测序读取值装配的软件(例如MTRA)确定选择的表明所述病原体的共有序列的核酸序列，
d.提供用使用广泛接受的多重序列比对算法(例如MAFFT、CLUSTALW、MUSCLE)和系统发生树构建算法(例如最大似然，最近邻，最大-简约)的软件构建的具有已知基因型的基因序列的集合的系统发生树，
e.使用适合于序列比对的软件(例如BLAST、TMAP、BWA)将获得的共有核酸序列与表明所述病原体的具有已知基因型的基因序列的集合进行比对，
f.确定与获得的共有核酸序列具有高相似性的基因序列的子集，
g.确定步骤f)中与获得的共有核酸序列具有高相似性的基因序列的子集的步骤d)中的系统发生树中的最低共同祖先，
h.基于步骤g)中获得的结果，诊断样品中存在的病原体基因型/亚型，和
i.任选确定表明所述病原体的基因序列的至少两种不同的基因型或亚型的共感染。
适合于通过上述方法分析的样品可以是任何类型的样品，尤其是如上所定义的临床样品。提供样品意味着从怀疑含有给定病原体(被给定病原体感染)的生物体移取样品。此外，该方法通常包括这样的步骤，其中提取并纯化样品中的核酸，使得可以进行进一步分析步骤，诸如逆转录、PCR等。
上述方法包括这样的步骤，其中选择表明存在所述病原体的共有序列。该步骤依赖于关于给定病原体的基因身份和变异性的信息。例如，如果HCV是应当测定其存在和基因型/亚型的病原体，则数据库提供关于那些区域的信息，其允许特异性检测HCV和确定所述HCV的基因型/亚型。显然，基于(RT-)PCR的扩增和检测方法需要设计特异性扩增允许特异性扩增的HCV基因组区域的引物。因此，本发明的方法进一步包括设计PCR引物的步骤，所述PCR引物与HCV的基因组区域或它们的互补物特异性杂交，以允许特异性扩增共有基因组区域，即，目的基因组区域(目标区域)。扩增的基因组区域的长度优选在约100至1000个核苷酸的范围内，但如果需要的话，也可以扩增基因组区域的较长片段，例如约1100、1200、1300、1400、1500个核苷酸长度或更长的区域。靶向基因组区域的选择通常取决于这样的问题，所述基因组区域是否对于给定病原体(例如HCV)是特异性的，和扩增产物的进一步分析是否允许确定所述病原体的基因型/亚型。例如，如果约800个核苷酸长度的基因组区域的扩增和分析足以特异性检测病原体，例如HCV，则没有必要获得更长片段，条件是该片段(共有基因组区域)也允许确定各自病原体的基因型/亚型。
在扩增核酸序列之后进行确定选择的表明所述病原体的共有序列的核酸序列的步骤。核酸序列通过病原体的靶向基因组区域的测序，优选下一代测序，最优选离子半导体测序来确定。在本发明的方法中，测序代表目的基因组区域的更大量扩增产物。组装所有测序反应的测序读取值以提供连续序列(重叠群)。组装步骤使用被称为MIRA组装器的自由可得的软件(即，适合于核苷酸序列的自动组装和编辑的软件)进行。可以使用的其它软件以名称Newbler、CLC Bio等已知，条件是此类软件适合于指导此类重叠群的组装。组装重叠群中的核苷酸序列之后，在覆盖范围、长度方面检查组装的重叠群的质量，其中具有至少300倍平均覆盖范围的目标核酸序列且具有长于250个核苷酸、长于300个核苷酸的长度的重叠群，优选长于400个核苷酸或仍更长序列的重叠群被认为对于本发明的目的是有效的。
在本发明的方法中，使用多重序列比对算法和树构建算法生成表明所述病原体的具有已知基因型的基因序列的集合的系统发生树。然后，使用适合于序列比对的软件(例如，TMAP软件)(其针对来自Ion Torrent PGM的数据特定调整的短读取值比对器)将获得的核酸序列与具有已知基因型的基因序列的集合进行比对。当病原体是HCV时，具有已知基因型的基因序列的集合可以收集自公众可得的“丙型肝炎病毒(HCV)数据库项目”，其最初由国家过敏和传染病研究所的微生物和传染病部门(Division of Microbiology andInfectious Diseases of the National Institute of Allergies and InfectiousDiseases，NIAID)资助。
