CN112501285B

CN112501285B - 用于mrkh综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN112501285B
Application number: CN202011606858.4A
Authority: CN
Inventors: 朱兰; 陈娜; 吴南; 赵森; 田维杰
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2020-12-30
Filing date: 2020-12-30
Publication date: 2022-03-01
Anticipated expiration: 2040-12-30
Also published as: CN112501285A

Abstract

本发明公开了用于MRKH综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用，所述诊断标记物为一组MRKH综合征相关的致病基因突变位点。本发明的研究利用全外显子组测序，首次发现了MRKH综合征罕见病患者的PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.‑132‑1G>A、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036‑2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T。本发明为进一步揭示MRKH综合征的病因和发病机制提供了关键线索和研究方向。

Description

用于MRKH综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学及基因检测领域，具体而言，涉及一组用于MRKH综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用。

背景技术

Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser(MRKH)综合征是一种罕见的女性先天性生殖道畸形，可导致患者性交障碍及不可治愈的原发性不孕。目前，人们对该综合征的致病原因及发病机制均知之甚少。每新生4000-5000例女性婴儿中，就有1例发生这种畸形，是原发性闭经最常见的病因之一。MRKH综合征患者的典型临床特征为女性先天性子宫及阴道上三分之二段缺失，染色体核型正常46，XX，具有典型的女性第二性征(Morcel K,Camborieux L,Guerrier D.Mayer-Rokitansky-Küster-Hauser(MRKH)syndrome[J].Orphanet journalof rare diseases,2007,2(1):1-9.)。这种生殖道畸形可孤立发生，即单纯型或I型(仅子宫及阴道发育异常)；部分患者可伴发其他系统畸形，即复杂型或II型(MURCS，苗勒氏管肾脏颈胸体节综合征)，包括肾脏畸形(单侧肾缺如、肾脏异位及马蹄肾)，骨骼畸形(短颈畸形、椎骨融合、脊柱侧凸及并趾多趾)，甚至较罕见的血液循环系统或视觉系统畸形。

MRKH综合征的病因及发病机制的研究已有几十年的历史。由于多数病例为散发性，最初被认为可能是母体接触环境有害因素所致，但早期回顾性研究并没有发现环境因素致病的证据。家族性病例报道提示遗传因素参与发病，但任何一种遗传模式都只能解释部分病例，故多因素/多基因遗传致病被认为是最合理的解释(Tiker F,Yildirim S V,Barutcu O,et al.Familial müllerian agenesis[J].The Turkish journal ofpediatrics,2000,42(4):322-324.；Wottgen M,Brucker S,Renner S P,et al.Higherincidence of linked malformations in siblings of Mayer–Rokitansky–Küster–Hauser-syndrome patients[J].Human reproduction,2008,23(5):1226-1231.)。遗传因素是MRKH综合征病因研究的主流方向，而主要策略为候选基因测序，研究内容主要集中在女性生殖道原基苗勒氏管发育相关的基因。

目前，仍然缺乏对MRKH综合征相关基因变异的鉴定研究。鉴于此，本发明通过对大规模的样本进行分析研究，发现了MRKH综合征患者中PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T，本发明为进一步揭示MRKH综合征的病因和发病机制提供了关键线索和研究方向。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一组用于MRKH综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用，本发明的发明人通过对大规模的样本进行研究，发现了MRKH综合征患者中PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T，该发现为进一步揭示MRKH综合征的病因和发病机制提供了关键线索和研究方向。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变位点的试剂：PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T。

进一步，所述试剂选自：引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。

进一步，所述试剂中引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片的设计是根据本领域的常规方法进行设计的。

第二方面，本发明提供了一种用于诊断MRKH综合征的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的试剂。

进一步，所述试剂盒还包括：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。

进一步，所述试剂盒检测的样本来源于被测个体的血液。

进一步，所述试剂盒中的使用说明书记载了如何使用本发明所述试剂盒对受试者个体进行检测。

进一步，所述试剂盒中的使用说明书还记载了如何对检测的结果进行判断，进而对受试者个体做出诊断结果或辅助诊断结果。

第三方面，本发明提供了本发明第一方面所述的试剂或本发明第二方面所述的试剂盒在如下任一方面所述的应用：

(1)在制备诊断或辅助诊断MRKH综合征产品中的应用；

(2)在制备筛查或辅助筛查MRKH综合征患者产品中的应用；

(3)在制备检测与MRKH综合征相关的基因是否存在突变的产品中的应用；

(4)在制备检测与MRKH综合征相关的蛋白质是否存在突变的产品中的应用。

第四方面，本发明提供了一种包括固相载体和固定在固相载体上的探针点阵的基因芯片。

进一步，所述基因芯片包含特异性结合突变基因PAX8、BMP4、BMP7、TBX6、WNT9B的探针；

优选地，所述突变基因PAX8、BMP4、BMP7、TBX6、WNT9B的突变位点分别为c.68G＞T，c.367G>T、c.-132-1G>A/-、c.766C>T，c.1036-2A>G，c.621+1G>A，c.976C>T；