由于病毒的高突变率，获得的核酸序列将完全匹配于数据库中的单一已知基因序列是不可能的。此外，数据库中储存的许多已知的基因序列是彼此高度类似的。因此，对于各核酸序列，获得基于BLAST比对分数与核酸序列最密切匹配的具有已知基因型的基因序列的子集S。从As(系统发生树上S中的已知基因序列的最低共有祖先)的基因型推断核酸序列的基因型。系统发生树T上的节点N的集合的最低共同祖先被定义为T中在N中具有所有节点作为后代的最低节点。生物学上，As代表S中已知基因序列的进化亲代。使用该方法，基因分型精确度改善，因为使用来自与核酸序列密切匹配的基因序列的所有基因型信息。此外，如果与核酸密切匹配的基因序列具有不同的基因型，则可以推断重组。类似地，如果相同样品中的核酸序列具有不同的基因型，则可以推断共感染。
本发明的方法的一个优点是，可以通过查看BLAST结果来检测重组或不寻常的序列变异。此外，也可能当最高匹配涉及来自不同基因型的序列时检测这一点。可能使用本发明的方法来使用重叠群序列直接构建系统发生树，其中可将所述序列置于所述树的与一种或其它基因型更近的一些部分中。通常，在该情况下很难检测到重组。
与本发明的方法相关的另一个优点是，检测共感染，例如病原体的至少两种株系、基因型或亚型(例如HCV的两种不同的基因型或亚型)共感染的能力。
上述方法的子方面涉及检测选自包含细菌或病毒的微生物的病原体。如本文所使用，细菌可优选选自已经发展对于药物诸如抗生素的耐受性的人致病细菌，例如甲氧西林耐受的金黄色葡萄球菌菌株(MRSA)、抗生素耐受的肺炎克雷伯氏菌菌株、抗生素耐受的结核分枝杆菌菌株、或毒素产生细菌，诸如EFIEC(肠出血性大肠杆菌菌株)。
优选检测或确定其基因型或亚型的病毒的实例选自人致病性病毒，包括HIV、HCV、HBV、诺罗病毒、冠状病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、疱疹病毒。
本发明的方法优选用于检测选自HCV、HIV、HBV、人疱疹病毒(例如CMV)等的病毒的病毒基因型/亚型的存在或不存在和确定。
当致病病毒是HCV时，本发明的方法特别非常适合于多于一种基因型或亚型的基因分型或共感染的检测。
当致病病毒是HCV时，本发明的方法特别适合于多于一种基因型或亚型的基因分型或共感染的检测，其中表明感染的共有序列(目标序列)是包含核苷酸位置8614和9298的HCV NS5B基因组区域的片段。
本发明的方法特别适用于分析临床样品，其中所述临床样品源自选自以下的患者：
a)怀疑被HCV感染的患者，
b)已知被HCV感染的患者，其中HCV的基因型和/或亚型是未知的，
c)先前未用抗病毒药物治疗的患者；
d)已经用抗病毒药物治疗的患者，
e)对抗病毒药物不响应的患者，
f)被似乎对抗病毒药物耐受的HCV感染的患者，
g)被HCV感染且在临床试验中用抗病毒药物治疗的患者。
本发明的方法优选包括测序步骤，其中通过下一代测序测定核苷酸序列。
当通过测序所述共有核酸(目标)序列的片段和将测序信息组装成重叠群来测定序列时，本发明的方法是特别合适的。
本发明的方法特别适合于使用软件算法(例如，MIRA组装器，参见http://www.chevreux.org/projects_main.html)将核酸序列读取值组装成重叠群序列。
在本发明的方法中，使用适合于序列比对的软件(例如，BLAST)将各重叠群与表明所述病原体的已知基因序列进行比对。
本发明还涵盖包含实施本文提及的方法的步骤的软件路径的软件产品。
本发明还涉及选择治疗疗法的方法，其包括进行任何前述段落的方法和基于所述确定所述病原体的基因型/亚型的方法的结果选择治疗。在本发明的该方面的优选实施方案中，用于治疗病原体感染的疗法是对于选自HCV、HIV、HBV、疱疹病毒(例如CMV)的病毒特异性的。本发明的该方面的最优选的实施方案涉及HCV感染的治疗。本发明的该方面中的表明HCV感染的共有序列是HCV基因组区域NS5B或其片段。优选地，该片段包含核苷酸位置8614和9298。然而，明确地考虑使用其它HCV基因组区域用于确定合适的基因型或亚型特异性治疗性处理。
本发明还涉及选择HCV感染的受试者的治疗疗法的方法，其包括进行任何前述段落的方法。例如，当患者被HCV基因型1感染时，用例如特拉匹韦加上干扰素和利巴韦林或Boceprivir加上干扰素和利巴韦林治疗是合适的。对于其它基因型，例如HCV2、3和4，可以选择用干扰素加上利巴韦林治疗。
本发明还涉及适用于阅读软件来进行任何上述用于检测病原体(例如HCV)的基因型的存在和确定病原体(例如HCV)的基因型的方法的装置。该装置能够执行软件中提供的方法步骤。
应当理解，尽管本发明已经结合本文所述的实施方案进行描述，前述描述以及随后的实施例意欲说明而非限制本发明的范围。本发明的范围内的其它方面、优点和改变对于本发明所属领域中的技术人员将是显而易见的。本文提及的所有专利和出版物都以其整体通过引用并入本文。
提出以下实施例，以便为本领域技术人员提供如何制备和使用本发明的组合物的完全公开和描述。实施例意欲作为本发明的非限制性实例。尽管已经作出努力以确保关于变量诸如量、温度等的精确度，但应当考虑实验误差和偏差。除非此外指出，否则份是重量份，温度是摄氏度，压力为大气压或接近大气压。所有组分均商业获得，除非另有说明。
实施例
获得自人患者的血液样品用于提取核酸，所述核酸后面进行准备步骤，用于使用Ion Torrent半导体测序装置的下一代测序。
作为表明HCV的存在的共有序列，选择包含核苷酸位置8614和9298的NS5B区域。
NGS测序用于测定上述选择的表明HCV的共有序列的核酸序列。使用适合于测序读取值组装的MTRA(http://mira-assembler.sourceforge.net/docs/DefinitiveGuideToMIRA.html)完成该步骤。
用使用广泛接受的多重序列比对算法MAFFT(http://mbe.oxfordjournals.org/content/30/4/772)和系统发生树构建算法(例如最大似然http://code.google.eom/p/phyml/)的软件构建具有已知HCV基因型的基因序列的集合的系统发生树。
使用适合于序列比对的软件(例如，来自IonTorrent的TMAP)将获得的共有核酸序列与表明所述病原体的具有已知基因型的基因序列的集合进行比对。
确定与获得的共有核酸序列具有高相似性的基因序列的子集。确定前述步骤中与获得的共有核酸序列具有高相似性的基因序列的子集的步骤d)中的系统发生树中的最低共同祖先。
基于前述步骤中获得的结果，诊断样品中存在的病原体基因型/亚型。

Claims (27)

1.确定/检测样品中的病原体的存在或不存在和/或基因型和/或亚型的方法，所述方法包括以下步骤：
a.提供怀疑含有病原体的样品，
b.选择表明存在所述病原体的共有序列，
c.确定选择的表明所述病原体的共有序列的核酸序列，
d.使用(适合于序列比对的软件)BLAST将获得的核酸序列与表明所述病原体的已知基因序列进行比对，和