进一步，所述探针为PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T的特异性寡核苷酸探针。

优选地，所述探针至少能检测一种上述突变基因。

进一步，所述基因芯片上的固相载体可选为载玻片；

优选地，所述载玻片为醛基修饰的载玻片。

此外，本发明还提供了一种检测MRKH综合征相关的基因突变位点的方法，所述方法包括如下步骤：

(1)从待检测的个体中获得样本；

(2)抽取步骤(1)中所述的样本DNA；

(3)样本DNA的PCR扩增和标记。以步骤(2)中获得的样本DNA为模板，选择合适引物PCR扩增，同时标记待测的突变相关序列；

(4)采用本发明所述的基因芯片在样本PCR产物变性后进行杂交检测。将样本PCR扩增产物与杂交液以一定的体积比混合后，获得混合液，混合液中PCR扩增产物变性后，将混合液点于芯片上进行杂交，杂交后用洗液进行洗涤，再通过检测标记信号的强度判断是否存在相应的突变。

进一步，步骤(4)中所述的杂交液为常规用于核酸杂交反应的杂交液，可选用各种市售或自行配置的杂交液。

进一步，步骤(4)中所述的混合液中PCR扩增产物变性可采用常规的变性方法，例如95℃变性。

进一步，步骤(4)中所述的杂交后用洗液进行洗涤的目的是将未完全匹配的PCR扩增产物从芯片上去除。

进一步，步骤(4)中所述洗液可采用本领域常规的用于核酸杂交的洗液。

进一步，所述的MRKH综合征相关的基因突变位点包括：PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T。

本发明所述的基因芯片可用于检测MRKH综合征相关的基因突变位点，可一次同时检测多个突变位点，从样本制备到PCR扩增，到最终得出检测结果，所需时间较短，全检测过程可在7小时左右的时间内完成，大大缩短了对患者或受试者的诊断时间，可以对临床上疑似MRKH综合征的患者进行初步筛查，以确定有无所述基因突变体，具有较好的临床推广价值，与传统的分子生物学方法相比，本发明所述的基因芯片具有高灵敏性、特异性、可重复性，同时，检测时间相对传统方法而言大大缩短。

第五方面，本发明提供了一种用于检测MRKH综合征的基因突变位点组合。

进一步，所述突变位点组合包括本发明第一方面所述的突变位点中的一种或多种。

第六方面，本发明提供了本发明第五方面所述的基因突变位点组合在制备诊断MRKH综合征的试剂中的应用。

第七方面，本发明提供了本发明第五方面所述的基因突变位点组合在制备诊断MRKH综合征的试剂盒中的应用。

进一步，本发明通过采集受检者外周血，提取基因组DNA，检测PAX8基因上是否存在突变位点c.68G＞T、BMP4基因上是否存在突变位点c.367G>T、BMP4基因上是否存在突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上是否存在突变位点c.766C>T、BMP7基因上是否存在突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上是否存在突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上是否存在突变位点c.976C>T，即可辅助MRKH综合征的快速诊断。

芯片、试剂盒

本发明所述的芯片包括：固相载体，以及有序固定在所述固相载体上的寡核苷酸探针，所述的寡核苷酸探针特异性地对应于PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T的序列。所述固相载体包括塑料制品、微颗粒、膜载体等。所述塑料制品可通过非共价或物理吸附机制与抗体或蛋白抗原相结合，最常用的塑料制品为聚苯乙烯制成的小试管、小珠和微量反应板；所述微颗粒是由高分子单体聚合成的微球或颗粒，其直径多为微米，由于带有能与蛋白质结合的功能团，易与抗体(抗原)形成化学偶联，结合容量大；所述膜载体包括硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜及尼龙膜等微孔滤膜。