e.基于选择的表明所述病原体的基因组区域的共有序列的核酸序列，确定病原体的基因型或亚型。
2.权利要求1的方法，其进一步包括步骤f，其中确定表明所述病原体的基因序列的至少两种不同的基因型或亚型的共感染。
3.权利要求1或2中任一项的方法，其中所述病原体是选自HCV、HIV、HBV或疱疹病毒的病毒。
4.权利要求1至3中任一项的方法，其中所述病毒是HCV。
5.权利要求1至4中任一项的方法，其中表明HCV感染的共有序列是包含核苷酸位置8614至9298的HCV NS5B基因组区域的片段。
6.权利要求1至5中任一项的方法，其中所述样品是临床样品。
7.权利要求1至6中任一项的方法，其中所述临床样品源自选自以下的患者：
a)怀疑被HCV感染的患者，
b)已知被HCV感染的患者，其中HCV的基因型和/或亚型是未知的，
c)先前未用抗病毒药物治疗的患者；
d)已经用抗病毒药物治疗的患者，
e)对抗病毒药物不响应的患者，
f)被似乎对抗病毒药物耐受的HCV感染的患者，等。
8.权利要求1至7中任一项的方法，其中所述序列通过扩增NS5B的基因组区域的部分和测定核苷酸序列来测定。
9.权利要求1至8中任一项的方法，其中所述核苷酸序列通过下一代测序来测定。
10.权利要求1至9中任一项的方法，其中所述序列通过测序所述共有序列和将测序信息组装成重叠群来测定。
11.权利要求1至10中任一项的方法，其中使用软件算法将所述测序信息组装成重叠群序列。
12.权利要求1至11中任一项的方法，其中使用适合于序列比对的软件、优选BLAST将各重叠群与表明所述病原体的基因序列进行比对。
13.软件产品，其包含实施权利要求1至12中任一项的方法的步骤的软件路径。
14.选择治疗疗法的方法，其包括进行权利要求1至12中任一项的方法，其进一步包括基于所述确定所述病原体的基因型/亚型的方法的结果选择治疗的步骤。
15.根据权利要求1至12和14中任一项的方法，其中所述病原体是选自HCV、HIV、HBV的病毒。
16.根据权利要求14和15中任一项的方法，其中所述病毒是HCV。
17.根据权利要求14至16中任一项的方法，其中表明感染的共有序列是HCV基因组区域NS5B 8614至9298。
18.根据权利要求14至17中任一项的方法，其中所述样品是临床样品。
19.根据权利要求14至18中任一项的方法，其中所述临床样品源自选自以下的患者：
a.怀疑被HCV感染的患者，
b.已知被HCV感染的患者，其中HCV的基因型和/或亚型是未知的，
c.先前未用抗病毒药物治疗的患者；
d.已经用抗病毒药物治疗的患者，
e.对抗病毒药物不响应的患者，
f.被对抗病毒药物耐受的HCV感染的患者，
g.参加针对抗病毒药物的临床试验的被HCV感染的患者。
20.根据权利要求14至19中任一项的方法，其中所述序列通过下一代测序来测定。
21.根据权利要求14至20中任一项的方法，其中所述序列通过测序所述共有序列的片段和将测序信息组装成重叠群来测定。
22.根据权利要求14至21中任一项的方法，其中使用软件算法将所述测序信息组装成重叠群序列。
23.根据权利要求14至22中任一项的方法，其中使用适合于序列比对的软件、优选BLAST将各重叠群与表明所述病原体的已知基因序列进行比对。
24.根据权利要求14至23中任一项的方法，其中根据HCV基因型选择特定的抗病毒药物治疗。
25.软件产品，其包含实施权利要求14至24中任一项的方法的步骤的软件路径。
26.装置，其能够读取和执行根据权利要求25的软件中定义的方法步骤。
27.根据权利要求26的方法，其中所述装置能够执行根据权利要求25的软件中提供的方法步骤。
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