“探针”指能与另一分子的特定序列或亚序列或其它部分结合的分子。除非另有指出，术语“探针”通常指能通过互补碱基配对与另一多核苷酸(往往称为“靶多核苷酸”)结合的多核苷酸探针。根据杂交条件的严谨性，探针能和与该探针缺乏完全序列互补性的靶多核苷酸结合。探针可作直接或间接的标记，其范围包括引物。杂交方式包括(但不限于)：溶液相、固相、混合相或原位杂交测定法。

本发明所述的试剂盒，包括特异性检测受试者基因组DNA中是否存在以下任一种、两种或几种突变位点的试剂：PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T，所述试剂选自：引物、引物对、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。本发明所述的试剂盒还包括如下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂。例如，用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。本发明的试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，和如何利用检测结果对结果进行判断。

本发明的优点和有益效果如下：

本发明对442例中国MRKH综合征患者、941名健康女性对照和150例来自北美、南美和欧洲的混合种族的MRKH综合征患者进行全外显子组测序，是目前国内对MRKH综合征最大样本量的测序研究，结果鉴定出了PAX8基因上的突变位点c.68G＞T(p.Gly23Val)、BMP4基因上的突变位点c.367G>T(p.Glu123Ter)、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A/-(Spliceacceptor)、BMP4基因上的突变位点c.766C>T(p.Arg256Ter)、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G(Splice acceptor)、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A(Splice donor)、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T(p.Gln326Ter)。

本发明提供了MRKH综合征的新的基因突变位点，为MRKH综合征的诊断提供了新的分子生物学基础，为人群中该疾病的诊断提供了依据，基于上述突变位点开发的MRKH综合征诊断的试剂盒和基因芯片能用于孕前遗传病筛查、产前筛查，以及患者是否患有MRKH综合征的辅助诊断。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1是苗勒管/沃尔夫管的延伸过程图；

图2是研究队列中3个PAX8变异家系和复制队列中1个PAX8变异家系的系谱分析图和Sanger测序结果图，其中，A图：MRK49，B图：MRK467，C图：MRK330，D图：BH9080；

图3是对致病基因PAX8上的突变位点进行荧光素酶检测的结果图，其中，WT：野生型，Positive：一种已知的有害变异体R31C阳性对照，n＝5，*p<0.05；

图4是PAX8中LGD突变体和有害错义突变体的突变谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例致病基因突变位点的鉴定及验证

1、研究人群

研究队列：本发明共招募了来自北京协和医院和深圳罗湖医院的442例MRKH综合征患者，其中，来自北京协和医院196例，来自深圳罗湖医院246例，I型MRKH综合征患者的330例(74.7％)，II型MRKH综合征患者的112例(25.3％)。通过妇科超声、盆腔MRI、染色体核型分析和收集的医疗记录确诊为MRKH综合征患者。每个受试患者均签署了知情同意书，北京协和医院和深圳罗湖医院伦理委员会批准了这项研究。

对照组：本发明共招募了941名健康女性作为对照，所有受试者均签署了知情同意书。

验证队列：本发明共招募了150例来自北美、南美和欧洲的混合种族的MRKH综合征患者。

2、研究方法

2.1对所有受试者进行了外显子组测序

分别提取每个受试者的外周血DNA，并对所有受试者进行了外显子组测序。从DNA样品制备Illumina配对末端文库并进行外显子组捕获，然后在Illumina HiSeq 4000平台上测序；使用内部开发的数据分析平台(Peking Union Medical College Pipeline，PUMP)调用和过滤变体。

2.2基因中突变负荷的筛选和测试

比较了442例MRKHS病例和941名女性对照者中19个候选基因的突变负荷，为了识别稀有突变，我们使用内部(病例和对照人群)和外部(ExAC和gnomAD)测序数据筛选出具有较小等位基因频率(MAF)<0.001的突变位点。然后筛选出可能致病的稀有的非同义变体(缺失，无意，移码，框内插入缺失，经典的剪接位点突变)。在准备好数据之后，两种模型用于突变负荷筛选：可能的基因干扰(LGD)模型和LGD+有害错义突变(D-mis)模型。使用SNP-set(序列)内核关联优化测试(SKAT-O)测试分析稀有突变的突变负荷，以确定19个基因中突变负荷的关联性。

2.3验证队列中可能的干扰基因位点筛选

本发明共招募了150例来自北美、南美和欧洲的混合种族的MRKH综合征患者作为验证队列。对验证队列中进行了类似的19个候选基因的筛选，筛选了验证队列中可能的干扰基因位点，D-mis和拷贝数变异(CNV)。最终筛选得到了PAX8基因的c.236C>G、c.156_157dupCG、c.25+1G>T、c.195delC、c.322C>T、c.542C>T、c.136G>A、c.266T>C、c.619C>T、c.727C>G、c.68G＞T共11个突变位点，TBX6基因的c.275_287dupTGGAGGAGGGCGG、c.621+1G>A共2个突变位点，BMP4基因的c.367G>T、c.-132-1G>A/-、c.766C>T共3个突变位点，BMP7基因的c.1036-2A>G突变位点，TBX6基因的c.621+1G>A突变位点，WNT9B基因的c.976C>T突变位点。

2.4通过Sanger测序验证筛选出的突变位点

通过Sanger测序验证了筛选出的LGD和D-mis突变为真性突变，测序结果见图2，方框内为突变位点；Sanger测序所采用的引物序列分别如表1所示。

表1 Sanger测序所采用的引物序列

2.5双重荧光素报告实验验证筛选出的突变位点对PAX转录活性的影响

为了对筛选出的突变位点进行进一步的验证，本发明进一步采用双重荧光素报告实验(Luciferase assay)对上述突变位点对PAX转录活性的影响进行了验证。具体验证方法如下：

(1)HeLa细胞在DMEM/F12培养基中生长，培养基中补充了10％的胎牛血清，2mM L-谷氨酰胺和50U/mL青霉素和50μg/mL链霉素。将生长状况良好的细胞经消化后种入24孔细胞培养板中，每种质粒种3个复孔，细胞计数后各孔中各加入2.5×10⁵个消化后的细胞，随后加入DMEM培养基将每孔体积补足至500μL后，将24孔细胞培养板放入细胞培养箱中37℃培养24小时并转染空载体(pEGFP)，PAX8野生型或突变质粒和pRL-SV40 Renilla对照质粒。pGL4-pTG1084质粒包含克隆了人甲状腺球蛋白启动子(-5'侧翼区域，从-1043bp到+41bp)使用KpnI和HindIII限制性位点将其插入pGL4.14质粒。使用Lipofectamine 3000进行转染。

(2)使用以下引物扩增PAX8的典型结合序列：

正向引物5’-GCGGGGTACCACCTGGCTGGATTGGTCTTC-3’(SEQ ID NO.11)

反向引物5’-GGCGAAGCTTTTTCCTGGCCCTTCCTGGG-3’(SEQ ID NO.12)

(3)pRL-SV40 Renilla对照质粒包含SV40启动子和Renilla Reniformis荧光素酶基因。海肾荧光素酶的荧光用于归一化PAX8质粒转染效率。重复独立测定5次。荧光素酶活性用DualGlo荧光素酶分析测量系统。

(4)转录活性检测：

a)转染24小时后，取出24孔细胞培养板，用移液管吸弃上清；

b)各孔中加入200μL PBS清洗2次，用移液管吸弃PBS；

c)各孔中加入预先用PBS稀释好的1X Passive Lysis Buffer裂解液100μL对细胞进行裂解，将24孔板放于摇床上室温裂解30分钟；

d)将裂解后的细胞收集至1.5mL EP管中；3000rpm离心5分钟后，从各EP管中去20μL上清加入至白板中；

e)运用Dual Luciferase reporter system检测试剂加样，首先在各孔中加入50μL发光试剂(Luciferase Assay Substrate)，在酶标仪(450nm)下检测免疫荧光发光强度(Firefly Luciferase conuts,LUC)；

f)取出白板，在各孔中分别加入50μL灭活试剂(Stop&Glo Buffer)后，在酶标仪(450nm)下检测灭活后发光强度(Renilla Luciferase counts,RLUC)；

g)记录下LUC值与RLUC值，计算LUC/RLUC的比值即为其转录活性强度；

h)数据分析及统计。

2.6比较基因组杂交微阵列(aCGH)

使用aCGH验证了ES鉴定的致病性CNV。从每个受试者的外周血中提取的样品得到基因组DNA和性别匹配的参考DNA使用AluI和RsaI酶将其片段化。安捷伦SureTag DNA标记试剂盒用于DNA标记。Cy5-dUTP用于每种DNA的染料标记受试者，将Cy3-dUTP用作参考DNA。将标记的待测DNA和参照DNA杂交到Agilent SurePrint G3 Custom CGH Array上。DNA处理，微阵列处理和数据分析按照安捷伦寡核苷酸CGH方案进行操作。

2.7数字液滴PCR(ddPCR)

为了验证BMP4变体c.367G>T(p.Glu123Ter)的嵌合性，设计两个TaqMan探针用于检测野生型和突变序列。为了同时检测验证列中鉴定的CNV，使用了两个设计有独特的荧光标签的TaqMan探针，当相应的结合区域TBX6(FAM探针)或管家基因TERT(HEX探针)通过PCR进行扩增时，荧光标签就会被激活并被检测到。使用Bio-Rad QX200 AutoDG ddPCR进行TaqMan反应的标准方案系统和标准的热循环仪。为了增加反应的效率，HindIII限制性核酸内切酶用于辅助DNA片段化，而无需切割要通过PCR扩增的区域。

3、实验结果

队列人口学信息和个体表型见表1，在7个候选基因中鉴定出12个LGD突变位点，包括PAX8(MIM：167415)、BMP4(MIM：112262)、BMP7(MIM：112267)、TBX6(MIM：602427)、HOXA10(MIM：142957)、EMX2(MIM：600035)和WNT9B(MIM：602864)(见表3和图1)，而在来自941名女性对照组样本的基因组的任何候选基因中均未检测到LGD变异(P＝1.2E-06，SKAT-O)。在12个LGD突变位点中，有8个被蛋白质截断，有4个影响标准剪接位点。除WNT9B和BMP4中的一个突变位点外，所有截断突变位点都被预测为会导致不稳定的突变RNA，其易受NMDEscPredictor 15的无意义介导的mRNA降解。

结果显示，在致病基因PAX8上鉴定出4个LGD突变位点：c.156_157dupCG(p.Val53AlafsTer24)、c.25+1G>T(Splice donor)、c.195delC(p.Tyr66ThrfsTer10)、c.322C>T(p.Arg108Ter)(见表3和表4)，所有携带PAX8杂合LGD突变位点的4名患者在初次就诊时均表现为I型MRKH综合征，临床上没有观察到甲状腺功能减退症(CH)的表型，MRK49(c.25+1G>T)和MRK467(c.322C>T)的甲状腺激素水平在正常范围内。此外，对这两个个体的亲本DNA进行测序后发现，其PAX8 LGD突变体都是父系遗传的(见图2)，与性别相关外显率的显性疾病特征一致。从研究队列的3个病例中鉴定出了3个D-mis PAX8突变体(c.542C>T[p.Ser181Phe]，c.266T>C[p.Val89Ala]，c.236C>G[p.Ser79Cys])(见表4)。荧光素酶测定法的结果显示c.236C>G导致反式激活潜力降低PAX8蛋白在其共有结合序列上的定位(见图3)，证明了其为LoF等位基因。对该个体MRK330(c.236C>G)研究发现，该突变体也是从其父亲遗传的(见图2)。MRK330及其父亲均患有CH，证明了PAX8的遗传多效性。在PAX8中还鉴定出无意义突变体c.619C>T(p.Arg207Ter)，在3例I型MRKHS的患者中鉴定出PAX8基因上的两个杂合D-mis突变体c.136G>A(p.Asp46Asn)、c.727C>G(p.Gln243Glu)(见表4)。荧光素酶测定法的结果显示c.136G>A变体引起PAX8的LoF(见图3)，该变体也是父系遗传，与常染色体显性遗传方式一致，且表现为限性遗传(见图2)。PAX8中的LGD和D-mis变体富集于该蛋白质的DNA结合PAX结构域(见图4)，表明PAX8的DNA结合功能在MRKHS的发病机制中具有重要作用。为了进一步研究PAX8的遗传多效性，对5名携带有CH致病性PAX8突变体的女性个体进行了研究，研究结果显示，在临床随访期间进行骨盆超声和MRI检查，发现其中一人(CH123)既往未见子宫发育不全，提示临床诊断为MRKHS。该个体中的PAX8变异为c.68G>T(p.Gly23Val)，在体内验证为LoF等位基因(见图3)。该个体的表型与综合征症状一致，即为先天性甲状腺功能减退-MRKH综合征(CH-MRKH综合征)。

结果显示，在MRK644和MRK166中分别鉴定出了BMP4(Genebank：NM_001202.3)中的杂合终止增益突变c.367G>T(p.Glu123Ter)和杂合剪接受体突变c.-132-1G>A(Spliceacceptor)。MRK644从母亲嵌合体继承了c.367G>T突变体的BMP4等位基因。ES检测到先证者中的BMP4变体c.367G>T为26/55(47％)突变体/总读数，推测为杂合突变体。相反，其母亲的血液DNA经ES检测得到的Vr/Tr＝13/60(22％)与嵌合变异等位基因一致。数字液滴PCR(ddPCR)进一步验证了这种嵌合现象，其结果表明先证者的突变率为50％，母亲的突变率为10％。对于第二个具有BMP4 LGD突变体的MRKH166，剪接受体突变体是从父系遗传的，呈现出与PAX8相似的限性遗传。在复制队列的ES研究中，从I型MRKHS的个体中发现了BMP4中的另一种LGD变异c.766C>T(p.Arg256Ter)，进一步表明BMP4变异与MRKHS相关。

结果显示，在BMP7(Genebank：NM_001719.2)中，鉴定出了来自MRK444的剪接受体突变体c.1036-2A>G(Splice donor)和来自MRK342的移码突变体c.275_287dupTGGAGGAGGGCGG(p.Pro98GlyfsTer31)。两人均表现为I型MRKH综合征。

结果显示，在II型MRKH综合征的个体MRK639中鉴定出了TBX6(Genebank：NM_004608.3)剪接供体变异体c.621+1G>A(Splice donor)。除苗勒氏管发育不全外，MRK639还患有先天性脊柱侧弯。Sanger测序结果表明，该个体携带c.621+1G>A剪接变体与轻度T-C-A单倍型(由三个单倍型SNP，rs2289292-rs3809624-rs3809627 25组成的轻度T-C-A单倍型)，与TBX6相关的先天性脊柱侧凸复合遗传基因剂量模型一致。复制队列中，在Mul23的TBX6中鉴定出了另一个移码突变体c.856_859delAATG(p.His286CysfsTer28)，该个体被诊断为II型MRKH综合征。

结果显示，在42个中国MRKH综合征患者个体的队列中首次发现WNT9B(Genebank：NM_001320458.2)中的错义变异。在本研究中，我们在MRK57中鉴定出了一个杂合无意义变体c.976C>T(p.Gln326Ter)，该个体被诊断为I型MRKH综合征(见表3)。

表2队列人口学信息和个体表型

⁺在复制队列的150个样本中，关于MRKH综合征分类的数据适用于所有个体，随访年龄和并发症的相关数据来源于96名患者，这一栏中的百分比是根据拥有可用信息的个体计算得到的。

表3对442例病例和941例女性对照中的19个候选基因进行突变负荷分析

利用SNP-set(Sequence)Kernel Association test-optimised(SKAT-O)test对罕见变异进行分析，以确定19个基因突变负荷的相关性。缩写：pLI，来自ExAC数据库(http://exac.broadinstitute.org/)的功能缺失不耐受概率；FDR，错误发现率；OR，比值比。

表4对442例病例和941例女性对照中的19个候选基因进行突变负荷分析

缩写：gnomAD，基因组聚合数据库；ExAC，外显子组整合数据库；AF，等位基因频率；vR，变体读取；tR，总读取；VAF，等位基因变异频率；-，不适用；LoF，功能丧失；CADD，结合注释依赖耗尽。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 中国医学科学院北京协和医院

<120> 用于MRKH综合征诊断的标记物及其在制备诊断试剂盒中的应用

<141> 2020-12-30

<160> 12

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

cctgagcaaa ctgctctcgt 20

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

cagtccccag ctcaactgta a 21

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tccctgcctg attgttcagc 20

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

gagggaggct ctggctaaat c 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

agatgccctc tttggtccat c 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

agtgggtttg gagaatggct g 21

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgatggagca caggctcatt t 21

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

agtgagtcag cttggagtca g 21

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gctctcgaga tccaaccacc 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

tcctcctact cctggcagac 20

<210> 11

<211> 30

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 11

gcggggtacc acctggctgg attggtcttc 30

<210> 12

<211> 29

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 12

ggcgaagctt tttcctggcc cttcctggg 29

Claims

1.检测样本中基因突变位点的试剂在制备诊断MRKH综合征试剂盒中的应用，其特征在于，所述基因突变位点为PAX8基因上的突变位点c.68G＞T、BMP4基因上的突变位点c.367G>T、BMP4基因上的突变位点c.-132-1G>A、BMP4基因上的突变位点c.766C>T、BMP7基因上的突变位点c.1036-2A>G、TBX6基因上的突变位点c.621+1G>A、WNT9B基因上的突变位点c.976C>T中的一种或多种。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂选自：引物、探针、抗体和核酸芯片中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒还包括：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物或溶剂。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本来源于被测个体的血液。